嗜酸乳杆菌核酸及其用途的制作方法

专利名称：嗜酸乳杆菌核酸及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及多核苷酸和由它们编码的多肽，以及使用所述多肽和表达它们的微生物的方法。
背景技术：
嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)是革兰氏阳性、杆状、非芽孢、同型发酵细菌，其为胃肠道和泌尿生殖道的正常栖居菌。自从其最初由Moro(1900)从婴儿粪便分离后，该“嗜酸”生物体已经在人、哺乳婴儿和消费高乳-、乳糖-或糊精食物的人的肠道中发现。历史上，嗜酸乳杆菌是最常认为是肠益生菌的乳杆菌，所述的肠益生菌能引起对胃肠道的微生物菌群有益的作用(Klaenliammer和Russell(2000)″Species of the Lactobacillus acidophilusComplex，″in Encyclopedia of Food Microbiology，Volume 2，ed.Robinson等，(Academic Press，San Diego，California)，pp.1151-1157)。
嗜酸乳杆菌可以发酵己糖(包括乳糖和更复杂的寡糖)(Kaplan和Hutkins(2000)Appl.Environ.Microbiol.662682-2684)来产生乳酸并降低该生物体生长环境的pH。酸化的环境(例如食物、阴道和胃肠道内的区域)可以干扰不受欢迎的细菌、病原体和酵母的生长。该生物体以其酸耐受性、在培养的乳制品中存活和在穿越胃和胃肠道过程中的生存力而众所周知。乳杆菌和其它共生细菌，其中一些认为是“有益生命”的益生菌，已经广泛地研究了它们对人健康的作用，特别是研究了在预防或治疗肠道传染、腹泻性疾病(diarrhealdisease)、预防癌以及刺激免疫系统中的作用。
因为它们在食品加工、表面活性组合物、去垢剂、纸、油的生产以及诊断剂和光学活性药物的生物技术中的潜在应用，微生物酯酶和脂酶是当前所关心的(Jaeger等，(1999)Annu.Rev.Microbiol.53315-351、Jaeger和Reetz(1998)Trends Biotech.16396-403)。修饰乳脂的酶是脂酶(三酰基甘油脂酶；EC 3.1.1.3)和酯酶(EC3.1.1.1)。酯酶定义为具有水解含有短链脂肪酯(≤C10)的酯底物的酶，而脂酶可水解长链酰基甘油(≥C10)(Verger(1997)TrendsBiotech.1532-38)。这些酶的底物和产物可能涉及成熟乳酪、发酵的乳制品、熏制腊肉和发酵香肠的多种风味成分形成。乳品领域所关心的是通过缩短它们的制备和加工的成熟期来减少多种奶酪的固有成本并提高风味强度。游离脂肪酸，其通过脂酶或酯酶作用于乳脂释放，可为乳制品提供其典型的风味特性。一旦进一步分解脂肪酸，则有可能发生与成熟的乳酪和发酵乳制品的其它成分的反应(Stead(1986)J.Dairy Sci.53481-505)，所述的反应有利于多种风味成分的形成。
草酸是强的二羧酸(pKa1＝1.23；pKa2＝3.83)并且是刺激组织的有毒化合物。这种作用认识于十八世纪，当时用于洗涤和漂白。极其高浓度的草酸盐可导致人和动物死亡，以及引起病理性疾病，包括高草酸盐尿(草酸盐水平超过正常范围)、维生素B6缺乏症、尿石病(形成结石或尿结石)、肾衰竭和其它疾病(Hatch等，(1995)ScanningMicrosc 91121-1126)。已经将草酸盐的毒性与其在与过氧化氢的反应过程中产生将活性氧物质生成为羟基或碳酸自由基(通过Fenton反应)的能力联系起来(Park等，(1997)Free Rad Res 27447-458和Urzua等，.(1998)Appl.Envirn.Microbiol.6468-73)。草酸广泛存在于自然界和许多食物如煮熟的胡萝卜(1.88mg/g)、番茄(0.04mg/g)、芹菜(0.17mg/g)、马铃薯(0.02mg/g)和玉米(0.03mg/g)以及其它的膳食来源如茶(0.11mg/ml)、咖啡(0.05mg/ml)和巧克力(1.17mg/g)中。草酸也可以通过非酶促降解产生或来自肠内微生物群的一些代谢前体(如抗坏血酸)(Ogawa等，(2000)World J.Surg.241154-1159)。在肠内，草酸可与钙、钠、镁或钾结合而形成较难溶解的盐，但也和铁结合产生高溶解性的盐。特异性降解草酸盐的细菌的存在据称通过阻碍吸收、分解代谢游离草酸盐并增强草酸盐从循环分泌来调节宿主的草酸盐的体内平衡。新近的临床研究已经证明了低比率的降解草酸盐的细菌(特别是产甲酸草酸杆菌(Oxalobacter formigenes)的肠内建群与由于尿中草酸盐浓度增加而增加高草酸盐尿的风险之间的关系(Troxel等，(2003)J.Endourol.17173-176)。因此，本领域需要可以调控草酸盐降解的组合物和方法。
附图简述

图1显示在嗜酸乳杆菌NCFM中的甲酰-CoA转移酶和草酰-CoA脱羧酶基因。指明了推定的rho依赖的终止子和它们相应的自由能。
图2显示了提出嗜酸乳杆菌的草酸盐脱羧作用的代谢途径。
图3 A显示了在pH5.5时嗜酸乳杆菌细胞中oxc操纵子的转录分析。细胞首先转移至pH6.8的MRS培养液中(非适应化的)。随后在将细胞置于pH5.5的MRS培养液中后进行基因诱导。标出了NCFM中的ORF数。
图3B显示了在pH5.5时嗜酸乳杆菌细胞中oxc操纵子的转录分析。最初将细胞转移至含有非抑制浓度的草酸铵的pH6.8的MRS培养液中(预先适应的)。随后在将细胞置于pH5.5的MRS培养液中后进行基因诱导。标出了NCFM中的ORF数。
图4显示了在用HCl、乳酸或草酸攻击2小时后，调节至pH4.0、3.5和3.0的MRS培养液中嗜酸乳杆菌NCFM和frc-变体的对数期细胞的存活率。
图5显示了嗜酸乳杆菌NCFM在半合成的(semi-defined)BM培养基中的生长曲线，所述的培养基含有不同浓度的草酸铵。评估了在存在0.1％葡萄糖(■)和葡萄糖加0.1％(▲)或0.5％()的草酰铵时，或者在缺少葡萄糖(□)或缺少葡萄糖加0.1％(△)或0.5％()草酸铵时的BM培养基中的生长。
图6显示了嗜酸乳杆菌的草酸盐降解活性。将菌株NCFM(■)和frc-(●)连续地转移至含有非抑制浓度的草酸(3.5mM)的培养液中，并随后转移至含有32mM草酸盐的培养液中。按时间提取样品并测量上清液中的草酸盐浓度。
发明概述具体而言，本发明提供了分离的核酸分子，所述核酸分子含有、基本上由和/或由SEQ ID NO1-36中奇数号列出的核苷酸序列组成，以及编码含由SEQ ID NO1-36中偶数号列出的氨基酸序列的分离的核酸分子。也提供了由在此描述的核酸分子编码的分离的或重组的多肽，以及含有、基本上由和/或由ID NO1-36偶数号中列出的氨基酸序列组成的多肽。与在序列表中列出的核苷酸和氨基酸序列充分相同的核酸分子和多肽变体包含于本发明中。而且，包含所述核苷酸和氨基酸序列的片段以及充分相同的片段。还包含与本发明核苷酸序列互补的，或者与本发明序列杂交的核苷酸序列。
组合物进一步包括用于重组表达在此描述的核酸分子的载体和细胞，以及含有所述载体的转基因微生物和/或细胞群。也包含于本发明的是用于重组生产本发明多肽的方法，以及关于它们的使用的方法。进一步包括的是用于检测样品中本发明核酸或多肽序列存在的方法和试剂盒，以及结合本发明多肽的抗体。
进一步提供了具有至少一种这些序列的载体、细胞和微生物。这些序列可用于调控细胞或生物体的草酸盐降解活性。进一步提供的是用于在受试者中调控草酸盐降解的方法。在一个实施方案中，受试者中的草酸盐降解通过施用有效浓度的至少一种本发明的草酸盐降解序列至所述受试者来增加。在另一个实施方案中，受试者中的草酸盐降解通过施用有效浓度的微生物给受试者来增加，所述的微生物具有至少一种本发明的草酸盐降解序列。
发明详述本发明现在将在下文参照附图更全面的描述，其中显示了一些但不是全部的本发明实施方案。实际上，这些发明可以以许多不同的形式实施，并且不应该理解为受限于在此列出的实施方案；而是，提供这些实施方案以便本公开内容将满足可适用的法律规定。全文中相同的数字指相同的元素。
根据前面描述和相关附图中的教导，这些发明所属领域的技术人员将理解在此列出的本发明的许多修改和其它实施方案。因而，应该理解本发明不受限于公开的特定实施方案，并应该理解修改和其它实施方案有意包含于附加的权利要求书的范围内。尽管在这里采用了特定术语，但它们仅以一般性的和描述性的方式使用而不是为了限制目的。如在此使用的，“a”或“an”可表示一个或多个。例如，“细胞”可以表示单个细胞或多个细胞。
如在此使用的，术语“基因”和“重组基因”指包含编码蛋白质的开放阅读框(ORF)的核酸分子。本发明的分离的核酸分子包含编码在SEQ ID NO1-36的偶数号中列出的氨基酸序列的核苷酸序列、在SEQ ID NO1-36的奇数号中列出的核酸序列(应理解核酸序列只在奇数号中给出，而氨基酸序列在偶数号中列出)，以及它们的变体和片段。本发明也包括反义核酸分子，如下描述。在另一个实施方案中，提供了启动子和/或调控核酸序列以促进核酸的表达。
而且，包括了分离的由列出的ORF编码的多肽和蛋白质，和它们的变体和片段，以及用于产生这些多肽的方法。对本发明来说，术语“蛋白质”和“多肽”可交换使用。
本发明包括的核酸和蛋白质组合物是分离的或充分纯化的。“分离的”或“充分纯化的”指核酸或蛋白质分子(或者生物活性片段或变体)充分地或基本上没有通常发现与天然状态的所述核酸或蛋白质相联的成分。这些成分包括其它的细胞物质、来自重组生产的培养基，以及多种在化学合成所述蛋白质或核酸中使用的化学试剂。优选地，本发明的“分离的”核酸无在所述核酸来源的生物体基因组DNA中的目标核酸旁侧的核酸序列(例如位于5′或3′末端的编码序列)。然而，所述分子可包含一些另外碱基或部分，所述的碱基或部分不会有害地影响所述组分的基本特性。例如，在多个实施方案中，分离的核酸包含少于5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核酸序列，所述的核酸序列通常与其来源的细胞中的基因组DNA相联系。同样，充分纯化的蛋白质具有少于大约30％、20％、10％、5％或1％(按干重计算)的污染蛋白质。当蛋白质经重组产生时，优选培养基少于蛋白制剂体积的30％、20％、10％或5％，而当蛋白质经化学生产时，优选该制剂具有少于约30％、20％、10％或5％(按干重计算)的化学前体。
本发明的组合物和方法可用于调控分子的机能。“调控”、“改变”或“修饰”指上调或下调靶标活性。根据本发明，如果本发明序列的水平和/或活性统计学上低于或高于合适对照中相同序列的水平和/或活性，则所述序列的水平或活性被调节(即过度表达或表达不足)。浓度和/或活性可以相对于合适的对照增加或减少至少0.5％、1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。本发明的蛋白质可用于修饰多种细菌(包括益生菌和乳酸菌)的能力，并还可用于修饰这些细菌发酵的食物的营养或促进健康的特性。本发明的核苷酸分子可用于调控蛋白质表达。包括本发明多核苷酸表达的上调或下调。上调可通过提供多重基因拷贝，通过修饰调控元件、促进转录或翻译机制调控表达，或通过其它途径完成。下调可通过使用已知的反义技术和基因沉默技术完成。
“乳酸菌”表示选自以下属的细菌气球菌属(Aerococcus)、肉杆菌属(Carnobacterium)、肠球菌属(Enterococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、酒球菌属(Oenococcus)、片球菌属(Pediococcus)、链球菌属(Streptococcus)、蜜蜂球菌属(Melissococcus)、差异球菌属(Alloiococcus)、狡诈球菌属(Dolosigranulum)、乳球形菌属(Lactosphaera)、四联球菌属(Tetragenococcus)、漫游球菌属(Vagococcus)和魏斯氏菌属(Weissella)(Holzapfel等，(2001)Am.J.Clin.Nutr.73365S-373S；Bergey′s Manual of SystematicBacteriology，Vol.2.1986.Williams and Wilkins，Baltimore，pp 1075-1079)。
“乳杆菌”表示任何来自乳杆菌属的细菌，包括但不限于干酪乳杆菌(L.casei)、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)、约氏乳杆菌(L.johnsonni)、加氏乳杆菌(L.gasserei)、嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、植物乳杆菌(L.plantarum)、发酵乳杆菌(L.fermentum)、唾液乳杆菌(L.salivarius)、保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus)，以及由Wood等列出的许多其它菌种(Holzapfel，W.H.N.The Genera of Lactic Acid Bacteria，Vol.2.1995.Brian J.B.Wood，Ed.Aspen Publishers，Inc.)。
本发明的多肽或产生它们的微生物可用作营养添加剂或补充剂，并且在乳制品和发酵加工中用作添加剂。多核苷酸序列、编码的多肽和表达它们的微生物可用于生产乳源性产品，例如乳酪、酸乳酪、发酵乳制品、酸乳和酪乳。产生本发明多肽的微生物可以是益生菌。“益生菌”指活的微生物，其经过胃肠道生存并对受试者产生有利影响。“受试者”指活的生物体，包括植物、微生物、人、动物(家畜、耕畜的或外来的动物)等。
本发明的多核苷酸和多肽可用于修饰乳源性产品。这些用途包括但不限于调节细菌的生长速率、修饰发酵乳制品的风味、调节由乳酸菌发酵的乳制品的酸化速率，以及改变发酵期间产生的产物。
在另一个实施方案中，本发明的组合物包括草酸盐降解多肽和多核苷酸。这些序列包括在SEQ ID NO1、2、3和4中列出的那些序列。另外的序列包括在SEQ ID NO5-36中列出的能用于调控草酸盐降解的那些序列。如下面进一步详细论述，这些序列可用于调控多种细胞类型、微生物和受试者的草酸盐降解能力。包括于本发明的特定蛋白质可在表1中找到。
在多个实施方案中，本发明的核酸分子编码蛋白质。它们还可以编码具有cDNA序列的mRNA转录物，所述的cDNA序列包含在SEQ ID NO1或3或者SEQ ID NO5-3 6的奇数号中列出的核苷酸序列。
除了在此公开的核苷酸序列及其片段和变体，本发明的分离的核酸分子还包括同源DNA序列或其变体和片段，所述的同源DNA序列通过用从此处公开的核苷酸序列获得的全部或部分序列杂交而从其它生物体鉴定并分离。
片段和变体本发明包括分离的核酸分子以及由此编码的蛋白质，所述的核酸分子包含调节和编码蛋白质的核苷酸序列或其变体和片段。“蛋白质”指具有在SEQ ID NO2和4以及SEQ ID NO5-36的偶数号中列出的氨基酸序列的蛋白质。还提供了这些核苷酸序列和编码的蛋白质的片段、生物活性部分和/或变体。核苷酸序列或蛋白质的“片段”是指少于全长核苷酸序列或蛋白质的部分核苷酸序列或氨基酸序列。
在此公开的核酸分子片段可用作杂交探针来鉴定样品中的其它与本发明核酸分子具有不同程度同源性的序列，或者可用作PCR扩增方法或序列突变法中的引物。本发明核酸分子的片段也可以结合至物理基底以形成巨阵列或微阵列(见，例如，美国专利No.5,837,832；美国专利No.5,861,242；美国专利No.6,309,823和国际公开号WO89/10977、WO89/11548和WO93/17126)。核酸的这些阵列可用于研究基因表达或用于鉴定与靶标序列具有充分同一性的核酸分子。
“核酸分子”指DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如mRNA)以及用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物。核酸分子可以是单链或双链的，但优选双链DNA。蛋白质的核苷酸片段可以编码具有生物活性的蛋白质片段，或者它可用作在此描述的杂交探针或PCR引物。生物活性的核苷酸片段可通过这样来制备分离本发明核苷酸序列之一的一部分，表达该核苷酸序列来产生编码的部分蛋白质(例如通过体外重组表达)，并评估所述的编码的部分蛋白质的活性。核酸分子片段可包含至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2200、2500、2700、3000、3200、3500、3700、4000、4200或4500个连续的核苷酸，包括未在这里具体叙述的5-4500之间的任何数目，或者多至在此公开的全长核苷酸序列中存在的核苷酸总数。
氨基酸序列片段包括适合用作免疫原以产生抗体的多肽片段。片段包括包含充分相同于或源于本发明蛋白质或部分长度的蛋白质的氨基酸序列的氨基酸序列，并显示出蛋白质的至少一种活性的肽，但是其包含比在此公开的全长蛋白质少的氨基酸。通常，生物活性片段包含具有所述蛋白质的至少一种活性的结构域或基序。蛋白质的生物活性片段可以是多肽，所述的多肽长为，例如5、10、15、20、25、30、40、50、75、100、150、200、300、400或500个连续氨基酸，包括在此未描述的5-500之间的任何数目，或者多至本发明的全长蛋白质中存在的氨基酸总数。这种生物活性片段可以例如通过重组技术制备并评估其天然蛋白质的一种或多种免疫原性和/或功能活性。如此处使用的，片段包含SEQ ID NO1-36的偶数号中的至少5个连续的氨基酸。然而，本发明还包括其它的片段，例如蛋白质中长于6、7、8或9个氨基酸的任何片段。
在本发明的一个实施方案中，提供了SEQ ID NO5-36的多核苷酸或多肽的片段。SEQ ID NO5-36的多肽或多核苷酸的生物活性片段可以包含，例如长为5、10、15、20、25、30、40、50、75、100、150、200、300、400或500个连续氨基酸或核苷酸，包括未在此描述的5-500之间的任何数目，或者多至本发明的全长蛋白质或多核苷酸中存在的氨基酸或核苷酸的总数。这种生物活性片段可以继续有生物活性(即，调控草酸盐降解活性或在此公开的任何其它活性)。
在本发明的另一个实施方案中，提供了SEQ ID NO1、2、3或4的多核苷酸或多肽的片段。SEQ ID NO1、2、3或4的多肽或多核苷酸的生物活性片段可以包含，例如长为5、10、15、20、25、30、40、50、75、100、150、200、300、400或500个连续氨基酸或核苷酸，包括在这里未描述的5-500之间的任何数目，或者多至本发明的全长蛋白质或多核苷酸中存在的氨基酸或核苷酸的总数。这种生物活性片段可以继续有生物活性(即，具有草酸盐降解活性或在此公开的任何其它方法)。
所述核苷酸和氨基酸序列的变体也包含于本发明中。“变体”指充分相同的序列。因此，本发明包含与编码多肽的核苷酸序列充分相同的分离的核酸分子，所述的多肽含有SEQ ID NO1-36的偶数号中列出的氨基酸序列，或者包含在严紧条件下与含有SEQ ID NO1-36的奇数号中列出的核苷酸序列的核酸分子或其互补序列杂交的核酸分子。变体还包括由本发明的核苷酸序列编码的多肽。而且，本发明的多肽具有与SEQ ID NO1-36的偶数号中列出的氨基酸序列充分相同的氨基酸序列。“充分相同”是指一个氨基酸序列或核苷酸序列与另一个氨基酸或核苷酸序列相比，包含足够数目或最低限度数目的等价的或相同的氨基酸残基或核苷酸，从而提供了共同的结构单位和/或显示出共同的功能活性。保守性核苷酸序列变体包括由于遗传密码简并性而不同的那些核苷酸序列。
通常，与SEQ ID NO1-36的偶数号中的任何氨基酸序列或SEQ IDNO1-36的奇数号中的任何核苷酸序列分别具有至少约45％、55％、65％、70％、75％、80％、85％或90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列或核苷酸序列在这里定义为充分相同。包含于本发明的变体蛋白质有生物活性，即它们继续拥有天然蛋白的目标生物活性，即在此描述的活性。本发明蛋白质的生物活性变体与所述蛋白质可以有少至1-15个氨基酸残基、少至1-10个例如6-10个、5个、4、3、2或者甚至1个氨基酸残基的不同。
在本发明的一个实施方案中，提供了SEQ ED NO1、2、3或4的多肽或多核苷酸的变体。一般而言，SEQ ED NO1、2、3或4的多肽或多核苷酸的变体可包括，与SEQ ID NO2或4的任何氨基酸序列或者SEQ ID NO1或3的任何核苷酸序列分别具有至少约45％、55％、65％、70％、75％、80％、85％或90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列或核苷酸序列。生物活性变体可以继续有生物活性(即，具有草酸盐降解活性)。
在本发明的另一个实施方案中，提供了SEQ ED NO5-36的多肽或多核苷酸的变体。一般，SEQ ED NO5-36的多肽或多核苷酸的变体可包括，与SEQ ED NO5-36的偶数号中的任何氨基酸序列或者SEQED NO5-36的奇数号中的任何核苷酸序列分别具有至少约45％、55％、65％、70％、75％、80％、85％或90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列或核苷酸序列。生物活性变体可以继续有生物活性(即，具有草酸盐降解活性或在此公开的任何其它活性)。
天然存在的变体可存在于菌群(例如嗜酸乳杆菌菌群)中。这些变体可使用公知的分子生物学技术例如在此描述的聚合酶链式反应(PCR)和杂交来鉴定。合成产生的核苷酸序列，例如通过定点诱变或PCR介导的诱变产生的仍然编码蛋白质的序列也作为变体包括在内。可将一个或多个核苷酸或氨基酸取代、添加或缺失引入在此公开的核苷酸或氨基酸序列，这样就将取代、添加或缺失引入进编码的蛋白质中。添加(插入)或缺失(截断)可在天然蛋白的N末端或C末端发生，或者在天然蛋白内的一个或多个位点发生。同样，一个或多个核苷酸或氨基酸取代可在天然蛋白的一个或多个位点发生。
例如，保守氨基酸取代可以在一个或多个预定的，优选非必需的氨基酸残基处发生。“非必需的”氨基酸残基是可以从蛋白质的野生型序列改变而不改变生物活性的残基，而“必需的”氨基酸是生物活性所必需的。“保守氨基酸取代”是指其中氨基酸残基用具有类似侧链的氨基酸残基代替的取代。具有类似侧链的氨基酸残基家族是本领域已知的。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、无电荷极性的侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、无极性的侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β分支的侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。这些取代不能用于保守氨基酸残基，或者不能用于位于保守基序内的氨基酸残基，因为这些残基是蛋白质活性所必需的。
