用于加强抗血管生成疗法的方法和组合物的制作方法

专利名称：用于加强抗血管生成疗法的方法和组合物的制作方法
对相关申请的交叉引用本申请根据35 U.S.C.119(e)要求受益于在2004年10月6日提交的第60/616,348号美国临时申请，该临时申请在此以参考的方式全文引入。
背景技术：
癌症通常是指由能扩散至身体的相邻组织或其他部分的细胞失控而异常的生长所导致的一组疾病(超过100种)中的一种。癌细胞能形成实体肿瘤，其中所述癌细胞团集在一起，或者例如在白血病中以分散的细胞存在。正常细胞分裂直至实现成熟，随后仅在需要替换受损或死亡细胞时才分裂。癌细胞通常被称为是“恶性的”，这是因为它们无穷无尽地分裂，最终挤出附近细胞并扩散至身体的其他部分。癌细胞从一个器官扩散至其他器官或者从身体的一部分扩散至其他部分的倾向使其与良性肿瘤细胞区分开来，所述良性肿瘤细胞虽过分生长但不扩散至身体的其他器官或部分。恶性癌细胞通过血流或淋巴系统最终转移并扩散至身体的其他部分，并能够在所述身体的其它部分增殖并形成新的肿瘤。这种肿瘤发展使得癌症成为致命的疾病。
虽然癌症的诊断和治疗已有很大改善，但是每年仍有许多人死于癌症，其死亡通常由于对传统疗法具有抵抗力的转移灶和癌症。
大多数药物介导的癌症疗法依赖于被称为细胞毒剂的对正在分裂的细胞具有选择性的毒物。这些药物之所以有效是因为癌症细胞通常比正常细胞更频繁地分裂。然而，这些药物几乎不可避免地无法杀死患者体内的所有癌细胞。一个原因是，癌细胞能获得具有耐药性的突变。另一个原因是，不是所有的癌细胞都比正常细胞更频繁地分裂，并且缓慢分裂的癌细胞与正常细胞一样对这些细胞毒剂不敏感，甚至是比正常细胞更不敏感。一些癌细胞分裂缓慢，这是因为它们驻留在血管稀少的实体肿瘤内并且不能产生细胞分裂所需要的能量。随着肿瘤的生长，它需要血液供应并因此要求生长出新的脉管系统。
血管生成是涉及新生血管生长进入组织的组织血管生成过程，也称为新血管生成。血管是向活组织供应氧和营养并从活组织中移除废产物的通道。在恰当的时候，血管生成是关键的生物学过程。例如，血管生成在再生、发育和伤口修复时是必需的。相反，不恰当的血管生成可产生严重的负面后果。例如，只有在作为血管生成的结果的实体肿瘤血管化以后，所述肿瘤才具有足够的氧和营养供应，使得其能快速生长和转移。
血管生成依赖性疾病是那些要求或诱发血管生长的疾病。这些疾病代表了寻求医学治疗的所有疾病中的重要部分，其包括肥胖症；炎性疾病，例如免疫和非免疫炎症、慢性关节风湿病和牛皮癣；与不适当或不合适的血管侵入相关的疾病，例如黄斑变性、糖尿病性视网膜病、新生血管性青光眼、再狭窄、在动脉粥样硬化斑块中的毛细血管增生和骨质疏松症；以及癌症相关的疾病，例如实体肿瘤、实体肿瘤转移灶、血管纤维瘤、晶体后纤维增生症、血管瘤和卡波西肉瘤等需要新生血管化以支持肿瘤生长的癌症。
促血管生成因子的治疗性建议在超过三十年前就已经由Folkman及其合作者首次描述(Folkman，N.Engl.J.Med.，2851182-1186(1971))。在身体失去对血管生成的至少部分控制时就会发生异常的血管生成，从而导致或者过量或者不足的血管生长。例如，诸如溃疡、中风和心脏病发作等状况可源自缺乏自然康复通常所需的血管生成。相反，过量血管增生可导致肿瘤生长、肿瘤扩散、肥胖症、黄斑变性、失明、牛皮癣和类风湿性关节炎。
血管生成是一个多方面过程。直接血管生成抑制剂阻止血管内皮细胞生长。间接血管生成抑制剂阻止血管生成的激活或者阻断协助启动血管生成的受体的表达。血管生成抑制剂在动物研究中已表现出希望，而临床实验正在进行之中(Kerbel等，Nature reviews，第2卷，第727～739页)。然而，还未证实血管生成抑制剂对所有癌症具有100％的有效率。
迄今已证实，癌症的治疗是棘手的。虽然“癌症”具有很多相同的特性，但每一种具体的癌症都有其自己的特性。遗传和环境因素对严重性和治疗的预后有复杂的相互影响。因此，治疗必须仔细地进行个案处理。
虽然近年来癌症化学疗法有显著的发展，但是使用单一试剂治疗癌症鲜有成功。首先，任何单一试剂仅能靶向存在的恶性细胞总群的亚组，留下癌性细胞亚群继续生长。其次，当长期接触药物后细胞可产生抗性。采用两种以上具有不同作用机理和不同毒性的试剂的组合疗法对避开抗药性和增加目标细胞群是有用的，但还未证实其对所有癌症的治疗都有效。此外，某些试剂组合可以是协同的其组合效果大于根据其单独活性所预测的效果。因此，组合不同试剂可以是治疗癌症的有力的策略。
然而，组合疗法有或对或错的建议。在许多情况下，交叉效应和治疗负担可导致组合的有效性比分别单独治疗的有效性更低。多药物的耐药性也是个问题。
细胞毒剂，诸如环磷酰胺，也已被用于治疗癌症。恶性细胞和健康细胞间的最显著的差异是癌细胞无限制增殖的能力。该差异被许多细胞毒剂所利用，其通常通过干扰DNA的合成或完整性而破坏细胞增殖。按此方式作用的各类细胞毒剂的实例包括烷化剂、抗代谢物(例如嘌呤和嘧啶类似物)和铂配位络合物。
通过破坏细胞分裂而起作用的细胞毒剂的一个问题是它们不能区分正常细胞和恶性细胞任何正在分裂的细胞都是它们作用的潜在目标。因此，也靶向正常表现出高水平增殖的细胞群(例如骨髓)，从而导致通常与癌症治疗相关的毒副作用。
促血管生成生长因子的抑制剂是用于抑制已知的促血管生成因子如VEGF或FCF的信号转导的试剂。这样的试剂可通过抑制血管生成因子与其受体间的相互作用而在细胞外发挥作用或者通过抑制相应受体的蛋白激酶活性而在细胞内发挥作用。这些试剂包括例如抗VEGF抗体或抗VEGF受体抗体或者VEGF-R、FGF-R或PDGF-R的蛋白激酶域的抑制剂。目前，这些试剂自身在癌症治疗中不能表现出足够的功效。
