专利名称：除去异常蛋白质用组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及除去异常蛋白质用组合物及预防伴随异常蛋白质积累引起的疾病的组合物。
背景技术：
异常蛋白质随着年龄的增加而增加，已证明其与身体内积累的蛋白质的分解异常引起的疾病或障碍(阿尔查默病、帕金森病、路易体痴呆、三碱基重复病、肌萎缩性侧索硬化症、白内障、动脉硬化、糖尿病肾病症、皮肤光老化、皮肤皱褶等)等很多疾病相关(非专利文献BIO Clinica，11卷、第5号、1996年)。此外，即使年轻，因过度紧张、紫外线等而使身体内慢慢产生大量活性氧时，会加速异常蛋白质的积累。现在，因蛋白质分解异常引起的疾病的预防及治疗已成为大的课题。以往，有关抑制异常蛋白质在身体内积累方面，已经对抑制蛋白质氧化修饰进行了研究。即尝试将身体抑制机制不能应对程度的由氧化应激反应生成的活性氧，通过摄取抗氧化物质而消除，从而抑制蛋白质氧化。代表性的抗氧化物质是维生素E类、类胡萝卜素类及多种植物中含有的类黄酮类。
但是，虽然抗氧化物质的摄取有助于消除身体内产生的活性氧，但是对已经积累的异常蛋白质的除去不起任何作用。因此，为了预防和治疗与伴随年龄增加而在身体内积累的异常蛋白质相关的各种疾病，必须除去异常蛋白质。
一方面，本发明者着眼于大豆皂苷的作用机理并对其继续研究，已提出其具有除去异常蛋白质功能(专利文献1日本特开2002-179592号公报、专利文献2日本特开2004-115438号公报)、预防或改善紫外线损伤功能(专利文献3日本特开2004-131431号公报)等。
另一方面，本发明者对除去异常蛋白质的成分进行研究，结果发现除大豆皂苷以外，羽衣甘蓝(Kale)(专利文献4日本特开2004-91398号公报)也具有该功能。
以预防和治疗与异常蛋白质相关的伴随年龄增加而引起的各种疾病为目的，已经证明如果使用上述大豆皂苷，作为通常的摄取量负担量增多。所以对使用少量就具有高效的成分进行开发研究。
专利文献1日本特开2002-179592号公报专利文献2日本特开2004-115438号公报专利文献3日本特开2004-131431号公报专利文献4日本特开2004-91398号公报发明内容本发明的目的是，着眼于大豆皂苷，特定并提供高效的除去异常蛋白质用组合物，并且提供有助于因蛋白质分解异常引起的疾病的预防及治疗等的组合物、制剂、食品。
本发明者为了达到上述目的，使用大豆皂苷的分离物研究除去异常蛋白质的成分。其结果在高纯度B类大豆皂苷中发现了所期望的效果，完成了本发明。
本发明的主要构成如下所示。
(1)除去异常蛋白质用组合物，其特征在于，以B类大豆皂苷为主要成分。
(2)如上述(1)所述的除去异常蛋白质用组合物，其特征在于，B类大豆皂苷为在100重量份大豆提取物中含有40～100重量份B类大豆皂苷的大豆提取物。
(3)如上述(1)或(2)所述的除去异常蛋白质用组合物，其中，B类大豆皂苷为SoyasaponinI、II、III、IV、V或这些物质的乙酰体，A类大豆皂苷为SoyasaponinA1、A2、A3、A4、A5、A6、Ac、Ad或这些物质的乙酰体、或这些物质的混合物。
(4)如上述(1)～(3)中任一项所述的除去异常蛋白质用组合物，其特征在于，含有从胶原、明胶、胶原水解物、明胶水解物中选择的任何一种以上及/或水飞蓟素。
(5)紫外线损伤预防·改善剂用组合物，其含有上述(1)～(4)中任一项所述的除去异常蛋白质用组合物。
(6)抗老化食品，其含有上述(1)～(4)中任一项所述的除去异常蛋白质用组合物或上述(5)所述的紫外线损伤预防·改善剂用组合物。
(7)抑制皮肤灰暗或抑制皱纹或保湿用食品，其含有上述(1)～(4)中任一项所述的除去异常蛋白质用组合物或上述(5)所述的紫外线损伤预防·改善剂用组合物。
(8)抗老化化妆料，其含有上述(1)～(4)中任一项所述的除去异常蛋白质用组合物或上述(5)所述的紫外线损伤预防·改善剂用组合物。
(9)抑制皮肤灰暗或抑制皱纹或保湿用化妆料，其含有上述(1)～(4)中任一项所述的除去异常蛋白质用组合物或上述(5)所述的紫外线损伤预防·改善剂用组合物。
(10)抗老化饲料或动物药，其含有上述(1)～(4)中任一项所述的除去异常蛋白质用组合物或上述(5)所述的紫外线损伤预防·改善剂用组合物。
(11)抑制皮肤灰暗或抑制皱纹或保湿用饲料或动物药，其含有上述(1)～(4)中任一项所述的除去异常蛋白质用组合物或上述(5)所述的紫外线损伤预防·改善剂用组合物。
(12)宠物动物用抗老化化妆料，其含有上述(1)～(4)中任一项所述的除去异常蛋白质用组合物或上述(5)所述的紫外线损伤预防·改善剂用组合物。