备选地，突变可以沿着全长或部分长度的编码序列任意进行，例如通过饱和诱变。突变体可以重组表达，并通过标准的检测技术根据活性筛选保留生物活性的那些突变体。用于诱变和核苷酸序列改变的方法是本领域已知的。见，例如Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82488-492；Kunkel等(1987)Methods in Enzymol.MolecularBiology(MacMillan Publishing Company，New York)和在其中引用的参考。显然，编码变体的DNA中发生的突变不能打断阅读框并优选不能产生可形成二级mRNA结构的互补区域。见，EP专利申请出版物No.75,444。关于不影响目标蛋白生物活性的合适的氨基酸取代的指导可以在Dayhoff等(1978)的Atlas of Protein Sequence andStructure(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C)的模型中找到，在此通过引用作为参考。
在此包括的氨基酸序列的缺失、插入和取代不希望产生蛋白质特性的根本改变。然而，当在这样进行前很难预测取代、缺失或插入的确切影响时，本领域的技术人员将理解所述的影响可通过常规的筛选试验来评价。
本发明的变体核苷酸和氨基酸序列也包括源于诱变方法和重组方法如DNA改组(DNA shuffling)的序列。使用这些方法，一个或多个不同的蛋白质编码区可用于产生具有理想特性的新的蛋白。如此，从一组相关多核苷酸序列产生重组多核苷酸文库，所述的多核苷酸序列包含具有基本的序列同一性并可以在体外或体内同源重组的序列区域。例如，使用这种方法，编码目的结构域的序列基序可以在本发明基因和其它已知基因之间改组以获得编码具有改良目的特性(例如有关酶时为增加的Km)的蛋白质的新基因。这种DNA改组方法是本领域已知的。见，例如Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA9110747-10751；Stemmer(1994)Nature 370389-391；Crameri等(1997)Nature Biotech.15436-438；Moore等(1997)J.Mol.Biol.272336-347；Zhang等，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA944504-4509；Crameri等，(1998)Nature 391288-291；以及U.S.Patent Nos.5,605,793和5,837,458。
本发明蛋白质的变体可作为激动剂(模拟物(mimetics))或作为拮抗剂起作用。蛋白质的激动剂可以充分地保持与天然存在形式的该蛋白质相同的，或其子集的生物活性。蛋白质的拮抗剂能通过，例如竞争性地结合至包括所述蛋白质的细胞信号级联系统的下游或上游成员来抑制天然存在形式的该蛋白质的一种或多种活性。
作为激动剂或拮抗剂起作用的蛋白质变体可根据蛋白质激动或拮抗活性通过筛选蛋白质突变体(例如截短突变体)的组合文库来鉴定。在一个实施方案中，变体的多样化库(variegated library)通过核酸水平的组合突变产生并由多样化基因文库编码。变体的多样化文库可以通过这样来产生例如通过将合成的寡核苷酸的混合物经酶促反应连接成基因序列，这样简并组的潜在序列可表达为独立的多肽，或备选地，表达为一组更大的其中含有一组序列的融合蛋白(例如用于噬菌体展示)。存在多种用于从简并的寡核苷酸序列产生潜在变体的文库的方法。简并基因序列的化学合成可以在DNA自动合成仪中实施，并随后将该合成基因连接进合适的表达载体中。简并组基因的使用使得能在一种混合物中提供全部的编码目的组的可能序列的序列。用于合成简并寡核苷酸的方法是本领域已知的(见，例如Narang(1983)Tetrahedron 393；Itakura等，(1984)Annu.Rev.Biochem.53323；Itakura等，(1984)Science 1981056；Ike等，(1983)Nucleic Acid Res.11477)。
另外，编码蛋白质的序列的片段文库可用于产生片段的多样化库，用于蛋白质变体的筛选和随后的选择。在一个实施方案中，编码序列片段的文库可以通过这样产生在其中切口只在每个分子约发生一次的条件下用核酸酶处理编码序列的双链PCR片段，使所述双链DNA变性，让该DNA复性形成能包括来自不同切口产物的有义/反义对的双链DNA，通过用S1核酸酶处理将单链部分从重新形成的双链体上除去，并将得到的片段文库连接至表达载体中。通过这种方法，能够得到编码所述蛋白质不同大小的N末端和内部片段的表达文库。
一些用于筛选通过点突变或截短产生的组合文库的基因产物和用于筛选cDNA文库中具有所选择的特性的基因产物的方法是本领域已知的。这种技术适用于迅速筛选通过蛋白质的组合诱变产生的基因文库。最广泛使用的、适于高通量分析的、用于筛选大的基因文库的技术通常包括克隆基因文库至可复制的表达载体中，用得到的载体文库转化合适的细胞，并表达所述组合基因，所述的表达是在其中目标活性的检测有助于分离编码其产物得以检测的基因的载体的条件下进行。循环总体诱变法(Recursive ensemble mutagenesis)(REM)是增加文库中功能性突变体的频率的技术，可与筛选检测法组合使用来鉴定变体(Arkin and Yourvan(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA897811-7815；Delgrave等，(1993)Protein Engineering6(3)327-331)。
序列鉴定所述序列是多个分子家族的成员，具有保守的功能特征。“家族”是指具有充分的核苷酸或氨基酸序列同一性的两种或多种蛋白质或核酸分子。含有进一步分化的组的家族可以分为亚家族。异种集团(clan)是认为具有共同祖先的一组家族。异种集团的成员通常具有类似的三级结构。
“序列同一性”是指当对比两个序列在特定比较窗口上寻求最大对应性时相同的核苷酸或氨基酸残基。“比较窗口”是指最理想比对的两段核苷酸序列或氨基酸序列的连续片段，其中与第一段序列比较第二段序列可包含增加或缺失(即缺口)。一般而言，对于核苷酸序列对比，比较窗口是长为至少20个连续核苷酸，并且任选可以是30、40、50、100更长。对于氨基酸序列对比，比较窗口长为至少6个连续氨基酸，并任选可以是10、15、20、30或更长。本领域的那些技术人员理解为了避免由于包含缺口而引起的高的相似性，通常引入缺口罚分并将其从匹配数中扣除。
家族成员可来自相同或不同的种，并可以包括同源物以及截然不同的蛋白质。通常，家族成员显示出共同的功能特性。同源物可以根据如下面公开的标准杂交技术在严格杂交条件下使用cDNA或其部分作为杂交探针基于它们与在此公开的核酸序列的同一性进行分离。
为了测定两个氨基酸或核苷酸序列的百分比同一性，进行了比对。两种序列的百分比同一性是在比较窗口中两种序列共有的相同残基数的函数{即百分比同一性＝相同的残基数/总残基数×100}。在一个实施方案中，序列是一样长。与下面提及的那些方法类似的方法可用于测定两个序列之间的百分比同一性。所述方法可在不允许或允许缺口时使用。比对也可以通过观察手工操作。
当氨基酸序列不同之处在于保守取代时，可以上调百分比同一性以校正取代的保守性质。用于进行该调整的方法是本领域已知的。通常将保守取代打分为部分错配而不是完全错配，从而增加了百分比序列同一性。
数学算法可用于测定两个序列的百分比同一性。数学算法的非限制性实例是Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA872264的算法，其在Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5877中进行了修改；Myers和Miller(1988)CABIOS411-17的算法；Smith等(1981)Adv.Appl.Math.2482的局部同源算法；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48443-453的同源比对算法；以及Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA852444-2448的相似性搜索方法。
已经设计了基于这些数学算法的多种计算机程序来使得能测定序列同一性。Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215403的BLAST程序是基于上述的Karlin和Altschul的算法(1990)。为获得与本发明核苷酸序列同源的核苷酸序列的搜索可以用BLAST程序进行，打分＝100，字长＝12。为获得与编码本发明蛋白质或多肽的序列同源的氨基酸序列，可使用BLASTX程序，打分＝50，字长＝3。有缺口的比对可以如Altschul等.(1997)Nucleic Acids Res.253389中描述的通过使用Gapped BLAST获得。为了测定分子间的远缘关系(distantrelationships)，可以使用PSI-BLAST。见前面的Altschul等(1997)。对于所有的BLAST程序，可使用各自程序的默认参数。
另一个可用于测定百分比序列同一性的程序是ALIGN程序(2.0版本)，其采用前述的Myers和Miller的数学算法(1998)。在比较氨基酸序列时该程序可使用PAM 120权重残基表、12的长度罚分和4的缺口罚分。
除ALIGN和BLAST程序外，BESTFIT、GAP、FASTA和TFASTA程序是Wisconsin Genetics Software Package(来自GCG，Madison，Wisconsin)的部分，并且可用于进行序列比对。优选的程序为GAP 10版，其采用前述的Needleman和Wunsch的算法(1970)。除非另外说明，在这里提供的序列同一性/相似性值指使用GAP10版或者它的任何等价程序获得的值，其中采用下列参数核苷酸序列的百分比同一性和百分比相似性使用50的GAP权重和3的长度权重，和nwsgapdna.cmp打分矩阵；氨基酸序列的百分比同一性和百分比相似性使用8的GAP权重和2的长度权重，以及BLOSUM62得分矩阵。也可使用其它等价程序。“等价程序”是指用于任何两种讨论的序列的任何序列比较程序，并且当与由GAP10版产生的相应比对相比较时，所述的序列比较程序产生具有相同核苷酸或氨基酸残基匹配和相同百分比序列同一性的比对。
鉴定和分离同源序列基于它们与在此列出的核苷酸序列或其片段和变体的序列同一性鉴定的同源核苷酸序列包含于本发明。方法例如PCR或杂交可用于从cDNA或基因组文库中鉴定序列，例如与本发明序列充分相同的序列。见，例如Sambrook等(1989)Molecular CloningLaboratory Manual(2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，NY)和Innis，等，(1990)PCR ProtocolsA Guide to Methods andApplications(Academic Press，NY)。用于构建这种cDNA和基因组文库的方法通常是本领域已知的并也公开于上面的参考中。
在杂交技术中，杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其它寡核苷酸，并可以由在此公开的全长或部分已知核苷酸序列组成。而且，它们可用可检测基团如32P，或任何其它可检测标记例如其它放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子标记。用于杂交的探针可以基于在此公开的已知核苷酸序列通过标记合成的寡核苷酸而产生。又可以使用基于已知核苷酸序列或编码的氨基酸序列中的保守核苷酸或氨基酸残基而设计的简并引物。杂交探针通常包含在严紧条件下与本发明核酸或其片段或变体的至少约10，优选约20，更优选约50、75、100、125、150、175、200、250、300、350或400个连续核苷酸杂交的核苷酸序列。为了在多种条件下获得特异性杂交，这些探针可包含对于编码的氨基酸序列是独特的序列。用于杂交的探针的制备通常是本领域已知的并公开于Sambrook等(1989)MolecularCloningA Laboratory Manual(2d ed.，Cold Spring HarborLaboratory Press，Plainview，New York)中，在此将其通过引用作为参考。
在一个实施方案中，编码蛋白质的全长核苷酸序列用作探针来鉴定新的核酸序列和mRNA。在另一个实施方案中，探针是在此公开的核苷酸序列的片段，在一些实施方案中，在严紧条件下与所述探针杂交的核苷酸序列长度可以是至少约25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、500、550、600、650、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000个或更多的核苷酸。
充分相同的序列将在严紧条件下互相杂交。“严紧条件”是指在其下探针与其靶序列比与其它序列以更高可检测水平(例如，至少两倍于背景)杂交的条件。通常，严紧条件包括那些用于杂交和洗涤的条件，并且在所述的条件下具有至少约60％，65％，70％，优选75％的序列同一性的核苷酸序列通常保持互相杂交。严紧条件是本领域已知的并可以在Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley &Sons，New York(1989))，6.3.1-6.3.6中找到。
严紧条件是依赖于序列的并将在不同的情况下不同。全长或部分的核酸序列可用于获得包含于本发明的同源物和直向同源物(ortholog)。“直向同源物”是指源于共同祖先的基因并由于物种形成而在不同物种中发现的基因。在不同物种中发现的基因当它们的核苷酸序列和/或它们编码的蛋白质序列具有如在文中别处定义的基本的同一性时则认为是直向同源物。直向同源物的功能在物种之间通常高度保守。
当使用探针时，严紧条件会是其中在pH7.0-8.3下盐浓度低于约1.5M Na离子，通常约0.01-1.0M Na离子浓度(或其它盐)，并且对于短探针(例如10-50个核苷酸)温度至少约30℃而对于长的探针(例如大于50个核苷酸)至少60℃的那些条件。
杂交后洗涤用于控制特异性。两个关键因素是最终的洗涤溶液的离子强度和温度。为了检测与全长或近似全长的靶序列杂交的序列，严紧条件下的温度选择为比在确定离子强度和pH下的特定序列的热解链温度(Tm)约低5℃。然而，严紧条件将包括比Tm低1℃-20℃范围的温度，这取决于如在这里另外限定的期望的严紧程度。对于DNA-DNA杂合体，Tm可以使用Meinkoth和Wahl(1984)Anal.Biochem.138267-284的等式测定Tm＝81.5℃+16.6(logM)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L，其中M是单价阳离子的摩尔浓度，％GC是DNA中鸟嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸的百分比，％form是杂交溶液中甲酰胺的百分比，而L是杂合体的碱基对长度。Tm是50％的互补靶序列杂交至完全匹配的探针时的温度(在确定的离子强度和pH下)。
检测具有不同程度同源性的序列的能力可以通过改变杂交和/或洗涤条件的严紧性获得。对于100％相同的靶序列(同源探测)，必须获得不允许错配的严紧条件。通过允许核苷酸残基的错配发生，可以检测具有低水平相似性的序列(异源探测)。对于每1％的错配，Tm降低约1℃；从而，可以操纵杂交和/或洗涤条件使得允许目标百分比同一性的序列杂交。例如，如果优选具有≥90％序列同一性的序列，Tm可以减少10℃。如果它们编码的多肽基本相同，两种核苷酸序列可以基本相同，但是不能在严紧条件下互相杂交。例如，如果将遗传密码的最大限度密码简并用于产生核酸拷贝，这种情况会出现。
示例性的低严紧条件包括在37℃下使用30-35％甲酰胺、1MNaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲液的杂交，并在50-55℃的1×至2×SSC(20×SSC＝3.0M NaCl/0.3 M柠檬酸钠)中洗涤。示例性的中等严紧条件包括在37℃的40-45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS中杂交，并在55-60℃的0.5×至1×SSC中洗涤。示例性的高严紧条件包括在37℃的50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，并在60-65℃的0.1×SSC中洗涤。任选地，洗涤缓冲液可包含约0.1％至约1％的SDS。杂交的持续时间一般少于约24小时，通常约4至12小时。核酸杂交的大量指导在Tijssen(1993)LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridizationwith Nucleic Acid Probes，Part I，Chapter 2(Elsevier，NewYork)；和Ausubel等，eds.(1995)Current Protocols in MolecularBiology，Chapter 2(Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York)中找到。参见Sambrook等(1989)Molecular CloningALaboratory Manual(2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)。在此将所有这些参考通过全文引用作为参考。
在扩增方法例如PCR方法中，可设计寡核苷酸引物用于PCR反应来扩增来自从任何目标生物体提取的cDNA或基因组DNA的相应DNA序列。PCR引物优选长度为至少约10或15个核苷酸，并最优选为至少约20、25或30个核苷酸。用于设计PCR引物和PCR克隆的方法一般是本领域已知的并公开于Sambrook等(1989)的MolecularCloningA Laboratory Manual(2d ed.，Cold Spring HarborLaboratory Press，Plainview，New York)中。也参见Innis等，eds.(1990)PCR ProtocolsA Guide to Methods and Applications(Academic Press，New York)；Innis和Gelfand，eds.(1995)PCRStrategies(Academic Press，New York)；以及Innis和Gelfand，eds.(1999)PCR Methods Manual(Academic Press，New York)。已知的PCR方法包括(但不限于)使用成对引物、嵌套引物、单一特异引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配引物等的方法。
检测法在这里提供了用于检测在样品中公开的多肽和/或核酸分子的表达以及它们公开的活性的检测法。用于检测样品中存在或缺乏公开的核酸或含有公开的多肽的蛋白质的示例性方法包括从食物/乳品/饲料产品、起子培养物(母料(mother)、子料(seed)、成批/一批、浓缩的、干的、冻干的、冷冻的)、培养的食物/乳品/饲料产品、食品添加物、生物工艺发酵物，或已经摄入益生菌物质的受试者获得样品，并让该样品以某种方式与能够与所述公开的多肽或核酸反应的化合物或试剂(例如含有所述公开的核酸或其片段的mRNA或基因组DNA)接触，这样在样品中所述公开的核酸或蛋白质的存在得以检测。可以将从来自食物、补充剂、培养物、产品或受试者的样品获得的结果与从来自对照、食物、补充培养物、产品或受试者的样品获得的结果比较。
在一些实施方案中，用于检测含有公开的核苷酸序列的mRNA或基因组DNA的试剂是经标记的核酸探针，所述探针能够与所述mRNA或基因组DNA的所述公开的核苷酸序列杂交。所述核酸探针可以是，例如公开的核酸分子，例如含有在SEQ ID NO1或3中列出的核苷酸序列或其片段或变体，或在SEQ ID NO5-36的奇数号中列出的核苷酸序列或其变体或片段的核酸，例如长为至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、125、150、175、200、250、300、400或500个核苷酸的核酸，包括未在这里描述的5-500之间的任何数目(例如16、34、172)，并且所述核酸探针能足以在严紧条件下特异性地与含有所述公开的核苷酸序列的所述mRNA或基因组DNA杂交。在这里描述了用于本发明检测法的其它合适探针。
在其它实施方案中，用于检测含有公开的氨基酸序列的蛋白质的试剂是能够结合至所述公开的多肽的抗体，优选具有可检测标记或能够检测到的抗体。抗体可以是多克隆的，或更优选是单克隆的。可以使用完整的抗体，或其片段(例如，Fab或F(ab′)2)。对于探针或抗体，术语“标记的”是指包括通过将可检测物质偶联(即物理连接)至所述探针或抗体而产生的所述探针或抗体的直接标记，以及通过与另一种(即第二种)经直接标记的反应物反应而产生的所述探针或抗体的间接标记。间接标记的实例包括使用荧光标记的二抗检测一抗和用生物素标记DNA探针末端，使得能用荧光标记的链霉亲和素检测。
术语“样品”包括存在于或分离自受试者的组织、细胞和生物流体，以及来自起子培养物的细胞或携带有这种培养物的食品，或源于使用这些培养物。也就是说，本发明的检测方法可用于在样品中体外和体内检测本发明的核酸或蛋白质。用于检测含有公开的序列的mRNA的体外检测技术包括RNA印迹杂交和原位杂交。用于检测含有公开的氨基酸序列的蛋白质的体外检测技术包括酶联免疫吸附检测法(ELISA)、蛋白质印迹法、免疫沉淀法和免疫荧光法。用于检测含有所述公开的核苷酸序列的DNA的体外检测技术包括DNA杂交。此外，用于检测含有公开的氨基酸序列的蛋白质的体内检测技术包括将对抗所述公开的多肽的标记抗体引入至受试者中。例如，所述抗体可以用放射性标记物标记，该标记物在受试者中的存在和位置可以通过标准的成像技术检测。
在一个实施方案中，样品含有来自消费了益生菌物质的试验受试者的蛋白质分子。备选地，样品可以含有来自起子培养物的mRNA或基因组DNA。
本发明还包括用于在样品中测定公开的核酸或蛋白质的存在的试剂盒。这种试剂盒可用于测定表达本发明特定多肽的微生物是否存在于食物产品或起子培养物中，或存在于已消费益生菌物质的受试者中。例如，所述试剂盒可包括能在样品中检测公开的多肽或核酸的标记化合物或试剂和用于测定样品中公开的多肽或核酸的量的手段(例如，识别所述公开的多肽的抗体或结合至编码公开的多肽(例如在SEQ IDNOS2或4或者SEQ ID NOS5-36中列出)的DNA的寡核苷酸探针)。试剂盒还可包括详细描述这些化合物用法的说明书。
对于基于抗体的试剂盒，该试剂盒可包含例如(1)结合至公开的多肽的第一抗体(例如连接至固体支持物上)；和任选的，(2)结合至所述公开的多肽或所述第一抗体并缀合至可检测试剂的不同的第二抗体。对于基于寡核苷酸的试剂盒，该试剂盒可包含例如(1)寡核苷酸，例如可检测标记的寡核苷酸，其杂交至公开的核酸序列，或(2)引物对，其用于扩增公开的核酸分子，以及任选探针，其用于检测所述扩增产物。
试剂盒还可以包含，例如缓冲剂、防腐剂或蛋白稳定剂。试剂盒也可包含检测可检测试剂所必需的成分(例如酶或底物)。试剂盒还可包含对照样品或一系列对照样品，可检测所述的对照样品并将其与获得的所述实验样品比较。试剂盒的每种成分通常封装于单独的容器中，并且全部的容器与使用说明书一起在单个包装中。