除少数例外的以外，没有对大多数癌症具有疗效的单独药物或者药物组合。因此，需要能够延迟危及生命的肿瘤的生长和/或通过进一步减轻肿瘤负担以提高生命质量的新型的药物或药物组合。

发明内容
本发明涉及抑制患有血管生成疾病或障碍或者具有发展为血管生成疾病或障碍风险的哺乳动物的组织中的血管生成的方法，所述方法包括向哺乳动物组合施用至少一种血管生成抑制剂和至少一种促进NADH+H+生成的试剂。这样的试剂包括例如醇类或多元醇类(多羟基化合物类)。
在本发明的一个实施方案中，所述血管生成抑制剂是直接血管生成抑制剂(即阿瓦斯汀(Avastin))。在另一个实施方案中，所述血管生成抑制剂是间接血管生成抑制剂(即ZD1839(易瑞沙(Iressa)))。在又一个实施方案中，所述血管生成抑制剂是消炎药，例如双氯芬酸、吲哚美辛、柳氮磺吡啶、CELEBREX(西乐堡)、THALOMID(沙利度胺)或IFN-α，或者氧化还原醌，例如甲萘醌，或者细胞毒剂，例如低剂量环磷酰胺。
在一个优选的实施方案中，所述促进NADH+H+生成的试剂是多元醇。所述多元醇最优选为木糖醇。作为另外一种选择，所述多元醇是甘露糖醇、山梨糖醇、阿糖醇(arabinol)和艾杜糖醇。此外，本发明还涉及一种抑制患有诸如癌症等血管生成疾病或障碍的哺乳动物的组织中的血管生成的方法。
在本发明的另一个实施方案中，所述方法涉及实体肿瘤或实体肿瘤转移灶的治疗。
在又一个实施方案中，所述方法涉及视网膜组织的治疗，并且所述疾病或障碍是视网膜病、糖尿病性视网膜病或者黄斑变性。作为另外一种选择，本发明的方法涉及具有再狭窄风险的组织的治疗，其中所述组织位于冠状动脉血管成形术部位。
在本发明的另一个实施方案中，所述方法涉及抑制哺乳动物组织中的血管生成，其中所述组织是发炎的，而所述疾病或障碍是关节炎或类风湿性关节炎。作为另外一种选择，所述哺乳动物组织是脂肪组织，而所述疾病是肥胖症。
本发明的方法可以或者单独使用，或者与本领域技术人员已知的其他治疗方法组合使用。这些方法可包括但不局限于放射疗法或手术。
采用本发明方法治疗的哺乳动物可包括人类或家养动物，例如猫或者狗。
在本发明的另一个实施方案中，所述施用包括静脉内施用、穿皮施用、滑膜腔内施用、肌肉内施用或口服施用。
在本发明的又一个实施方案中，所述口服施用组合物是能进一步含有调味剂(即薄荷醇和/或茴香脑)的水性悬浮液或者溶液。该水性悬浮液或溶液的一些组分可以以干燥形式提供，并在口服使用前较短时间内再生(reconstitute)(＝溶解)。
本发明的方法可以或者预防性地或者治疗性地施用至少一种血管生成抑制剂和促进NADH+H+胞内累积的试剂。
本发明的方法还能以周为周期而施用所述至少一种血管生成抑制剂和促进NADH+H+胞内累积的试剂。该周期可以包括每周两次在不连续的天数内施用所述组合，而促进NADH+H+胞内累积的试剂和氧化还原醌仅在该周的其他时间内每天施用。在下文实施例1中提供了该交替治疗的详细描述。
本发明的方法涉及抑制具有发展为血管生成疾病或障碍风险的哺乳动物中的血管生成疾病或障碍。所述风险可以采用基因手段来确定。作为另外一种选择，所述风险可以通过测定在患者生物学液体(即血液、尿液)中癌症标记蛋白的水平来确定。标记蛋白包括例如降钙素、PSA、CEA、胸腺素β-15、胸腺素β-16和基质金属蛋白酶(MMP)。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括至少一种血管生成抑制剂、至少一种促进NADH+H+生成的试剂(例如多羟基化合物)和药用载体的组合。
在一个优选的实施方案中，所述至少一种血管生成抑制剂是在美国申请第10/898,721号中描述的组合物，该美国申请在此以参考的方式引入。该抑制剂包括细胞毒剂，优选为环磷酰胺；消炎药，优选为COX1-2抑制剂，如双氯芬酸和吲哚美辛；和氧化还原醌，优选为维生素K3(或甲萘醌或亚硫酸氢钠甲萘醌)。也可包括苯甲酸的酯，优选为苯甲酸苄酯。除这些优选的血管生成抑制剂外，本发明的组合物还包含能促进NADH+胞内累积的试剂，例如多羟基化合物，优选为木糖醇，以及药用载体。NFκB抑制剂，诸如柳氮磺吡啶也应当优选包括在内。
在一些实施方案中，所述组合进一步包括二膦酸盐，优选为帕米膦酸盐或阿仑膦酸盐。在其它的一些实施方案中，所述组合进一步包括基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂。
此处使用的“细胞毒剂”在以低剂量施用时起到血管生成抑制剂的作用。优选的细胞毒剂包括例如环磷酰胺、异环磷酰胺、阿糖胞苷、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、长春新碱、多柔比星和柔红霉素、苯丁酸氮芥、卡莫司汀、长春碱、甲氨蝶呤和紫杉醇。更优选的细胞毒剂包括环磷酰胺、异环磷酰胺、阿糖胞苷、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、长春新碱、米托蒽醌、多柔比星和柔红霉素。环磷酰胺和异环磷酰胺是最优选的细胞毒剂。
