蛋白质过敏原衍生物的制作方法

专利名称：蛋白质过敏原衍生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及降低野生型蛋白质过敏原的致敏活性的方法、新型过敏原衍生物和过敏反应疫苗接种方案。
背景技术：
过敏反应是对通常无害的外来(即，非本体)物质(“过敏原”)的反应能力的遗传或后天特异性变异。过敏反应与受侵袭器官系统(皮肤、结膜、鼻子、咽、支气管粘膜、胃肠道)中的炎性反应、急性疾病症状(例如过敏性鼻炎、结膜炎、皮炎、过敏性休克和哮喘)和慢性疾病表现(例如哮喘和特异性皮炎中的晚期反应)相关联。
I型过敏反应代表遗传决定的超敏症，其侵扰大约20％的工业化世界人口。I型过敏反应的病理生理标志是对无害抗原(过敏原)产生免疫球蛋白E(IgE)抗体。
目前，过敏反应治疗的唯一成因(causative)形式是过敏原特异性的免疫疗法，其中对患者施用递增的过敏原剂量以引发过敏原特异性的无应答状态。尽管数个研究已经证实了过敏原特异性的免疫疗法的临床效力，但没有充分理解其中的机制。
过敏原特异性免疫疗法的主要缺点是依赖于天然过敏原提取物的使用，这些提取物难以(即使不是不可能)至少标准化至工业生产水平。这类天然过敏原提取物由不同的致敏和不致敏化合物构成，由于该事实，在施用的提取物中可能不存在某些过敏原，或甚至更糟糕的是，患者可能在治疗过程中对组分产生新的IgE-特异性。提取物为基础的疗法的另一缺点源于下述事实——即生物活性过敏原制品的施用可能引发过敏性副作用。
分子生物技术在过敏原表征领域中的应用能够分离出为所有相关环境过敏原编码的cDNAs并能够生产重组过敏原。使用这类重组过敏原可以通过体外诊断法(即在血清中检测过敏原特异性的IgE抗体)或体内测试来确定各个患者的反应性状况(profile)。基于这种技术，似乎可以开发出针对过敏反应，尤其是针对I型过敏反应的新型组分为基础的疫苗接种方案，这些方案可以根据患者的敏感状况进行调节。但是，由于重组过敏原与其天然对应物的相似性，重组过敏原也表现出显著的致敏活性。由于重组过敏原近似地模仿野生型过敏原的致敏活性，在施用天然过敏原的免疫疗法中与这种致敏活性相联的所有缺点也存在于重组过敏原中。为了改进免疫疗法，必须降低重组过敏原的致敏活性，由此可以提高过敏原施用剂量而仅具有低的过敏性副作用风险。
已经建议通过施用仅含T细胞抗原决定簇的肽而只影响过敏原特异性T细胞的活性。T细胞抗原决定簇代表完整过敏原被抗原提呈细胞蛋白水解消化(proteolytic digestion)而产生的小肽。这类T细胞抗原决定簇可以作为合成肽制造。但是，迄今用T细胞抗原决定簇进行的试验仅表现出差的结果和低的效力。已经考虑了对T细胞肽为基础的免疫疗法的低效力的一些解释首先，可能难以施用最佳剂量以实现T细胞耐受而非活化。其次，小T细胞抗原决定簇肽在体内具有短半衰期。第三，显著证据表明特异反应性个体体内的IgE生成代表了不要求新生(de novo)类转换的记忆免疫应答并因此不受T细胞衍生的细胞因子控制。仅以T细胞抗原决定簇的施用为基础的治疗形式因此可以通过已转换的记忆B细胞调节过敏原特异性T细胞的活性，而可能对过敏原特异性IgE抗体的生成几乎没有影响。
已经进一步提出通过重组DNA技术或肽合成来制造低致敏过敏原衍生物或片段。这类衍生物或片段含有T细胞抗原决定簇并可以诱发与天然过敏原的IgE识别竞争的IgG抗体。20多年前证实，过敏原的蛋白水解消化产生小过敏原片段，它们部分保持其IgE结合能力但没有引起急性反应。尽管过敏原的蛋白水解难以控制和标准化，但分子生物学已经开辟了生产IgE结合半抗原的新途径。这类IgE结合半抗原经提议可用于具有降低的过敏性效应风险的积极免疫法，以及用于被动治疗法以在过敏原接触之前使效应细胞结合IgE达到饱和并由此阻断过敏原引发的介体释放。
另一建议是以下述观察为基础通过基因工程制造低致敏过敏原形式——过敏原可以作为仅在一些氨基酸残基方面和/或在具有低IgE结合能力的构象方面不同的异构体天然存在。例如，通过基因工程，主要桦树花粉过敏原Bet v 1的低聚产生具有显著降低的致敏活性的重组三聚体。或者，已经建议引入点突变以在过敏原结构中引起构象变化并由此破坏不连续的IgE抗原决定簇，或直接影响IgE结合能力(Valenta等人，Biol.Chem.380(1999)，815-824)。
还已经证明，由于它们的native-like folds的缺失，过敏原分裂成数部分(例如，分裂成两部分)导致过敏原的IgE结合能力和致敏活性几乎完全丧失(Vrtala等人(J.Clin.Invest.99(1997)，1673-1681)报导了Bet v 1，Twardosz等人(BBRC 239(1997)，197-204)报导了Bet v 4，Hayek等人(J.Immunol.161(1998)，7031-7039)报导了Alng 4，Zeiler等人(J.Allergy Clin.Immunol.100(1997)，721-727)报导了牛毛屑过敏原，Elfman(Int.Arch.Allergy Immunol.117(1998)，167-173)报导了Lep d2)，Westritschnig(J.Immunol.172(2004)，5684-5692)报道了Phlp 7)....)。主要含有不连续/构象IgE抗原决定簇的蛋白质的分裂导致抗原的IgE结合能力显著降低。基于这一认识，在现有技术中研究了这类低致敏过敏原片段是否可以在体内引发保护性免疫应答(Westritschnig等人(Curr.Opinion in Allergy and Clin.Immunol.3(2003)，495-500))。
本发明的目的是基于上述认识提供改进过敏反应免疫疗法的手段和方法。这类方法和手段应该是有效的，具有低过敏性休克风险，容易顺应各个患者的需求并容易转化成工业规模。

发明内容
因此，本发明提供了具有降低的致敏活性的野生型蛋白质过敏原衍生物的制造方法，其特征在于包括下列步骤-提供具有致敏活性的野生型蛋白质过敏原，-将所述野生型蛋白质过敏原剪切成两部分，所述两部分具有降低的致敏活性或缺乏致敏活性，并-将所述两个片段以相反方向(inverse orientation)重新接合。
本发明的方法基于下述事实——主要含有不连续/构象IgE抗原决定簇的蛋白质的分裂导致过敏原的IgE结合能力显著降低。但是，某些过敏原的片段的致免疫性太低以致不能引发保护性抗体应答(Westritschnig等人，(2004))。