在一个实施方案中，试剂盒包含阵列形式的多个探针，例如在美国专利No.5,412,087、5,545,531和PCT出版物No.WO95/00530中描述的那些，在此将其通过引用作为参考。可以直接将用于所述阵列的探针合成在所述阵列的表面，如PCT出版物No.WO95/00530中公开的，或在固定至所述阵列表面前合成(Gait，ed.，Oligonucleotide synthesis a practical approach，IRL PressOxford，England，1984)。所述探针可以使用本领域技术人员熟知的技术固定在表面上，例如在美国专利No.5,412,087中描述的那些。探针可以是核酸或肽序列(优选为纯化的)或抗体。
阵列可用于根据它们的基因组、cDNA、多肽或抗体含量的不同，包括特定序列或蛋白的存在或缺乏，以及那些材料的浓度来筛选生物体、样品或产品。结合至捕获探针可例如通过从连接至含有所述公开的核苷酸序列的核酸分子、含有所述公开的氨基酸序列的多肽或抗体的标记物产生的信号来检测。所述方法可以包括将含有所述公开的核酸、多肽或抗体的分子与具有多种捕获探针的第一阵列和具有不同的多种捕获探针的第二阵列接触。可比较每次杂交结果以分析第一样品和第二样品之间的表达的不同。第一组多种捕获探针可来自对照样品，例如野生型乳酸菌，或来自对照受试者例如食物、膳食添加物、起子培养物样品或生物流体。第二组多种捕获探针可来自实验样品，例如突变型乳酸菌，或来自已经吃了益生菌物质的受试者，例如起子培养物样品或生物流体。
这些检测法可特别用于其中必需检测不需要的材料的微生物选择和质量控制过程。特定核苷酸序列或多肽的检测还可用于测定食物、发酵产品或工业微生物，或存在于消费了益生菌的动物或人中的微生物的遗传组成。
反义核苷酸序列本发明还包括反义核酸分子，即与编码蛋白的有义核酸互补的分子，例如与双链cDNA分子的编码链互补或与mRNA序列互补的分子。因此，反义核酸可以与有义核酸以氢键结合。反义核酸可与全长的编码链互补，或只与它的一部分，例如全部或部分的蛋白质编码区(或开放阅读框)互补。反义核酸分子可以与编码蛋白的核苷酸序列的编码链的非编码区是反义的。所述的非编码区是所述编码区旁侧且不翻译成氨基酸的5′和3′序列。反义核苷酸序列可用于中断所述靶基因的表达。可使用与相应序列具有70％或75％，优选80％，并更优选85％或90％序列同一性的反义构建体。
给定编码在此公开的多肽(例如SEQ ID NO2或4，或SEQ ID NO5-36的偶数序列)的编码链序列，则本发明的反义核酸可根据Watson和Crick碱基配对法则设计。所述反义核酸分子可与mRNA的全部编码区互补，但更优选只与mRNA的部分编码区或非编码区反义的寡核苷酸。例如，所述反义寡核苷酸可与mRNA的翻译起始位点周围的区域互补。反义寡核苷酸可以长为例如约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450或500个核苷酸，或其可以是100、200个核苷酸，或更长。本发明的反义核酸可使用本领域已知的化学合成和酶促连接方法构建。
例如，反义核酸(例如反义寡核苷酸)可使用天然存在的核苷酸或经多种修饰的核苷酸化学合成，所述的经多种修饰的核苷酸是设计用来增加所述分子的生物稳定性或增加在反义和有义核酸之间形成的双链的物理稳定性，其包括但不限于例如硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。备选地，所述反义核酸可使用表达载体通过生物学方法产生，其中核酸已经在反义方向亚克隆至所述的表达载体中(即从所述的插入核酸转录的RNA对感兴趣的目的靶标核酸是反义定向)。
本发明的反义核酸分子可以是α-异头核酸分子。α-异头核酸分子与互补RNA形成特异性的双链杂交链，与通常的β-单位相反，所述杂交链中链相互平行(Gaultier等，(1987)Nucleic Acids Res.156625-6641)。所述反义核酸分子还可以包含2′-o-甲基核糖核苷酸(Inoue等(1987)Nucleic Acids Res.156131-6148)或嵌合的RNA-DNA类似物(Inoue等(1987)FEBS Lett.215327-330)。
本发明也包括核酶，所述的核酶是具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，所述的核糖核酸酶活性能够裂解它们与其具有互补区的单链核酸，例如mRNA。核酶(例如锤头核酶(在Haselhoff和Gerlach(1988)Nature 334585-591中描述))可用于催化裂解mRNA转录物从而抑制mRNA翻译。对编码核酸具有特异性的核酶可以基于在此公开的核苷酸的核苷酸序列(例如，SEQ ID NOS1-2556的奇数号)设计。见，例如Cech等，美国专利No.4,987,071；和Cech等，美国专利No.5,116,742。备选地，mRNA可用于从RNA分子库选择具有特定的核糖核酸酶活性的催化性RNA。见，例如Bartel和Szostak(1993)Science 2611411-1418。
本发明还包括形成三螺旋结构的核酸分子。例如，基因表达可通过靶向与所述蛋白的调控区互补的核苷酸序列(例如，启动子和/或增强子)，形成防止靶细胞中所述基因转录的三螺旋结构而抑制。一般见Helene(1991)Anticancer Drug Des.6(6)569；Helene(1992)Ann.N.Y.Acad.Sci.66027；和Maher(1992)Bioassays14(12)807。
在一些实施方案中，本发明的核酸分子可以在碱基部分、糖部分或磷酸主链上修饰以提高例如分子的稳定性、杂交或溶解性。例如，可修饰核酸的脱氧核糖磷酸主链产生肽核酸(见Hyrup等人(1996)Bioorganic & Medicinal Chemistry 45)。如在这里使用的，术语“肽核酸”或“PNA”指核酸模拟物，例如DNA模拟物，其中脱氧核糖磷酸主链由假肽主链取代并且只保留四个天然的核碱基。已经显示PNA的中性主链能在低离子强度条件下与DNA和RNA特异性杂交。PNA寡聚物的合成可使用例如在前面的Hyrup等(1996)；Perry-O′Keefe等(1996)Proa Natl.Acad.Sci.USA 9314670中描述的标准固相肽合成方法进行。
PNA可用作反义或反基因(antigene)试剂，通过例如诱导转录或翻译停止(translation arrest)或者抑制复制来序列特异性地调控基因表达。本发明PNA也可用于，例如通过例如PNA指导的PCR钳夹术分析基因中的单碱基对突变；当与其它酶例如S1核酸酶结合使用时用作人工限制性内切酶(前面所述的Hyrup(1996))；或用作DNA序列和杂交的探针或引物(前面所述的Hyrup(1996)；前面所述的Perry-O′Keefe等(1996))。
在另一个实施方案中，分子的PNA可以通过连接亲脂的或其它辅助基团至PNA，通过形成PNA-DNA嵌合体，或通过使用脂质体或本领域已知的其它药物递送技术修饰来例如增强它们的稳定性、特异性或细胞摄取。PNA-DNA嵌合体的合成可以如前面所述的Hyrup(1996)；Finn等，(1996)Nucleic Acids Res.24(17)3357-63；Mag等，(1989)Nucleic Acids Res.175973；和Peterson等，(1975)BioorganicMed.Chem.Lett.51119中描述的进行。
融合蛋白本发明还包括嵌合蛋白或融合蛋白。“嵌合蛋白”或“融合蛋白”包含有效连接(例如按读码框融合)至第二多肽的第一多肽。“第一多肽”指具有对应于第一蛋白质的氨基酸序列的多肽，而“第二多肽”指具有对应于某种蛋白质的氨基酸序列的多肽，所述的某种蛋白质与第一蛋白质不充分相同，并且其源自相同的或不同的生物体。在融合蛋白中，所述多肽可以对应于完整的或部分的蛋白质，优选包含蛋白质的至少一个生物活性部分。在所述融合蛋白中，术语“有效连接”表示第一多肽和第二多肽按读码框相互融合。第二多肽可以融合至第一多肽的N末端或C末端。
连接的编码序列的表达产生了形成融合蛋白的两个连接的异源氨基酸序列。载体序列(第二多肽)编码载体多肽，其例如加强或增加所述融合蛋白在细菌宿主中的表达。由所述载体序列编码的融合蛋白的部分(即载体多肽)可以是蛋白质片段、整个功能部分或整个蛋白质序列。可另外设计所述载体区域或多肽用于纯化所述融合蛋白，所述的纯化或者是用对载体多肽特异性的抗体或是用亲和纯化来进行。同样，可利用所述载体多肽的物理特性使得能选择性地纯化所述融合蛋白。
具体的目的载体多肽包括超氧化物歧化酶(SOD)、麦芽糖-结合蛋白质(MBP)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、N-端组氨酸(His)标签等。上面名单不用于限制，因为任何加强所述蛋白质表达为融合蛋白的载体多肽可用于本发明方法中。
在一个实施方案中，融合蛋白是GST-融合蛋白，在GST-融合蛋白中所述的序列融合至GST序列C-端上。在另一个实施方案中，融合蛋白是免疫球蛋白融合蛋白，其中整个或部分蛋白融合至源于免疫球蛋白家族成员的序列上。本发明的免疫球蛋白融合蛋白可用作免疫原以在受试者中产生抗体，纯化配体，并在筛选检测法中用以鉴定抑制蛋白质与配体相互作用的分子。
在本发明的一个实施方案中，融合蛋白具有修饰细菌细胞的功能特性的能力。“功能特性”是指细菌行使某些非天然的功能，例如与粘连、免疫刺激或溶解相关的那些功能的能力。所述的蛋白质包括但不限于抗体、酶、抗原、具有杀菌活性的蛋白或具有结合受体活性的蛋白质。“杀菌活性”是指杀死一种或多种细菌的能力。“结合受体活性”是指结合细胞膜、细胞表面或溶液中的受体的能力。评估革兰氏阳性细菌表面上表达的融合蛋白用作疫苗的能力的方法是本领域已知的(见，例如Fischetti等，(1996)Curr.Opin.Biotechnol.7659-666；Pouwels等，(1998)Int.J.Food Microbiol.41155-167)。
本领域的技术人员将理解可以根据纯化方案选择特定的载体多肽。例如，His标签、GST和麦芽糖结合蛋白质代表可以结合至很容易获得的亲和柱并容易洗脱的载体多肽。因而，如果所述载体多肽是N-端His标签例如六组氨酸(His6标签)，所述融合蛋白可使用含有金属螯合树脂的基质，例如次氨基三乙酸镍(Ni-NTA)、亚氨二醋酸镍(Ni-DDA)和含有钴的树脂(Co-resin)纯化。见，例如Steinert等，(1997)QI AGEN News 411-15，在这里将其通过全文引用作为参考。如果载体多肽是GST，所述融合蛋白可使用含有谷胱甘肽-琼脂聚糖珠的基质(Sigma或Pharmacia Biotech)纯化；如果载体多肽是麦芽糖-结合蛋白质(MBP)，所述融合蛋白可使用含有直链淀粉衍生的琼脂糖树脂的基质纯化。
优选地，本发明的嵌合蛋白或融合蛋白通过标准DNA重组技术生产。例如，编码不同多肽序列的DNA片段可以按读码框连接在一起，或者融合核苷酸序列可例如使用DNA自动合成仪合成。备选地，核酸片段的PCR扩增可使用在两个连续核酸片段之间产生互补突出端的锚定引物进行，所述的核酸片段随后可退火并再扩增以便产生嵌合的核酸序列(见，例如，Ausubel等，eds.(1995)Current Protocols inMolecular Biology) (Greene Publishing and Wiley-Merscience，NY)。而且，可将编码FOS相关蛋白的核酸克隆进可商业获得的表达载体中，这样其按读码框连接至存在的融合部分上。
通常设计融合蛋白表达载体用于容易移除载体多肽以便使蛋白保留与其相关的天然生物活性。用于裂解融合蛋白的方法是本领域已知的。参见，例如，Ausubel等，eds.(1998)Current Protocols inMolecular Biology(John Wiley & Sons，Inc.)。融合蛋白的化学裂解可使用试剂例如溴化氰、2-(2-硝基苯亚磺酰基)-3-甲基-3′-溴代假吲哚、羟胺或低的pH完成。化学裂解通常在变性条件下完成以便裂解不可溶的融合蛋白。
如果希望从载体多肽分离所述多肽并且在这些融合多肽之间接点处的切割位点不是天然存在，可设计融合构建体以包含特定的蛋白酶切割位点来促进酶促裂解并除去载体多肽。以这种方式，可在载体多肽(例如MBP、GST、SOD，或N-端His标签)的编码序列和所述多肽的编码序列之间融合进连接序列，所述的连接序列含有具有目标酶特异性切割位点的肽的编码序列。对切割位点具有特异性的合适的酶包括(但不限于)凝血因子Xa、凝血酶、肠激酶、remin、胶原酶和烟草蚀斑病毒(TEV)蛋白酶。这些酶的切割位点是本领域熟知的。因此，例如，如果凝血因子Xa用于从所述多肽裂解载体多肽，可设计融合构建体包含编码凝血因子Xa敏感性切割位点的连接序列，例如序列IEGR(见，例如，Nagai和Thogersen(1984)Nature 309810-812、Nagai和Thogersen(1987)Meth.Enzymol.153461-481，以及Pryor和Leiting(1997)Protein Expr.Purif.10(3)309-319，在此将其通过引用作为参考)。如果凝血酶用于从所述多肽裂解载体多肽，可设计融合构建体包含编码凝血酶敏感性切割位点的连接序列，例如序列LVPRGS或VIAGR(分别见，例如，Pryor和Leiting(1997)ProteinExpr.Purif.10(3)309-319和Hong等，(1997)Chin.Med.Sci.J.12(3)143-147，在此将其通过引用作为参考)。TEV蛋白酶的切割位点是本领域已知的。见，例如，在美国专利No.5,532,142中描述的切割位点，在此将其通过全文引用作为参考。也参见Ausubel等，eds.(1998)Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley& Sons，Inc.)，Chapter16中的论述。
抗体本发明分离的多肽可用作免疫原来产生特异性结合蛋白质的抗体，或用来刺激体内抗体的产生。可将全长蛋白质用作免疫原，或者备选地，可以使用在此描述的蛋白质的抗原性肽片段。蛋白质的抗原性肽包含在SEQ ID NO2或4或SEQ ID NO5-36的偶数号中列出的氨基酸序列或其变体或片段的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸残基，或在这里未叙述的5-50之间的任何数目的氨基酸残基，并且包含蛋白质的表位，这样使得产生的对抗所述肽的抗体与所述蛋白质形成特异性的免疫复合物。所述抗原性肽包含的优选表位是位于所述蛋白质表面的蛋白质区域，例如亲水性区域。
重组表达载体本发明核酸分子可包含于载体(优选表达载体)中。“载体”指能运送其连接的另一种核酸的核酸分子。表达载体包括一个或多个调控序列并引导它们有效连接的核酸的表达。“有效连接”是指目标核苷酸序列连接至调控序列，这样使得所述核苷酸序列能表达(例如，在体外转录/翻译系统中或当将所述载体介导进细胞中时在细胞中进行)。如此处使用的，关于序列的“异源性”是指源于外来种的序列，或者如果来自相同种，指通过人类有意干涉，在其基因组成和/或基因座位方面与天然形式相比经修饰的序列。例如，有效连接至异源多核苷酸的启动子来自不同于所述多核苷酸所起源的种的物种，或者如果来自相同的种/类似种，其中之一或两者都是从它们的初始形式和/或基因座位经充分修饰而来，或者所述启动子不是所述有效连接的多核苷酸的天然启动子。术语“调控序列”表示包括，例如可控的转录启动子、操纵子、增强子、转录终止子和/或其它表达控制元件例如翻译控制序列(例如SD共有序列、起始子和终止密码子)。这些调控序列取决于例如所使用的细胞而不同。
载体可在细胞中自主复制(附加型载体)，或可整合至细胞的基因组中，并与细胞的基因组一起复制(非附加型哺乳动物载体)。整合型载体通常包含至少一种与细菌染色体同源的序列，其使得重组在载体中的同源DNA和细菌染色体之间发生。整合型载体还可以包含噬菌体或转座子序列。附加型载体或质粒是可将另外的DNA片段连接进入的环状双链DNA。在使用DNA重组技术时，能稳定保持在宿主中的质粒通常是优选形式的表达载体。
本发明包含的表达构建体或载体包含适于在细胞中表达所述核酸的形式的本发明核酸构建体。原核细胞中的表达包含于本发明中。本领域那些技术人员将会理解，表达载体的设计可取决于要转化细胞的选择、期望的蛋白质的生产水平等因素。可将本发明的表达载体导入细胞中，从而产生由在此描述的核酸编码的蛋白质或肽，包括融合蛋白或肽(例如，蛋白质、突变形式的蛋白质、融合蛋白等)。
调控序列包括引导核苷酸序列组成型表达的那些序列以及只在某些条件下引导核苷酸序列诱导性表达的那些序列。细菌启动子是能结合细菌RNA聚合酶并起始编码序列(例如，结构基因)下游(3′)转录为mRNA的任何DNA序列。启动子具有转录起始区域，该起始区域通常位于邻近编码序列的5′端。该转录起始区域通常包含RNA聚合酶结合位点和转录起始位点。细菌启动子还可包含另一个称为操纵子的区域，所述的区域能够与邻近的RNA合成开始的RNA聚合酶结合位点交叠。所述的操纵子允许负调控(可诱导的)转录，因为基因阻遏蛋白可以结合至所述操纵子从而抑制特定基因的转录。组成型表达可在缺乏负调控元件例如操纵子的情况下发生。而且，正调控可通过基因激活蛋白结合序列完成，所述的序列如果存在，通常邻近(5′)于RNA聚合酶结合序列。
基因激活蛋白的实例是分解代谢物激活物蛋白(CAP)，其帮助大肠杆菌中的lac操纵子起始转录(Raibaud等，(1984)Annu.Rev.Genet.18173)。因此调控表达可以是正的或负的，从而增强或降低转录。正向和负向调控元件的其它实例是本领域已知的。可包括在蛋白质表达系统内的多种启动子包括(但不限于)T7/LacO杂合启动子、trp启动子、T7启动子、lac启动子和λ噬菌体启动子。任何合适的启动子可用于实施本发明，包括天然启动子或异源启动子。异源启动子可以是组成性激活的或可诱导的。异源启动子的非限制性实例在Kullen和Klaenhammer的美国专利No.6,242,194中给出。
编码代谢途径酶的序列提供了特别有用的启动子序列。实例包括源于糖代谢酶，例如半乳糖、乳糖(lac)(Chang等，(1987)Nature1981056)和麦芽糖的启动子序列。另外的实例包括源于生物合成酶例如色氨酸(trp)的启动子序列(Goeddel等，(1980)Nucleic AcidsRes.84057；Yelverton等，(1981)Nucleic Acids Res.9731；美国专利No.4,738,921；EPO出版物No.36,776和121,775)。β-内酰胺酶(bla)启动子系统(Weissmann(1981)″The Cloning ofInterferon and Other Mistakes，″in Interferon 3(ed.I.Gresser)；λ噬菌体PL(Shimatake等，(1981)Nature 292128)；阿拉伯糖诱导的araB启动子(美国专利No.5,028,530)和T5(美国专利No.4,689,406)启动子系统也提供了有用的启动子序列。也可参见Balbas(2001)Mol.Biotech.19251-267，其中讨论了大肠杆菌表达系统。
而且，非天然存在的合成启动子也可用作细菌启动子。例如，可将一种细菌或噬菌体启动子的转录激活序列与另一种细菌或噬菌体启动子的操纵子序列连接，产生合成的杂合启动子(美国专利No.4,551,433)。例如，tac(Amann等(1983)Gene 25167；de Boer等，(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.8021)和trc(Brosius等，(1985)J.Biol.Chem.2603539-3541)启动子是杂合trp-lac启动子，所述的杂合trp-lac启动子包含由lac抑制物调节的trp启动子和lac操纵子序列。tac启动子具有作为可诱导调控序列的额外性质。因此，例如，有效连接至tac启动子的编码序列的表达可通过加入异丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)而在细胞培养中诱导。而且，细菌启动子可以包括非细菌起源的天然存在的启动子，所述的启动子具有结合细菌RNA聚合酶并起始转录的能力。非细菌起源的天然存在的启动子还可以与兼容的RNA聚合酶偶联以在原核生物中产生一些基因的高水平表达。噬菌体T7 RNA聚合酶/启动子系统是偶联的启动子系统的实例(Studier等，(1986)J.Mol.Biol.189113；Tabor等，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.821074)。而且，杂合启动子也可以由噬菌体启动子和大肠杆菌操纵子区组成(EPO出版物No.267,851)。
载体可另外包含编码那个启动子的抑制物(或诱导物)的核酸。例如，本发明的可诱导载体可通过表达编码LacI阻遏蛋白的核酸来调控从Lac操纵子(LacO)的转录。其它实例包括使用lexA基因调节pRecA的表达，以及使用trpO来调节ptrp。可采用增加抑制程度(例如lacIq)或修饰诱导方式(例如λCI857，赋予λpL温度诱导性；或λCI+，赋予λpL化学诱导性)的此等基因的等位基因。
除了功能性启动子序列，有效的核糖体结合位点也可用于表达融合构建体。在原核生物中，核糖体结合位点称为SD(SD)序列并包括起始密码子(ATG)和位于所述起始密码子上游3-11个核苷酸处、长3-9个核苷酸的序列(Shine等人(1975)Nature 25434)。
据认为SD序列通过SD序列和细菌16SrRNA的3′末端之间的碱基配对来促进mRNA结合至核糖体(Steitz等，(1979)″GeneticSignals and Nucleotide Sequences in Messenger RNA，″inBiological Regulation and DevelopmentGene Expression(ed.R.F.Goldberger，Plenum Press，NY)。
蛋白质也可通过产生嵌合的DNA分子从细胞分泌，所述的嵌合DNA分子编码含有细菌中多肽分泌所需的信号肽序列的蛋白质(美国专利No.4,336,336)。所述的信号序列片段通常编码由引导蛋白质从细胞分泌的疏水性氨基酸组成的信号肽。蛋白质分泌进生长培养基(革兰氏阳性细菌)或分泌进周质空间，所述的周质空间位于细胞(革兰氏阴性细菌)的内膜和外膜之间。优选存在可在体内或体外裂解的加工位点，所述的位点在信号肽序列和蛋白质之间编码。
编码合适的信号序列的DNA可源于分泌的细菌蛋白的基因，例如大肠杆菌外膜蛋白基因(ompA)(Masui等，(1983)FEBS Lett.151(1)159-164；Ghrayeb等，(1984)EMBO J.32437-2442)和大肠杆菌碱性磷酸酯酶信号序列(phoA)(Oka等，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.827212)。其它原核信号序列包括，例如来自青霉素酶、Ipp或耐热肠毒素II先导序列的信号序列。
通常，细菌识别的转录终止序列是位于翻译终止密码子3′的调控区，并因而与启动子一起位于编码序列旁侧。这些序列引导mRNA的转录，所述的mRNA能翻译成由所述DNA编码的多肽。转录终止序列常常包括能够形成茎环结构的DNA序列(约50个核苷酸)，所述的茎环结构有助于终止转录。实例包括源于具有强启动子的基因，例如大肠杆菌的trp基因以及其它生物合成基因的转录终止序列。