(13)宠物动物用抑制皮肤灰暗或抑制皱纹或保湿用化妆料，其含有上述(1)～(4)中任一项所述的除去异常蛋白质用组合物或上述(5)所述的紫外线损伤预防·改善剂用组合物。
通过提供高纯度B类大豆皂苷作为除去异常蛋白质用的有效成分，与以往的大豆皂苷相比，可得到更好的效果，可将没有负担的基准量设定为通常的摄取量。
使用本发明的除去异常蛋白质用组合物，能够除去积累的异常蛋白质。因此，本发明的制剂，在蛋白质分解异常引起的疾病或障碍(阿尔查默病、帕金森病、路易体痴呆、三碱基重复病、肌萎缩性侧索硬化症、白内障、动脉硬化、糖尿病肾病症、皮肤光老化、皮肤皱褶等)等蛋白质分解异常引起的疾病的预防或治疗方面有效。并且，也可将其作为抗老化用的化妆料、食品应用。
具体来说，可期待其具有抗老化效果、抑制皮肤灰暗效果、抑制皱纹效果、保湿效果、紫外线损伤预防·改善作用。
作为具体的利用形式，能够在医药、食品、化妆料、饲料等中利用。
图1表示UV照射试验中皂苷给药量和皮肤水分量的关系。
图2表示UV照射试验中皂苷给药量和皮肤弹性的关系。
图3表示UV照射试验中皂苷给药量和皮肤羰基化蛋白质的关系。
图4表示负荷百草枯(paraquat)时皂苷给药量和皮肤羰基化蛋白质的关系。
图5表示负荷百草枯(paraquat)时皂苷给药量和肝脏羰基化蛋白质的关系。
图6表示负荷百草枯(paraquat)时皂苷给药量和红血球羰基化蛋白质的关系。
具体实施例方式
以下，对本发明进行详细说明。
在本发明中，异常蛋白质一般是指伴随年龄增加而被氧化、糖化、或醛修饰的蛋白质。
来自大豆的皂苷，广泛分布于大豆种子中的种皮、子叶、胚轴或大豆植物体的叶、茎、根等中，其结构上虽然类似甘草甜素的结构，但在三萜类骨架中具有2～5个糖组成的糖链。根据糖苷配基(aglycone)(非糖类)的结构大豆皂苷可分为4类(A、B、E、及DDMP类)，各类皂苷均具有多种多样的糖链结构，到目前为止，已鉴定出分别以Soyasapogenol A、B、E、DDMP作为各类糖苷配基的8种A类、2种E类、5种B类、6种DDMP类(非专利文献Agric Biol Chem，55315-322(1991)(非专利文献AgricBiol Chem，55911-917(1991)(非专利文献Agric Biol Chem，57546-550(1993))。
A类皂苷是在Soyasapogenol A的C-3和C-22位这两处结合糖链的双糖链皂苷，仅分布于大豆的种子胚轴中，是产生不愉快味道(苦味、收敛味)的主要原因。有关A类皂苷现在有2种命名，Soyasaponin A1和Soyasaponin Ab是同一种化合物，同样A2为Af、A3为Ah、A4为Aa、A5为Ae、A6为Ag。对于Ac及Ad的别名还不清楚(非专利文献BBB62(12)2291-2299，1998)。
B类皂苷和E类皂苷是仅在C-3位结合1个糖链的单糖链皂苷。DDMP类皂苷在温和条件下提取后能够精制(非专利文献Agric Biol Chem，57546-550(1993))，但在加热条件下及碱性条件下转化为B类皂苷。因此，大豆中存在的皂苷几乎都是A类皂苷和DDMP类皂苷，B类皂苷只有少量，推测B类皂苷大多在提取时由DDMP类皂苷生成的Artifact成分。B类皂苷大量存在于大豆胚轴、子叶中，有关B类皂苷现在有2种命名，Soyasaponin I和Soyasaponin Bb是同一种化合物，同样II为Bc、III为Bb’、IV为Bc’、V为Ba(非专利文献BBB 62(12)2291-2299，1998)。
以往，不清楚大豆皂苷的吸收动态，但推测Soyasaponin I在人体肠道内不会被直接吸收，而被肠内细菌分解为糖苷配基Soyasapogenol B，并且呈浓度依赖性吸收，这表明其他B类皂苷也作为糖苷配基型被吸收(非专利文献J Nutr134 1687-1873(2004))。因此，将B类皂苷作为食品摄取时，可推测不论其组成如何(糖苷、糖苷配基或/及其衍生物等)，同样作为糖苷配基型被吸收。
一般来说，皂苷多具有溶血性，但有报告指出大豆皂苷几乎没有溶血性(非专利文献基础和临床(日语原文基礎と臨床)Vol.15No.5 1981)。此外，本发明者对从大豆中得到的大豆皂苷类在家兔2％血液悬浮液中的溶血指数进行测定，结果其与人参皂苷相同，为100以下，证明其没有溶血性，与其他报告一致。
本发明者为了分析B类大豆皂苷的安全性，对变异原性及急性毒性进行试验，结果均无异常，证明其安全性高。
本发明的高含量B类大豆皂苷，可以通过下述工序制得。