所述血管生成抑制剂也可以是促血管生成生长因子抑制剂。在此处所使用的短语“促血管生成生长因子抑制剂”是指被用于抑制已知的促血管生成因子如VEGF或FGF的信号转导的试剂。所述试剂可通过抑制血管生成因子与其受体间的相互作用而在细胞外发挥作用或者通过抑制相应受体的蛋白激酶活性而在细胞内发挥作用。这些试剂包括例如抗VEGF抗体或抗VEGF受体抗体(US 6,416,758和WO 01/72829)或者VEGF-R、FGF-R或PDGF-R的蛋白激酶域的抑制剂(WO 97/34876和US6,462,060)。
本发明的药物组合物还可包含基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂。在此处使用的短语“基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂”是指任何可以抑制哺乳动物体内天然存在的至少一种基质金属蛋白酶的至少5％水解活性的化合物。这样的化合物也称为“MMP抑制剂”。
已知大量的基质金属蛋白酶抑制剂，并且都可以用在本发明中。一些可用在本发明中的MMP抑制剂的具体实例是AG-3340、RO 32-3555、RS 13-0830、金属蛋白酶的组织抑制剂(TIMP)(例如TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3或TIMP-4)、α2-巨球蛋白、四环素类(例如四环素、二甲胺四环素、多西环素)、天冬氨酸异羟肟酸(例如巴马司他、马立马司他(MARIMISTAT)和托卡特)、螯合剂(例如EDTA、半胱氨酸、乙酰半胱氨酸、D青霉胺和金盐)、合成MMP片段、琥珀酰巯基嘌呤、膦酰胺酯(phosphonamidate)和异羟肟酸(hydroxaminic acid)。
在一个实施方案中，所述药物组合物被配制成易于口服施用的水性悬浮液或溶液形式。该水性悬浮液或溶液的一些组分可以以干燥形式提供，并在口服使用前较短时间内再生(＝溶解)。
在另一个实施方案中，所述制剂还含有调味剂(例如薄荷醇和/或茴香脑)。
在又一个实施方案中，制备分开的制剂，所述分开的制剂仅含有NADH+H+胞内累积促进剂(例如木糖醇)和氧化还原醌(例如甲萘醌)，并优选含有NFκB抑制剂(例如柳氮磺吡啶)和调味剂(例如薄荷醇和/或茴香脑)。
本发明还包括试剂盒，所述试剂盒包括所述组合的组分及其施用说明书。


图1木糖醇对抗血管生成疗法的抗癌功效的改善。图1显示出三组患有耐环磷酰胺乳癌肿瘤的小鼠的肿瘤体积(mm3)。在肿瘤细胞接种后5天，使用抗血管生成疗法(此处称为4×4)治疗的组和使用4×4+木糖醇治疗的组，均在接种后4周时间内每周接受两次腹膜内注射(i.p.)环磷酰胺+双氯芬酸+甲萘醌的药剂。在同一时期内当周余下的4天内施用不含环磷酰胺+双氯芬酸的药剂。细节参见下表1。对照组仅在4周时间内每周6天接受赋形剂(在DDW中的2％泊洛沙姆(pluronic)、2％聚乙二醇硬脂酸酯15(Solutol HS-15))的腹膜内注射。与对照小鼠相比(仅有4×4或赋形剂对照)，使用4×4组合+木糖醇的小鼠的肿瘤体积明显减小。
图2图2显示分别接受对照治疗、Tiltan治疗和柳氮磺吡啶治疗(如实施例2所描述；TB002)的患有肿瘤的小鼠的平均肿瘤体积(mm3)作为接种后时间的函数(n＝7～8只小鼠/组；SE)。
图3图3显示分别接受对照治疗、Tiltan治疗和柳氮磺吡啶治疗(如实施例2所描述；TB004)的患有肿瘤的小鼠的平均肿瘤体积(mm3)作为接种后时间的函数(n＝7～8只小鼠/组；SE)。
图4图4显示在开始治疗以后(如实施例3所描述)，两种肿瘤标记CA-125和CA15.3都降低至正常水平范围并在该范围保持至第30周。
图5图5显示在TiltAn治疗6周以后，骨盆、腹腔和胸腔的CT显示疾病稳定。在第12周，肝转移灶的体积减小且该减小持续至第30周。
具体实施例方式
我们已发现促进NADH+H+胞内累积的试剂(即多元醇类或多羟基化合物类)增强了血管生成抑制剂的效果，即它们的抗癌效果。因此，本发明涉及抑制患有血管生成疾病或障碍或者具有发展血管生成疾病或障碍风险的哺乳动物的组织中的血管生成的方法，所述方法通过组合施用有效量的至少一种促进NADH+H+胞内累积的试剂和至少一种血管生成抑制剂。
本发明还包括一种药物组合物，所述药物组合物含有至少一种血管生成抑制剂、至少一种促进NADH+H+胞内累积的试剂和药用载体。
在本发明的一个实施方案中，所述血管生成抑制剂是直接血管生成抑制剂(即血管生长抑素、贝伐单抗(阿瓦斯汀)、阿瑞司坦(Arresten)、血管能抑素(Canstatin)、考布他汀、内皮生长抑素、NM-3、凝血酶致敏蛋白(thrombospondin)、肿瘤抑素、2-甲氧基雌二醇和维他辛(Vitaxin))。作为另外一种选择，所述血管生成抑制剂可以是间接血管生成抑制剂(即ZD1839(易瑞沙)、ZD6474、OSI774(它赛瓦(Tarceva))、CI1033、PKI1666、IMC225(爱必妥(Erbitux))、PTK787、SU6668、SU11248、群司珠单抗、TNP-470、HPMA共聚物-TNP-470和IFN-α)。