表达载体具有多个用于序列插入的限制性酶切位点，这样以便其处于调控区的转录调控下。确保载体在细胞中维持的可选择标记基因也可包含于表达载体中。可选择标记的实例包括那些赋予对药物例如氨苄青霉素、氯霉素、红霉素、卡那霉素(新霉素)和四环素抗性的那些可选择标记(Davies等，(1978)Annu.Rev.Microbiol.32469)。可选择标记还可以使细胞能在基本培养基上生长，或在存在毒性代谢物时生长，并且可以包括生物合成基因，例如组氨酸、色氨酸和亮氨酸生物合成途径的那些生物合成基因。
如此处使用的，关于序列的“异源性”是指源于外来种的序列，或者如果来自相同种，指通过人类有意干涉在其组成和/或基因座位方面对天然形式经修饰而得到的序列。例如，有效连接至异源多核苷酸的启动子来自不同于所述多核苷酸起源的种的物种，或者如果来自相同的种/类似种，其中之一或两者都是从它们的初始形式和/或基因座位经充分修饰而来，或者所述启动子不是所述有效连接的多核苷酸的天然启动子。
调控区相对于本发明细胞和/或核苷酸序列可以是天然的(同源的)，或外来的(异源的)。调控区也可以是天然的或合成的。如果调控区相对于本发明核苷酸序列是“外来的”或“异源的”，这表示该调控区不是有效连接的本发明核苷酸序列天然的或自然存在的区域。例如，所述的区域可源于噬菌体。尽管序列可使用异源调控区表达，但也可以使用天然的区域。在一些情况中将期望这些构建体以改变蛋白质在细胞中的表达水平。因此，可改变细胞的表型。
在制备表达盒时，可操纵多种DNA片段，以提供正常定向的DNA序列并且，如果合适，在正常的读码框中提供。为此目的，可采用接头或连接序列来连接DNA片段或可采用其它操作以提供便利的限制性酶切位点、移除多余的DNA、除去限制性酶切位点等。为此，可能涉及体外诱变、引物修补、限制性酶切、退火、再置换例如转换和颠换。
本发明进一步提供重组表达载体，所述重组表达载体含有以反义方向克隆进表达载体的本发明DNA分子。也就是说，将所述DNA分子以允许与mRNA反义的RNA分子的表达(由所述DNA分子的转录)的方式有效地连接至调控序列。可选择有效连接至以反义方向克隆的核酸分子的调节序列来引导所述反义RNA分子的连续性或诱导性表达。反义表达载体可以是重组质粒或噬菌粒形式，其中反义核酸在高效调控区的控制下产生，所述表达载体的活性可由介导所述载体进入的细胞类型确定。对于使用反义基因的基因表达调控的讨论参见Weintraub等，(1986)Reviews-Trends in Genetics，Vol.1(1)。
备选地，一些上面描述的成分可一起置于转化载体中。转化载体通常包含可选择标记，所述标记维持在复制子中或发展进入整合载体中，如上描述。
微生物或细菌细胞含有本发明核酸序列或蛋白质的细菌的生产、这些细菌的起子培养物的制备和发酵底物，特别是食物底物例如牛奶的方法可根据已知的技术实施。(见，例如，Gilliland，S.E.(ed)Bacterial StarterCultures for Food，CRC press，1985，205pp.；Read，G.(Ed.)Prescott and Dunn′s Industrial Microbiology，4thEd.，AVIPublishing Company，Inc.1982，883 pp.；Peppler，JJ.和Perlman，D.(Eds.)Microbial TechnologyVolume II，FermentationTechnology，Academic Press，1979，536pp.)。
“发酵”是指微生物引起的有机化合物的产能、代谢分解，所述的产能、代谢分解通常在厌氧条件下进行并放出气体。
适用于核酸分子的“引入”是指通过常规的转化或转染技术，或通过噬菌体介导的感染引入细胞(例如原核细胞)中。如在这里使用的，术语“转化”、“转导”、“接合”和“原生质融合”意在指多种用于将外来核酸(例如DNA)引入细胞中的本领域公认的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质转染法或电穿孔术。用于转化或转染细胞的合适的方法可以在Sambrook等，(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual(2d ed.，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Plainview，NY)和其它实验室手册中找到。适用于本发明多肽或微生物的“引入”是指通过摄取、局部施用、鼻部施用、泌尿生殖器施用、栓剂施用或经口施用将多肽或微生物引入至宿主中。
用于产生本发明多肽的细菌细胞在合适的培养基中培养，如在Sambrook等，(1989)Molecular Cloning，A Laboratory Manual(2ded.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，NY)中的一般性描述。
调控草酸盐降解提供了用于降解草酸盐的方法和组合物。草酸盐通过一系列的酶促反应分解代谢。草酸盐降解的两种一般机制包括脱羧产生甲酸和CO2和氧化产生过氧化氢和CO2。脱羧作用可有氧或厌氧地完成，而氧化作用是严格需氧的。在脱羧反应中，草酸盐通过甲酰辅酶A转移酶(甲酰-CoA转移酶；E.C.2.8.3)还原，所述的转移酶通过循环甲酰-CoA的CoA部分来活化草酸盐分子。接下来，草酰-辅酶A脱羧酶(草酰-CoA脱羧酶；E.C.4.1.1.8)使活化的草酸盐分子脱羧。如这里说明的，草酸盐降解这种途径已经在嗜酸乳杆菌中确定。图2提供了这种草酸盐降解途径的示意图。因此，本发明提供了涉及调控草酸盐降解的方法和组合物。
提供了含有在SEQ ID NO1和2中列出的降解草酸盐的多核苷酸和多肽的组合物。SEQ ID NO1和2编码甲酰-CoA转移酶家族的成员。如在此使用的，“甲酰-CoA转移酶活性”催化甲酰-CoA的CoA转移至草酸盐或琥珀酸盐。检测这种活性的方法是已知的。参见，例如Baetz等，(1990)Journal of Bacteriology 1723537-3540，在这里将其通过引用作为参考。这些序列，以及其变体和片段可用于调控目标生物体的草酸盐降解活性。
进一步提供的是含有在SEQ ID NO3和4中列出的降解草酸盐的多核苷酸和多肽的组合物。SEQ ID NO3和4编码草酰-CoA脱羧酶。如在此使用的，具有“草酰-CoA脱羧酶活性”的多肽使活化的草酸盐分子脱羧。检测这种活性的方法是已知的。例如，草酰-CoA的消耗和甲酰-CoA的产生可通过毛细管电泳监控。参见，例如，Federici等，(2004)Applied and Environmental Microbiology 705066-5073和Lung等，(1994)Journal of Bacteriology 1762468-2472，在此将其每个通过引用作为参考。这些序列，以及其变体和片段可用于调控目标生物体的草酸盐降解活性。
本发明组合物进一步包括多种多核苷酸和多肽，所述的多核苷酸和多肽在响应pH6.8下的1％草酸铵时在嗜酸乳杆菌中差异表达。这种多肽和多核苷酸在SEQ ID NO5-36中列出。在一个实施方案中，这种序列可用于调控草酸盐降解或用于在此公开的任何其它方法。
如此处使用的，术语“草酸盐降解”和“草酸盐减少”活性是可互换的并且两者都指草酸盐的减少或降解。草酸盐降解活性包括甲酰-CoA转移酶活性、草酰-CoA脱羧酶活性，或在降低样品中的草酸盐水平的酶促途径中采用的任何活性。如在此定义的“调控草酸盐降解”是指当与合适的对照比较时，样品中草酸盐水平的任何统计学上的显著增加或减少。因此，草酸盐降解序列或微生物的有效浓度是足以调控草酸盐降解的浓度。测量草酸盐降解的检测法包括(但不限于)上面讨论的关于甲酰-CoA转移酶活性和草酰-CoA脱羧酶活性的检测法。此外，用于草酸盐降解的检测法包括直接测量草酸盐浓度。参见，例如Duncan等，(2002)Applied and Environmental Microbiology683841-3847，在此通过引用作为参考。
在一个实施方案中，用至少一种编码本发明的草酸盐降解序列的多核苷酸，或其生物活性变体或片段转化合适的宿主细胞，并因而与在合适的宿主对照细胞中发现的活性比较赋予了所述转化的宿主细胞受到调控的草酸盐降解活性(即，草酸盐降解活性增加或减少)。宿主可以包括，例如特别适合口服施用和/或在肠道建群的微生物。备选地，宿主可以是植物或植物细胞，其一旦转化，将会产生期望的草酸盐降解多肽并从而当摄入该植物材料时使肠道获得这些活性。备选地，转化的植物由于通过转化产生的多肽的作用而具有较低量的草酸盐，并因而当消费时，所述的植物不会提供给食物与非转化植物提供的草酸盐一样多的草酸盐。降解草酸盐的多核苷酸也可用于合成或离体系统以提供具有降解草酸盐活性的蛋白质。
组合物进一步包含能够降解草酸盐的微生物。在一个实施方案中，微生物包括这样一细菌，所述的细菌具有第一核酸，所述的第一核酸包含在SEQ ID NO1中列出的核酸或其生物活性变体或片段；以及具有第二核酸分子，所述的第二核酸分子含有在SEQ ID NO3中列出的核苷酸序列或其生物活性变体或片段，其中第一核酸分子或第二核酸分子的至少一种是与所述细菌异源的，并且第一和第二核酸分子有效连接至在该细菌中有活性的启动子。在一个特定的实施方案中，两种核酸都与微生物异源。
在本发明方法和组合物中采用的微生物可包括益生菌、乳酸菌、乳杆菌或嗜酸乳杆菌。其它的目的微生物包括(但不限于)产甲酸草酸杆菌、假单胞菌(Pseudomonas)、梭状芽孢杆菌(Clostridia)或双歧杆菌。可以理解，采用的天然微生物能够降解草酸盐，但还包括不能降解草酸盐的微生物，例如细菌或真菌，并因此当用本发明异源的降解草酸盐的多核苷酸转化时，赋予了降解草酸盐的能力。表达和分离草酸盐降解多肽的方法或多种用于将这些序列引入微生物中的方法是本领域已知的并在这里的其它地方详细地公开。
本发明还包括具有经调控的草酸盐降解活性的受试者(即动物，包括人类和非人类动物，例如家畜、耕畜或外来的动物)。在特定的实施方案中，这些受试者具有增强的减少草酸盐的能力。这些具有增强的草酸盐降解能力的动物可用作研究草酸盐相关疾病的体内模型。
提供了方法来调控细胞或生物体的草酸盐降解能力。在一种方法中，提供本发明的草酸盐降解序列给细胞来增强或抑制所述细胞的草酸盐降解能力。在其它方法中，将组合物施用给植物或动物以改变植物或动物的草酸盐水平，所述的组合物含有本发明草酸盐降解序列和/或表达本发明草酸盐降解序列的降解草酸盐的微生物。方法还包括食物添加方法，例如将本发明组合物在食物中或与食物一起施用给动物以便改变所述食物中或在消化所述食物期间的草酸水平。
进一步提供的是用于减少草酸盐水平以便治疗或预防与草酸盐相关的病症的方法。“与草酸盐相关的病症”指导致受试者中草酸盐水平升高的任何病症。可以受益于预防性治疗的受试者包括(但不限于)其草酸盐降解细菌由于例如抗菌处理或术后情况而减少的个体或动物。本发明的方法也可用于治疗这样的个体或动物，所述的个体和动物具有草酸盐降解细菌的菌落，但是其仍然具有不健康水平的草酸盐，所述的不健康水平的草酸盐是由于例如，草酸盐易感性和/或内源草酸盐的过度产生而引起。不用于限制的与草酸盐相关的病症包括高草酸盐尿、原发性尿草酸盐过多、特发性草酸钙肾结石病(尿石病)、肠原性尿草酸盐过多、外阴痛(vulvodynia)、终末期肾脏疾病相关的草酸盐沉着症、心传导疾病(cardiac conductance disorder)、炎性肠病、克罗恩病和溃疡性结肠炎。
“治疗”指具有与草酸盐相关病症的受试者中的任何改善。所述的改善可以表征为受试者中草酸盐水平的任何统计学上的显著减少。因此，“阳性治疗反应”包括完全的反应(即减少至正常的草酸盐水平)和部分反应(即草酸盐水平的任何统计学上的显著减少)。可以使用多种检测法来测量肠、肾脏、粪便或多种细胞液或体液如血液或尿中存在的草酸盐的水平。参见，例如，Duncan等，(2002)Appliedand Environmental Microbiology 683841-3847。
用于治疗与草酸盐相关的病症的方法包括施用含有本发明的一种或多种草酸盐降解微生物和/或草酸盐降解多肽的组合物。可以分离在本发明方法中施用的草酸盐降解多肽或可将它们作为细胞溶解产物施用。所述的细胞溶解产物可以从任何表达本发明的草酸盐降解序列或其生物活性变体或片段的宿主细胞制备。在一个实施方案中，所述的细胞溶解产物来自噬酸乳杆菌。在一个特定的实施方案中，施用的草酸盐降解序列包含本发明的一种或多种草酸盐降解序列，所述的序列是例如(但不限于)SEQ ID NO1、2、3或4或其生物活性变体或片段。在其它实施方案，施用的序列包括在SEQ ID NO5-3 6中列出的一个或多个序列或其生物活性变体或片段。也可以施用提高草酸盐降解活性的其它因子。
进一步提供的是含有本发明的一种或多种降解草酸盐的微生物和/或草酸盐降解多肽和/或细胞溶解物的组合物，所述的组合物用作药物。也提供的是组合物在生产用于治疗与草酸盐相关的病症的药物中的用途，所述组合物含有本发明的一种或多种降解草酸盐的微生物和/或草酸盐降解多肽。
本发明也进一步提供含有本发明的一种或多种降解草酸盐的微生物和/或草酸盐降解多肽和/或细胞溶解产物的组合物的用途，所述的组合物用于生产用于治疗非限制性的与草酸盐相关的病症的药物，所述的病症包括一种或多种高草酸盐尿、原发性尿草酸盐过多、特发性草酸钙肾结石病(尿石病)、肠原性尿草酸盐过多、外阴痛、终末期肾脏疾病相关的草酸盐沉着症、心传导疾病、炎性肠病、克罗恩病和溃疡性结肠炎。
当采用表达本发明的至少一种降解草酸盐的多核苷酸的降解草酸盐的微生物时，所述微生物及其子代在受试者的肠内复制并从肠道中除去草酸盐，因而减少了可用于吸收的草酸盐的量，这导致增加的草酸盐从血液排泄进肠内。
取决于人或动物的与草酸盐相关的病症的严重性或肠或体液内的草酸盐的量，这种组合物可以一天施用一次或多次，施用一天或多天。只要人或动物中存在有害的草酸盐水平，可以持续所述的治疗。仍然在另一实施方案中，施用所述的组合物以通过减少肠道中草酸盐的量来降低发展与草酸盐相关的疾病的风险。肠道内的这种减少导致系统性的草酸盐水平降低，因而促进好的健康状态。
为了治疗或预防与草酸盐相关的病症，施用治疗有效量的草酸盐降解多肽、含有减少草酸盐的多肽的草酸盐降解微生物、具有来自草酸盐降解多肽的细胞溶解物的细胞。“治疗有效量”指足以引起治疗效果的本发明的草酸盐降解微生物和/或多肽的浓度。因而，施用剂量单位中的本发明的草酸盐降解微生物和/或多肽的浓度在治疗或预防与草酸盐相关的病症方面是有效的。治疗有效量将取决于许多因素，所述的因素包括例如，与草酸盐相关的疾病的严重性、患者的反应性、患者的重量、连同要考虑的其它个体间差异性(intrapersonalvariability)、施用的方法以及使用的草酸盐降解微生物和/或多肽制剂。因而所述的草酸盐降解组合物以由个体需要所确定的间隔来施用。可能需要单次的、周期性的或定期的施用。方法也包括施用这种组合物每天多于一次、每天多于两次、每天多于三次以及每天是1-15次。这种施用可以是连续数周、数月或数年(其间每天施用)，或可以以特定次数进行来治疗或预防与草酸盐相关的病症。
本发明的组合物包含可药用的制剂。例如，本发明的方法和组合物包含提供所述组合物(即草酸盐降解酶或草酸盐降解微生物)至目标位置如递送所述组合物至受试者的肠/粘膜区域的剂量递送系统。药物组合物包括草酸盐降解细菌或一种或多种草酸盐降解多肽，单独的或在包括细菌或多肽的组合物中，所述的细菌或多肽已经以液体或糊剂的形式冻干或冷冻并包封于凝胶胶囊、微型胶囊或其它肠保护剂中。肠保护包衣可用于保护所述的组合物免受胃酸的不利影响。这种肠溶衣包括使用醋酸邻苯二甲酸纤维素(CAP)。包囊化技术的另外描述包括美国专利No.5,286,495，将其在此通过引用作为参考。然后释放的组合物转化肠内存在的草酸盐为无害的产物。也可以将载体与细菌或多肽结合。这些可以包括，例如，盐水-磷酸盐缓冲液。
在其它实施方案中，不同的食品可以用本发明的草酸盐降解组合物补充。随后可将这种食品施用给受试者。可以采用多种方法来生产这种食品，包括例如，将食物原料与本发明的减少草酸盐的组合物掺合。例如，可将酸奶培养物、最终的酸奶食品、牛奶、乳酪或肉产品与本发明的草酸盐降解微生物掺合。而且，可以使用已知的转化技术产生表达本发明的减少草酸盐的酶的植物。一旦摄入后，当食品为肠所消化并吸收时，所述的草酸盐降解组合物(包括一种或多种微生物、一种或多种多肽或其组合)降解肠中存在的草酸盐因而减少草酸盐吸收进血流中。
应该理解，本发明的草酸盐降解序列可以与其它已知调控草酸盐降解的序列结合使用。多种草酸盐降解酶和编码这些酶的基因是已知的并且包括，例如，在美国专利No.5,912,125；6,090,628和6,214,980中列出的那些酶。将这些专利在此将其通过全文引用作为参考。术语草酸盐降解酶包括(但不限于)草酸盐氧化酶、草酸盐脱羧酶、草酰-CoA脱羧酶和甲酰-CoA转移酶，并且包括能与草酸盐或草酸相互作用的酶。这些酶可以源于天然来源或用本领域已知的重组手段合成，并且包括所有能与草酸盐或草酸相互作用的片段，例如结合位点、活性位点或片段。该术语也包括(但不限于)所有必需的辅因子、辅酶、金属或该酶与草酸盐或草酸相互作用所需的结合物质或底物物质。本发明也考虑这些酶的任何结合伴侣并且包括结合至所述酶或与所述酶相互作用的抗体和抗体片段。
额外的使用方法提供了方法，其中改变了在发酵中使用的微生物的特性以提供允许更有效的和/或更经济的生物过程的菌株，或提供更能在作为益生菌施用了该菌株的宿主的胃肠道存活、生长和/或建群或居住的菌株。
在一个实施方案中，本发明的多核苷酸或多肽的表达或过度表达可以调控细菌的生长速率。“生长速率”表示生物体或培养物生长速率的度量。当微生物以指数生长速率生长于连续的液体培养物中时，细胞量的增加可以以特定生长速率常数(μ)表达dP/dt＝μ×P，其中P是细胞量，t是时间。“过度表达”表示目标蛋白质在经修饰的细菌中与其在野生型细菌中的产量相比以增加的量产生。测量细菌的生长速率的检测法是本领域已知的(参见，例如，Bruinenberg等，(1992)Appl.Environ.Microbiol.5878-84)。
提供了用于在受试者中增加草酸盐降解的方法，所述的方法包括将脂酶或酯酶引入受试者中。在一个实施方案中，所述的蛋白质在用于发酵乳制品的生物体中表达，并且受试者摄入该产品。在另一实施方案中，将所述的多肽本身加入至食品中。草酰-CoA脱羧酶在受试者肠道中的表达可以有助于降低血液或尿中的草酸盐的浓度(参见，例如，Troxel等，(2003)J.Endourol.17173-176；Lung等，(1991)Am.J.Kidney Dis.17381-385；Sidhu等，(1999)J.Am.Soc.Nephrol.Suppl 14S334-S340)。
表1.本发明的核酸和蛋白质
根据前面描述和相关附图中的教导，这些发明所属领域的技术人员将理解在此列出的本发明的许多修改和其它实施方案。因而，应该理解本发明不受限于公开的特定实施方案，并应该理解修改和其它实施方案有意包含于附加的权利要求书的范围内。尽管在这里采用了特定术语，但它们仅以一般性的和描述性的方式使用而不是为了限制目的。
以举例说明的方式而不是以限定的方式提供下列实施例。
试验实施例1.含有frc和oxc的染色体区域的分析草酸可以在膳食来源(如咖啡、茶、巧克力)或通过肠道微生物群或通过非酶促降解从一些代谢前体(如抗坏血酸)产生。在人的肠道中，其可能与钙、纳、镁或钾结合形成不容易溶解的盐，引起病理性障碍(人中的高草酸盐尿、吡哆醇缺乏症、尿石症和肾衰竭)。含有与甲酰辅酶A转移酶(frc)和草酰辅酶A脱羧酶(oxc)同源的基因的操纵子在益生噬酸乳杆菌的基因组中得以鉴定。这些基因(先前在乳杆菌中没有描述)据推测负责这些生物体中的草酸盐降解。使用cDNA微阵列的转录分析和逆转录定量PCR显示轻度的酸性条件是frc和oxc转录的先决条件。因而，噬酸乳杆菌这些基因的依赖草酸的诱导仅在先前适应于草酸的亚抑菌浓度的曝露于pH5.5的细胞中完成。与野生型菌株比较，使用含有缺失型frc基因(frc-)的突变体的生理学分析确认，frc表达特异性地影响在pH3.5的草酸下的存活。将含有噬酸乳杆菌NCFM的97.5％基因的全基因组微阵列用于鉴定用以摄入解离的草酸盐进细胞的候选基因。其中基因组信息是可利用的，乳酸菌的其它成员用来筛选frc和oxc基因。除了加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)NCK334和动物双歧杆菌(Bifidobacteriumanimalis)，其它菌株中没有一个含有用于草酸盐利用的基因。
噬酸乳杆菌NCFM的基因组序列(Altermann等，(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1023906-3912)揭示一种操纵子的存在可能涉及草酸分解代谢(图1)。该预测的操纵子由甲酰-CoA转移酶(LBA0395，frc)和草酰-CoA脱羧酶(LBA0396，oxc)组成，它们在互补链上编码(图1)。高能rho-依赖的终止子可以预测在下游LBA0397(Δ-11.4Kcal/mol)和LBA0395(Δ-14.6Kcal/mol)。此外，在oxc的上游定位一个典型的RBS序列(agaagg)(离起始处7nt)和推定的启动子。
frc的下游基因(LBA0394)也在互补链上编码并且其推定的产物是395个氨基酸(aa)的蛋白质，其几乎等同(90％的同一性，E值为0.0)于预测的来自加氏乳杆菌NCK334(登记号ZP_00046082)的酰基-CoA转移酶/肉碱脱水酶。其也显示了与来自大肠杆菌K12(登记号NP_416872)推定的甲酰-CoA转移酶44％的同一性以及与大肠杆菌胆酸诱导操纵子的推定的蛋白质F(登记号BAA16242)44％的同一性。在该蛋白质中存在一个属于CoA-转移酶新家族的保守结构域(pfam02515)。大多数CoA-转移酶属于两个熟知的酶家族，但是最近描述了CoA-转移酶的第三个家族(Heider(2001)FEBS Lett.509345-349)。这个酶家族的成员是草酰-CoA-转移酶、琥珀酸酰-CoA(R)-苄基琥珀酸酯CoA-转移酶、(E)-肉桂酰基-CoA(R)-苯基乳酸酯CoA转移酶和丁酰甜菜碱基-CoA(R)-肉碱CoA-转移酶。
LBA0395编码445个氨基酸长度的蛋白质并且与LBA0394具有30％的同一性(48％相似性)。而且，LBA0395高度类似于来自加氏乳杆菌预测的酰基-CoA转移酶和来自大肠杆菌K12的甲酰-CoA转移酶。然而，与LBA0394相反，LBA0395也显示了与由frc(来自产甲酸草酸杆菌的甲酰-CoA转移酶基因)编码的蛋白质有44％的同一性(61％的相似性)(Sidhu等，(1997)J.Bacteriol.1793378-3381)，所述的frc编码的蛋白质是被鉴定的CoA转移酶的家族III的第一个成员。
LBA0396编码一个569个氨基酸的蛋白质，所述的蛋白质类似于来自产甲酸草酸杆菌的草酰-CoA脱羧酶(EC4.1.1.8)(53％的同一性和71％的类似性；Lung等，(1994)J Bacteriol.1762468-2472)和来自乳酸双歧杆菌的草酰-CoA脱羧酶(46％的同一性和63％的类似性，Federici等，(2004)Appl.Environ.Microbiol.705066-5073)。由LBA0396编码的蛋白质表现出一个存在于需要硫胺素焦磷酸(TTP)的酶中的保守结构域。该结构域也存在于数种酶中，所述的酶包括乙酰乳酸合酶、丙酮酸脱氢酶(细胞色素)、乙醛酸醛连接酶和磷酸丙酮酸脱羧酶。而且，在LBA0396中，N-末端TPP-结合结构域(pfam02776)从第7个氨基酸残基开始并横跨171个氨基酸，并且中心的TPP结构域(pfam00205)从第197个氨基酸残基开始并横跨154个氨基酸。
