专利名称：胭脂红酸色料的制备方法
技术领域：
本发明涉及胭脂红酸色料、新型胭脂红酸色料组合物的制备方法，以及它们在食物如酸奶、水果制品、饮料、其它各种需要稳定红色的食物产品以及化妆品中的应用。
背景技术：
胭脂红酸是一种着色剂，可以从雌性胭脂虫(Dactylopius coccuscosta)(又名“Coccus cacti L.”)体内提取。这种昆虫以胭脂仙人掌(Nopalea coccinellifera)、梨果仙人掌(Opuntia fidus indica)以及其它的仙人掌类植物为生。这些仙人掌一般种植在如墨西哥和中美南美洲的沙漠地区。依据pH值的不同，这种着色剂的颜色范围可从桔黄到红色再到紫色，通常称之为洋红或洋红色。胭脂红着色剂被广泛用在食物和饮料中。
从胭脂虫干体中通过水或酒精进行萃取可得到胭脂红酸。在从昆虫体内通过水萃取术萃取胭脂红酸的过程中，昆虫体内的蛋白质也被萃取出来，并存在于萃取的色料提取物中。昆虫的蛋白质含量通常低于0.5％。通过水萃取术得到的洋红主要包括胭脂红酸以及一些胭脂虫蛋白和昆虫体内其它少量的可萃取物质。下文中的萃取物是指胭脂红萃取溶液。
据报道胭脂虫蛋白会引发一些与过敏相关的问题。为解决该过敏性问题，在US2002/0058016；EP1318178(SAN-EI GEN(日本))中描述了一种方法，其通过将胭脂红萃取溶液进行酶蛋白质水解，随后去除分子量超过6,000的胭脂虫的昆虫蛋白。
文献中还描述了多种其它的非蛋白质水解的标准方法来制备不含胭脂虫昆虫蛋白的纯胭脂红酸产品。这些方法通常使用适当的吸附处理、离子交换处理、酸处理和/或膜处理。商用的胭脂红酸产品基本不含胭脂虫昆虫蛋白，这些产品包括Chr.Hansen，A/S(Denmark)公司的Cochineal粉末以及由如Pronex(Peru)或Sensient公司提供的类似的商业产品。
这里的胭脂红酸色料是指一种主要含有胭脂红酸，并或多或少的与铝和钙有结合的着色组合物。其被称为胭脂红酸钙-铝色料。该色料是将胭脂红酸与铝和/或钙在水性条件下进行反应得到。调节反应条件使得铝/钙-胭脂红酸色料配合物易于沉淀。该配合物被称之为胭脂红。
在US2002/0058016(SAN-EI GEN(Japan))的实施例2中描述了基于实施例1制得的纯胭脂红酸溶液而制备成胭脂红酸钙-铝色料。在实施例2的 部分还解释到“当胭脂红酸铝色料或钙色料(胭脂红)形成聚合物时，在有低分子量的蛋白质存在下，更容易获得红色强度增加的纯色料。因此，通过添加相对低分子量的蛋白质可制得具有较高的红色强度以及市场价值的洋红色(胭脂红)，其中相对低分子量的蛋白质不会成为上述不含过敏原溶液的过敏原”。除了在此所提出的推测外，这些文献中并没有提供其他关于添加低分子量蛋白质到胭脂红酸色料中的可能性的相关细节。
发明内容
本发明的目的就是提供改良的胭脂红酸色料，其不含有潜在过敏原的胭脂虫蛋白。
用于制备理想色料的溶液要求具有几个重要的参数。这些重要参数是本发明的发明者们从基本不含胭脂虫昆虫蛋白的纯胭脂红酸产品开始制备中确认的。下面将对这些参数进行详细的描述，并且还包括对添加非胭脂虫蛋白以及胭脂红酸百分比的详细描述。