原料大豆胚轴可以使用事先用有机溶剂等脱脂后的大豆胚轴，也可以使用未脱脂的大豆胚轴，但从皂苷的提取效率来看，优选使用脱脂后的大豆胚轴。从原料大豆胚轴中提取皂苷的方法，一般的方法是在室温到80℃下，在原料中加入其5～10倍容量的提取溶剂进行搅拌，但只要是能够充分提取皂苷的条件，没有特别限定。
本发明中的离子交换树脂，只要是含有3级胺的弱碱性阴离子交换树脂，没有特别限定，可利用粒径不均匀的树脂例如三菱化成制DIAIONWA-30等，但优选在平均粒径±10％的范围内具有90％以上的粒度分布的均匀粒径的离子交换树脂。
从上述皂苷提取液中通过蒸馏操作馏去溶剂，将用水稀释的皂苷溶液吸附于上述离子交换树脂，然后用水、醇、含水醇洗涤树脂，然后再使用酸或碱洗脱出吸附于树脂上的皂苷。将洗脱的皂苷溶液直接干燥得到的大豆皂苷粗精制物的纯度低为20～50重量％，皂苷以外的杂质多，生理活性高的B类大豆皂苷的比率仅低为20～30重量％程度。
为了提高皂苷的纯度，将洗脱的皂苷直接用水稀释，使皂苷吸附于无极性的合成吸附剂上。作为无极性的合成吸附剂，有苯乙烯·二苯乙烯型树脂等，可以使用如三菱化学制的DIAION HP-20、Rohm and Haas公司制的Amberlite XAD-2等。使其吸附于合成吸附剂上时使用的含水醇的醇浓度因醇的种类不同而不同，如果是甲醇优选为0～50重量％，乙醇则优选为0～30重量％。接着，用水或含水乙醇洗涤树脂后，使用比洗涤时的醇浓度高的含水醇进行洗脱，能够得到高纯度皂苷溶液。
根据需要使用pH调节剂将得到的高纯度皂苷溶液调节pH后，采用加热干燥、减压加热干燥、喷雾干燥、冷冻干燥等方法进行干燥，能够得到高纯度大豆皂苷粉末。
通过上述工序能够高效、廉价地得到纯度为70重量％以上的高纯度大豆皂苷，并且能够将活性高的B类大豆皂苷浓缩为50重量％以上的浓度，此外，能够将总皂苷中的B类大豆皂苷的比率提高为70重量％以上。
使用树脂进行精制的顺序为，使用阴离子交换树脂进行处理后，使用无极性合成吸附剂进行精制。先用合成吸附剂处理时，低极性物质等被合成吸附剂牢固吸附，即使进行碱处理等通常的树脂再生处理，也会引起树脂劣化，树脂能力逐渐降低，与此相比，通过先用阴离子交换树脂对大豆皂苷进行粗精制，能够除去大豆异黄酮、寡糖，还可以除去低极性物质，使接下来的无极性合成吸附剂的处理能力提高，难于发生劣化。此时，阴离子交换树脂通过碱处理可以重复使用多次。
调制的富含B类大豆皂苷的组合物，其具有良好的除去异常蛋白质作用、紫外线损伤预防·改善作用、抗老化作用、抑制皮肤灰暗作用、抑制皱纹作用及保湿作用的效果，并可得到确认。
利用这种作用效果的形式为，医药、食品、饮料、营养辅助食品、食品添加剂、化妆料、饲料、饲料添加剂、动物药等。均可供与经口给药或非经口给药。
高纯度B类大豆皂苷本身可用于各种用途，并且根据目的可以预先与各种其他成分混合，或添加到食品、饲料或动物药中。
作为食品，可直接或添加各种营养成分使用。例如可以在添加淀粉、乳糖、麦芽糖、植物油脂粉末、可可脂粉末、硬脂酸等适当助剂后，使用常用方法，使其成型为适合食用的形式如颗粒状、粒状、片剂、胶囊、糊状等，作为健康辅助食品、保健功能性食品等供与食用；或也可以添加在各种食品如火腿、香肠等肉食加工食品，鱼糕、圆筒状鱼糕等水产加工食品，面包、点心、黄油、奶粉、发酵乳制品中使用；也可以添加在水、果汁、牛奶、清凉饮料等饮料中使用。所述的制剂、食品，能够利用通常采用的制剂化技术制造。
作为化妆料，直接或添加在小麦胚芽油或橄榄油等中作为化妆料成分使用，可使用这些物质制造化妆料。
作为医药的适用方法，可采用经口给药或非经口给药的任何方式。给药时，可以将有效成分和适合经口给药、直肠内给药、注射等给药方法的固体或液体医药用无毒性载体混合，以常用的医药制剂形式给药。
非经口适用的组合物，可适用于如水溶液、油剂、乳液、悬浮液等液体制剂，凝胶、乳膏等半固体制剂，粉末、颗粒、胶囊、微胶囊、固体等固体制剂的形式。采用以往公知的方法制成上述形式，能够制成洗剂、乳剂、凝胶剂、乳膏剂、软膏、硬膏、巴布剂、气雾剂、栓剂、注射剂、粉末剂等各种剂型。通过涂抹、粘贴、喷雾等可将这些制剂适用于身体上。特别是这些剂型中，洗剂、乳剂、乳膏剂、软膏剂、硬膏剂、巴布剂、气雾剂等适用于皮肤外用剂。作为化妆料，可以为化妆水、乳液、乳膏、面膜等皮肤化妆料，化妆底液、化妆乳膏、乳液状或乳膏或软膏型粉底、口红、眼影、胭脂等化妆用化妆料，护手霜、护腿霜、护体液等身体用化妆料等。
预先形成与增量剂混合的组合物的状态能够方便使用。作为增量剂，能够使用葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖等糖类，山梨糖醇等糖醇，糊精、环糊精等加工淀粉、小麦淀粉、玉米淀粉等淀粉类，酪蛋白、大豆蛋白质等蛋白质，阿拉伯胶、海藻酸钠、酪蛋白钠、明胶、果胶、粉末纤维素、羧甲基纤维素等高分子稳定剂，卵磷脂、蔗糖脂肪酸酯、丙二醇脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯等乳化剂、钙粉末等。