Oxc上游的LBA0397编码一个639个氨基酸的蛋白质，所述的蛋白质显示保守的结构域COG0488，即Uup，其对应于具有相同两个ATP酶结构域的ABC转运蛋白的ATP酶组分(Holland和light(1999)J.Mol.Biol.293381-399)。观察到与由加氏乳杆菌和约氏乳杆菌编码的等价蛋白有高度的同一性(超过75％)。
筛选了其它乳酸菌的frc和oxc相关基因。加氏乳杆菌NCK334(登记号ZP_00046991)和动物双歧杆菌(登记号AB163432.1)除外，其它菌株，包括植物乳杆菌WCFS1(Kleerbezem等，(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1001990-1995)和约氏乳杆菌，其为有名的益生菌(Pridmore等，(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1012512-2517)，都不含有用于草酸盐利用的基因。
实施例2.使用微阵列的oxc操纵子的转录分析产甲酸草酸杆菌中草酸盐/甲酸盐的逆向转运与草酸盐脱羧作用相偶联并且产生质子运动梯度(Abe等，(1996)J.Biol.Chem.2716789-6793)。鉴于我们不能通过计算机分析嗜酸乳杆菌基因组来鉴定推断的草酸透酶/逆向转运蛋白这个事实，我们进行了微阵列试验来试图鉴定可能负责草酸盐特异性转运进细胞的候选蛋白。
在嗜酸乳杆菌在补充葡萄糖的MRS培养基中生长期间，由于发酵以及乳酸产生，开始为6.5的培养物的pH通常降低。NCFM可以很好地耐受适度的酸性条件(pH约5.5)。将含有97.4％的NCFM评注基因的全基因组阵列(WGA)用于鉴定在适度酸性条件下差异表达的基因(GEO登记号GPL1401[platform]和GSE1976[series]；4)。曝露于pH5.5中30分钟后，我们观察到分别编码推断的甲酰-CoA转移酶(frc)和草酰-CoA脱羧酶(oxc)的开放阅读框LBA0395(3.2倍)和LBA0396(4.5倍)的一致诱导(图2)。在本试验中，嗜酸乳杆菌的WGA用于分析细胞在pH6.8下曝露于70mM草酸铵30分钟后整体的基因表达。十六个基因显著得以上调(P≤0.05并且倍数变化＞2.0，表2)以及315个基因得以下调(P≤0.05并且倍数变化＞0.5)。在该条件下frc和oxc基因都得以下调。最上调的基因是镉/锰转运ATP酶(LBA1234)和两个未鉴定的膜蛋白(LBA1119和LBA1690)。开放阅读框LBA0038、LBA0039、LBA0040和LBA0041得以上调(在1.43和2.45倍之间)。这四个基因(在后随链上编码)显示形成一个操纵子。LBA0041编码一种推定的依赖腺苷钴胺素(AdoCb1)的核苷三磷酸还原酶。开放阅读框LBA0038、LBA0039和LBA0040没有很好了解，然而LBA0040类似于推定的ATP钴胺素腺苷酰转移酶(Johnson等，(2001)J.Bacteriol 1831577-84)，其为负责激活维生素B12(氰钴胺素，CNCb1)为辅酶B12(AdoCb1)中最后步骤的酶。这些基因在存在草酸铵时得以上调的原因需要进一步研究。
表2.在pH6.8下嗜酸乳杆菌NCFM对1％草酸铵反应的差异表达的基因。
实施例3.通过RTO-PCR的oxc操纵子的转录分析在存在和缺少作为操纵子表达诱导物的草酸铵时评估了frc和oxc的酸诱导。设计了符合RTQ-PCR标准的引物用于基因LBA0394、LBA0395(frc)、LBA0396(oxc)和LBA0397。而且，因为LBA0394显示了与胆汁-可诱导的蛋白的一些同源性(见上)，我们也设计了用于NCFM基因组中的两个开放阅读框的RTQ-PCR引物，所述的开放阅读框编码胆盐水解酶LBA0872(bsh1)和LBA1078(bsh2)。
通过三次连续转移进含有0.05％草酸铵(非抑制性浓度)的MRS培养液中让嗜酸乳杆菌适应草酸盐。然后将预先-曝露或没有曝露于该化合物的细胞转移至pH5.5(用乳酸调节)的MRS培养液，并随时间提取样品。在任何检测的条件下开放阅读框LBA0397、bsh1和bsh2(没有显示)没有表达。LBA0394的表达是基础且恒定的。相比之下，在曝露于pH5.5的细胞中frc和oxc基因高度表达(图3A)。当嗜酸乳杆菌细胞在存在草酸铵时增殖并且随后曝露于pH5.5的0.5％的草酸铵时，frc和oxc表达显著增加(图3B)。随后，将细胞预先曝露于草酸盐或不曝露于草酸盐，并然后将其再悬浮于含有0.5％的草酸铵(pH＞6.0)的MRS中。然而，在更高的pH下，没有观察到诱导任何研究的基因(数据没有显示)。
实施例4.frc失活和突变表型分析使用了整合质粒pORI28，其为源于pWV01的载体(Law等，(1995)J.Bacteriol.1777011-7018)，用以用缺失型frc基因代替frc基因。用嗜酸乳杆菌NCFM染色体DNA作为模板扩增了含有frc的1.42-kb的片段，并克隆进pORI28中。随后，通过反向PCR扩增和后面自我连接除去72bp的所述克隆片段。然后将得到的3.04kb的质粒pTRK837通过电穿孔介导进含有辅助质粒pTRK669的嗜酸乳杆菌NCFM中。随后的促进整合事件和基因替代的后续步骤根据先前描述的方法(Russell和Klaenhammer(2001)Appl.Environ.Microbiol.674361-4364和Bruno-Barcena等(2005)FEMS Microbiol.Lett.24691-101)进行。使用frc的内部片段作为探针的PCR和DNA杂交试验确认了基因替代的发生。
将野生型(嗜酸乳杆菌NCFM；wt)和frc-菌株在pH4.0、3.5和3.0下存活的细胞对数(OD600＝0.3)进行比较，使用盐酸(HCl)、乳酸和草酸来酸化MRS培养液。当HCl或乳酸用于酸化所述培养基时在wt和突变体之间没有观察到不同。而且，存在5％的草酸时，在pH4.0(＞50％的存活)或3.0(＜0.01％的存活)下菌株间没有观察到不同。然而，在pH3.5下2小时后frc-对5％(w/v)的草酸更敏感。
因为草酸盐的加入引起MRS培养液的沉淀，对对照株和突变株在半合成培养基(BM)中在存在草酸盐时耐受和/或生长的能力进行了检测(图4)。对于两种嗜酸乳杆菌菌株，在BM中的生长速率相似(在含有0.1％葡萄糖的BM中为0.7h-1)。当存在葡萄糖时加入0.1％或0.5％的草酸铵(C2H8N2O4)至所述培养基时，菌株之间没有观察到不同，因为在存在0.5％C2H8N2O4时两种菌株的生长速率都下降(对照株为0.48h-1以及突变株为0.52h-1)。有趣地是，当0.5％的C2H8N2O4加入至没有葡萄糖的培养基时观察到了7小时的停滞期，这表明菌株需要解除这种化合物的毒性来生长。
最后，测量了NCFM和frc突变体两者中的草酸盐浓度(图6)。将乳杆菌菌株在没有柠檬酸盐(BMcit)的BM培养液中连续转移3天，所述的培养液含有1％的葡萄糖和3.5mM的草酸铵。3天后，将100μl的细胞在相同的培养基中孵育并生长至0.6的A600，离心并再悬浮于含有0.1％的葡萄糖和35mM的草酸铵(32mM草酸盐)的BMcit-中。随时间过去提取样品，离心，用1N氢氧化钠中和至5-7之间的pH(根据生产商的说明书)并在-20℃下保存。基于草酸盐氧化酶对草酸盐的氧化，用诊断草酸盐试剂盒(Trinity Biotech，Co Wicklow，Ireland)将上清液中草酸盐浓度测量三次。
如图6中显示了，在对照株中培养物上清液中草酸盐的含量显著降低(多达23.6％)，而在突变菌株中其中的草酸盐含量降低了5.8％。在培养物生长的开始的16小时期间，大多数的草酸盐发生降解。结果表明嗜酸乳杆菌能降解草酸盐，并且frc参与该过程。
实施例5.来自嗜酸乳杆菌的草酰-CoA脱羧酶和甲酰-CoA转移酶的转录和功能分析的总结使用嗜酸乳杆菌NCFM的全基因组微阵列的试验(Azcarate-Peril等，Appl Environ.Microbiol，(出版中))显示在适度的酸性pH下一致诱导了开放阅读框LBA0395和LBA0396。这些基因和相邻基因与在Genbank中存在的序列的比较分析鉴别了甲酰-CoA转移酶(frc)和草酰-CoA脱羧酶(oxc)，其与来自产甲酸草酸杆菌的frc和oxc高度相似。在嗜酸乳杆菌中，frc和oxc显示形成了操纵子并且在互补链上编码。RTQ-PCR和微阵列试验确认，草酸盐(pH＞5.8)不直接诱导frc和oxc的表达，其在酸性条件下诱导。然而，当将嗜酸乳杆菌反复转移进含有非抑制性浓度的草酸铵的培养液中并随后曝露于pH5.5下时，这些基因(特别是frc)的表达显著增加。而且，当失活frc并且将突变体菌株曝露于酸性pH时，证明在pH3.5下特异性地对草酸更易受影响，表明frc涉及嗜酸乳杆菌对草酸盐的解毒作用。而且，frc-突变体不能降解草酸盐并且明显低于野生型菌株，所述的野生型菌株表现了23.56％的草酸盐降解活性。
数位作者已经讨论了肠胃道的固有微生物的概念(综述参见33)。实际上，Tannock基于以下三个重要的特征提出了简明的定义与宿主长期关联、在消化道的特定区域有稳定的群体以及证明了的生态功能。草酸盐广泛地存在于自然界并且富草酸盐食物是膳食中重要的草酸盐来源。特异性降解草酸盐的细菌的存在可以通过阻碍吸收、分解代谢游离的草酸盐并增强草酸盐从循环系统除去来调节宿主的草酸盐平衡。从而，解除这种化合物毒性的能力潜在地说明了嗜酸乳杆菌的新的生态功能。
从人胃肠道分离的其它降解草酸盐的细菌包括迟缓真杆菌(Eubacterium lentutn)(Ito等，(1996)In t.J.Urol.331-34)和粪肠球菌(Enterococcus faecalis)(Hokama等，(2000)Microbiol.Immunol.44235-240)。所述的作者在厌氧条件下从人粪便分离了降解草酸盐的粪肠球菌，并且他们使用对抗产甲酸草酸杆菌的Frc和Oxc的抗体通过蛋白质印迹法鉴定了甲酰-CoA转移酶和草酰-CoA脱羧酶。Campieri等(Campieri等，(2001)Kidney Internat.601097-1105)测量了用8×1011LAB(包括嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、短乳杆菌(L.brevis)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)和婴儿双岐杆菌(Bifidobacterium infantis))处理的患有特发性草酸钙尿石病的患者中的草酸盐的降解。他们观察到排泄的草酸盐的减少，以及体外的减少，特别是通过嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌引起的减少(甚至当它们的生长为这种化合物部分抑制时)。然而，负责这些微生物降解草酸盐的基因没有鉴定。更近来，草酰-CoA脱羧酶基因在乳双岐杆菌(B.lactis)得以鉴定，并且该酶的降解草酸盐活性通过基于毛细管电泳的方法得以确认(Federici等，(2004)Appl.Environ.Microbiol.705066-5073)。因此，胃肠道中的草酸盐分解代谢可能是一些共生菌和益生菌的一个重要特性。
在其它降解草酸盐的生物体如产甲酸草酸杆菌中，草酸盐的利用与能量产生偶联，通过草酸盐和甲酸盐的逆向转运产生。我们不能通过计算机分析鉴定将分离的草酸盐整合进细胞的推定的透性酶/逆向转运蛋白。通常认为，非解离形式的有机酸(例如草酸)可以通过细胞膜自由扩散。这可以解释草酸的特异性转运蛋白在NCFM的基因组中的缺失。进入细胞的草酸盐浓度在酸性条件下将增加，这也可以在细胞通过可变pH条件的胃肠道发生。另一假设是，编码膜蛋白的三个基因之一可以参与将这种化合物转运进细胞，特别是因为它们在存在草酸铵时得以强烈上调。首先，镉/锰转运ATP酶(LBA1234)上调9.64倍。所述预测的由LBA1234编码的蛋白显示了两个保守结构域pfam00122(E1-E2 ATP酶)和COG0474(MgtA，阳离子转运ATP酶)。E1E2-ATP酶是在它们的催化循环期间形成磷酸-中间产物的主要主动转运蛋白。基于一级结构和潜在跨膜区域将它们分为P1至P4(Axelsen和Palmgren(1998)J Mol Evol.4684-101)。E1E2-ATP酶转运二价阳离子(如草酸盐就是)，因而LBA1234可能是负责将草酸盐转运进细胞的转运蛋白。另外两个未鉴定的膜蛋白(LBA1119和LBA1690)也得以上调，但是它们不具有任何用于推断鉴定的特征。而且，在任何试验条件下我们没有观察到LBA0397的过度表达，该基因紧邻oxc的下游，编码推定的ABC转运蛋白的ATP酶亚基。
LBA0394上游基因类似于转录调控子并且LBA0397下游基因是推定的富AT的DNA结合蛋白。这些观察结果，结合表达数据表明，嗜酸乳杆菌中的oxc操纵子受到调控。而且，我们可以推测，使草酰-CoA脱羧的能力是嗜酸乳杆菌通过水平基因转移所需要的。该操纵子在互补链上编码并且frc(38.4％)和oxc(40.2％)的GC含量比NCFM基因组(34.71％)的平均含量明显高。
益生菌作为预防和/或治疗泌尿生殖器感染和复发性膀胱癌的手段的效力在过去的二十年中已经被科学地接受(Hoesl和Altwein(2005)Eur.Urol.47288-296)。更近些年，在产甲酸草酸杆菌的临床试验中获得了令人鼓舞的结果，所述的研究针对患有I型高草酸盐尿(一种遗传的、威胁生命的疾病，其特征是复发性的形成草酸盐结石、肾钙质沉着和最终的肝脏和肾脏衰竭)的患者。另外的临床试验和能进行草酸盐去毒作用的益生菌的递送可以得到一种补充的方法，该方法由医生和消费者来增强接受益生菌用于预防肾结石形成和减少其它病理性紊乱(如维生素B6缺乏症、尿石病和肾衰竭)的发病率。
实施例6.序列鉴定SEQ ID NO14与PFAM家族PF00582具有同源性。PF00582包括普遍应激蛋白(universal stress protein)家族。该家族的代表性成员是UspA USPA_ECOLI(Sousa等，(2001)Structure 91135-1141)，其为一种小的细胞质细菌蛋白，当细胞曝露于应激剂(stress agent)时它的表达得以增强。UspA增强了细胞在长期曝露于这种条件期间的存活率，并且可以提供一般的“应激耐受”活性。嗜血流感杆菌(Haemophilus influenzae)UspA的晶体结构(Nystrom等，(1994)Mol Microbiol 11537-544)显示了与结合ATP的詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)MJ0577蛋白(Zarembinski等，(1998)Proc Natl Acad Sd USA 9515189-15193)类似的α/β折叠，尽管UspA缺少结合ATP的活性。
SEQ ID NO6与PFAM家族PF01923具有同源性。PF01923包括与钴胺素腺苷转移酶具有同源性的蛋白质的家族。该家族含有PduO和EutT的基因产物，所述的基因产物都是钴胺素腺苷转移酶。PduO是具有ATP钴(I)胺素腺苷转移酶活性的蛋白。该蛋白的主要作用是将无活性的钴胺素转化为AdoCb1用于1，2-丙二醇降解(Kofoid等，(1999)J Bacteriol 1815317-5329)。EutT酶看起来是一种腺苷转移酶，将CNB12转化为AdoB12(Johnson(2001)J Bacteriol1831577-1584)。
SEQ ID NO18与PFAM家族PF00122具有同源性。PF00122包括与p-类型(或E1-E2-类型)的ATP酶具有同源性的蛋白质的家族，所述的ATP酶构成了阳离子转运酶的一个超家族，存在于原核和真核细胞中，所述的家族成员介导所有共同的生物学相关的阳离子的膜的透过性。在ATP水解过程中形成天冬氨酰磷酸中间产物的酶可以分为4大组(1)Ca2+转运ATP酶；(2)Na+/K+和胃H+/K+转运ATP酶；(3)植物、真菌和低等真核生物的质膜H+转运ATP酶(质子泵)；和(4)所有细菌的P-类型ATP酶，鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)的Mg2+ATP酶除外，其更类似于真核序列。然而，众多的序列分析方法导致了分类的多样性。
SEQ ID NO22与PFAM家族PF02449具有同源性。PF02449包括与β-半乳糖苷酶同源的蛋白质的家族。这组β-半乳糖苷酶属于糖基水解酶42家族。该酶催化末端的非还原末端β-D-半乳糖苷酶残基。
SEQ ID NO26和18与PFAM家族PF00702具有同源性。PF00702包括具有类似卤酸脱卤酶的水解酶结构域的蛋白质家族。该家族在结构上与α/β水解酶家族(Ab水解酶1)不同。该家族包括L-2-卤酸脱卤酶、环氧化物水解酶和磷酸酶。该家族的结构由两个结构域组成。一个是嵌入的四螺旋束，在HAD1_PSEUC的残基16-96之间，其为比对的保守区域最不好的区域。该折叠的其它部分由核心α/β结构域组成。
SEQ ID NO30与PFAM家族PF01182具有同源性。PF01182含有具有葡糖胺-6-磷酸异构酶/6-磷酸葡糖酸内酯酶结构域的蛋白质家族。该家族含有6-磷酸葡糖酸内酯酶(EC3.1.1.31)、葡糖胺-6-磷酸异构酶(EC3.5.99.6)和半乳糖胺-6-磷酸异构酶。6-磷酸葡糖酸内酯酶是负责将6-磷酸葡糖酸内酯转化为6-磷酸葡糖酸(戊糖磷酸途径的第二步)的酶。葡糖胺-6-磷酸异构酶(或葡糖胺6-磷酸脱氨酶)是负责将D-葡糖胺6-磷酸转化为D-果糖6-磷酸的酶。这是细菌如大肠杆菌(基因nagB)或真菌如白色念珠菌(基因NAG1)中N-乙酰葡糖胺(GlcNAC)利用途径中最后的特异性步骤。位于葡糖胺-6-磷酸异构酶中心部分的区域含有保守的组氨酸，所述的保守组氨酸在nagB中已经显示对催化机制的吡喃糖开环步骤很重要。
SEQ ID NO34与PFAM家族PF02302具有同源性。PF02302包括具有PTS系统、乳糖/纤维二糖特异性IIB亚基的蛋白质家族。细菌磷酸烯醇丙酮酸糖磷酸转移酶系统(PTS)是一个多蛋白系统，该系统涉及调控多种代谢和转录过程。乳糖/纤维二糖-特异性家族是四个结构和功能不同的IIB PTS系统细胞质酶之一。IIB纤维二糖的折叠显示了与哺乳动物酪氨酸磷酸酶相似的结构。
SEQ ID NO36与PFAM家族PF03632具有同源性。PF03632包括具有糖基水解酶家族65中心催化结构域的蛋白家族。糖基水解酶的这个家族含有液泡酸海藻糖酶和麦芽糖磷酸化酶。麦芽糖磷酸化酶(MP)是二聚体酶，该酶催化麦芽糖和无机磷酸转化为β-D-葡萄糖-1-磷酸和葡萄糖。中心结构域是催化结构域，其结合接近高度保守的Glu的磷酸离子。磷酸和谷氨酸的排列认为是引起异头碳原子上亲核攻击的原因(Egloff等，(2001)Structure(Camb)9689-697)。所述的催化结构域也形成了大部分的二聚作用接触面。
SEQ ID NO36与PFAM家族PF03636具有同源性。PF03636包括具有糖基水解酶家族65N-末端结构域的蛋白家族。糖基水解酶的这个家族含有液泡酸海藻糖酶和麦芽糖磷酸化酶。麦芽糖磷酸化酶(MP)是二聚体酶，该酶催化麦芽糖和无机磷酸转化为β-D-葡萄糖-1-磷酸和葡萄糖。这个结构域被认为对催化活性是必须的(Egloff等，(2001)Structure(Camb)9689-697)。
在本说明书中提及的所有的出版物、专利和专利申请案用于表示本发明所属领域的技术人员的水平。所有出版物、专利和专利申请在此引入作为参考，就如同每一出版物、专利或专利申请被明确和单独地引入作为参考一样。
虽然为了清楚理解的目的已经通过说明和实例的方式相当详细地描述了前述的发明，但是显然可以做出某些改变和修饰而不脱离附带的权利要求的范围。
表3.每个蛋白质序列的Top Blast结果
表4.每个蛋白质序列的PFAM结果
序列表<110>Klaenhammer，ToddRussel，WilliamAltermann，Eric<120>嗜酸乳杆菌核酸及其用途<130>035051/300837<150>60/711,491<151>2005-08-26<150>60/622,712<151>2004-10-27<160>36<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>1335<212>DNA<213>嗜酸乳杆菌<220>
<221>CDS<222>(1)...(1335)<400>1atg act gaa gaa gaa aat gaa tat gca cct tta aaa ggt att aaa gtc 48Met Thr Glu Glu Glu Asn Glu Tyr Ala Pro Leu Lys Gly Ile Lys Val1 5 10 15gtt gac tgg act caa gta caa tct ggt cca tca tgt act caa att tta 96Val Asp Trp Thr Gln Val Gln Ser Gly Pro Ser Cys Thr Gln Ile Leu20 25 30gct tgg ctt ggt gcc gaa gtt att aaa att gaa cgt act aat act ggt 144Ala Trp Leu Gly Ala Glu Val Ile Lys Ile Glu Arg Thr Asn Thr Gly35 40 45gat cca acc aga aat gaa tta ctt gat att caa gat tca tgg agt ttg 192
Asp Pro Thr Arg Asn Glu Leu Leu Asp Ile Gln Asp Ser Trp Ser Leu50 55 60tac tac tta caa tta aat gcc aac aag aag tca tta aca tta aac att 240Tyr Tyr Leu Gln Leu Asn Ala Asn Lys Lys Ser Leu Thr Leu Asn Ile65 70 75 80aag gct cca gaa ggc aaa aag atc atg tac gac ttg ctt aag aaa gcc 288Lys Ala Pro Glu Gly Lys Lys Ile Met Tyr Asp Leu Leu Lys Lys Ala85 90 95gat atc ttt gtt gaa aat att aaa cct ggt gct gca gaa aaa gct ggc 336Asp Ile Phe Val Glu Asn Ile Lys Pro Gly Ala Ala Glu Lys Ala Gly100 105 110tat ggt tgg gaa act gtt cac aag ctt aat cca cgt ttg att atg gct 384Tyr Gly Trp Glu Thr Val His Lys Leu Asn Pro Arg Leu Ile Met Ala115 120 125tca ctt aaa ggt ttc aac gaa ggc tca cgt ttt gct aac gtt aag gct 432Ser Leu Lys Gly Phe Asn Glu Gly Ser Arg Phe Ala Asn Val Lys Ala130 135 140ttt gaa cca gtt gct caa gct gct ggt ggt gct gca tct gct act ggt 480Phe Glu Pro Val Ala Gln Ala Ala Gly Gly Ala Ala Ser Ala Thr Gly145 150 155 160tgg aac aaa ggc gaa ttt aac gtt cct acc caa tca gca gct gct tta 528Trp Asn Lys Gly Glu Phe Asn Val Pro Thr Gln Ser Ala Ala Ala Leu165 170 175ggt gac tca aac tca ggt atg cac tta act att gct att tta gct gct 576Gly Asp Ser Asn Ser Gly Met His Leu Thr Ile Ala Ile Leu Ala Ala180 185 190tta atg caa cgt gaa cac act ggt gaa ggt act tat gta tac caa tca 624Leu Met Gln Arg Glu His Thr Gly Glu Gly Thr Tyr Val Tyr Gln Ser195 200 205atg caa gat gct gta tta aac ctt tgc cgt att aag tta cgt gac caa 672Met Gln Asp Ala Val Leu Asn Leu Cys Arg Ile Lys Leu Arg Asp Gln210 215 220ctt atg tta gac aac tta ggt gct tta cct cac tat gct gtt tac cct 720