使用本方法，提供了新型和指定蛋白质过敏原衍生物，其结合了以T细胞和B细胞抗原决定簇为基础的方法的优点。同时，本发明的过敏原衍生物不存在仅用片段或用片段的复杂排列(例如结合半抗原和与三个或更多片段改组(shuffling)的IgE)进行疫苗接种的缺点。
实际上，本发明表明，使用在结构要素的完整性方面最接近野生型过敏原(例如，具有野生型过敏原的所有氨基酸)但没有其致敏活性(或致敏活性充分降低)的结构可以获得最佳结果。当然，如果在在过敏原衍生物生成过程中仅缺失(删除)或添加(插入)数个氨基酸残基或如果各部分通过连接体结合而非直接结合，本发明的优点仍然存在。通过将过敏原分成指定片段的已知和一般原理实现致敏活性的这种降低或消除。除了这种一般原理外，本发明还将所得过敏原的两部分以相反方向重新接合，这产生含有过敏原的几乎所有相关结构信息(因为在本发明的过敏原衍生物中包含完全或几乎完全的氨基酸序列)但与野生型过敏原相比只有低(或没有)残留致敏活性的过敏原衍生物。
本发明的这些“头-尾倒置(head-to-tail)”衍生物能够为过敏反应患者带来适当的、个人化的和有效的免疫疗法，其容易用常规步骤扩大规模。本发明的衍生物诱发保护性IgG抗体，其可以阻断患者的IgE与野生型过敏原的结合并抑制过敏原诱发的嗜碱细胞脱粒。
本发明的方法尤其适用于重组DNA技术。一旦通过基因工程构筑衍生物，其可以容易地以工业规模在合适的宿主中通过转基因表达以相当大的量获得。本发明的过敏原衍生物优选在具有高表达能力的宿主中制造。
通过本发明改性的优选过敏原包括例如在www.allergen.org/List.htm下可得的所有主要蛋白质。根据本发明，特别优选的过敏原类别包括前纤维蛋白(profilins)，尤其是Ph1 p12，桦树过敏原，尤其是Bet v 4，尘螨过敏原，尤其是Der p2，储螨过敏原，尤其是Lep d 2，梯牧草过敏原，尤其是Phl p 7，和表A中所列的过敏原。
表A通过根据本发明连接(shuffling)而改性的优选过敏原(包括参比例)














参考文献1.Marsh，D.G.，and L.R.Freidhoff.1992.ALBE，an allergen database.IUIS，Baltimore，MD，Edition 1.0.
2.Marsh，D.G.，L. Goodfriend，T.P. King，H.Lowenstein，and T.A.E.Platts-Mills.1986.Allergen nomenclature.Bull WHO 64767-770.
3.King，T.P.，P.S.Norman，and J.T. Cornell.1964.Isolation and characterization ofallergen from ragweed pollen.II.Biochemistry 3458-468.
4.Lowenstein，H.1980.Timothy pollen allergens.Allergy 35188-191.
5.Aukrust，I.1980.Purification of allergens in Cladosporium herbarum.Allergy35206-207.
6.Demerec，M.，E.A.Adelberg，A.J.Clark，and P.E.Hartman.1966.A proposal for auniform nomenclature in bacterial genetics.Genetics 5461-75.
7.Bodmer，J.G.，E.D.Albert，W.F.Bodmer，B.Dupont，H.A.Erlich，B.Mach，S.G.E.Marsh，W.R.Mayr，P.Parham，T.Sasuki，G.M.Th.Schreuder，J.L.Strominger，A.Svejgaard，and P.I.Terasaki.1991.Nomenclature for factors of the HLA system，1990.Immunogenetics 33301-309.
8.Griffith，I.J.，J.Pollock，D.G.Klapper，B.L.Rogers，and A.K.Nault.1991.Sequencepolymorphism of Amb a I and Amb a II，the major allergens in Ambrosia artemisiifolia(short ragweed).Int.Arch.Allergy Appl.Immunol.96296-304.
9.Roebber，M.，D.G.Klapper，L.Goodfriend，W.B.Bias，S.H.Hsu，and D.G.Marsh.1985.Immunochemical and genetic studies of Amb t V(Ra5G)，an Ra5 homologuefrom giant ragweed pollen.J.Immunol.1343062-3069.
10.Metzler，W.J.，K.Valentine，M.Roebber，M.Friedrichs，D.G.Marsh，and L.Mueller.1992.Solution structures of ragweed allergen Amb t V.Biochemistry315117-5127.
11.Metzler，W.J.，K.Valentine，M.Roebber，D.G.Marsh，and L.Mueller.1992.Proton resonance assignments and three-dimensional solution structure of the ragweedallergen Amb a V by nuclear magnetic resonance spectroscopy.Biochemistry318697-8705.
12.Goodfriend，L.，A.M.Choudhury，J.Del Carpio，and T.P.King.1979.CytochromesCNew ragweed pollen allergens.Fed.Proc.381415.
13.Ekramoddoullah，A.K.M.，F.T.Kisil，and A.H.Sehon.1982.Allergenic crossreactivity of cytochrome c from Kentucky bluegrass and perennial ryegrass pollens.MoI.Immunol.191527-1534.