因此，本发明中关于制备胭脂红酸色料的第一方面包括如下步骤(i)用含有铝和钙化合物处理水溶液，该水溶液包括(a)0.5到15％(g/l)的胭脂红酸，以及(b)从0.75到15％(g/l)的非胭脂虫昆虫蛋白，其中基本上所有的非胭脂虫昆虫蛋白的分子量(MW)低于10,000Da，其中，水溶液基本不含有分子量(MW)超过6,000Da的胭脂虫昆虫蛋白；(ii)调节合适的反应条件以制备钙-铝胭脂红酸色料，其中色料包括(a)从40到80％的胭脂红酸(干重)以及(b)从10到30％的非胭脂虫昆虫蛋白(干重)，其中基本上所有的非胭脂虫昆虫蛋白的分子量(MW)低于10,000Da，并且其中色料基本不含有分子量(MW)超过6,000Da的胭脂虫昆虫蛋白。
商用胭脂红萃取溶液通常含有约0.6％胭脂红酸以及相对低的胭脂虫昆虫蛋白，通常约为0.1到0.25％蛋白质。在文献中认为这种蛋白质含量足以制备色料。然而，与上述文献不同，本发明的发明者们认为可含有比此更高的蛋白质的量来获得改良的色料。使用明显较高的蛋白质的量的好处，如步骤(i)所示，可提高胭脂红酸的产率。在与步骤(i)中的水溶液中的胭脂红酸的初始量相比下，该产率还与步骤(ii)中色料中的胭脂红酸的量相关。进一步的描述可参见这里的实施例，此处获得的产率高达98.2％。
截止本发明的申请日，本发明的发明者们还未发现先前的研究(例如商用色料产品)所描述的胭脂红酸色料具有本发明的胭脂红酸含量和非昆虫蛋白含量。
因此，本发明的第二个方面是关于从此处所描述的第一个方面以及其具体实施方式
的处理过程中可获得的胭脂红酸钙-铝色料，其中色料包括(a)从40到80％的胭脂红酸(干重)，以及(b)从10到30％非胭脂虫昆虫蛋白(干重)，其中基本上所有的非胭脂虫昆虫蛋白的分子量(MW)低于10,000Da，其中色料基本不含有分子量(MW)超过6,000Da的胭脂虫昆虫蛋白；这里，“可获得的”表述的是其常用的意思，即指色料可通过在此描述的具体的步骤获得，但在理论上可通过不同的方法获得。优选地，第二个方面的色料可通过对此处所描述的第一个方面以及其具体实施方式
的处理过程来获得。
本发明的第三个方面是关于对此处所描述的第二个方面以及其具体实施方式
所得到的胭脂红酸铝色料、胭脂红酸钙色料或胭脂红酸钙-铝色料的使用，这些实施方式用于制造添加到食物产品、甜料、糖果、饮料、医药品或化妆品中的有色组合物。
第三个方面也可描述为使用此处所描述的第二个方面以及其具体实施方式
所制得的胭脂红酸铝色料、胭脂红酸钙色料或胭脂红酸钙-铝色料的有色组合物对食物产品、甜料、糖果、饮料、医药品或化妆品进行着色的方法。
本发明的详细说明胭脂红酸色料的制备过程用于制造步骤(i)中水溶液的胭脂红酸优选来自于纯的胭脂红酸组合物。“纯的胭脂红酸组合物”在此处表示高纯度的胭脂红萃取溶液。其优选含有90到99％的胭脂红酸(干重)以及优选基本上不含胭脂虫昆虫蛋白。
术语“基本上不含胭脂虫昆虫蛋白”在这里表示通过SDS-PAGE分析检测不到昆虫蛋白的存在。在实施例1中给出了合适的SDS-PAGE分析方法。
纯的胭脂红酸组合物可通过一系列常规方法制得，如通常采用适当的吸附处理、离子交换处理、酸处理和/或膜处理。商用的纯胭脂红酸组合物包括Chr.Hansen，A/S(Denmark)公司的水溶性Cochineal粉末或来自于如Pronex(Peru)或Sensient公司的类似的商业产品。纯的胭脂红酸组合物可通过US2002/0058016中所描述的蛋白质水解方法来获得。
在步骤(i)中用于制备水溶液的非胭脂虫昆虫蛋白优选为来自于蛋白质组合物，该组合物的来源必须为食品工业和/或制药所允许。例如，该蛋白质优选为不是来自于例如是已知有毒于如人类的蛇的蛋白质组合物。此外，优选该蛋白质的来源不会引起过敏或只会引起可接受的过敏性问题。