Leu Met Leu Asp Asn Leu Gly Ala Leu Pro His Tyr Ala Val Tyr Pro225 230 235 240aac tat aag tgg gga gac gct att cct cgt gct gag aac act gaa ggt 768Asn Tyr Lys Trp Gly Asp Ala Ile Pro Arg Ala Glu Asn Thr Glu Gly245 250 255ggt caa gtt atc ggt tgg act tat aaa gct aaa ggc tgg gaa act gat 816Gly Gln Val Ile Gly Trp Thr Tyr Lys Ala Lys Gly Trp Glu Thr Asp260 265 270cct aat gct tat gtc tac att gtt gtt caa aac agt aac aag agc tgg 864Pro Asn Ala Tyr Val Tyr Ile Val Val Gln Asn Ser Asn Lys Ser Trp275 280 285gaa gct att gca aat acc atg ggt cat cca gaa tgg att act gat gaa 912Glu Ala Ile Ala Asn Thr Met Gly His Pro Glu Trp Ile Thr Asp Glu290 295 300cgt ttc caa gat tgg caa cat cgt caa ttg aat aaa gaa gct ctt tac 960Arg Phe Gln Asp Trp Gln His Arg Gln Leu Asn Lys Glu Ala Leu Tyr305 310 315 320caa tgt att gaa agc tac acc aag aat tat gac aaa ttt gaa tta acc 1008Gln Cys Ile Glu Ser Tyr Thr Lys Asn Tyr Asp Lys Phe Glu Leu Thr325 330 335aaa act tta ggt gaa gct ggt att cca gtt ggt cct gtc ctt gat tgg 1056Lys Thr Leu Gly Glu Ala Gly Ile Pro Val Gly Pro Val Leu Asp Trp340 345 350cat gaa ctt gaa aat gat cca gac ttg aac tca gat ggt aca att gta 1104His Glu Leu Glu Asn Asp Pro Asp Leu Asn Ser Asp Gly Thr Ile Val355 360 365act atc gat caa ggt ggt aat cgt ggt aaa ttc aag act att ggt tta 1152Thr Ile Asp Gln Gly Gly Asn Arg Gly Lys Phe Lys Thr Ile Gly Leu370 375 380cca ttt act ctt gct aac tac aag cct gac tat aag cgt gct cca gac 1200Pro Phe Thr Leu Ala Asn Tyr Lys Pro Asp Tyr Lys Arg Ala Pro Asp385 390 395 400ctt ggt gaa aat aac aaa gaa att ttg tct tca ctt ggt tat gat cca 1248
Leu Gly Glu Asn Asn Lys Glu Ile Leu Ser Ser Leu Gly Tyr Asp Pro405 410 415gac caa att gag aaa tta act gaa gaa ggc gta att tct aag gct aaa 1296Asp Gln Ile Glu Lys Leu Thr Glu Glu Gly Val Ile Ser Lys Ala Lys420 425 430ggc cct aag aat cca cgt gtt caa gtt att aaa ggt gaa 1335Gly Pro Lys Asn Pro Arg Val Gln Val Ile Lys Gly Glu435 440 445<210>2<211>445<212>PRT<213>嗜酸乳杆菌<400>2Met Thr Glu Glu Glu Asn Glu Tyr Ala Pro Leu Lys Gly Ile Lys Val1 5 10 15Val Asp Trp Thr Gln Val Gln Ser Gly Pro Ser Cys Thr Gln Ile Leu20 25 30Ala Trp Leu Gly Ala Glu Val Ile Lys Ile Glu Arg Thr Asn Thr Gly35 40 45Asp Pro Thr Arg Asn Glu Leu Leu Asp Ile Gln Asp Ser Trp Ser Leu50 55 60Tyr Tyr Leu Gln Leu Asn Ala Asn Lys Lys Ser Leu Thr Leu Asn Ile65 70 75 80Lys Ala Pro Glu Gly Lys Lys Ile Met Tyr Asp Leu Leu Lys Lys Ala85 90 95Asp Ile Phe Val Glu Asn Ile Lys Pro Gly Ala Ala Glu Lys Ala Gly100 105 110Tyr Gly Trp Glu Thr Val His Lys Leu Asn Pro Arg Leu Ile Met Ala115 120 125Ser Leu Lys Gly Phe Asn Glu Gly Ser Arg Phe Ala Asn Val Lys Ala130 135 140Phe Glu Pro Val Ala Gln Ala Ala Gly Gly Ala Ala Ser Ala Thr Gly145 150 155 160Trp Asn Lys Gly Glu Phe Asn Val Pro Thr Gln Ser Ala Ala Ala Leu165 170 175Gly Asp Ser Asn Ser Gly Met His Leu Thr Ile Ala Ile Leu Ala Ala180 185 190Leu Met Gln Arg Glu His Thr Gly Glu Gly Thr Tyr Val Tyr Gln Ser195 200 205
Met Gln Asp Ala Val Leu Asn Leu Cys Arg Ile Lys Leu Arg Asp Gln210 215 220Leu Met Leu Asp Asn Leu Gly Ala Leu Pro His Tyr Ala Val Tyr Pro225 230 235 240Asn Tyr Lys Trp Gly Asp Ala Ile Pro Arg Ala Glu Asn Thr Glu Gly245 250 255Gly Gln Val Ile Gly Trp Thr Tyr Lys Ala Lys Gly Trp Glu Thr Asp260 265 270Pro Asn Ala Tyr Val Tyr Ile Val Val Gln Asn Ser Asn Lys Ser Trp275 280 285Glu Ala Ile Ala Asn Thr Met Gly His Pro Glu Trp Ile Thr Asp Glu290 295 300Arg Phe Gln Asp Trp Gln His Arg Gln Leu Asn Lys Glu Ala Leu Tyr305 310 315 320Gln Cys Ile Glu Ser Tyr Thr Lys Asn Tyr Asp Lys Phe Glu Leu Thr325 330 335Lys Thr Leu Gly Glu Ala Gly Ile Pro Val Gly Pro Val Leu Asp Trp340 345 350His Glu Leu Glu Asn Asp Pro Asp Leu Asn Ser Asp Gly Thr Ile Val355 360 365Thr Ile Asp Gln Gly Gly Asn Arg Gly Lys Phe Lys Thr Ile Gly Leu370 375 380Pro Phe Thr Leu Ala Asn Tyr Lys Pro Asp Tyr Lys Arg Ala Pro Asp385 390 395 400Leu Gly Glu Asn Asn Lys Glu Ile Leu Ser Ser Leu Gly Tyr Asp Pro405 410 415Asp Gln Ile Glu Lys Leu Thr Glu Glu Gly Val Ile Ser Lys Ala Lys420 425 430Gly Pro Lys Asn Pro Arg Val Gln Val Ile Lys Gly Glu435 440 445<210>3<211>1707<212>DNA<213>嗜酸乳杆菌<220>
<221>CDS<222>(1)...(1707)<400>3gtg gtt gat aca tca ctc act gga gca gca ctt tta atc gat gct tta 48Met Val Asp Thr Ser Leu Thr Gly Ala Ala Leu Leu Ile Asp Ala Leu
1 5 10 15caa gct aac ggt tta aac aat atg tat ggt gtt gta ggt att cca gtt 96Gln Ala Asn Gly Leu Asn Asn Met Tyr Gly Val Val Gly Ile Pro Val20 25 30acc gac ttt gcc cgt tta gct caa cta aag ggt atg aaa tat tat gga 144Thr Asp Phe Ala Arg Leu Ala Gln Leu Lys Gly Met Lys Tyr Tyr Gly35 40 45ttt aga cgt gaa gat tca gct gta gat gca gct gct ggt gca ggc ttt 192Phe Arg Arg Glu Asp Ser Ala Val Asp Ala Ala Ala Gly Ala Gly Phe50 55 60att act ggt aag cct ggc gta gct tta act gta tct gca cct ggt ttc 240Ile Thr Gly Lys Pro Gly Val Ala Leu Thr Val Ser Ala Pro Gly Phe65 70 75 80tta aat ggt ttg aca gct tta gca caa gct act aag aac tgc ttc cca 288Leu Asn Gly Leu Thr Ala Leu Ala Gln Ala Thr Lys Asn Cys Phe Pro85 90 95tta att atg att tca ggt tca tca gat cgt cat att att gac ctg gat 336Leu Ile Met Ile Ser Gly Ser Ser Asp Arg His Ile Ile Asp Leu Asp100 105 110cgt gga gat tat gaa ggt ctt gat caa tat aat gtt gct aaa cca ttc 384Arg Gly Asp Tyr Glu Gly Leu Asp Gln Tyr Asn Val Ala Lys Pro Phe115 120 125tgt aaa gca gca tat cgt gtt gat cgc gca gaa gat atg gga cta gct 432Cys Lys Ala Ala Tyr Arg Val Asp Arg Ala Glu Asp Met Gly Leu Ala130 135 140gtt gct cgt gca gtg aga act gct gtt agt ggt cgt cca ggt ggt gtt 480Val Ala Arg Ala Val Arg Thr Ala Val Ser Gly Arg Pro Gly Gly Val145 150 155 160tac ttg gat ctt cct gca gca act gtc act gat aca gtt gca caa aag 528Tyr Leu Asp Leu Pro Ala Ala Thr Val Thr Asp Thr Val Ala Gln Lys165 170 175tca gat gct aat atc tac aaa gtt gta gat cca gct cca aag caa ttg 576Ser Asp Ala Asn Ile Tyr Lys Val Val Asp Pro Ala Pro Lys Gln Leu
180 185 190cca tca gat gat gca atc aac cgt gcc gtg gaa tta tta aaa gat gca624Pro Ser Asp Asp Ala Ile Asn Arg Ala Val Glu Leu Leu Lys Asp Ala195 200 205aaa cat cct gta att ctt ctt ggt aaa ggt tct gct tac gct caa agc672Lys His Pro Val Ile Leu Leu Gly Lys Gly Ser Ala Tyr Ala Gln Ser210 215 220gaa gac gaa atc aga gaa tta gtt aat aag act aat atc cca ttc ttg720Glu Asp Glu Ile Arg Glu Leu Val Asn Lys Thr Asn Ile Pro Phe Leu225 230 235 240cca atg tca atg gcc aaa ggt gtt gta cca gat gat tct cca gca tct768Pro Met Ser Met Ala Lys Gly Val Val Pro Asp Asp Ser Pro Ala Ser245 250 255gct gca tca gct cgt tca ttt aca ctt ggt caa gct gat gtt gta ctt816Ala Ala Ser Ala Arg Ser Phe Thr Leu Gly Gln Ala Asp Val Val Leu260 265 270ttg atc ggt gca cgt ctt aat tgg atg ctt tca aac ggt gaa tct cca864Leu Ile Gly Ala Arg Leu Asn Trp Met Leu Ser Asn Gly Glu Ser Pro275 280 285tta ttc agt gaa gac gcc aag ttt att caa gtt gat att gat gca act912Leu Phe Ser Glu Asp Ala Lys Phe Ile Gln Val Asp Ile Asp Ala Thr290 295 300gaa ttt gat tca aac aga aag att gat gct cca tta cag ggt gac att960Glu Phe Asp Ser Asn Arg Lys Ile Asp Ala Pro Leu Gln Gly Asp Ile305 310 315 320aaa tct gta atg caa aaa tta aat tct gcc gct atc aat gct ggt gtt1008Lys Ser Val Met Gln Lys Leu Asn Ser Ala Ala Ile Asn Ala Gly Val325 330 335aag gca cca aca gat tgg att aat gct att aag acc gaa agc gaa aag1056Lys Ala Pro Thr Asp Trp Ile Asn Ala Ile Lys Thr Glu Ser Glu Lys340 345 350aac aat act aag ttt gct aaa aga att tca gct tca gaa gct aaa tca1104Asn Asn Thr Lys Phe Ala Lys Arg Ile Ser Ala Ser Glu Ala Lys Ser
355 360 365act tta ggc tac tac agc gca att gaa cca att aat gac tta atg caa1152Thr Leu Gly Tyr Tyr Ser Ala Ile Glu Pro Ile Asn Asp Leu Met Gln370 375 380aag cat cct gat act tat tta gta agt gaa ggt gcc aac act ttg gat1200Lys His Pro Asp Thr Tyr Leu Val Ser Glu Gly Ala Asn Thr Leu Asp385 390 395 400att ggt cgt gac tta att ggt atg caa aag cct cgt cac cgt ctt gac1248Ile Gly Arg Asp Leu Ile Gly Met Gln Lys Pro Arg His Arg Leu Asp405 410 415act ggt act tgg ggt gtt atg ggt gtt ggc atg ggt tat gcc att gct1296Thr Gly Thr Trp Gly Val Met Gly Val Gly Met Gly Tyr Ala Ile Ala420 425 430gca gct att gaa act ggc aaa cca gtt att gcc ctt gaa ggt gac tca1344Ala Ala Ile Glu Thr Gly Lys Pro Val Ile Ala Leu Glu Gly Asp Ser435 440 445gca ttt ggt ttt gat ggt atg gaa atg gaa act att tgc cgt tac cac1392Ala Phe Gly Phe Asp Gly Met Glu Met Glu Thr Ile Cys Arg Tyr His450 455 460tta cct gtt att gta gtt att att aac aac ggt ggt att tac aac ggt1440Leu Pro Val Ile Val Val Ile Ile Asn Asn Gly Gly Ile Tyr Asn Gly465 470 475 480gat gtt aac gtt gtt cct gat caa cca ggc cct act gtc ttg gat cac1488Asp Val Asn Val Val Pro Asp Gln Pro Gly Pro Thr Val Leu Asp His485 490 495aat gcc cac tat ggt gat atc tct aag gca ttc ggc ggt gat agc tac1536Asn Ala His Tyr Gly Asp Ile Ser Lys Ala Phe Gly Gly Asp Ser Tyr500 505 510cgt gta aat aac tac gaa gaa atg aaa gat gct ctt gaa aaa gcg tat1584Arg Val Asn Asn Tyr Glu Glu Met Lys Asp Ala Leu Glu Lys Ala Tyr515 520 525gaa tca ggt aac cca aca atc atc gat gct caa att cct gag tca atg1632Glu Ser Gly Asn Pro Thr Ile Ile Asp Ala Gln Ile Pro Glu Ser Met