本发明的除去异常蛋白质用组合物，除含有上述高纯度B类大豆皂苷外，还可含有具有抗氧化作用的化合物。具有抗氧化作用的化合物没有特别限定，例如可以为各种维生素类、水飞蓟素等各种多酚类、生育三烯酚、辅酶素Q10及含有这些物质的天然成分等。
本发明的除去异常蛋白质用组合物，除含有上述高纯度B类大豆皂苷外，还可含有具有身体胶原合成促进剂的化合物。具有身体胶原合成促进作用的化合物，没有特别限定，例如可以为胶原及明胶的分解物、包含N末端含有甘氨酸的三肽的肽混合物等。
胶原可使用从牛、猪、鱼等动物的皮肤、骨及腱等结缔组织中提取的物质，或使胶原进行热变性后的明胶等所有胶原。作为胶原及/或明胶的分解物，优选使用含有分子量为400以下的分解物的多肽，更优选含有高含量平均分子量在200～300附近的分解物的多肽。含有分子量为400以下的分解物的多肽、更优选的含有高含量的平均分子量在200～300附近的物质的多肽，因为氨基酸的分子量为100左右，所以相当于含有高含量三肽的多肽。分子量为400以下的胶原及/或明胶的分解物可以精制，也可不精制。例如也可以为其他胶原及/或明胶的分解物等的混合物。
因此，胶原及/或明胶的分解物，通过含有作为特定有效成分的分子量约为400以下的肽，通过其水解处理，能够有助于提高身体内的胶原合成促进活性。
水飞蓟素(Silymarin；CAS No.65666-07-1)是从菊科水飞蓟(别名大蓟、大翅蓟、奶蓟草；CAS No.84604-20-6)中提取的黄酮木脂素的总称，已确认的主要成分有水飞蓟宾(Silybin；CAS No.22888-70-6)、水飞蓟宁Silydianin；CAS No.29782-68-1)、水飞蓟亭(Silychristin；CASNo.33889-69-9)、异水飞蓟宾(Isosilybin；CAS No.72581-71-6)等(天然药物事典(日文原文天然薬物事典)奥田拓男编)。水飞蓟素自古以来在欧洲一直用以预防和治疗肝脏疾病而被使用。此外，其作为抗氧化剂广为人知。作为对皮肤有用的组合物，已知有治疗干癣及特应性皮炎的制剂(专利文献日本特开平5-286864号公报)；含有作为活性成分的黄酮木脂素和磷脂质的复合物，对红斑、烧伤、皮肤或粘膜的营养障碍状态、皮炎等的治疗，防止皮肤老化及放射线、风、太阳等外部环境的刺激的保护方面有用的组合物(专利文献专利第2948818号)；透过表皮屏障强化剂(专利文献日本特开2000-169328)；皮脂分泌抑制剂(专利文献日本特开2000-169332)等。水飞蓟素通常是从水飞蓟的果实中进行醇提取，利用喷雾干燥得到的干燥粉末提取物作为原料销售。本发明使用的水飞蓟素可直接使用市售的水飞蓟素。此外，可以使用从水飞蓟中分离、精制水飞蓟宾、水飞蓟宁、水飞蓟亭、异水飞蓟宾等水飞蓟素的构成成分得到的化合物。
本发明的除去异常蛋白质用组合物，可以用于抗老化、抗紫外线损伤。并且，同时含有具有除去异常蛋白质作用的化合物和具有抗氧化作用的化合物或具有身体胶原合成促进作用的化合物的组合物，能够提供具有抗老化作用、具有抑制异常蛋白质积累及除去异常蛋白质功能的抗老化用组合物。
具有除去异常蛋白质作用的化合物，可作为化妆料使用，其化妆料具有抗老化、抗皮肤灰暗、抗皱纹、保湿的用途。本发明的组合物，能够经口给药、或将没有溶血性的组合物作为注射剂给药等非经口给药。经口给药时，能够以健康食品、美容食品等食品形式给药。
本发明的组合物，能够适用于如水溶液、油剂、乳液、悬浮液等液体制剂，凝胶、乳膏等半固体制剂，散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂等固体制剂的形式。采用以往公知方法制备成所述形式，能够得到各种剂型。洗剂、乳剂、乳膏剂、软膏剂、硬膏剂、巴布剂、气雾剂等适用于皮肤外用剂。
本发明的化妆料中，可含有植物油类的油脂类、高级脂肪酸、高级醇、聚硅氧烷、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂、非离子表面活性剂、防腐剂、糖类、金属离子鳌合剂、水溶性高分子类的高分子、增粘剂、粉体成分、紫外线吸收剂、紫外线遮断剂、透明质酸类的保湿剂、香料、pH调节剂等。并且也能够含有维生素类、皮肤赋活剂、血流循环促进剂、常在菌控制剂、活性氧除去剂、抗炎症剂、抗癌剂、美白剂、杀菌剂等其他药效成分、生理活性成分。