14.Ansari，A.A.，E.A.Killoran，and D.G.Marsh.1987.An investigation of humanresponse to perennial ryegrass(Lolium perenne)pollen cytochrome c{Lol p X).J.Allergy Clin.Immunol.80229-235.
15.Morgenstern，J.P.，I.J.Griffith，A.W.Brauer，B.L.Rogers，J.F.Bond，M.D.Chapman，and M.Kuo.1991.Amino acid sequence of FeI d I，the major allergen of the domesticcatprotein sequence analysis and cDNA cloning.Proc.Natl.Acad.Sci.USA889690-9694.
16.Griffith，I.J.，S.Craig，J.Pollock，X.Yu，J.P.Morgenstern，and B.L.Rogers.1992.Expression and genomic structure of the genes encoding FdI，the major allergen fromthe domestic cat.Gene 113263-268.
17.Weber，A.，L.Marz，and F.Altmann.1986.Characteristics of the asparagine-linkedoligosaccharide from honey-bee venom phospholipase A2.Comp.Biochem.Physiol.83B321-324.
18.Weber，A.，H.Schroder，K.Thalberg，and L.Marz.1987.Specific interaction of IgEan-tibodies with a carbohydrate epitope of honey bee venom phosphollpase A2.allergy42464-470.
19.Stanworth，D.R.，K.J.Dorrington，T.E.Hugli，K.Reid，and M.W.Turner.1990.Nomenclature for synthetic peptides representative of immunoglobulin chain sequences.Bulletin WHO 68109-111.
20.Rafnar，T.，I.J.Griffith，M.C.Kuo，J.F.Bond，B.L.Rogers，and D.G.Klapper.1991.Cloning of Amb a I(Antigen E)，the major allergen family of short ragweedpollen.J.Biol.Chem.2661229-1236.
21.Rogers，B.L.，J.P.Morgenstern，I.J.Griffith，X.B.Yu，CM.Counsell，A.W.Brauer，T.P.King，R.D.Garman，and M.C.Kuo.1991.Complete sequence of the allergen Amba IIrecombinant expression and reactivity with T cells from ragweed allergic patients.J.Immunol.1472547-2552.
22.Klapper，D.G.，L.Goodfriend，and J.D.Capra.1980.Amino acid sequence ofragweed allergen Ra3.Biochemistry 195729-5734.
23.Ghosh，B.，M.P.Perry，T.Rafnar，and D.G.Marsh.1993.Cloning and expression ofimmunologically active recombinant Amb a V allergen of short ragweed(Ambrosiaartemisiifolia)pollen.J.Immunol.1505391-5399.
24.Roebber，M.，R.Hussain，D.G.Klapper，and D.G.Marsh.1983.Isolation andproperties of a new short ragweed pollen allergen，Ra6.J.Immunol.131706-711.
25.Lubahn，B.，and D.G.Klapper.1993.Cloning and characterization of ragweedallergen Amb a VI(abst).J.Allergy Clin.Immunol.91338.
26.Roebber，M.，and D.G.Marsh.1991.Isolation and characterization of allergen Amba VII from short ragweed pollen.J.Allergy Clin.Immunol.87324.
27 Goodfriend L，Choudhury AM，Klapper DG，Coulter KM，Dorval G，DelCarpio J，Osterland CK.Ra5G，a homologue of Ra5 in giant ragweed pollenisolation，HIA-DR-associated activity and amino acid sequence.MoI Immunol 22899-906，1985.
28 Himly M，Jahn-Schmid B，Dedic A，Kelemen P，Wopfner N，Altmann F，van Ree R，Briza P，Richter K，Ebner C，Ferreira F.Art v 1，the major allergen of mugwort pollen，isa modular glycoprotein with a defensin-like and a hydroxyproline-rich domain.FASEBJ 17106-108，2003.
28A Nilsen，B.M.，K.Sletten，M.O′Neill，B.Smestead Paulsen，and H.van Halbeek.1991.Structural analysis of the glycoprotein allergen Art v II from pollen of mugwort(Artemesia vulgaris).J.Biol.Chem.2662660-2668.
29 Wopfner N，Willeroidee M，Hebenstreit D，van Ree R，Aalbers M，Briza P，Thalhamer J，Ebner C，Richter K，Ferreira F.Molecular and immunologicalcharacterization ofprofilin from mugWort pollen.Biol Chem 3831779-1789，2002.
29A Jimenez A，Moreno C，Martinez J，Martinez A，Bartolome B，Guerra F，Palacios R1994.Sensitization to sunflower pollenonly an occupational allergy？Int Arch AllergyImmunol 105297-307.
29B Barderas R，Villalba M，Lombardero M，Rodriguez R.Identification andcharacterization of Che a l allergen from Chenopodium album pollen.Int Arch AllergyImmunol 12747-54，2002.
29C Cames J，Fernandez-Caldas E，Casanovas M，Lahoz C，Colas C.Immunochemical characterization of Salsola kali pollen extracts.Allergy 56，Supplement 68274，2001.
29D Giuliani A，Pini C，Bonini S，Mucci N，Ferroni L，Vicari GIsolation andpurification of a major allergen from Parietaria officinalis pollen.Allergy 42434-440，1987.
30Smith，P.M.，Suphioglu，C.，Griffith，I.J.，Theriault，K.，Knox，R.B.and Singh，M.B.1996.Cloning and expression in yeast Pichia pastoris of a biologically active form ofCyn d 1，the major allergen of Bermuda grass pollen.J.Allergy Clin.Immunol.98331-343.
31Suphioglu，C.，Ferreira，F.and Knox，R.B.1997.Molecular cloning andimmunological characterisation of Cyn d 7，a novel calcium-binding allergen fromBermuda grass pollen.FEBS Lett.402167-172.
31a.Asturias JA，Arilla MC，Gomez-Bayon N，Martinez J，Martinez A，and Palacios R.1997.Cloning and high level expression of Cynodon dactylon(Bermuda grass)pollenprofilin(Cyn d 12)in Escherichia colipurification and characterization of the allergen.Clin ExpAllergy 271307-1313.
32.Mecheri，S.，G.Peltre，and B.David.1985.Purification and characterization of amajor allergen from Dactylis glomerata pollenThe Ag Dg 1.Int.Arch.Allergy Appl.Immunol 78283-289.