530 535 540ggt aaa gaa tca ggt cat atc ggc aac tta aac cca aag ttg gac tta 1680Gly Lys Glu Ser Gly His Ile Gly Asn Leu Asn Pro Lys Leu Asp Leu545 550 555 560agt tct ctt gaa gca aag gag aat aaa 1707Ser Ser Leu Glu Ala Lys Glu Asn Lys565<210>4<211>569<212>PRT<213>嗜酸乳杆菌<400>4Met Val Asp Thr Ser Leu Thr Gly Ala Ala Leu Leu Ile Asp Ala Leu1 5 10 15Gln Ala Asn Gly Leu Asn Asn Met Tyr Gly Val Val Gly Ile Pro Val20 25 30Thr Asp Phe Ala Arg Leu Ala Gln Leu Lys Gly Met Lys Tyr Tyr Gly35 40 45Phe Arg Arg Glu Asp Ser Ala Val Asp Ala Ala Ala Gly Ala Gly Phe50 55 60Ile Thr Gly Lys Pro Gly Val Ala Leu Thr Val Ser Ala Pro Gly Phe65 70 75 80Leu Asn Gly Leu Thr Ala Leu Ala Gln Ala Thr Lys Asn Cys Phe Pro85 90 95Leu Ile Met Ile Ser Gly Ser Ser Asp Arg His Ile Ile Asp Leu Asp100 105 110Arg Gly Asp Tyr Glu Gly Leu Asp Gln Tyr Asn Val Ala Lys Pro Phe115 120 125Cys Lys Ala Ala Tyr Arg Val Asp Arg Ala Glu Asp Met Gly Leu Ala130 135 140Val Ala Arg Ala Val Arg Thr Ala Val Ser Gly Arg Pro Gly Gly Val145 150 155 160Tyr Leu Asp Leu Pro Ala Ala Thr Val Thr Asp Thr Val Ala Gln Lys165 170 175Ser Asp Ala Asn Ile Tyr Lys Val Val Asp Pro Ala Pro Lys Gln Leu180 185 190Pro Ser Asp Asp Ala Ile Asn Arg Ala Val Glu Leu Leu Lys Asp Ala195 200 205Lys His Pro Val Ile Leu Leu Gly Lys Gly Ser Ala Tyr Ala Gln Ser
210 215 220Glu Asp Glu Ile Arg Glu Leu Val Asn Lys Thr Asn Ile Pro Phe Leu225 230 235 240Pro Met Ser Met Ala Lys Gly Val Val Pro Asp Asp Ser Pro Ala Ser245 250 255Ala Ala Ser Ala Arg Ser Phe Thr Leu Gly Gln Ala Asp Val Val Leu260 265 270Leu Ile Gly Ala Arg Leu Asn Trp Met Leu Ser Asn Gly Glu Ser Pro275 280 285Leu Phe Ser Glu Asp Ala Lys Phe Ile Gln Val Asp Ile Asp Ala Thr290 295 300Glu Phe Asp Ser Asn Arg Lys Ile Asp Ala Pro Leu Gln Gly Asp Ile305 310 315 320Lys Ser Val Met Gln Lys Leu Asn Ser Ala Ala Ile Asn Ala Gly Val325 330 335Lys Ala Pro Thr Asp Trp Ile Asn Ala Ile Lys Thr Glu Ser Glu Lys340 345 350Asn Asn Thr Lys Phe Ala Lys Arg Ile Ser Ala Ser Glu Ala Lys Ser355 360 365Thr Leu Gly Tyr Tyr Ser Ala Ile Glu Pro Ile Asn Asp Leu Met Gln370 375 380Lys His Pro Asp Thr Tyr Leu Val Ser Glu Gly Ala Asn Thr Leu Asp385 390 395 400Ile Gly Arg Asp Leu Ile Gly Met Gln Lys Pro Arg His Arg Leu Asp405 410 415Thr Gly Thr Trp Gly Val Met Gly Val Gly Met Gly Tyr Ala Ile Ala420 425 430Ala Ala Ile Glu Thr Gly Lys Pro Val Ile Ala Leu Glu Gly Asp Ser435 440 445Ala Phe Gly Phe Asp Gly Met Glu Met Glu Thr Ile Cys Arg Tyr His450 455 460Leu Pro Val Ile Val Val Ile Ile Asn Asn Gly Gly Ile Tyr Asn Gly465 470 475 480Asp Val Asn Val Val Pro Asp Gln Pro Gly Pro Thr Val Leu Asp His485 490 495Asn Ala His Tyr Gly Asp Ile Ser Lys Ala Phe Gly Gly Asp Ser Tyr500 505 510Arg Val Asn Asn Tyr Glu Glu Met Lys Asp Ala Leu Glu Lys Ala Tyr515 520 525Glu Ser Gly Asn Pro Thr Ile Ile Asp Ala Gln Ile Pro Glu Ser Met530 535 540Gly Lys Glu Ser Gly His Ile Gly Asn Leu Asn Pro Lys Leu Asp Leu545 550 555 560Ser Ser Leu Glu Ala Lys Glu Asn Lys
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cgc gct gaa cgc tcc ttg gtc aag ttg agt ctc aat gaa caa aaa tta432Arg Ala Glu Arg Ser Leu Val Lys Leu Ser Leu Asn Glu Gln Lys Leu130 135 140gct gat tgt gat ttg gaa tat atg aat cgc tta tcc gat tat ctt ttt480Ala Asp Cys Asp Leu Glu Tyr Met Asn Arg Leu Ser Asp Tyr Leu Phe145 150 155 160ata ttg gga cgt tat gcc aat gta ctt gat ggt tat act gaa aaa aaa528Ile Leu Gly Arg Tyr Ala Asn Val Leu Asp Gly Tyr Thr Glu Lys Lys165 170 175agt aaa gtt agg gat aaa aac cgt att aat ggc561Ser Lys Val Arg Asp Lys Asn Arg Ile Asn Gly180 185<210>6<211>187<212>PRT<213>嗜酸乳杆菌<400>6Met Thr Ile Lys Ile Tyr Thr Lys Val Gly Asp Lys Gly Leu Thr Lys1 5 10 15Gln Val Thr Gly Lys Met Val Pro Lys Tyr Asp Leu Gln Ile Glu Ala20 25 30Leu Gly Asn Ile Asp Glu Leu Gln Ser Tyr Leu Gly Val Val Leu Ala35 40 45Asn Leu Ser Asn Asn Cys Gln Lys Leu Arg Asn Glu Leu Glu Asn Val50 55 60Gln Arg Asn Leu Tyr Gln Leu Gln Ala Asp Ile Val Val Lys Asn His65 70 75 80His Glu Ile Asn Glu Ser Asn Val Val Gln Leu Glu Asn Arg Ile Asn85 90 95Glu Leu Thr Pro Lys Ile Pro Tyr Ile Pro Glu Phe Ile Leu Pro Gly100 105 110Gly Lys Val Thr Gly Thr Asn Leu Gln Tyr Ala Arg Thr Val Ala Arg115 120 125Arg Ala Glu Arg Ser Leu Val Lys Leu Ser Leu Asn Glu Gln Lys Leu130 135 140Ala Asp Cys Asp Leu Glu Tyr Met Asn Arg Leu Ser Asp Tyr Leu Phe145 150 155 160
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ggt tgg gaa tac ggt ttt tta gta gac ctt ggt atg act att ttt ggc 384Gly Trp Glu Tyr Gly Phe Leu Val Asp Leu Gly Met Thr Ile Phe Gly115 120 125ggt tta tct gct ttc atc gct tat ctt att tct agt ttt gct ttt gat 432Gly Leu Ser Ala Phe Ile Ala Tyr Leu Ile Ser Ser Phe Ala Phe Asp130 135 140acc tat cat gcc att ggt aat ttt gct ttt tac ttt gtt tta tat aaa 480Thr Tyr His Ala Ile Gly Asn Phe Ala Phe Tyr Phe Val Leu Tyr Lys145 150 155 160cct gta act aag gca ctt gaa gca tat caa cgg agg ata att 522Pro Val Thr Lys Ala Leu Glu Ala Tyr Gln Arg Arg Ile Ile165 170<210>8<211>174<212>PRT<213>嗜酸乳杆菌<400>8Met Val Thr Glu Arg Leu Gln Ile Arg Gln Ile Ala Leu Met Ala Met1 5 10 15Leu Thr Ala Met Cys Val Val Leu Arg Ile Phe Lys Ile Ile Pro Ile20 25 30Pro Asn Val Gln Pro Val Thr Asp Ile Leu Met Ile Val Thr Leu Asn35 40 45Leu Gly Ile Gly Ser Gly Ile Thr Leu Ala Thr Leu Thr Met Leu Ile50 55 60Ser Asn Ile Tyr Leu Gly Phe Gly Ile Trp Thr Ile Pro Gln Ile Leu65 70 75 80Ala Tyr Thr Gly Cys Val Leu Thr Val Ala Phe Phe Ala Lys Phe Thr85 90 95Pro Leu Lys Asn Tyr Phe Leu Leu Gln Val Ala Leu Ala Thr Phe Leu100 105 110Gly Trp Glu Tyr Gly Phe Leu Val Asp Leu Gly Met Thr Ile Phe Gly115 120 125Gly Leu Ser Ala Phe Ile Ala Tyr Leu Ile Ser Ser Phe Ala Phe Asp130 135 140Thr Tyr His Ala Ile Gly Asn Phe Ala Phe Tyr Phe Val Leu Tyr Lys145 150 155 160
Pro Val Thr Lys Ala Leu Glu Ala Tyr Gln Arg Arg Ile Ile165 170<210>9<211>261<212>DNA<213>嗜酸乳杆菌<220>
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tct caa ggt ttg ctt agt gca ggt gta act tca tgg ctt cca act aca288Ser Gln Gly Leu Leu Ser Ala Gly Val Thr Ser Trp Leu Pro Thr Thr85 90 95att acg gct gat agt gat act tta act aga att tgt aag atg ttt gca336Ile Thr Ala Asp Ser Asp Thr Leu Thr Arg Ile Cys Lys Met Phe Ala100 105 110gat cac caa ggt caa gaa act ggg gca aaa att caa gga att cac ttt384Asp His Gln Gly Gln Glu Thr Gly Ala Lys Ile Gln Gly Ile His Phe115 120 125gaa ggc cca ttc ttt act gaa gag cat gcc ggt gct gaa aat cct aaa432Glu Gly Pro Phe Phe Thr Glu Glu His Ala Gly Ala Glu Asn Pro Lys130 135 140tat atg atg gat ccg gat att aat gtc ttt aac aaa tgg cgt gat gtt480Tyr Met Met Asp Pro Asp Ile Asn Val Phe Asn Lys Trp Arg Asp Val145 150 155 160tcg aat ggc atg ctt tgc aag att tct atg gca cct gaa aga aaa ggt528Ser Asn Gly Met Leu Cys Lys Ile Ser Met Ala Pro Glu Arg Lys Gly165 170 175tct aaa gaa ttt att cgt gaa gct gta aaa gaa ggc gta gtt att gca576Ser Lys Glu Phe Ile Arg Glu Ala Val Lys Glu Gly Val Val Ile Ala180 185 190ttg ggt cac tca agt gcc act ttt gaa gaa gct gtc gaa ggt gtt gaa624Leu Gly His Ser Ser Ala Thr Phe Glu Glu Ala Val Glu Gly Val Glu195 200 205gca ggt gca acg atg ttt acg cat act ttt aac ggg atg cca gat cca672Ala Gly Ala Thr Met Phe Thr His Thr Phe Asn Gly Met Pro Asp Pro210 215 220agt cat cat acg cca tca att tca aat gct gca atg gcc ttg aat aat720Ser His His Thr Pro Ser Ile Ser Asn Ala Ala Met Ala Leu Asn Asn225 230 235 240gta act gat gaa tta att tgt gac ggc cac cac gtt caa cca tca atg768Val Thr Asp Glu Leu Ile Cys Asp Gly His His Val Gln Pro Ser Met245 250 255
gct aaa gca tta att aat gca gtt ggt cca gag cac att gct ttg att 816Ala Lys Ala Leu Ile Asn Ala Val Gly Pro Glu His Ile Ala Leu Ile260 265 270act gac tgt atg gaa gcc ggg atg atg cca gac ggc gac tac atg tta 864Thr Asp Cys Met Glu Ala Gly Met Met Pro Asp Gly Asp Tyr Met Leu275 280 285ggg gaa ctt cca gtt tat gta aaa gat ggt atg gct cgc ctt aag gat 912Gly Glu Leu Pro Val Tyr Val Lys Asp Gly Met Ala Arg Leu Lys Asp290 295 300ggc gat aat tta gca ggt tca att ttg caa tta aaa caa gca att aag 960Gly Asp Asn Leu Ala Gly Ser Ile Leu Gln Leu Lys Gln Ala Ile Lys305 310 315 320aat gtt gtt gat tgg aat att gta act cca gaa aaa gct gtg ctg atg 1008Asn Val Val Asp Trp Asn Ile Val Thr Pro Glu Lys Ala Val Leu Met325 330 335gct agt tac gtt cct gct aag agt gct cat att ttg aat aag tgc ggt 1056Ala Ser Tyr Val Pro Ala Lys Ser Ala His Ile Leu Asn Lys Cys Gly340 345 350act att gca cct gac aag gat gct gat ttc tta atc ttg aat cca gat 1104Thr Ile Ala Pro Asp Lys Asp Ala Asp Phe Leu Ile Leu Asn Pro Asp355 360 365atg acg ctt agt gag act tac atg aat ggt gaa tca aga tac aaa gct 1152Met Thr Leu Ser Glu Thr Tyr Met Asn Gly Glu Ser Arg Tyr Lys Ala370 375 380<210>12<211>384<212>PRT<213>嗜酸乳杆菌<400>12Met Thr Tyr Tyr Ile His Ala Asp Lys Phe Phe Leu Glu Asn Arg Thr1 5 10 15Glu Asn Gly Gly Tyr Leu Glu Val Gln Asp Asp Gly Lys Phe Gly Phe
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370 375 380<210>13<211>483<212>DNA<213>嗜酸乳杆菌<220>
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tca gtt act gaa tat gta aat caa cat gct tta gct gat gtt tta att 432Ser Val Thr Glu Tyr Val Asn Gln His Ala Leu Ala Asp Val Leu Ile130 135 140gtt aaa aca gat atg gat aat agc cct gtt aag cca agt gtg aaa aaa 480Val Lys Thr Asp Met Asp Asn Ser Pro Val Lys Pro Ser Val Lys Lys145 150 155 160ggt 483Gly<210>14<211>161<212>PRT<213>嗜酸乳杆菌<400>14Met Val Lys Glu Ser Ile Leu Val Pro Val Asp Gly Ser Glu Ser Ala1 5 10 15Glu Arg Ala Phe Asp Lys Ala Val Arg Val Gly Leu Arg Asp Gly Ala20 25 30His Val Asp Val Leu Asn Val Ile Asp Thr Arg Gln Phe Met Gly Glu35 40 45Met Gln Asp Thr Leu Ile Ser Gly Asp Thr Ile Tyr Gln Met Thr Gln50 55 60Asp Ser Glu Glu Tyr Leu Lys Ser Leu Lys Lys Trp Ala His Asp Asn65 70 75 80Phe Asn Phe Asp Asp Ile Asp Tyr His Ile Arg Tyr Gly Ser Pro Lys85 90 95Arg Ile Ile Ser Tyr Asp Phe Ile Lys Asp His His Asn Ash Leu Ile100 105 110Val Met Gly Ala Thr Gly Leu Asn Ala Val Glu Arg Met Leu Met Gly115 120 125Ser Val Thr Glu Tyr Val Asn Gln His Ala Leu Ala Asp Val Leu Ile130 135 140Val Lys Thr Asp Met Asp Asn Ser Pro Val Lys Pro Ser Val Lys Lys145 150 155 160Gly
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130 135 140tta gca gta gcg gtt gtc tgt gtg atg ggt aca gtt ttt act tta tta480Leu Ala Val Ala Val Val Cys Val Met Gly Thr Val Phe Thr Leu Leu145 150 155 160gaa att gga ctt aag cca gtt ctt ggt tta act gat tct caa ttc ggc528Glu Ile Gly Leu Lys Pro Val Leu Gly Leu Thr Asp Ser Gln Phe Gly165 170 175att gtt gcc ggt ggt tct ttg cac gaa att gct cat gcg gtt gct tca576Ile Val Ala Gly Gly Ser Leu His Glu Ile Ala His Ala Val Ala Ser180 185 190ggt ggt gca ttt ggt aat atc agt tta gat agt gca tta atc atg aaa624Gly Gly Ala Phe Gly Asn Ile Ser Leu Asp Ser Ala Leu Ile Met Lys195 200 205cta tct cgt gta att ctt tta gca cct gtg gca tta att atc ggc tat672Leu Ser Arg Val Ile Leu Leu Ala Pro Val Ala Leu Ile Ile Gly Tyr210 215 220tta tac caa cgc cgc aca gct aag gta agt aca att gac agt act aca720Leu Tyr Gln Arg Arg Thr Ala Lys Val Ser Thr Ile Asp Ser Thr Thr225 230 235 240aag act ggc aaa ttg cca att cct tgg ttc tta gga gga ttt att tta768Lys Thr Gly Lys Leu Pro Ile Pro Trp Phe Leu Gly Gly Phe Ile Leu245 250 255acc agt gtt tta ggt act tac tta cca ttc tct act agt tta tta gat816Thr Ser Val Leu Gly Thr Tyr Leu Pro Phe Ser Thr Ser Leu Leu Asp260 265 270gct tta gta caa gta gcc tac atc ttt tta gga atg gct atg gcc gca864Ala Leu Val Gln Val Ala Tyr Ile Phe Leu Gly Met Ala Met Ala Ala275 280 285ttg ggc att tct gta aac ttc aaa gtt atc ttt aag cga gga gga gct912Leu Gly Ile Ser Val Asn Phe Lys Val Ile Phe Lys Arg Gly Gly Ala290 295 300gta ttt ggt gct gcc gca att agt tct act tgt tta ttg att ttc atg960Val Phe Gly Ala Ala Ala Ile Ser Ser Thr Cys Leu Leu Ile Phe Met