化妆料可以为，化妆水、乳液、乳膏、面膜等皮肤化妆料，化妆底液、化妆乳膏、乳液状或乳膏状或软膏型粉底，护手霜、护腿霜、护体液等身体用化妆料等，入浴剂、头发化妆料。通常按照化妆料使用的制剂化方法，能够制造所述剂型。可以为口红、眼影、胭脂等粉饰类化妆料。
本发明的除去异常蛋白质用组合物，含有作为主要有效成分的高纯度B类大豆皂苷，除此之外，根据需要能够含有药学许可的稀释剂或载体等添加剂。此外根据需要，本发明的组合物能够含有具有药学活性的其他药效成分。
现在，普遍认为积累的异常蛋白质与阿尔查默病、帕金森病、路易体痴呆、三碱基重复病、肌萎缩性侧索硬化症、白内障、动脉硬化、糖尿病肾病症、皮肤光老化、皮肤灰暗或皮肤皱纹等疾病相关。因此认为，通过摄取本发明的除去异常蛋白质用组合物，可以预防或治疗上述疾病(非专利文献The FASEBJournal、9卷、1173-1182页、1995年)。
本发明的组合物，可应用于预防老化及防止老化用化妆料或健康食品、抗衰老化妆料或美容食品、预防皮肤氧化及防止皮肤氧化的化妆料或健康食品。本发明的除去异常蛋白质用组合物，对于哺乳动物具有良好的作用，且安全性高。
本发明的组合物，对将要暴露于紫外线或已暴露于紫外线的身体组织、特别是皮肤，可用于能够预防或改善紫外线引起的损伤的紫外线预防或改善用组合物。其对因紫外线暴露产生的活性氧产生的细胞内变性蛋白质(异常蛋白质)进行高效分解，抑制紫外线暴露引起的细胞损伤。
此外，根据用途、剂型能够添加下述物质。
作为油脂类，例如可以为山茶油、月见草油、澳洲坚果油、橄榄油、菜籽油、玉米油、芝麻油、霍霍巴油、胚芽油、小麦胚芽油、辛酸甘油三酯等液体油脂，可可脂、椰子油、硬化椰子油、棕榈油、棕榈核油、树蜡、树蜡核油、硬化油、硬化蓖麻油等固体油脂，蜂蜡、小烛树蜡、棉蜡、糠蜡、羊毛脂、醋酸羊毛脂、液体羊毛脂、甘蔗蜡等蜡类。
作为烃类，例如可以为流体石蜡、角鲨烯(Squalene)、角鲨烷(Squalan)、Microcrystallenn wax等。
作为高级脂肪酸，例如可以为月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(EPA)。
作为高级醇，例如可以为月桂醇、硬脂醇、鲸蜡醇、十六烷醇～十八烷醇混合物等直链醇，单硬脂酰甘油醚、羊毛脂醇、胆固醇、植物甾醇、辛基十二烷醇等支链醇等。
作为聚硅氧烷，例如可以为链状聚硅氧烷的二甲基聚硅氧烷、甲基苯基聚硅氧烷等，环状聚硅氧烷的十甲基环戊硅氧烷等。
作为阴离子表面活性剂，例如可以为月桂酸钠等脂肪酸盐、月桂基硫酸钠等高级烷基硫酸酯盐、POE月桂基硫酸三乙醇胺等烷基醚硫酸酯盐、N-酰替肌氨酸、硫基琥珀酸盐、N-酰基氨基酸盐等。
作为阳离子表面活性剂，例如可以为硬脂基三甲基氯化铵等烷基三甲基铵盐、氯化亚苄基毒芹、氯化苄基铵等。
作为两性表面活性剂，例如可以为烷基甜菜碱、胺基甜菜碱等甜菜碱类表面活性剂等。
作为非离子表面活性剂，例如可以为山梨糖醇苷单油酸酯等山梨糖醇苷脂肪酸酯类、硬化蓖麻油衍生物。
作为防腐剂，例如可以为对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯乙酸乙酯等。作为金属离子鳌合剂，例如可以为乙二胺四乙酸二钠、EDTA酸、EDTA酸钠盐等EDTA酸盐。
作为高分子，例如可以为阿拉伯胶、黄蓍胶、半乳聚糖、瓜尔胶(Guargum)、卡拉胶(Carrageenan)、果胶、琼脂、榅桲种子(Cydonia oblonga)、葡聚糖、支链淀粉、羧甲基淀粉、胶原、酪蛋白、明胶、甲基纤维素、甲基羟基丙基纤维素、羟基乙基纤维素、羧甲基纤维素钠(CMC)、海藻酸钠、羧基乙烯聚合物(CARBOPOL)等乙烯类高分子等。
作为增粘剂，例如可以为卡拉胶、黄蓍胶、榅桲种子、酪蛋白、糊精、明胶、CMC、羟基乙基纤维素、羟基丙基纤维素、羧基乙烯聚合物、瓜尔胶、苍耳烷胶、膨润土等。
作为粉末成分，例如可以为滑石、高岭土、云母、硅石、沸石、聚乙烯粉末、聚苯乙烯粉末、纤维素粉末、无机白色颜料、无机红色类颜料、氧化钛云母粉、氧化钛滑石粉、着色氧化钛云母粉等珍珠颜料、红色201号、红色202号等有机颜料等。
作为紫外线吸收剂，例如可以为对氨基安息香酸、水杨酸苯酯、对甲氧肉桂酸异丙酯、对甲氧基肉桂酸辛酯、2，4-二羟基二苯甲酮等。
作为紫外线遮断剂，例如可以为氧化钛、滑石、胭脂红、膨润土、高岭土、氧化锌等。
作为保湿剂，例如可以为聚乙二醇、丙二醇、二丙二醇、1，3-丁二醇、1，2-戊二醇、甘油、二甘油、聚甘油、木糖醇、麦芽糖醇、麦芽糖、山梨醇、葡萄糖、果糖、软骨素硫酸钠、透明质酸钠、乳酸钠、吡咯烷酮羧酸、环糊精等。