33.Roberts，A.M.，L.J.Bevan，P.S.Flora，I.Jepson，and M.R.Walker.1993.Nucleotide sequence of cDNA encoding the Group II allergen of Cocksfoot/Orchardgrass(Dactylis glomerata)，Dae g II.Allergy 48615-623.
33a.Guerin-Marchand，C，Senechal，H.，Bouin，A.P.，Leduc-Brodard，V.，Taudou，G.，Weyer，A.，Peltre，G.and David，B.1996.Cloning，sequencing and immunologicalcharacterization of Dae g 3，a major allergen from Dactylis glomerata pollen.MoI.Immunol.33797-806.
34.Klysner，S.，K.Welinder，H.Lowenstein，and F.Matthiesen.1992.Group Vallergens in grass pollen IV.Similarities in amino acid compositions and amino terminalsequences of the group V allergens from Lolium perenne，Poa pratensis and Dactylisglomerata.Clin.Exp.Allergy 22491-497.
35.Perez，M.，G.Y.Ishioka，L.E.Walker，and R.W.Chesnut.1990.cDNA cloningand immunological characterization of the rye grass allergen LoI p I.J.Biol.Chem.26516210-16215.
36.Griffith，I.J.，P.M.Smith，J.Pollock，P.Theerakulpisut，A.Avjioglu，S.Davies，T.Hough，M.B.Singh，R.J.Simpson，L.D.Ward，and R.B.Knox.1991.Cloning andsequencing of LoI p I，the major allergenic protein of rye-grass pollen.FEBS Letters279210-215.
37′.Ansari，A.A.，P.Shenbagamurthi，and D.G.Marsh.1989.Complete amino acidsequence of a Lolium perenne{perennial rye grass)pollen allergen，LoI p II.J.Biol.Chem.2641118l-11185.
37a.Sidoli，A.，Tamborini，E.，Giuntini，I.，Levi，S.，Volonte，G.，Paini，C，De Lalla，C，Siccardi，A.G.，Baralle，F.E.，Galliani，S.and Arosio，P.1993.Cloning，expression，andimmunological characterization of recombinant Lolium perenne allergen LoI p II.J.Biol.Chem.26821819-21825.
38.Ansari，A.A.，P.Shenbagamurthi，and D.G.Marsh.1989.Complete primarystructure of a Lolium perenne(perennial rye grass)pollen allergen，LoI p IIIComparison with known LoI p I and II sequences.Biochemistry 288665-8670.
39.Singh，M.B.，T.Hough，P.Theerakulpisut，A.Avjioglu，S.Davies，P.M.Smith，P.Taylor，R.J.Simpson，L.D.Ward，J.McCluskey，R.Puy，and R.B.Knox.1991.Isolation of cDNA.encoding a newly identified major allergenic protein of rye-grasspollenIntracellular targeting to the amyloplost.Proc.Natl.Acad.Sci.881384-1388.
39a.van Ree R，Hoffman DR，van Dijk W，Brodard V，Mahieu K，Koeleman CA，Grande M，van Leeuwen WA，Aalberse RC.1995.LoI p XI，a new major grass pollenallergen，is a member of a family of soybean trypsin inhibitor-related proteins.J AllergyClin Immunol 95970-978.
40.Suphioglu，C.and Singh，M.B.1995.Cloning，sequencing and expression inEscherichia coli of Pha a 1 and four isoforms of Pha a 5，the major allergens of canarygrass pollen.Clin.Exp.Allergy 25853-865.
41 Dolecek，C，Vrtala，S.，Laffer，S.，Steinberger，P，Kraft，D.，Scheiner，O.and Valenta，R.1993.Molecular characterization of PhI p II，a major timothy grass(Phleum pratense)pollen allergen.FEBS Lett.335299-304.
41A Fischer S，Grote M，Fahlbusch B，Muller WD，Kraft D，Valenta R.1996.Characterization of PhI p 4，a major timothy grass(Phleum pratense)pollen allergen.JAllergy Clin Immunol 98189-198.
42 Matthiesen，F.，and H.Lowenstein.1991.Group V allergens in grass pollens.I.Purification and characterization of the group V allergen from Phleum pratense pollen，PhI p V.Clin.Exp.Allergy 21297-307.
43 Petersen，A.，Bufe，A.，Schranmm，G.，Schlaak，M.and Becker，W.M.1995.Characterization of the allergen group VI in timothy grass pollen(PhI p 6).II.cDNAcloning of PhI p 6 and structural comparison to grass group V.Int.Arch.AllergyImmunol.10855-59.
43A Marknell De Witt A，Niederberger V，Lehtonen P，Spitzauer S，Sperr WR，Valent P，Valenta R，Lidholm J.Molecular and immmunological characterization of a novel timothygrass(Phleum pratense)pollen allergen，PhI p 11.Clin Exp Allergy 321329-1340，2002.
44 Valenta，R.，Ball，T.，Vrtala，S.，Duchene，M.，Kraft，D.and Scheiner，O.1994.cDNAcloning and expression of timothy grass (Phleum pratense)pollen profilin inEscherichia colicomparison with birch pollen profilin.Biochem.Biophys.Res.Commun.199106-118.
46 Esch，R.E.，and D.G.Klapper.1989.Isolation and characterization of a majorcross-reactive grass group I allergenic determinant.MoI.Immunol.26557-561.
47.Olsen，E.，L.Zhang，R.D.Hill，F.T.Kisil，A.H.Sehon，and S.Mohapatra.1991.Identification and characterization of the Poa p IX group of basic allergens of Kentuckybluegrass pollen.J.Immunol.147205-211.
48.Avjioglu，A.，M.Singh，and R.B.Knox.1993.Sequence analysis of Sor h I，thegroup I allergen of Johnson grass pollen and it comparison to rye-grass LoI p I(abst).J.Allergy Clin.Immunol.91340.
52.Kos T，Hoffmann-Sommergruber K，Ferreira F，Hirschwehr R，Ahorn H，HorakF，Jager S，Sperr W，Kraft D，Scheiner 0.1993.Purification，characterization andN-terminal amino acid sequence of a new major allergen from European chestnutpollen-Cas s 1.Biochem Biophys Res Commun 1961086-92.