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<221>CDS<222>(1)...(2001)<400>21atg aca caa tta tca cgt ttt ctt tat ggt ggt gat tat aat cct gac 48Met Thr Gln Leu Ser Arg Phe Leu Tyr Gly Gly Asp Tyr Asn Pro Asp1 5 10 15caa tgg cca gaa gaa aca tgg tcg aaa gat att cac gta ttt aaa aag 96Gln Trp Pro Glu Glu Thr Trp Ser Lys Asp Ile His Val Phe Lys Lys20 25 30gcg gat att aat tcg gca acg att aac att ttt tct tgg gca ttg ctt 144Ala Asp Ile Asn Ser Ala Thr Ile Asn Ile Phe Ser Trp Ala Leu Leu35 40 45gaa cca aga gaa gga aaa tat aat ttc tca aaa tta gat aaa gtt gta 192Glu Pro Arg Glu Gly Lys Tyr Asn Phe Ser Lys Leu Asp Lys Val Val50 55 60caa caa tta tct gat gct aac ttt gat att gtg atg gga aca gcc aca 240Gln Gln Leu Ser Asp Ala Asn Phe Asp Ile Val Met Gly Thr Ala Thr65 70 75 80gca gcg atg cca gct tgg atg ttt aaa aaa tat ccc gat att gcc aga 288Ala Ala Met Pro Ala Trp Met Phe Lys Lys Tyr Pro Asp Ile Ala Arg85 90 95gta gat tat caa gac aga cgt cat gta ttt ggt cag cgg cat aac ttc 336Val Asp Tyr Gln Asp Arg Arg His Val Phe Gly Gln Arg His Asn Phe100 105 110
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Ile Pro Glu Leu Leu Ser Asp Ala Lys Lys Gln Asn Leu Lys Met Val100 105 110att gct tct gct tca aag aat gca cct aag att tta act aga cta gga 384Ile Ala Ser Ala Ser Lys Asn Ala Pro Lys Ile Leu Thr Arg Leu Gly115 120 125att atg gat gaa ttt gat ggg att gtt gat cct gcc act ctt cat cat 432Ile Met Asp Glu Phe Asp Gly Ile Val Asp Pro Ala Thr Leu His His130 135 140ggt aag cca gat cca gaa att tat atc aaa gcg caa gaa ctt gtt gga 480Gly Lys Pro Asp Pro Glu Ile Tyr Ile Lys Ala Gln Glu Leu Val Gly145 150 155 160ttg aag gca aat gaa gta att agc ttt gaa gat gcc caa gct ggt gtt 528Leu Lys Ala Asn Glu Val Ile Ser Phe Glu Asp Ala Gln Ala Gly Val165 170 175gaa gca att aag gct gct cat caa ttt gca gtt gga ata ggt aat aaa 576Glu Ala Ile Lys Ala Ala His Gln Phe Ala Val Gly Ile Gly Asn Lys180 185 190aag ctt ttg aaa gaa gct gat tac atc gtt cca acc act gct gat ctt 624Lys Leu Leu Lys Glu Ala Asp Tyr Ile Val Pro Thr Thr Ala Asp Leu195 200 205aag ctt agt gaa att gaa aaa gtt ttt gaa gag aaa gaa 663Lys Leu Ser Glu Ile Glu Lys Val Phe Glu Glu Lys Glu210 215 220<210>26<211>221<212>PRT<213>嗜酸乳杆菌<400>26Met Leu Lys Gly Leu Ile Phe Asp Leu Asp Gly Val Leu Thr Asp Ser1 5 10 15Ala Arg Phe His Leu Thr Ala Trp Asn Asn Leu Ala Lys Glu Leu Gly20 25 30Ile Thr Leu Thr Asn Glu Gln Leu Asp Ser Leu Arg Gly Ile Ser Arg35 40 45
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ggc atg act aag gat gtt cca gca tac tgc aag gaa tac gat caa ata 336Gly Met Thr Lys Asp Val Pro Ala Tyr Cys Lys Glu Tyr Asp Gln Ile100 105 110att aaa gac aat cct att gat att caa tta tta ggt atc ggc caa aac 384Ile Lys Asp Asn Pro Ile Asp Ile Gln Leu Leu Gly Ile Gly Gln Asn115 120 125ggt cat att gcc ttt aat gaa cct ggt act cca ttc gat att ggc act 432Gly His Ile Ala Phe Asn Glu Pro Gly Thr Pro Phe Asp Ile Gly Thr130 135 140cac gaa gtt aaa tta act gaa aac act att aag gct aac gca cgc ttt 480His Glu Val Lys Leu Thr Glu Asn Thr Ile Lys Ala Asn Ala Arg Phe145 150 155 160ttc gat aat gaa gat gaa gtt cca aag agc gca att tgt atg ggt act 528Phe Asp Asn Glu Asp Glu Val Pro Lys Ser Ala Ile Cys Met Gly Thr165 170 175gct aat atc atg gat tca aag aaa att gtt tta atg gca ttc ggt gaa 576Ala Asn Ile Met Asp Ser Lys Lys Ile Val Leu Met Ala Phe Gly Glu180 185 190aag aaa gct aag gcc att aaa gaa atg atc gaa gga cct atc act gaa 624Lys Lys Ala Lys Ala Ile Lys Glu Met Ile Glu Gly Pro Ile Thr Glu195 200 205gaa gtt cct gca tcc atc tta caa aaa cac cca gac gta act gtc atc 672Glu Val Pro Ala Ser Ile Leu Gln Lys His Pro Asp Val Thr Val Ile210 215 220gtt gat aca tat gca gct caa gag ctt gac gat aaa tat aag aac 717Val Asp Thr Tyr Ala Ala Gln Glu Leu Asp Asp Lys Tyr Lys Asn225 230 235<210>30<211>239<212>PRT<213>嗜酸乳杆菌<400>30
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725 730 735gtc atg gta cat gac aat aaa ttg gat ttg aag gaa ggt aaa act aaa 2256Val Met Val His Asp Asn Lys Leu Asp Leu Lys Glu Gly Lys Thr Lys740745 750tgc tta aag gct 2268Cys Leu Lys Ala755<210>36<211>756<212>PRT<213>嗜酸乳杆菌<400>36Met Lys Arg Ile Phe Glu Ile Asp Pro Trp Lys Val Ile Thr His Lys1 5 10 15Phe Asp Pro Lys Asp Lys Arg Leu Gln Glu Ser Met Thr Ala Ile Gly20 25 30Asn Asp Tyr Met Gly Met Arg Gly Asn Phe Glu Glu Gly Tyr Ser Gly35 40 45Asp Ser Leu Gln Gly Thr Tyr Leu Ala Gly Val Trp Phe Pro Asp Lys50 55 60Thr Val Val Gly Trp Trp Lys Asn Gly Tyr Pro Lys Tyr Phe Gly Lys65 70 75 80Thr Pro Asn Ala Pro Ser Phe Ile Gly Ile Gly Ile Asn Val Asn Gly85 90 95Glu Lys Val Asp Leu Ala Lys Val Lys Phe Ser Asp Phe Glu Leu Ser100 105 110Leu Asp Met His Gln Gly Leu Leu Ser Arg Ser Phe Ile Tyr Glu Gly115 120 125Lys Asp Val Lys Val Lys Leu Glu Phe Glu Arg Phe Leu His Ile Val130 135 140Gln Lys Glu Ala Ala Leu Ile Lys Val Lys Ala Thr Val Leu Glu Gly145 150 155 160His Ala Lys Ile Asp Phe Asp Ser Thr Leu Asp Gly Thr Val Val Asn165 170 175Glu Asp Ser Asn Tyr Gly Asp Arg Phe Trp Ile Pro Leu Gly Glu Asp180 185 190Lys Asp Glu Lys Thr Ile Gln Val Lys Thr Lys Lys Asn Pro Tyr Asp195 200 205Val Pro Gln Phe Thr Val Leu Leu Lys Glu Ala Leu Arg Asn Asn Gly
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1.分离的核酸分子，所述的核酸分子选自a)含有在SEQ ID NO1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27或29中列出的核苷酸序列的核酸分子；b)含有与SEQ ID NO1或3具有至少90％序列同一性的核苷酸序列的核酸分子，其中所述核酸分子编码具有草酸盐降解活性的多肽；或含有与SEQ ID NO5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27或29具有至少90％序列同一性的核苷酸序列的核酸分子，其中所述核酸分子编码具有生物学活性的多肽；c)含有SEQ ID NO1或3的至少50个连续核苷酸的核酸分子，其中所述核酸分子编码具有草酸盐降解活性的多肽；或含有SEQ ID NO5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27或29的至少50个连续核苷酸的核酸分子，其中所述核酸分子编码具有生物学活性的多肽；d)编码包含在SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、27、28或30中列出的氨基酸序列的多肽的核酸分子；和e)在严紧条件下与a)-d)中任一杂交的核酸分子，其中所述核酸分子编码具有草酸盐降解活性的多肽。
2.含有权利要求1的核酸分子的载体。
3.含有异源核酸分子的细胞，其中所述的异源核酸分子在权利要求1中给出。
4.权利要求3的细胞，其中所述的细胞是细菌细胞。
5.分离的多肽，所述多肽选自a)含有SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28或30中列出的氨基酸序列的多肽；b)含有具有SEQ ID NO2或4的至少50个连续氨基酸的片段的多肽，其中所述多肽具有草酸盐降解活性；或含有具有SEQ ID NO6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28或30的至少50个连续氨基酸的片段的多肽，其中所述的多肽具有生物学活性；和c)与在SEQ ID NO2或4中列出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的多肽；或与SEQ ID NO6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28或30所示氨基酸序列具有至少90％序列同一性的多肽。
6.选择性结合权利要求5的多肽的抗体。
7.细菌，所述的细菌包含(a)选自以下的第一核酸分子i)含有SEQ ID NO1中列出的核苷酸序列的核酸分子；ii)含有与SEQ ID NO1具有至少90％序列同一性的核苷酸序列的核酸分子，其中所述核苷酸序列编码具有草酸盐降解活性的多肽；iii)含有具有SEQ ID NO1的至少50个连续核苷酸的片段的核酸分子，其中所述核苷酸序列编码具有草酸盐降解活性的多肽；iv)编码含有SEQ ID NO2中列出的氨基酸序列的多肽的核酸分子；和v)在严紧条件下与i)-iv)中任一杂交的核酸分子，其中所述核苷酸序列编码具有草酸盐降解活性的多肽；和(b)选自以下的第二核酸分子i)含有SEQ ID NO3中列出的核苷酸序列的核酸分子；ii)含有与SEQ ID NO3具有至少90％序列同一性的核苷酸序列的核酸分子，其中所述核苷酸序列编码具有草酸盐降解活性的多肽；iii)包含具有SEQ ID NO3的50个连续核苷酸的片段的核酸分子，其中所述核苷酸序列编码具有草酸盐降解活性的多肽；iv)编码含有SEQ ID NO4中列出的氨基酸序列的多肽的核酸分子；和v)在严紧条件下与i)-iv)中任一杂交的核酸分子；其中至少所述第一或第二核酸分子之一相对于所述细菌是异源的并且所述第一和第二核酸分子有效地连接至在所述细菌中有活性的启动子。
8.权利要求7的细菌，其中所述的第一和第二核酸分子两者相对于所述细菌细胞都是异源的。
9.权利要求4、7或8的细菌，其中所述细菌是益生菌。
10.权利要求4、7或8的细菌，其中所述细菌是乳酸菌。
11.权利要求10的细菌，其中所述的乳酸菌选自噬酸乳杆菌、加氏乳杆菌、约氏乳杆菌和植物乳杆菌。
12.用于调控细胞草酸盐降解活性的方法，所述的方法包括a)将至少一种权利要求1的核酸分子引入所述细胞；并且b)在允许所述核酸分子表达的条件下培养所述细胞，其中所述核酸分子的表达调控所述细胞的草酸盐降解活性。
13.权利要求12的方法，其中所述的细胞是细菌细胞。
14.用于在受试者中增加草酸盐降解的方法，所述方法包括将有效浓度的权利要求4、7、8、9、10或11的所述细菌引入所述受试者。
15.用于在受试者中增加草酸盐降解的方法，所述方法包括将有效浓度的权利要求5的至少一种多肽引入所述受试者。
16.用于产生多肽的方法，所述方法包括在其中编码所述多肽的核酸分子得以表达的条件下培养权利要求3的细胞，所述多肽选自a)含有SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28或30中列出的氨基酸序列的多肽；b)含有具有SEQ ID NO2或4的至少50个连续氨基酸的片段的多肽，其中所述多肽具有草酸盐降解活性；或含有具有SEQ ID NO6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28或30的至少50个连续氨基酸的片段的多肽，其中所述的多肽具有生物学活性；和c)与在SEQ ID NO2或4中列出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的多肽；或与在SEQ ID NO6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28或30中列出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的多肽。
17.用于在样品中检测多肽存在的方法，所述方法包括将所述样品与选择性结合多肽的化合物接触并检测所述化合物是否结合至所述样品中的所述多肽上；其中所述多肽选自a)含有SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28或30中列出的氨基酸序列的多肽；b)含有具有SEQ ID NO2或4的至少50个连续氨基酸的片段的多肽，其中所述多肽具有草酸盐降解活性；或含有具有SEQ ID NO6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28或30的至少50个连续氨基酸的片段的多肽，其中所述的多肽具有生物学活性；和c)与在SEQ ID NO2或4中列出的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的多肽；或与在SEQ ID NO6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28或30中列出的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的多肽。
18.权利要求17的方法，其中结合所述多肽的所述化合物是抗体。
19.试剂盒，所述试剂盒包含用于权利要求17的方法的化合物和使用说明书。
20.用于检测样品中权利要求1的核酸分子存在的方法，所述的方法包括以下步骤a)将所述样品与选择性杂交至所述核酸分子的核酸探针或引物接触；并且b)检测所述核酸探针或引物是否结合至所述样品中的核酸分子。
21.权利要求20的方法，其中所述样品含有mRNA分子并且将所述样品与核酸探针接触。
22.试剂盒，所述试剂盒包括选择性与权利要求1的核酸分子杂交的化合物和使用说明书。
23.用于修饰细菌细胞功能特性的方法，所述方法包括a)用核酸分子转化所述细菌细胞，所述核酸分子包括有效连接至编码异源多肽或其片段的核苷酸序列的权利要求1的核苷酸序列；并且b)在允许所述核酸分子表达的条件下培养所述细菌细胞，其中所述异源多肽或其片段在所述细菌上或所述细菌中表达并且提供野生型细菌细胞中不存在的功能。
24.用于修饰发酵乳产品的风味的方法，所述方法包括在细菌中过度表达至少一种来自噬酸乳杆菌的多肽，并将所述细菌用于发酵乳产品，其中所述多肽选自a)含有SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28或30中列出的氨基酸序列的多肽；b)含有与SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、2O、22、24、26、28或30的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的多肽，其中所述的多肽保留了生物学活性；c)含有SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28或30的氨基酸序列的片段的多肽，其中所述片段保留了生物学活性；以及d)由核苷酸序列编码的多肽，所述核苷酸序列与SEQ ID NO1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27或29的核苷酸序列具有至少90％的同一性。
25.药物组合物，所述药物组合物包含权利要求3、4、7、8、9、10或11的细胞。
26.药物组合物，所述药物组合物包含权利要求5的多肽。
27.权利要求25或26的药物组合物在生产用于调控细胞的草酸盐降解活性的药物中的用途。
28.权利要求25或26的药物组合物在调控细胞的草酸盐降解活性中的用途。
全文摘要
本发明提供了嗜酸乳杆菌NCFM核酸分子、多肽、其片段和变体。此外，也包括融合蛋白、抗原肽和抗体。本发明也提供了包含本发明核酸分子的重组表达载体，以及含有该表达载体的细胞。还提供了生产本发明多肽的方法和使用它们的方法。
文档编号A61K35/74GK101084314SQ200580040705
公开日2007年12月5日 申请日期2005年10月27日 优先权日2004年10月27日
发明者W·M·拉塞尔, T·R·克拉恩哈莫, E·奥特曼 申请人:北卡罗来纳州大学