用于制备步骤(i)中水溶液的“非胭脂虫昆虫蛋白”术语在这里全部表示多肽、氨基酸、蛋白质或它们的混合物。
合适的蛋白质组合物的实施例是基于植物蛋白质如大豆蛋白和土豆蛋白。
优选地，蛋白质为奶蛋白如牛奶蛋白。优选地，奶蛋白来自于奶的水解物例如乳清水解物。合适的商业乳清水解物可从商业的牛奶公司获得。当胭脂红酸的颜色被用于奶的食物产品时这一点尤其突出。
优选地，基本所有的非胭脂虫昆虫蛋白具有的分子量(MW)低于6,000Da，更优选低于4,000Da，进一步优选低于3,000Da。
在这里所描述的步骤中隐含的意思是当步骤(i)中的蛋白质具有一定的分子量时，则在步骤(ii)中得到的色料也具有相应的蛋白质MW组成。例如，步骤(i)中所有的蛋白质基本上具有的分子量(MW)低于6,000Da，那么步骤(ii)色料中的所有的蛋白质基本上具有的分子量(MW)也低于6,000Da。
术语“基本上所有的蛋白质具有的分子量(MW)低于[某个数]Da”在这里表示比标明的分子量更大的MW通过SDS-PAGE分析不会被检测到。在实施例1中给出了合适的SDS-PAGE分析方法。
水溶液优选通过将适当的蛋白质组合物(如粉末状)添加到纯胭脂红酸溶液中制得或简单地将如纯胭脂红酸(如粉末状)添加到含有适当的蛋白质组合物的溶液中制得。换句话讲，就是将适当的蛋白质组合物与适当的纯胭脂红酸组合物进行混合。
在第一个方面的步骤(i)的水溶液中，胭脂红酸/非胭脂虫昆虫蛋白(g/l)的比例优选小于1。本发明的发明者们已证实如果比例大于1，溶液容易形成凝胶。可参见这里的实施例1中的表。
胭脂红酸/非胭脂虫昆虫蛋白(g/l)的比例优选从0.4到0.9，更优选从0.5到0.8，并且最优选从0.5到0.7。
在蛋白质被添加到水溶液之前，溶液的pH值优选调节到5到7，更优选约pH 6。
水介质优选为水，更优选为蒸馏水。
优选地，水溶液基本不含胭脂虫昆虫蛋白。
优选地，水溶液含有从1到10％的胭脂红酸以及从1.5到10％的非胭脂虫昆虫蛋白，更优选水溶液含有从2到7％的胭脂红酸以及从3到8％的非胭脂虫昆虫蛋白，进一步优选水溶液含有从3到5％的胭脂红酸以及从4到6％的非胭脂虫昆虫蛋白，在适当的条件下使用铝和钙的化合物对胭脂红酸/蛋白质水溶液进行处理从而得到胭脂红酸色料。本领域技术人员通常知道制备色料的合适的条件。然而，本发明的发明者们对此进行了详细的分析并且得到下述的优选条件。
使用铝和钙的化合物对水溶液进行处理可在不同的条件下进行。例如，可将铝和钙添加到仅含有蛋白质的溶液中，然后向溶液中添加胭脂红酸。
然而，优选在第一步先制备含有胭脂红酸和蛋白质的溶液，然后将铝和钙的化合物添加到溶液中。
虽不受理论上的限制，但仍然认为在理想的配方中，将铝和钙添加到已含有胭脂红酸和蛋白质水溶液中的步骤是相当重要的。
实际上这不同于US2002/0058016的实施例2所给出的建议，在该实施例2中建议先制备胭脂红酸铝溶液，然后向其中添加低MW的蛋白质。
优选先添加铝，然后等待一段适当的时间再添加钙到水溶液中。该适当的时间约为30秒到1小时，优选为从1分钟到15分钟。
出人意料的是，本发明的发明者们证实如果先将钙添加到胭脂红酸/蛋白质溶液中，就会在最终的色料中可能得到并不希望得到的“黑点”。黑点被认为是胭脂红酸钙。但如果将铝先添加到胭脂红酸/蛋白质溶液中，得到的“黑点”就会少很多。更详细的信息可参见这里的实施例2。