在本申请的内容中，血管生成抑制剂还包括细胞毒剂。细胞毒剂用于治疗异常和失控的渐进性细胞生长。实例包括烷化剂环磷酰胺(Bristol-Meyers Squibb)、异环磷酰胺(Bristol-Meyers Squibb)、苯丁酸氮芥(Glaxo Wellcome)和卡莫司汀(Bristol-Meyers-Squibb)；抗代谢物阿糖胞苷(Pharmacia&Upjohn)、6-巯基嘌呤(Glaxo Wellcome)、6-硫鸟嘌呤(GlaxoWellcome)和甲氨蝶呤(Immunex)；抗生素多柔比星(Pharmacia&Upjohn)、柔红霉素(NeXstar)和米托蒽醌(Immunex)；和各种试剂，例如长春新碱(Lilly)、长春碱(Lilly)和紫杉醇(Bristol-Meyers Squibb)。优选的细胞毒剂包括环磷酰胺、异环磷酰胺、阿糖胞苷、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、多柔比星、柔红霉素、米托蒽醌和长春新碱。最优选的细胞毒剂是环磷酰胺和异环磷酰胺。
所述血管生成抑制剂也可以是促血管生成生长因子的抑制剂。这些试剂用于抑制已知的促血管生成因子如VEGF或FGF的信号转导。所述试剂可通过抑制血管生成因子与其受体间的相互作用而在细胞外发挥作用或者通过抑制相应受体的蛋白激酶活性而在细胞内发挥作用。这些试剂包括例如抗VEGF抗体或抗VEGF受体抗体(US 6,416,758和WO01/72829)或者VEGF-R、FGF-R或PDGF-R的蛋白激酶域的抑制剂(WO97/34876和US 6,462,060)。
CELEBREX(西乐堡)、THALOMID(沙利度胺)和IFN-α已被公认是血管生成抑制剂(Kerbel等，Nature Reviews，第2卷，2002年10月，第727页)并包括在本发明的方法和组合物中。然而，值得注意的是，虽然这些抑制剂中的一些试剂是消炎药，但是它们与本发明的优选消炎药不同。因此，西乐堡是专一的COX2抑制剂，但不是COX1抑制剂，而沙利度胺是TNFα应答的衰减剂，本发明的优选试剂是COX1-2抑制剂，如双氯芬酸或吲哚美辛，以及NFκB抑制剂，如柳氮磺吡啶。
在一个优选的实施方案中，所述血管生成抑制剂是在美国申请第10/898,721号中描述的组合物，该申请在此以参考的方式引入。所述美国第10/898,721号的血管生成抑制剂包括细胞毒剂，优选为环磷酰胺；消炎药，优选为COX1-2抑制剂，如双氯芬酸和吲哚美辛；和氧化还原醌，优选为维生素K3(或甲萘醌或亚硫酸氢钠甲萘醌)和药用载体。也可包括苯甲酸的酯，其优选为苯甲酸苄酯。
我们已发现促进NADH+H+胞内累积的试剂(即多元醇类或多羟基化合物类)可以增强血管生成抑制剂的抗癌效果。因此，除至少一种血管生成抑制剂以外，本发明的组合物和方法还包含至少一种促进NADH+H+胞内累积的试剂。在一个优选的实施方案中，所述NADH+H+促进剂是多元醇(多羟基化合物)。在一个最优选的实施方案中，所述多羟基化合物是木糖醇。
作为另外一种选择，所述多元醇是甘露糖醇、山梨糖醇、阿糖醇和艾杜糖醇或本领域技术人员已知的任何其他多羟基化合物。
在某些实施方案中，所述组合物还包括二膦酸盐，优选为帕米膦酸盐或阿仑膦酸盐。在另一些实施方案中，所述组合还包括基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂。此处使用的短语“基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂”是指任何可以抑制哺乳动物体内天然存在的至少一种基质金属蛋白酶的至少5％水解活性的化合物。这样的化合物也称为“MMP抑制剂”。
已知大量基质金属蛋白酶抑制剂，并且所有这些抑制剂都可以用于本发明。在本发明中有用的MMP抑制剂的一些具体实例是AG-3340、RO 32-3555、RS 13-0830、金属蛋白酶的组织抑制剂(TIMP)(例如TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3或TIMP-4)、α2-巨球蛋白、四环素类(例如四环素、二甲胺四环素、多西环素)、天冬氨酸异羟肟酸(例如巴马司他、马立马司他和托卡特)、螯合剂(例如EDTA、半胱氨酸、乙酰半胱氨酸、D青霉胺和金盐)、合成MMP片段、琥珀酰巯基嘌呤、膦酰胺酯和异羟肟酸。
在另外的实施方案中，所述组合还包括NFκB抑制剂，优选为柳氮磺吡啶。在还有的另外的实施方案中，所述组合还包括胞内NADH+H+促进剂和氧化还原醌(优选为维生素K3)以及NFκB抑制剂(如柳氮磺吡啶)的分开的组合物。所述分开的组合物在不服用其他血管生成抑制剂的天数内施用。
本发明涉及抑制患有血管生成疾病或障碍(如癌症)的哺乳动物组织中的血管生成的方法。所述癌症可以包括但不局限于肺癌(例如腺癌，和包括非小细胞肺癌)、胰癌(例如胰腺癌，如外分泌胰腺癌)、结肠癌(例如结肠直肠癌，例如结肠腺癌和结肠腺瘤)、前列腺癌(包括晚期疾病)、淋巴样谱系的造血肿瘤(例如急性淋巴细胞性白血病、B细胞淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤)、髓细胞性白血病(例如急性髓细胞性白血病(AML))、甲状腺滤泡性癌(thyroid follicular cancer)、骨髓异常增生综合征(MDS)、源自间质的肿瘤(例如纤维肉瘤和横纹肌肉瘤)、黑色素瘤、畸胎癌、成神经细胞瘤、神经胶质瘤、皮肤良性肿瘤(例如角化棘皮瘤)、乳癌(例如晚期乳癌)、肾癌、卵巢癌、膀胱癌和上皮癌。
本发明的方法可涉及实体肿瘤或实体肿瘤转移灶的治疗。
在还有的另一个实施方案中，所述方法涉及视网膜组织的治疗，并且所述疾病或障碍是视网膜病、糖尿病性视网膜病或者黄斑变性。作为另外一种选择，本发明的方法涉及具有再狭窄风险的组织的治疗，其中所述组织位于冠状动脉血管成形术部位。