53.Diaz-Perales A，Lombardero M，Sanchez-Monge R，Garcia-Selles FJ，Pernas M，Fernandez-Rivas M，Barber D，Salcedo G.2000.Lipid-transfer proteins as potentialplant panallergenscross-reactivity among proteins of Artemisia pollen，Castaneae nutand Rosaceae fruits，with different IgE-binding capacities.Clin Exp Allergy301403-1410.
54.Ipsen，H.，and O.C.Hansen.1991.The NH2-terminal amino acid sequence of theimmuno-chemically partialidentical maj or allergens of alder(Alnus glutinosa)AIn g I，birch(Betula verrucosa)Bet v I，hornbeam(Carpinus betulus)Car b I and oak(Quercusalba)Que a I pollens.MoI.Immunol.281279-1288.
55.Taniai，M.，S.Ando，M.Usui，M.Kurimoto，M.Sakaguchi，S.Inouye，and T.Matuhasi.1988.N-terminal amino acid sequence of a major allergen of Japanese cedarpollen(Cryj I).FEBS Lett.239329-332.
56.Griffith，I.J.，A.Lussier，R.Garman，R.Koury，H.Yeung，and J.Polloc k.1993.ThecDNA cloning of Cry j I，the major allergen of Cryptomeria j aponica(Japanese cedar)(abst).J.Allergy Clin.Immunol.91339.
57.Sakaguchi，M.，S.Inouye，M.Taniai，S.Ando，M.Usui，and T.Matuhasi.Identification of the second major allergen of Japanese cedar pollen.Allergy 45309-312，1990.
57A Yokoyama M，Miyahara M，Shimizu K，Kino K，Tsunoo H.Purification，identification，and cDNA cloning of Jun a 2，the second major allergen of mountaincedar pollen.Biochem Biophys Res Coi[alpha]-mun 275195-202，2000.
57B Midoro-Horiuti T，Goldblum RM，Kurosky A，Wood TG，Brooks EG.VariableExpression of Patho-genesis-Related Protein Allergen in Mountain Cedar(Juniperusashei)Pollen.J Immunol1642188-2192，2000.
57C Tinghino R.，Barletta B.，Palumbo S.，Afferni C，Iacovacci P.，Mari A.，Di FeliceG.，Pini，C.Molecular characterization of a cross-reactive Juniperus oxycedrus pollenallergen，Jun o 2a novel calcium-binding allergen J.Allergy Clin.Immunol.101772-777，1998.
58Gross GN，Zimburean JM，Capra JD.Isolation and partial characterization of theallergen in mountain cedar pollen.Scand J Immunol 8437-441，1978.
58A Obispo TM，Melero JA，Carpizo JA，Carreira J，Lombafdero M.The mainallergen of Olea euro-paea(Ole e I)is also present in other species of the oleaceaefamily.Clin ExpAllergy 23311-316，1993.
58B Midoro-Horiuti T，Goldblum RM，Brooks EG.Identification of mutations in thegenes for the pollen allergens of eastern red cedar(Juniperus virginiana).Clin ExpAllergy 31771-778，2001.
59 Lombardero M.，Barbas J.A.，Moscoso del Prado J.，Carreira J.cDNA sequenceanalysis of the main olive allergen，Ole e I.Clin.Exp.Allergy 24765-770，1994.
60 Villalba，M.，E.Batanero，C.Lopez-Otin，L.M.Sanchez，R.I.Monsalve，M.A.Gonzalez de Ia Pena，C.Lahoz，and R.Rodriguez.Amino acid sequence of Ole e I，themajor allergen from olive tree pollen(Olea europaea).Eur.J.Biochem.216863-869，1993.
60A Asturias JA，Arilla MC，Gomez-Bayon N，Martinez J，Martinez A，Palacios R.Cloning and expression of the panallergen profilin and the major allergen(Ole e 1)fromolive tree pollen.J Allergy Clin Immunol100365-372，1997.
60B Batanero E，Villalba M，Ledesma A Pu ente XS，Rodriguez R.Ole e 3，an olive-treeallergen，belongs to a widespread family of pollen proteins.Eur J Biochem 241772-778，1996.
60C Batanero E，Ledesma A，Villalba M，Rodriguez R.Purification，amino acidsequence and immunological characterization of Ole e 6，a cysteine-enriched allergenfrom olive tree pollen.FEBS Lett.410293-296，1997.
60D Tejera ML，Villalba M，Batanero E，Rodriguez R.Identification，isolation，andcharacterization of Ole e 7，a new allergen of olive tree pollen.J Allergy Clin Immunol104797-802，1999.
60E Ledesma A，Villalba M，Rodriguez R.Cloning，expression and characterization of anovel four EF-hand Ca(2+)-binding protein from olive pollen with allergenic activity.FEBS Lett 466192-196，2000.
60F Barral P，Batanero E，Palomares O，Quiralte J，Villalba M，Rodriguez R.A majorallergen from pollen defines a novel family of plant proteins and shows intra-andinterspecies[correction of interspecie]cross-reactivity.J Immunol 1723644-3651，2004.
61 Yi FC，Cheong N，Shek PC，Wang DY，Chua K Y，Lee BW.Identification of sharedand unique immunoglobulin E epitopes of the highly conserved tropomyosins in Blomiatropicalis and Dermatophag-oides pteronyssinus.Clin Exp Allergy 321203-1210，2002.
61A Ramos JD，Cheong N，Lee BW，Chua K Y.cDNA cloning and expression of BIo t11，the Blomia tropicalis allergen homologous to paramyosin.Int Arch Allergy Immunol126286-293，2001.
62Chua，K.Y.，G.A.Stewart，and W.R.Thomas.Sequence analysisof cDNA encodingfor a major house dust mite allergen，Der p i.J.Exp.Med.167175-182，1988.
62A Chua，K.Y.，C.R.Doyle，R.J.Simpson，K.J.Turner，G.A.Stewart，and VJ.R.Thomas.Isolation of cDNA coding for the major mite allergen Der p II by IgE plaqueimmunoassay.Int.Arch.Allergy Appl.Immunol.91118-123，1990.