作为药效成分，例如可以为维生素A油、视黄醇等维生素A类，核黄素等维生素B2类，吡多辛盐酸盐等B6类，L-抗坏血酸、L-抗坏血酸磷酸酯、L-抗坏血酸单棕榈酸酯、L-抗坏血酸二棕榈酸酯、L-抗坏血酸-2-葡糖苷等维生素C类，泛酸钙等泛酸类，维生素D2、胆骨化醇等维生素D类，α-生育酚、乙酸生育酚、烟酸DL-α-生育酚等维生素E类等。
可以为胎盘提取物、谷胱肝肽、虎耳草提取物等美白剂，蜂王浆、山毛榉提取物等皮肤赋活剂，辣椒素、姜辣素、斑蝥粉、鱼石脂、咖啡因、单宁酸、γ-谷维素等血液循环促进剂，甘草酸衍生物、甘草次酸(Glycyrrhetinic acid)衍生物、庚五烯等消炎剂，精氨酸、丝氨酸、白氨酸、色氨酸等氨基酸类，常在菌抑制剂的麦芽糖蔗糖聚合物、氯化溶菌酶等。
进而可以为母菊提取物、荷兰芹提取物、山毛榉提取物、葡萄酒酵母提取物、葡萄柚提取物、金银花提取物、大米提取物、葡萄提取物、忽布提取物、米糠提取物、枇把提取物、黄檗提取物、薏苡仁提取物、当药提取物、草木樨(Melilotus officinalis Lam)提取物、白桦提取物、甘草提取物、芍药提取物、皂草提取物、丝瓜提取物、辣椒提取物、柠檬提取物、龙胆(Gentiaha)提取物、紫苏提取物、芦荟提取物、迷迭香提取物、鼠尾草提取物、麝香草(thyme)提取物、茶提取物、海藻提取物、黄瓜提取物、丁香(clove)提取物、人参提取物、Marronnier提取物、金缕梅(Hamamelis)提取物、山桑提取物等各种提取物。
以下，根据实施例对本发明进行更详细地说明，但本发明并不限于这些实施例等。
实施例1使无毛小白鼠在70天内经口摄取大豆皂苷，照射UVA及UVB，对高纯度B类大豆皂苷的有用性进行探讨。
导入时使用6周龄的无毛小白鼠(HosHR-1♂)，在以下条件下进行试验。
1)试验对象物的制备及给药无毛小白鼠的分组是在给药开始日，根据体重将一般状态良好的动物分成每组5只，各组间没有差别。并且，各个体在1笼/组的条件下饲养。将粗大豆皂苷(A类大豆皂苷14.9％、B类大豆皂苷25.8％)悬浮于蒸馏水中，使单位体重的总皂苷量为50mg/kg((a)粗原料为123mg/kg)，将B类大豆皂苷(A类大豆皂苷9.5％、B类大豆皂苷69.4％)悬浮于蒸馏水中，使单位体重的B类皂苷量为50mg/kg((b)B类皂苷原料为72mg/kg)，分别每日1次、10周时间使用胃管强制经口给药使其摄取。实施UV照射日是在照射2小时后进行给药。饲养条件如表1所示。
2)皮肤水分量的测定测定水分量时使用水分测定仪，对背部的从尾根部朝向头部2cm、从腰椎向右侧0.5cm的部位测定3次并求其平均值。测定日定为试验开始日、中间观察日及解剖日。
3)皮肤弹性的测定使用皮肤弹性测定装置(非专利文献Cutometer SEM 575/ElectronicGmbh co.制)，对背部的从尾根部朝向头部2cm、从腰椎向右侧0.5cm的部位测定3次并求其平均值。测定日定为解剖日。
4)氧化蛋白质的测定氧化蛋白质即羰基化蛋白质，使用与因氧化障碍生成的蛋白质的羰基特异性结合的2，4-二硝基苯基肼(DNPH)，将羰基化蛋白质标记后，使用与DNPH特异性结合的抗DNPH抗体检测。具体方法如下所示，将UV照射部位的皮肤剪下1cm2，加入1ml的0.1M三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH7.5)进行均质，10000rpm×15分钟离心分离，将其上清液过滤后进行分析。蛋白质的二硝基苯基肼(DNPH)化采用公知的方法(非专利文献Nakamura，此外，Journal of Biochemistry、119卷、768～774页、1996年)。利用SDS-PAGE分离DNPH化的蛋白质，使用蛋白质转录装置转录到Polyvinylidene difluoride(PVDF)膜上。将转录后的膜置于含有5％脱脂乳的PBS(-)溶液中封闭2小时以上，洗涤后使其与抗DNPH抗体反应2小时，洗涤后再使其与生物素化抗兔IgG反应1小时，洗涤后使用荧光检测试剂盒(ECL PLUS)使PVDF膜感光，使用医疗用自动显像装置转录图象。使用密度计进行图象分析。
5)UV照射UV照射时，将动物移到专用PC笼中，每组分别照射UVB20mj/cm2及UVA14j/cm2，在每周的周一、周三及周五这3日循环照射，照射10周时间。
6)解剖使每组从本饲养期间结束后的第二天开始绝食18小时，然后通过在腹腔内给药戊巴比妥(40mg/kg)导入麻醉，实施解剖。有报告指出使用该照射量、照射期间可形成与人体光老化同样的皮肤皱纹(非专利文献Jof Dermatologicaln Science 27519-525(2001))。