在本发明的另一个实施方案中，所述方法涉及抑制哺乳动物组织中的血管生成，其中所述组织是发炎的，而所述疾病或障碍是关节炎或类风湿性关节炎。作为另外一种选择，所述组织是脂肪组织且所述疾病是肥胖症。
本发明的组合疗法可以单独使用，或者与本领域技术人员已知的其他治疗方法组合使用。这些方法可包括但不局限于放射疗法或手术。
本发明的血管生成抑制剂和促进NADH+H+胞内累积的试剂可通过适用于待施用化合物的医学上可接受的任何方法施用，所述方法包括口服施用、直肠施用、局部施用、穿皮施用、滑膜腔内施用、肌肉内施用或肠胃外(包括皮下、肌内和静脉内)施用。所述药物组合或者单独的每种试剂可通过本领域已知的任何方法施用。这些方法包括口服施用、直肠施用、鼻内施用、局部(包括口腔和舌下)施用或者肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内和皮内)施用，并包括持续释放制剂。
为方便患者，优选口服施用，并且在此情况下，可加入调味剂(即薄荷醇)。然而，通常口服施用比静脉施用需要更大的剂量。因此，施用途径取决于以下情况有经验的技术人员必须确定在特定情况下哪种施用形式最恰当，其中需要平衡所需剂量与每月施用次数。
在施用所述化合物时，可以采用单独的每种化合物的正常剂量。然而，如果所述血管生成抑制剂是细胞毒剂，为了减小副作用，优选采用比单独使用细胞毒剂时更少的剂量—通常为单独用量的75％以下，更优选为50％以下，进而更优选为40％以下。优选所述促进NADH+H+胞内累积的试剂(即多羟基化合物)按每天5g～100g的剂量，最优选为每天10g～50g的剂量给药。
所述血管生成抑制剂可以以临床医师认为合适的任何方式施用，例如针对PDR中单独的细胞毒剂所描述的那些施用方式。例如，当所述细胞毒剂是环磷酰胺时，所述剂量优选为0.1mg/kg～50mg/kg，最优选为0.2mg/kg～20mg/kg。
当与其他化学治疗药物合用时，要按治疗医师认为合适的方式对患者个体进行监视。通常无需附加的药物治疗，直到例如所述患者的中性白细胞计数至少为1500个细胞/mm3。如果发生严重的中性白细胞减少症或严重的周围神经病时，或者如果使用国家癌症研究所(National CancerInstitute)的普通毒性标准(Common Toxicity Criteria)观察到2级以上水平的粘膜炎时，也可减少剂量。
在治疗应用中，根据本发明使用的试剂的剂量和施用规程因以下因素而异所述试剂，受治患者的年龄、体重和临床症状，和实施所述治疗的临床医师或行医者的经验和判断，以及影响所选剂量的其他因素。通常，所述用药量和施用规程应当足以使肿瘤生长减缓，优选为消退，还优选使癌症完全消退。在一些情况下，可以通过直接成像(例如MRI)或者通过肿瘤特异性标记的血液水平的降低来监测消退。药剂的有效量是能够提供临床医师或其他有资质的观察者可以注意到的客观的可鉴别的改善的量。患者体内肿瘤的消退通常通过参考肿瘤的直径来测量。肿瘤直径的减小表明有消退。在治疗停止后不再重新生成肿瘤也表明了完全退化。
组合试剂或单独试剂以从每天数次至每月一次的周期间隔给药。如上所述，施用所述试剂直到获得所期望的治疗结果。另外，为了避免副作用，不是所述组合的所有成分都需要在每次施用时给药。例如，所述木糖醇和甲萘醌可以每天给药，而其他血管生成抑制剂(即环磷酰胺和双氯芬酸)可以每周给药两次。
本发明的方法允许或者预防性地或者治疗性地施用血管生成抑制剂和胞内NADH+H+促进剂。
当预防性地提供时，所述化合物在出现任何症状前提供。所述化合物的预防性施用起到防止或阻止血管生成疾病或障碍，即癌症的作用。可以对具有例如癌症家族史的患者进行所述促进NADH+H+胞内累积的试剂和血管生成抑制剂的预防性施用。作为另外一种选择，可对癌症标记蛋白水平增加的患者施用本发明的化合物。这些标记包括例如增加的PSA、CEA、胸腺素β-15、胸腺素β-16、降钙素和基质金属蛋白酶(MMP)。当预防性提供时，所述血管生成抑制剂和促进NADH+H+胞内累积的试剂中的任意一种的剂量都可以适当地减少，或者二者同时适当地减少。
当治疗性地提供时，所述化合物在血管生成疾病或障碍的症状或征候开始出现时(或开始出现后)提供。因此，本发明的组合疗法可以或者在某个部位出现预期的血管生成前或者在某个部位已开始出现血管生成后进行。
本发明的方法涉及抑制具有发展为血管生成疾病或障碍风险的哺乳动物中的血管生成疾病或障碍。所述风险可以利用基因手段来确定。作为另外一种选择，所述风险也可以通过测定患者的生物学液体(即血液、尿液)中癌症标记蛋白的水平来确定。标记蛋白包括例如降钙素、PSA、CEA、胸腺素β-15、胸腺素β-16和基质金属蛋白酶(MMP)。
在相关的实施方案中，本发明预期将所述方法与其他疗法如化学疗法、放射疗法或者外科手术组合实施。在一个实施方案中，所述方法涉及抵抗实体肿瘤和控制转移灶的形成。可以在其他疗法之前、之中或之后，施用血管生成抑制量的至少一种促进NADH+H+累积的试剂和至少一种抗血管生成化合物。此外，本发明的化合物也可在进行本领域技术人员已知的其他癌症疗法的同时施用。
在本方法应用于抑制肿瘤新生血管化的情况中，所述方法也可应用于抑制肿瘤组织的生长、抑制肿瘤转移灶的形成和使已有肿瘤消退。
药物组合物在本发明的又一个实施方案中，我们提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含至少一种血管生成抑制剂、至少一种促进NADH+H+胞内累积的试剂和药用载体的组合。