62B Smith AM，Benjamin DC，Derewenda U，Smith WA，Thomas WR，Chapman MD.Sequence polymorphisms and antibody binding to the group 2 dust mite allergens.IntArch Allergy Immunol 12461-63，2001.
62C Smith AM，Benjamin DC，Hozic N，Derewenda U，Smith WA，Thomas WR，Gafvelin G，van Hage-Ham-sten M，Chapman MD.The molecular basis of antigeniccross-reactivity between the group 2 mite allergens.J Allergy Clin Immunol 107977-984，2001.
63 Smith WA，Thomas WR.Comparative analysis of the genes encoding group 3allergens from Derma-tophagoides pteronyssinus and Dermatophagoides farinae.IntArch Allergy Immunol 109133-140，1996.
64 Lake，F.R.，L.D.Ward，R.J.Simpson，P.J.Thompson，and G.A.Stewart.House dustmite-derived amylaseAllergenicity and physicochemical characterisation.J.AllergyClin.Immunol.871035-1042，1991.
65 Tovey，E.R.，M.C.Johnson，A.L.Roche，G.S.Cobon，and B.A.Baldo.Cloningand sequencing of a cDNA expressing a recombinant house dust mite protein that bindshuman IgE and corresponds to an important low molecular weight allergen.J.Exp.Med.1701457-1462，1989.
66 Yasueda，H.，T.Shida，T.Ando，S.Sugiyama，and H.Yamakawa.1991.Allergenicand proteolytic properties of fourth allergens from Dermatophagoides mites.In″DustMite Allergens and Asthma.Report of the 2nd international workshop″A.Todt，Ed.，UCB Institute of Allergy，Brussels，Belgium，pp.63-64.
67 Shen，H.-D.，K.-Y. Chua，K.-.L.Lin，K.-H.Hsieh，and W.R.Thomas.Molecularcloning of a house dust mite allergen with common antibody binding specificities withmultiple components in mite extracts.Clin.Exp.Allergy 23934-940，1993.
67A O′Neil GM，Donovan GR，Baldo BA.Cloning and charaterisatlon of a majorallergen of the house dust mite Dermatophagoides pteronyssinus，homologous withglutathione S-transferase.Biochim Bio-phys Acta，1219521-528，1994.
67B King C，Simpson RJ，Moritz RL，Reed GE，Thompson PJ，Stewart GA.Theisolation and characterization of a novel collagenolytic serine protease allergen(Der p 9)from the dust mite Dermatophagoides pteronyssinus.J Allergy Clin Immunol 98739-747，1996.
68 Lind P，Hansen OC，Horn N.The binding of mouse hybridoma and human IgEantibodies to the major fecal allergen，Der p I of D.pteronyssinus.J.Immunol.1404256-4262，1988.
69 Dilworth，R.J.，K.Y.Chua，and W.R.Thomas.Sequence analysis of cDNA codingfor a mojor house dust allergn Der f I.Clin.Exp.Allergy 2125-32，1991.
70 Nishiyama，C，T.Yunki，T.Takai，Y.Okumura，and H.Okudaira.Determination ofthree disulfide bonds in a major house dust mite allergen，Der f II.Int.Arch.AllergyImmunol.101159-166.1993.
70A Trudinger，M.，K.Y.Chua，and W.R.Thomas.cDHA encoding the major dust miteallergen Der fII.Clin.Exp.Allergy 2133-38，1991.
71 Shen HD，Chua KY，Lin WL，Hsieh KH，Thomas WR.Molecular cloning andimmunological characterization of the house dust mite allergen Der f.7.Clin ExpAllergy 251000-1006，1995.
71A Tategaki A，Kawamoto S，Aki T，Jyo T，Suzuki O，Shigeta S，Ono K.Newlydescribed house dust mite allergens.ACI International suppl.174-76，2000.
72Aki T，Kodama T，Fujikawa A，Miura K，Shigeta S，Wada T，Jyo T，Murooka Y，OkaS，Ono K.Immunochemical characteristion of recombinant and native tropomyosins asa new allergen from the house dust mite Dermatophagoides farinae.J Allergy ClinImmunol 9674-83，1995.
72A Tsai L，Sun Y，Chao P，Ng H，Hung M，Hsieh K，Liaw S，Chua K.Sequenceanalysis and expression of a cDNA clone encoding a 98-kDa allergen inDermatophagoides farinae.Clin Exp Allergy 291606-1613，1999.
72B Gafvelin G，Johansson E，Lundin A，Smith AM，Chapman MD，Benjamin DC，Derewenda U，Van Hage-Hamsten M.Cross-reactivity studies of a new group 2allergen from the dust mite Glycyphagus do-mesticus，GIy d 2，and group 2 allergensfrom Dermatophagoides pteronyssinus，Lepidoglyphus destructor，and Tyrophagusputrescentiae with recombinant allergens.J Allergy Clin Immunol 107511-518，2001.
73 van Hage-Hamsten，M.，T.Bergman，E.Johansson，B.Persson，H.Jornvall，B.Harfast，and S.G.O.Johansson.N-terminal amino acid sequence of major allergen of themite lepidoglyphus destructor(abst).J.Allergy Clin.Immunol.91353，1993.
74 Varela J，Ventas P，Carreira J，Barbas JA，Glmenez-Gallego G，Polo F.Primarystructure of Lep d I，the main Lepidoglyphus destructor allergen.Eur J Biochem 22593-98，1994.
74A Schmidt M，van der Ploeg I，Olsson S，van Hage Hamsten M.The completecDNA encoding the Lepidoglyphus destructor major allergen Lep d 1.FEBS Lett 37011-14，1995.
75 Eriksson TLJ，Rasool O，Huecas S，Whitley P，Crameri R，Appenzeller[upsilon]，Gafvelin G，van Hage-Hamsten M.Cloning of three new allergens from the dust miteLepidoglyphus destructor using phage.surface display technolog y.Eur.J.Biochem.268287-294，2001.