优选地，使用1g铝/1溶液～20g铝/1溶液以及1g钙/1溶液～20g钙/1溶液对水溶液进行处理。本领域技术人员知道如何优化二者的关系从而得到所需要的颜色。
合适的铝化合物为硫酸铝。优选的铝化合物为AlK(SO4)2*12H2O。合适的钙化合物为碳酸钙或氯化钙。优选的钙化合物为(CH3COO)2Ca*H2O。
在使用铝和/或钙化合物对胭脂红酸/蛋白质水溶液进行处理时，为了制得胭脂红酸色料，优选调节pH从3～7。优选地，调节pH值为4～6，更加优选调节pH值为4.5～5.5。
pH值的调节可以在胭脂红酸/蛋白质与盐混合后进行。然而，优选在加入盐之前调节好pH值。
使用铝和钙的化合物对胭脂红酸/蛋白质水溶液进行处理时，优选使用下面的条件来制备胭脂红酸色料时间15分钟～2小时，更加优选为30分钟～60分钟。
温度从80℃～99℃，更加优选为从92℃～97℃。
步骤(ii)中制得的最终组合物胭脂红酸色料与步骤(i)中的初始组合物水溶液相关联。在上面已给出优选的水溶液中胭脂红酸/蛋白质的含量。相应的优选步骤(ii)中制得的胭脂红酸色料组合物中色料含有55到75％的胭脂红酸(干重)以及15到25％的蛋白质(干重)，更加优选色料中含有62到72％的胭脂红酸(干重)以及18到22％的蛋白质(干重)。
当然，在色料中的胭脂红酸和蛋白质的量不能超过100％。实际上，总数约通常在90％，这是由于色料中含有其它的材料，如用于制备色料所用的盐。相应地，如果色料含有75％的胭脂红酸(干重)，那么通常不会有超过15％的蛋白质(干重)。
确定胭脂红酸含量的优选方法为FAO/WHO所描述的已知的标准方法JECFA委员会在1995年的的第44次会议上的文档以及Food ChemicalCodex，第二版(FCCII)。在Commission Directive 94/45/EC from July1995，Official journal of the European Communities No.L 226，p.9中，描述了适当稀释后的着色产品E-120在494nm具有最大值。
确定蛋白质含量的优选方法为已知的凯氏(Kjeldahl)法和/或氨基酸分析法。
在得到步骤(ii)中的胭脂红酸色料后，通常还进行一系列后处理。这些步骤包括对胭脂红酸色料进行过滤和/或对胭脂红酸色料进行干燥以得到干燥的胭脂红酸色料的步骤。这些步骤对于熟练的人员来讲是常规步骤并且可参考上述给出的参考书。
胭脂红酸色料在不同产品中的应用为了使用如这里所进行的描述的胭脂红酸色料，需要将其转为合适的有色组合物。此处的有色组合物应该从广义上去进行理解。根据最后的需要，其可为未处理的胭脂红酸色料或者是经过滤和/或干燥后的色料。另一种可选择的方法就是将色料转变为合适的胭脂红酸溶液或水溶性胭脂红(粉末)。
然而，其也可以为添加了食物卫生或医药上可接受的合适的载体或添加剂的有色组合物。载体或添加剂的选择取决于最终的使用，如在食物或医药中，本领域技术人员通常选择添加适当的载体或添加剂。更多的信息，可参考US2002/0058016。
如上所述，有色组合物还可添加到食物产品、甜料、糖果、饮料、医药品或化妆品中。
此处的食物产品是指食物和饲料产品。优选为食物产品。优选的食物产品包括日常的产品如酸奶或肉类。
有色组合物更进一步的特征就是色彩的强度。胭脂红酸的颜色可以为红色，并且为了在最终的如食物产品中得到足够的色彩，可以使用不同强度的如红色制得有色组合物。