7)统计处理试验结果用平均值±标准误差表示，通过Excel统计Student’s-ttest检测显著误差。
1.一般状态观察对于从第4周左右开始UV照射的动物，与UV非照射动物相比，发现其头部皮肤的轻度褐色化、颈部皱纹的深度及后肢背部的皱纹明显。
在解剖时的外观观察中，确认UV照射动物的面部、颈部及后肢背部皱纹明显。但UV照射中，摄取粗大豆皂苷及B类大豆皂苷的动物的该症状为轻度，特别是摄取B类大豆皂苷的动物的皱纹深度浅，肉眼观察到的皱纹颜色淡。此外，摄取B类大豆皂苷的动物，与CONTROL相比较其皮肤有湿润感，特别是UV+摄取B类大豆皂苷的动物，其症状感觉明显。
2.体重变化对于体重变化，各组没有发现大的差异。
3.摄食量对于摄食量，与体重变化一样，没有发现大的差异。
4.肝脏重量对于肝脏重量，也没有发现大的差异，没有观察到异常症状。此外，其他脏器也没有发现异常。
5.皮肤水分量可以推测，皮肤水分量的数值越大，皮肤中的水分越高即保湿能力越强。一般认为通过UV照射皮肤的水分量会降低，在本试验中，中间观察日、解剖日的水分量与对照组相比，UV照射组的降低。在皮肤水分量的测定中，在中间观察日，与UV照射组相比，2组UV照射+摄取大豆皂苷的动物都显示高值。在解剖日的测定中，与UV照射组相比，UV照射+粗大豆皂苷组显示低值，但UV照射+B类大豆皂苷组的平均值显示高值，是与对照组相同程度的值。结果如图1所示。
6.皮肤弹性皮肤弹性，可以推测其数值越大皮肤的弹性越高。一般认为通过UV照射皮肤的弹性会降低。其结果如图2所示。在UV非照射组中，B类大豆皂苷给药组和粗大豆皂苷组相比，其弹性显著提高。
7.氧化蛋白质的量其结果如图3所示，氧化蛋白质的量作为羰基化蛋白质的量被检测。羰基化蛋白质，其数值越低表示其在脏器内的积累量越少。图3表明，通过UV照射氧化蛋白质的量与非照射相比显著增加，但UV照射的同时给药B类大豆皂苷的组则显著减少，表明高纯度B类大豆皂苷具有除去氧化蛋白质的效果。
特别是，粗大豆皂苷组与UV照射组为相同程度，而B类大豆皂苷组却明显减少，表明发挥了B类大豆皂苷的作用。
由以上结果可以确认，与普通的粗大豆皂苷、对照组相比，高纯度B类大豆皂苷对于因紫外线照射引起的皮肤应激反应可抑制水分量减少，并且是具有预防皮肤干燥、皱纹等生成效果的物质。此外，与粗大豆皂苷、对照组相比，高纯度B类大豆皂苷可使氧化蛋白质的量显著减少，表明高纯度B类大豆皂苷的除去氧化蛋白质效果的有效性。
并且证明，通过给药高纯度B类皂苷，皮肤的弹性提高。用高纯度B类大豆皂苷50mg/kg对小白鼠给药，使用体表面积换算公式y=(3x)2]]>换算成在人体内的给药量，相当于约450mg/日/60kg体重，是能够作为食品并不难于摄取的量。
实施例2[试验高纯度B类大豆皂苷对负荷百草枯应激反应大白鼠的效果]导入时使用6周龄的大白鼠(Wistar/Cri♂)，在以下条件下进行试验。
1)试验对象物的制备及给药Wistar系大白鼠的分组是在开始给药日，根据体重将一般状态良好的动物分成每组5只，各组间没有差别。此外，各个体单独饲养。粗大豆皂苷(A类大豆皂苷14.9％，B类大豆皂苷25.8％)作为混合食物给食，混合于东方酵母公司制的MF饲料中，以单位体重的总皂苷摄取量为15mg/kg进行给食。B类大豆皂苷(A类大豆皂苷9.5％，B类大豆皂苷69.4％)也作为混合给食，混合于东方酵母公司制的MF饲料中，以单位体重的B类大豆皂苷的摄取量为15mg/kg进行给食。百草枯，将使1000mg百草枯溶解于500ml生理食盐水中的注射溶液，以单位体重10mg/kg的Dose每周1次，2个月腹腔内注射给药。饲养条件如表2所示。
2)解剖各组从本饲养期间结束的第二天开始绝食18小时，然后通过在腹腔内给药戊巴比妥(40mg/kg)导入麻醉，实施解剖。
3)统计处理试验结果如图4～6所示。
1.一般状态观察百草枯是引起急性中毒的强效农药，给药后动物个体立即出现体温降低、失去活力及软便化。但是，百草枯+大豆皂苷给药组的该症状轻，给药后第二天恢复到对照组水平的状态。其中，百草枯+摄取B类大豆皂苷的动物的该症状为轻度，给药期间的后半期也同样。
2.体重变化对于体重变化，各组没有发现大的差异。
3.摄食量对于摄食量，与体重变化一样，没有发现大的差异。