75A Saarne T，Kaiser L，Rasool O，Huecas S，van Hage-Hamsten M，Gafvelin GCloning and characterisation of two IgE-binding proteins，homologous to tropomyosinand a-tubulin，from the mite Lepidoglyphus destructor.Int Arch Allergy Immunol 130258-265，2003.
75B Eriksson TL，Johansson E，Whitley P，Schmidt M，Elsayed S，van Hage-HamstenM.Cloning and characterisation of a group II allergen from the dust mite Tyrophagusputrescentiae.Eur.J.Biochem.251(1-2)，443-447，1998.
76.Rautiainen J，Rytkonen M，pelkonen J，Pentikainen J，Perola 0，Virtanen T，Zeiler T，Mantyjarvi R.BDA20，a major bovine dander allergen characterized at the sequencelevel is Bos d 2.Submitted.
77.Gjesing B，Lowenstein H.lmmunochemistry of food antigens.Ann Allergy 53602，1984.
78.de Groot，H.，K.G.H.Goei，P.van Swieten，and R.C.Aalberse.Affinity purificationof a major and a minor allergen from dog extractSerologic activity of affiity-purifiedCan fI and Can fI-depleted extract.J.Allergy Clin.Immunol.871056-1065，1991.
79.Konieczny，A.Personal communication；Immunologic Pharmaceutical Corp.
79A.Bulone，V.Separation of horse dander allergen proteins by two-dimensionalelectrophoresis.Molecular characterisation and identification of Equ c 2.0101 and Equ c2.0102 as lipocalin proteins.Eur J Biochem 253202-211，1998.
79B.Swiss-Prot ace.P81216，P81217.
79C.Dandeu J.P.，Rabillon J.，Divanovic A.，Carmi-Leroy A.，David B.(1993).Hydrophobic interaction chromatography for isolation and purification of Equ c 1，thehorse major allergen.J.Chromatogr.62123-31.
79D.Goubran Botros H.，Rabillon J.，Gregoire C，David B.，Dandeu J.P.1998.Thiophilic absorption chromatographypurification of Equ c 2 and Equ c 3，two horseallergens from horse sweat.J.Chromatogr.B 71057-65.
79E.Hilger C，Kohnen M，Grigioni F，Lehners C，Hentges F.Allergic cross-reactionsbetween cat and pig serum albumin.Allergy 52179-187，1997；and Hilger C，Grigioni F，Hentges F.Sequence of the gene encoding cat(Felis domesticus)serum albumin.Gene169295-296，1996.
79F.Ichikawa K，Vailes LD，Pomes A，Chapman MD.Molecular cloning，expressionand modeling of cat allergen，cystatin(FeI d 3)，a cysteine protease inhibitor.Clin ExpAllergy，In Press 2001.
80 Fahlbusch B，Rudeschko 0，Szilagyi O，Schlott B，Henzgen M，Schlenvoigt G，Schubert H.Purification and partial characterization of the major allergen，Cav p 1，from guinea pig Cavia por-cellus.Allergy 57417-422，2002.
81 McDonald，B.，M.C.Kuo，J.L.Ohman，and L.J.Rosenwasser.1988.A 29 aminoacid peptide derived from rat alpha 2 euglobulin triggers murine allergen specifichuman T cells(abst).J.Allergy Clin.Immunol.83251.
81A Clarke，A.J.，P.M.Cissold，R.A.Shawi，P.Beattie，and J.Bishop.1984.Structureof mouse urinary protein genesdifferential splicing configurations in the 3′-non-codingregion.EMBO J 31045-1052.
82.Longbottom，J.L.1983.Chracterization of allergens from the urines ofexperimental animals.McMillan Press，London，pp.525-529.83.Laperche，Y.，K.R.Lynch，K.P.Dolans，and P.Feigelsen.1983.Tissue-specific control of alpha 2u globulingene expressionconstitutive synthesis in submaxillary gland.Cell 32453-460.
83A.Bush RK，Sanchez H，Geisler D.1999.Molecular cloning of a major Alternariaalternata allergen，rAlt a 2.J Allergy Clin Immunol 104665-671.
83B.Aukrust L，Borch SM.1979.Partial purification and characterization of twoCladosporium herbarum allergens.Int Arch Allergy Appl Immunol 6068-79.
83C.Sward-Nordmo M，Paulsen BS，Wold JK.1988.The glycoprotein allergen Ag-54(CIa h II)from Cladosporium herbarum.Structural studies of the carbohydrate moiety.Int Arch Allergy Appl Immunol 85288-294.
84 Shen，et al.J.Allergy Clin.Immunol.103S157，1999.
84A Crameri R.Epidemiology and molecular basis of the involvement of Aspergillusfumigatus in allergic diseases.Contrib.Microbiol.Vol.2，Karger，Basel(in press).
84B Shen，et al.(manuscript submitted)，199984C Shen HD，Ling WL，Tan MF，Wang SR，Chou H，Han SIH.Vacuolar serineproteinaseA major allergen of Aspergillus fumigatus.10th International Congress ofImmunology，Abstract，1998.
85 Kumar A，Reddy LV，Sochanik A，Kurup VP.1993.Isolation and characterization ofa recombinant heat shock protein of Aspergillus fumigatus.J.Allergy Clin.Immunol.911024-1030.
85A Saxena S，Madan T，Muralidhar K，Sarma EO.2003.cDHA cloning，expressionand characterization of an allergenic L3 ribosomal protein of Aspergillus fumigatus.Clin Exp Immunol 13486-91.
85B Baur X，Melching-Kollmuss S，Koops F，Strassburger K，Zober A.IgE-mediatedallergy to phytase-a new animal feed additive.Allergy 57943-945，2002.
86A Shen HD，Lin WL，Tsai JJ，Liaw SF，Han SH.1996.Allergenic components inthree different species of Penicilliumcrossreactivity among maj or allergens.Clin ExpAllergy 26444-451.
86B.Shen，et al.Abstract；The XVIII Congress of the European Academy ofAllergology and Clinical Immunology，Brussels，Belgium，3-7July 1999.