在一个实施方案中，所述组合物包括一种控释装置，其中一种或多种药物以延迟的方式释放。所述制剂可以是片剂(或丸剂)的形式，该制剂在口服后在不同的时间间隔内释放不同剂量的药物。
在组合中发现的本发明药物组合物可以是固体、半固体或者液体剂型，例如悬浮液或气雾剂等。优选所述组合物以适用于按精确剂量的单次施用的单位剂量形式施用。根据所述制剂的需要，所述组合物也可以包括药用无毒的载体或稀释剂，其可定义为通常用于制备用于动物或人类施用的药物组合物的赋形剂。
组合物可以以持续释放制剂或定时释放制剂提供。所述载体或稀释剂可包含本领域已知的任何持续释放材料，如单独使用或与蜡混合使用的单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。也可采用微囊化。所述定时释放制剂可以提供立即释放和当天脉冲释放的组合。对所述稀释剂进行选择，以便不影响到所述组合的生物活性。这样的稀释剂的实例包括蒸馏水、生理盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和汉克氏溶液(Hank’s solution)。此外，所述制剂的药物组合物也可包含其他载体、佐剂、乳化剂(诸如泊咯沙姆)或无毒、非治疗性、非免疫原性的稳定剂等。这样的稀释剂或载体的有效量是就各成分的溶解度或生物活性等而言能有效地获得药用制剂的量。
本发明还包括用于抑制血管生成的试剂盒。所述试剂盒包括至少一瓶血管生成抑制剂、至少一瓶促进NADH+H+胞内累积的试剂和药用载体。最优选所述试剂盒含有描述它们的组合使用的说明书。
因此，本发明涉及至少两种试剂的抗瘤/抗血管生成组合，并涉及用于治疗血管生成疾病或障碍，即癌症、黄斑变性或肥胖症的方法。
所述组合的所有试剂可以有利地配制为优选每天施用一次的单次剂量形式。更有利的是，以液体形式提供所述口服制剂。
应当理解，上述详细说明和下述实施例只是为了描述，而不应理解为是对本发明范围的限制。对于本领域技术人员而言显而易见的是，在不背离本发明精神和范围的情况下，可以对所公开的实施方案作出许多变化和修改。此外，此处引用的所有专利、专利申请和出版物均以参考的方式在此引入。
实施例实施例1使EMT-6/CTX细胞系的耐环磷酰胺乳癌细胞解冻，在组织培养板中生长，并皮下(s.c.)注射(106个细胞/ml)到27g的CB6F1雄性小鼠的后胁腹中。
所述抗血管生成治疗(特此定义为“4×4”)包含表1细述的药物的周期性组合。比较使用木糖醇的4×4治疗(第3组)或不使用木糖醇的4×4治疗(第2组)的功效。
将小鼠分为3组，每组7只。在肿瘤接种后5天，所述4×4组和所述4×4+木糖醇组接受相应剂量的腹膜内注射(按照表1所示的用于每组的mg/Kg剂量)。所述含有甲萘醌、环磷酰胺和双氯芬酸的药剂(＝完全组合)在接种后4周内每周给药两次(星期日和星期三)，而在相同时间内，当周剩余的4天里(除周六外)给予仅含有甲萘醌的药剂。对照组在4周时间里每周6天接受仅有赋形剂1的腹膜内注射。
表1

1赋形剂在DDW中的2％泊洛沙姆、2％聚乙二醇硬脂酸酯152木糖醇-赋形剂在DDW中的2％泊洛沙姆、2％聚乙二醇硬脂酸酯15、60％木糖醇实施例2表明添加柳氮磺吡啶至Tiltan制剂中的功效的实验此处和全文使用的术语“Tiltan制剂”或“Tiltan”是在表1组3(“4×4”+木糖醇；完全组合+木糖醇)中描述的治疗方案。
下文讨论的实验显示，添加柳氮磺吡啶至Tiltan制剂中，导致鼠类体内模型中肿瘤抑制的增强。
程序在以下实验中，对用于抑制小鼠体内肿瘤生长的不同药物组合进行了体内测试。比较所述药物组合与对照组(接受仅含有非活性成分的赋形剂)和Tiltan组(接受所述Tiltan药物组合)。
接种在7～8周龄的CB6F1系小鼠(Balbc和C57b1的杂交种)的背部中心皮下注射3.5×105小鼠乳癌细胞(EMT6/CTX)。随后将小鼠标记并分组。
肿瘤测量每周测量两次肿瘤尺寸并作图。用于评估肿瘤三维尺寸的公式是长×宽×宽×0.52。宽度测量还用作肿瘤高度的标度，而0.52是归一化因子。
注射小鼠每天或者注射治疗药物或者注射赋形剂，每周6天。注射体积为0.05mL每10g体重(25g小鼠接受0.125mL)。所有注射均为腹膜内注射。
治疗组合物所述实验药物基于所述Tiltan制剂并与其方案一致。因此每周被分为两种治疗类型，即，细胞毒剂日和非细胞毒剂日。
在非细胞毒剂日，小鼠接受下述药物木糖醇-60％，和亚硫酸氢钠甲萘醌(70％纯度)-27.5mg/Kg/天。
在细胞毒剂日，下列药物添加到前述制剂中双氯芬酸钠-30mg/kg/天，环磷酰胺(CTX)-60mg/kg/天。
上述所有药物均在含有双蒸水(DDW)、2％聚乙二醇硬脂酸酯15和2％Lutrol(泊洛沙姆)F-68的赋形剂中输送。
接受柳氮磺吡啶的组除进行常规Tiltan治疗外还施用柳氮磺吡啶。每日剂量如实验方案所述，范围为150mg/Kg/天～350mg/Kg/天。
制备对于对照组以溶液终体积的98％的量加入DDW。然后加入2％Solutol(液体)和2％Lutrol，并充分搅拌溶液。
对于所有不含有柳氮磺吡啶的组由于木糖醇溶解和体积增加，以溶液终体积的60％的量加入DDW。60％木糖醇必须在预热的DDW(～60℃)中溶解并搅拌直到溶液清澈为止。量取98％的最终溶液体积，随后加入2％Solutol(液体)。然后向木糖醇溶液中加入所有其他药物并搅拌直至溶液均匀。