4.氧化蛋白质的量的测定(皮肤/红血球/肝脏)在抽取的各样品(皮肤1cm2/血液100μl/肝脏100mg)中加入1ml的0.1M三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH7.5)进行均质，10000rpm×15分钟离心分离，将其上清液过滤后进行分析。蛋白质的二硝基苯基肼(DNPH)化采用公知的方法(非专利文献Nakamura，此外，Journal ofBiochemistry、119卷、768～774页、1996年)。利用SDS-PAGE分离DNPH化的蛋白质，使用蛋白质转录装置转录到Polyvinylidenedifluoride(PVDF)膜上。将转录后的膜置于含有5％脱脂乳的PBS(-)溶液中封闭2小时以上，洗涤后使其与抗DNPH抗体反应2小时，洗涤后，再使其与生物素化抗兔IgG反应1小时，洗涤后使用荧光检测试剂盒(ECLPLUS)使PVDF膜感光，使用医疗用自动显像装置转录图象。使用密度计进行图象分析。
其结果如图4～6所示，氧化蛋白质的量作为羰基化蛋白质的量被检测。图4～6表明，给药百草枯后氧化蛋白质的量显著增加，百草枯+高纯度B类大豆皂苷给药组的增加得到显著抑制，与粗大豆皂苷组相比其效果良好。由此表明高纯度B类大豆皂苷具有除去氧化蛋白质效果。
由以上结果可知，与通常的粗大豆皂苷、对照组相比，高纯度大豆皂苷B可使给药百草枯后产生的皮肤、肝脏、红血球中的氧化蛋白质的量显著减少，表明高纯度大豆皂苷B的除去氧化蛋白质效果的有效性。将高纯度B类大豆皂苷15mg/kg给药大白鼠，使用体表面积换算公式y=(3x)2]]>换算成在人体内的给药量，相当于约134mg/日/60kg体重，是能够作为食品并不难于摄取的量。
处方例1[胶囊剂]组成大豆皂苷(含有50％大豆皂苷B) 50mg生育三烯酚 30mg蜂蜡 10mg葡萄籽油 110mg将上述成分混合，填充到混合有明胶和甘油的胶囊基质中，得到软胶囊。
处方例2[片剂]组成大豆皂苷(含有50％大豆皂苷B) 25mg水飞蓟(含有65％水飞蓟素) 20mg胶原水解物 50mg纤维素 40mg淀粉 20mg蔗糖脂肪酸酯 2mg将上述成分混合、压片，得到片剂。
处方例3[果汁]
处方例4[乳膏]
将上述成分(1)～(11)加热到80℃溶解成为油相，将成分(12)～(14)加热到70℃溶解成为水相。在油相中慢慢加入水相进行乳化，边搅拌边冷却到40℃，进而搅拌冷却到30℃，得到乳膏。
权利要求
1.除去异常蛋白质用组合物，其特征在于，以B类大豆皂苷为主要成分。
2.如权利要求1所述的除去异常蛋白质用组合物，其特征在于，B类大豆皂苷为在100重量份大豆提取物中含有40～100重量份B类大豆皂苷的大豆提取物。
3.如权利要求1或2所述的除去异常蛋白质用组合物，其中，B类大豆皂苷为Soyasaponin I、II、III、IV、V或这些物质的乙酰体，A类大豆皂苷为SoyasaponinA1、A2、A3、A4、A5、A6、Ac、Ad或这些物质的乙酰体、或这些物质的混合物。
4.如权利要求1～3中任一项所述的除去异常蛋白质用组合物，其特征在于，含有从胶原、明胶、胶原水解物、明胶水解物中选择的任何一种以上及/或水飞蓟素。
5.紫外线损伤预防·改善剂用组合物，其含有权利要求1～4中任一项所述的除去异常蛋白质用组合物。
6.抗老化食品，其含有权利要求1～4中任一项所述的除去异常蛋白质用组合物或权利要求5所述的紫外线损伤预防·改善剂用组合物。
7.抑制皮肤灰暗或抑制皱纹或保湿用食品，其含有权利要求1～4中任一项所述的除去异常蛋白质用组合物或权利要求5所述的紫外线损伤预防·改善剂用组合物。
8.抗老化化妆料，其含有权利要求1～4中任一项所述的除去异常蛋白质用组合物或权利要求5所述的紫外线损伤预防·改善剂用组合物。
9.抑制皮肤灰暗或抑制皱纹或保湿用化妆料，其含有权利要求1～4中任一项所述的除去异常蛋白质用组合物或权利要求5所述的紫外线损伤预防·改善剂用组合物。
10.抗老化饲料或动物药，其含有权利要求1～4中任一项所述的除去异常蛋白质用组合物或权利要求5所述的紫外线损伤预防·改善剂用组合物。
11.抑制皮肤灰暗或抑制皱纹或保湿用饲料或动物药，其含有权利要求1～4中任一项所述的除去异常蛋白质用组合物或权利要求5所述的紫外线损伤预防·改善剂用组合物。
12.宠物动物用抗老化化妆料，其含有权利要求1～4中任一项所述的除去异常蛋白质用组合物或权利要求5所述的紫外线损伤预防·改善剂用组合物。
13.宠物动物用的抑制皮肤灰暗或抑制皱纹或保湿用化妆料，其含有权利要求1～4中任一项所述的除去异常蛋白质用组合物或权利要求5所述的紫外线损伤预防·改善剂用组合物。
全文摘要
除去异常蛋白质用组合物，其用于提供高效的除去异常蛋白质用组合物、或提供有助于因蛋白质分解异常引起的疾病的预防及治疗等的组合物、制剂、食品，其中以B类大豆皂苷为主要成分。
文档编号A61K36/00GK101048166SQ20058003654
公开日2007年10月3日 申请日期2005年10月25日 优先权日2004年10月28日
发明者小野衣里日, 宫田智 申请人:株式会社芳珂