如这里的描述，对胭脂红酸色料进行一系列的加工从而得到所要求的色彩强度的有色组合物。
可通过食物产品中使用的微胶囊技术对有色组合物进行胶囊化，如WO97/26803(Chr.Hansen A/S)中所述，通过阿拉伯树胶进行的胶囊化。
实施例材料及其分析方法纯的胭脂红酸从纯化的胭脂红萃取物(胭脂虫)中得到的商用胭脂红酸。
最少约90％的胭脂红酸。
蛋白质组合物商用乳清水解蛋白可用于婴儿乳粉的蛋白源，其可减少过敏原的含量。基本上所有的蛋白质的分子量(MW)都低于6,000Da。
ELISA分析使用在乳清蛋白浓缩液中培养的多克隆抗体进行单一位点免疫化验ELISA的抗原测试。
μg蛋白eqv./g蛋白最大85铝盐AlK(SO4)2*12H2O钙盐(CH3COO)2Ca*H2O乙酸CH3COOH氢氧化钠NaOH-粒SDS-PAGE分析溶剂Tris缓冲液pH 8(20g Tris/1,000ml软化水，用浓盐酸调节pH)将胭脂红色料添加到缓冲溶液中，从而使得所有的的样品含有相量的胭脂红酸/ml，对应到1.5g/l的46.56％胭脂红酸(C.A.)的色料。
使用Marker 12或Sea Blue作为蛋白质大小的指示剂(MW)。
1M DL-二硫苏糖醇(DTT)在130μl Milli-Q水(MQW)中含20mg DTT溶液添加到凝胶中的量Mark 12 5μl，Sea Blue 7μl，胭脂红样品10μl使用考马斯蓝和/或银色对NUPAGE Novex高性能预制凝胶4-12％BIS-TRIS进行染色实施例1胭脂红酸色料的制备该实施例揭示了使用胭脂红酸和乳清水解物制备Al-Ca胭脂红色料。
将21g胭脂红酸溶于500ml的水中并且在将33g的肽溶解于胭脂红溶液中。调节pH值到5并将温度升高到85-95℃。然后将8g的AlK(SO4)2*12H2O溶解在50ml的水中并加入到溶液中，并且将8.2g的(CH3COO)2Ca*H2O溶解在50ml的水中并加入到溶液中。45分钟后，溶液中70-98％的胭脂红酸被转变为胭脂红色料并从溶液中沉淀。将胭脂红色料从溶液中进行分离、干燥并进行分析。
得到的胭脂红色料含有65-75％的胭脂红酸以及18-22％的蛋白质。对色料进行SDS-PAGE分析，没有检测到分子量大于3,000Da的蛋白质。
得到的胭脂红色料具有鲜红色阴影并可用作基于胭脂昆虫蛋白的胭脂红色料，其可用于制作胭脂红溶液以及水溶性的胭脂红粉末。
结论在实施例1的表中显示的结果表明如下(1)当水溶液含有3％到5％的胭脂红酸以及4％到7％的乳清水解蛋白时可得到理想的胭脂红酸产率；(2)当蛋白质的量在这里所述的范围内增加时，产率增加；(3)胭脂红酸/加入的蛋白质的比率应小于1，从而避免产生凝胶以及避免导致不可能的处理。此外，优选的比率0.5～0.8并且最优选的比率约为0.6。
实施例2该实施例揭示了使用胭脂红酸和乳清水解物制备Al-Ca胭脂红色料。
将21g胭脂红酸溶于500ml的水中并且在将33g的肽溶解于胭脂红溶液中。调节pH值到5并将温度升高到85-95℃。然后将8g的(CH3COO)2Ca*H2O溶解在50ml的水中并加入到溶液中，并且将8.2g的AlK(SO4)2*12H2O溶解在50ml的水中并加入到溶液中。45分钟后，溶液中70-98％的胭脂红酸被转变为胭脂红色料并从溶液中沉淀。将胭脂红色料从溶液中进行分离、干燥并进行分析。
在色料中确定存在可视的黑点。这些黑点最有可能为胭脂红酸钙，其没有发生从胭脂红酸钙到铝-钙胭脂红色料的转变过程。