对于柳氮磺吡啶制备由于木糖醇溶解和体积增加，以溶液终体积的60％的量加入DDW。为提高柳氮磺吡啶的溶解度，pH必须为碱性，并因此将Na2CO3加入到DDW中至0.2M的浓度。然后检查pH为10.5。随后加入柳氮磺吡啶，pH被中和。随后将溶液加热(～60℃)并加入60％木糖醇。量取98％的最终溶液体积并随后加入2％Solutol(液体)。然后向木糖醇溶液中加入所有其他药物并搅拌直至溶液均匀。
治疗方案一旦在大多数小鼠中观察到小的肿瘤(大约在接种后第5天或第6天)就开始治疗。首次治疗为细胞毒剂治疗，并记为该周的第1天(D1)。
在每周的第1天和第4天(分别为D1和D4)进行细胞毒剂治疗。在第2、3、5和6天(分别为D2、D3、D5和D6)进行非细胞毒剂治疗。第7天不进行治疗。根据各实验组，或者在细胞毒剂日或者在非细胞毒剂日进行柳氮磺吡啶治疗。对照组每天接受赋形剂。
实验TB002和TB004分别在接种后持续33天和29天。
试验TB002所述TB002试验包括3组对照组、Tiltan组和接受柳氮磺吡啶治疗的组。对照组和Tiltan组按上述“治疗方案”的具体说明接受治疗。接受柳氮磺吡啶治疗的组在细胞毒剂日(D1和D4)按350mg/Kg/天的柳氮磺吡啶(SSZ)的剂量给药，并在非细胞毒剂日恢复常规Tiltan治疗。
试验TB004所述TB004试验包括3组对照组、Tiltan组和接受柳氮磺吡啶治疗的组。对照组和Tiltan组按上述“治疗方案”的具体说明接受治疗。接受柳氮磺吡啶治疗的组在细胞毒剂日(D1和D4)按150mg/Kg/天的柳氮磺吡啶的剂量给药，并在非细胞毒剂日(D2、D3、D5和D6)按350mg/Kg/天的剂量给药。
结果两组实验结果显示在图2和3中。对照组与Tiltan组和柳氮磺吡啶治疗组的平均肿瘤体积(mm3)作为接种后时间的函数(n＝7～8只小鼠/组；SE)。
实施例3案例研究带有肺转移灶和肝转移灶的卵巢癌患者。
患者是60岁的带有肺转移灶和肝转移灶的卵巢癌患者。
时间0患有转移性腺癌的卵巢(IV期)；TAH+BSO时间0+5个月卡铂和泰素的辅助治疗。在CA-125标记增加后(参见图4)，该患者转至TiltAn治疗(表现状态-0)。
时间0+30个月开始TiltAn治疗(第1和2周为50％的剂量；第3和4周为75％的剂量；第5周以后为完全剂量)。
下述为对完全剂量治疗的描述在以周为周期的治疗周期的第1和4天按每周两次给药

在以周为周期的治疗周期的第2、3、5、6和7天按每周5次给药

结果(具体参见图4和5)肿瘤标记治疗开始后，两种肿瘤标记CA-125和CA-15.3均降至正常水平，并维持在该范围内至第30周。
肿瘤尺寸在TiltAn治疗6周以后，骨盆、腹腔和胸腔的CT显示疾病稳定。在第12周，肝转移灶的体积减小且该减小持续至第30周。
权利要求
1.一种药物组合物，所述药物组合物包含至少一种血管生成抑制剂、至少一种促进胞内NADH+H+累积的试剂和药用载体的组合。
2.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述至少一种血管生成抑制剂选自由直接血管生成抑制剂、间接血管生成抑制剂、细胞毒剂和促血管生成生长因子抑制剂组成的组。
3.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述组合物还包含至少一种消炎药和氧化还原醌。
4.如权利要求2所述的药物组合物，其中所述直接血管生成抑制剂选自由血管生长抑素、贝伐单抗(阿瓦斯汀)、阿瑞司坦、血管能抑素、考布他汀、内皮生长抑素、NM-3、凝血酶致敏蛋白、肿瘤抑素、2-甲氧基雌二醇和维他辛组成的组。
5.如权利要求2所述的药物组合物，其中所述间接血管生成抑制剂选自由ZD1839(易瑞沙)、ZD6474、OSI774(它赛瓦)、CI1033、PKI1666、IMC225(爱必妥)、PTK787、SU6668、SU11248、群司珠单抗、TNP-470、HPMA共聚物-TNP-470和IFN-α组成的组。
6.如权利要求2所述的药物组合物，其中所述细胞毒剂选自由环磷酰胺、异环磷酰胺、阿糖胞苷、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、长春新碱、多柔比星、柔红霉素、苯丁酸氮芥、卡莫司汀、长春碱、甲氨蝶呤、米托蒽醌和紫杉醇组成的组。
7.如权利要求2所述的药物组合物，其中所述细胞毒剂是环磷酰胺或异环磷酰胺。
8.如权利要求2所述的药物组合物，其中所述促血管生成生长因子抑制剂选自由抗VEGF抗体或抗VEGF受体抗体以及VEGF-R、FGF-R或PDGF-R的蛋白激酶域的抑制剂组成的组。
9.如权利要求2所述的药物组合物，其中所述至少一种消炎药选自由甾族药物(例如地塞米松)、包括COX 1-2抑制剂在内的非甾族消炎药和NFκB抑制剂组成的组。
10.如权利要求9所述的药物组合物，其中所述NFκB抑制剂是柳氮磺吡啶。
11.如权利要求9所述的药物组合物，其中所述NFκB抑制剂选自由柳氮磺吡啶、5-氨基水杨酸盐和磺胺吡啶组成的组。
12.如权利要求3所述的药物组合物，其中所述至少一种消炎药是双氯芬酸、吲哚美辛和/或柳氮磺吡啶。
13.如权利要求3所述的药物组合物，其中所述氧化还原醌是维生素K3(甲萘醌或亚硫酸氢钠甲萘醌)。
14.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述至少一种血管生成抑制剂包含细胞毒剂、COX 1-2抑制剂(双氯芬酸或吲哚美辛)、氧化还原醌(维生素K3、甲萘醌或亚硫酸氢钠甲萘醌)和药用载体。
15.如权利要求12所述的药物组合物，其中所述至少一种血管生成抑制剂还包含NFκB抑制剂(柳氮磺吡啶)。
16.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述促进NADH+H+胞内累积的试剂是多元醇。
17.如权利要求16所述的药物组合物，其中所述多元醇是木糖醇。
18.如权利要求16所述的药物组合物，其中所述多元醇选自由木糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、阿糖醇和艾杜糖醇组成的组。
19.如权利要求1所述的药物组合物，该药物组合物还包含MMP抑制剂。
20.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述至少一种血管生成抑制剂、多元醇和所述药用载体被配制成水性悬浮液或溶液。
21.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述组合物被配制用于口服施用。
22.如权利要求21所述的药物组合物，其中所述组合物的至少一种成分以干燥形式提供并在口服施用前再生。
23.如权利要求21所述的药物组合物，其中所述组合物进一步含有调味剂。
24.如权利要求23所述的药物组合物，其中所述调味剂是薄荷醇和/或茴香脑。
25.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述至少一种血管生成抑制剂、多元醇和所述药用载体在不连续的天数内施用，而在其它天数内仅施用多元醇、氧化还原醌和所述药用载体。
26.如权利要求25所述的药物组合物，其中所述至少一种血管生成抑制剂、多元醇和所述药用载体每周施用两次，而在该周的其他时间每天施用所述多元醇、氧化还原醌和所述药用载体。
27.一种抑制患有血管生成疾病或障碍或者具有发展为血管生成疾病或障碍风险的哺乳动物的组织中的血管生成的方法，所述方法包括向组织施用血管生成抑制量的至少一种血管生成抑制剂、至少一种促进NADH+H+胞内累积的试剂和药用载体。
28.如权利要求27所述的方法，该方法进一步包括施用MMP抑制剂。
29.如权利要求27所述的方法，其中所述血管生成疾病或障碍是癌症。
30.如权利要求27所述的方法，其中所述癌症选自由肺癌(例如腺癌，和包括非小细胞肺癌)、胰癌(例如胰腺癌，例如外分泌胰腺癌)、结肠癌(例如结肠直肠癌，例如结肠腺癌和结肠腺瘤)、包括晚期疾病在内的前列腺癌、淋巴样谱系的造血肿瘤(例如急性淋巴细胞性白血病、B细胞淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤)、髓细胞性白血病(例如急性髓细胞性白血病(AML))、甲状腺滤泡性癌、骨髓异常增生综合征(MDS)、源自间质的肿瘤(例如纤维肉瘤、横纹肌肉瘤)、黑色素瘤、畸胎癌、成神经细胞瘤、神经胶质瘤、皮肤良性肿瘤(例如角化棘皮瘤)、乳癌(例如晚期乳癌)、肾癌、卵巢癌、膀胱癌和上皮癌组成的组。
31.如权利要求27所述的方法，其中所述血管生成疾病或障碍是黄斑变性、肥胖症、视网膜病、糖尿病性视网膜病、关节炎、类风湿性关节炎、牛皮癣和再狭窄。
32.如权利要求27所述的方法，其中所述组合物被配制成水性悬浮液或溶液。
33.如权利要求27所述的方法，其中所述施用包括静脉内施用、穿皮施用、滑膜腔内施用、肌肉内施用或口服施用。
34.如权利要求27所述的方法，其中所述哺乳动物选自由人类、猫、狗或马组成的组。
35.如权利要求27所述的方法，其中所述施用是在以周为周期的治疗周期的第1和4天按每周两次进行，并且其中施用25ml～100ml的30％～60％木糖醇的水溶液，该水溶液含有约200mg～600mg环磷酰胺、约100mg～300mg双氯芬酸和约100mg～500mg维生素K3。
36.如权利要求27所述的方法，其中所述施用是在以周为周期的治疗周期的第1和4天按每周两次进行，并且其中施用25ml～100ml的30％～60％木糖醇的水溶液，该水溶液含有约200mg～600mg环磷酰胺、约100mg～300mg双氯芬酸、约100mg～500mg维生素K3和约500mg～3,000mg的柳氮磺吡啶。
37.如权利要求27所述的方法，其中所述施用是在以周为周期的治疗周期的第2、3、5、6和7天按每周5次进行，并且其中施用25ml～100ml的30％～60％木糖醇的水溶液，该水溶液含有约100mg～500mg的维生素K3。
38.如权利要求27所述的方法，其中所述施用是在以周为周期的治疗周期的第2、3、5、6和7天按每周5次进行，并且其中施用25ml～100ml的30％～60％木糖醇的水溶液，该水溶液含有约100mg～500mg的维生素K3和约200mg～1,000mg的柳氮磺吡啶。
39.一种用于治疗或预防血管生成疾病或障碍的试剂盒，所述试剂盒包括分开的小瓶，所述小瓶包含血管生成抑制剂、促进NADH+H+胞内累积的试剂以及氧化还原醌、药用载体和施用每种成分用的说明书。
40.如权利要求9所述的药物组合物，其中所述COX-2抑制剂是双氯芬酸或吲哚美辛。
全文摘要
本发明涉及用于加强抗血管生成疗法的方法和组合物。具体地说，本发明涉及一项令人惊奇的发现，即，促进NADH+H
文档编号A61K47/00GK101068561SQ200580034291
公开日2007年11月7日 申请日期2005年10月5日 优先权日2004年10月6日
发明者什姆埃尔·A·本-萨松 申请人:蒂尔坦制药有限公司