可以认为，通过首先添加AlK(SO4)2*12H2O溶液，铝和肽附着到胭脂红酸从而使得钙在形成铝-钙胭脂红色料之前很难/不可能形成胭脂红酸钙。
结论在实施例2中的结果表明为了产生较少的“黑点”，首先添加铝，等待一段时间后再加入钙是重要的。
权利要求
1.制备胭脂红酸色料的方法，包括如下步骤(i)用含有铝和钙的化合物处理水溶液，该水溶液包括(a)0.5到15％(g/l)的胭脂红酸，以及(b)从0.75到15％(g/l)的非胭脂虫昆虫蛋白，其中基本上所有的非胭脂虫昆虫蛋白的分子量(MW)低于10,000Da，其中水溶液基本不含有分子量(MW)超过6,000Da的胭脂虫昆虫蛋白；(ii)调节反应条件以达到合适的反应条件制备钙-铝胭脂红酸色料，其中色料包括(b)从40到80％的胭脂红酸(干重)以及(b)从10到30％的非胭脂虫昆虫蛋白(干重)，其中基本上所有的非胭脂虫昆虫蛋白的分子量(MW)低于10,000Da，并且其中色料基本不含有分子量(MW)超过6,000Da的胭脂虫昆虫蛋白。
2.权利要求1的方法，其中，水溶液通过将适当的蛋白质组合物与适当的纯的胭脂红酸组合物混合后制得。
3.权利要求2的方法，其中，蛋白质组合物为奶制水解物，特别为乳清水解物。
4.前述权利要求的任意一项的方法，其中，基本上所有的蛋白质具有低于6,000Da的分子量(MW)，更优选为低于4,000Da，进一步优选为低于3,000Da。
5.前述权利要求的任意一项的方法，其中，水溶液含有2到7％的胭脂红酸以及3到8％的蛋白质，更优选为水溶液含有3到5％的胭脂红酸以及4到6％的蛋白质，并且，其中步骤(ii)中制得的胭脂红酸色料含有55到75％的胭脂红酸(干重)以及15到25％的蛋白质(干重)，更加优选色料中含有62到72％的胭脂红酸(干重)以及18到22％的蛋白质(干重)。
6.前述权利要求的任意一项的方法，其中，在权利要求1的步骤(i)的水溶液中，胭脂红酸/非胭脂虫昆虫蛋白(g/l)的比例应当小于1，更优选从0.5到0.8，并且最优选从0.5到0.7。
7.权利要求6的方法，其中，在步骤(i)中，首先加入铝，然后经过适当的时间后，再将钙加入到水溶液中，所述适当的时间从2分钟到3天。
8.前述权利要求的任意一项的方法，其中，在使用铝和/或钙化合物对胭脂红酸/蛋白质水溶液进行处理时，为了制得胭脂红酸色料，将pH值调节到2～8，优选调节pH到3～7，更加优选调节pH值到4～6。
9.通过权利要求1～8中的任意一项的方法制得的胭脂红酸铝色料、胭脂红酸钙色料或胭脂红酸钙-铝色料，其中，色料含有40到80％胭脂红酸(干重)以及10到30％的蛋白(干重)，并且其中色料基本上不含胭脂虫昆虫蛋白，并且在色料中基本上所有的蛋白质的分子量(MW)都低于10,000Da。
10.权利要求9中的胭脂红酸铝色料、胭脂红酸钙色料或胭脂红酸钙-铝色料在制备有色组合物并添加到食物产品、甜料、糖果、饮料、医药品或化妆品中的应用。
全文摘要
胭脂红酸色料、新型胭脂红酸色料组合物的制备方法，以及它们在食物如酸奶、水果制品、饮料、其它各种需要稳定红色的食物产品以及化妆品中的应用。
文档编号A61K8/98GK101061185SQ200580039446
公开日2007年10月24日 申请日期2005年11月24日 优先权日2004年11月25日
发明者朱莉·浮士德·施米特-雅各布森, 里科·赛克斯绰普·弗兰德森 申请人:科·汉森有限公司