87 Shen HD，Lin WL，Tarn MF，Wang SR，Tzean SS，Huang MH，Han SH.Characterization of allergens from Penicillium oxalicum and P.notatum byimmunob[iota]otting and N-terminal amino acid sequence analysis.Clin Exp Allergy 29642-651，1999.
87A Shen HD，Liaw SF，Lin WL，Ro LH，Yang HL，Han SH.Molecular cloning ofcDNA coding for the 68 kDa allergen of Penicillium notatum using MoAbs.Clin ExpAllergy 25350-356，1995.
87B Shen HD，Wang CW，Lin WL，Lai HY，Tarn MF，Chou H，Wang SR，Han SH.cDNA cloning and immunologic characterization of Pen o 18，the vacuolar serineprotease major allergen of Penicillium oxalicum.J Lab Clin Med 137115-124，2001.
88 Woodfolk JA，Wheatley LM，Piyasena RV，Benjamin DC，Platts-Mills TA.1998.Trichophyton antigens associated with IgE antibodies and delayed type hypersensitivity.Sequence homology to two families of serine proteinases.J Biol Chem 27329489-96.
88A Deuell，B.，L.K.Arruda，M.L.Hayden，M.D.Chapman and T.A.E.Platts-Mills.1991.Trichophyton tonsurans Allergen I.J.Immunol.14796-101.
89 Shen，H.D.，K.B.Choo，H.H.Lee，J.C.Hsieh，and S.H.Han.1991.The 40kdallergen of Candida albicans is an alcohol dehydrogeneasemolecular cloning andimmunological analysis using monoclonal antibodies.Clin.Exp.Allergy 21675-681.
89A Horner WE，Reese G，Lehrer SB.1995.Identification of the allergen Psi c 2 fromthe basidio-mycete Psilocybe cubensis as a fungal cyclophilin.Int Arch AllergyImmunol 107298-300.
89B Chang CY，Chou H，Tam MF，Tang RB，Lai HY，Shen HD.Characterization ofEnolase Allergen from Rhodotorula mucilaginosa.J Biomed Sci 9645-655，2002.
90 Yasueda H，Hashida-Okado T，Saito A，Uchida K，Kuroda M，Onishi Y，TakahashiK，Yamaguchi H，Takesako K，Akiyama K.Identification and cloning of two novelallergens from the lipophic yeast，Malassezia furfur.Biochem Biophys Res Commun248240-244，1998.NBstrain TIMM2782(Teikyo university Institute for MedicalMycology)equal to strain CBS1878(Central Bureau von Schimmelkulturen).
90A Onishi Y，Kuroda M，Yasueda H，Saito A，Sono-Koyama E，Tunasawa S，Hashida-Okado T，Yagihara T，Uchida K，Yamaguchi H，Akiyama K，Kato I，TakesakoK.Two-dimensional electrophoresis of Malassezia allergens for atopic dermatitis andisolation of MaI f 4 homologs with mitochondrial malate dehydrogenase.Eur JBiochem 261148-154，1999.NBstrain TIMM2782(Teikyo University Institute forMedical Mycology)equal to strain CBS 1878(Central Bureau von Schiiranelkulturen).
91 Schmidt M，Zargari A，Holt P，Lindbom L，Hellman U，Whitley P，van der Ploeg I，Harfast B，Scheynius A.The complete cDNA sequence and expression of the first majorallergenic protein of Malassezia furfur，MaI f 1.Eur[sigma]Biochem 246181-185，1997.NBstrain ATCC no.42132(American Type Culture Collection).
91A Rasool O，Zargari A，Almqvist J，Eshaghi H，Whitley P，Scheynius A.Cloning，characterization and expression of complete coding sequences of three IgE bindingMalassezia furfur allergens，MaI f 7，MaI f 8and MaI f 9.Eur J Biochem 2674355-4361，2000.NBstrain ATCC no.42132(American Type Culture Collection).
91B NB；strain 4625(Indian Agricultural Research Institute，PUSA；New Delhi，India).
92 Kuchler，K.，M.Gmachl，M.J.Sippl，and G.Kreil.1989.Analysis of the cDHA forphospholi- pase A2 from honey bee venom glandsThe deduced amino acid sequencereveals homology to the corresponding vertebrate enzymes.Eur.J.Biochem.184249-254.
93 Gmachl，M.，and G.Kreil.1993.Bee venom hyaluronidase is homologous to amembrane protein of mammalian sperm.Proc.Natl.Acad.Sci.OSA 903569-3573.
93A Hoffman DR.1977.Allergens in bee venom III.Identification of allergen B as anacid phosphatase.J Allergy Clin.Immunol.59364-366.
94 Habermann，E.1972.Bee and wasp venoms.Science 177314-322.
95 Hoffman DR，Jacobson RS.1996.Allergens in Hymenoptera venom XXVIIBumblebee venom allergy and allergens.J.Allergy Clin.Immunol.97812-821.
95A Hoffman DR，El-Choufani AE，Smith MM，de Groot H.2001.Occupationalallergy to bumblebee venomAllergens of Bombus terrestris.J Allergy Clin Immunol Inpress.
95B Helm R，Cockrell G，Stanley JS，Brenner RJ，Burks W，Bannon GA.1996.Isolation and characterization of a clone encoding a maj ore allergen(BIa g Bd90K)involved in IgE mediated cockroach hypersensitivity.J Allerg Clin Immunol98172-180.
95C Pomes A，Melen E，Vailes LD，Retief JD，Arruda LK，Chapman MD.1998.Novelallergen structures with tandem amino acid repeats derived from German and Americancockroach.J Biol Chem 27330801-30807.
96 Arruda LK，Vailes LD，Mann BJ，Shannon J，Fox JW，Vedvick TS，Hayden ML，Chapman MD.Molecular cloning of a major cockroach(Blattella germanica)allergen，BIa g 2.Sequence homology to the aspartic proteases.J Biol Chem 27019563-19568，1995.
97 Arruda LK，Vailes LD，Hayden ML，Benjamin DC，Chapman MD.Cloning ofcockroach allergen，BIa g 4，identifies ligand binding proteins(or calycins)as a cause ofIgE antibody responses.J Biol Chem 27031196-31201，1995.
98 Arruda LK，Vailes LD，Benjamin DC，Chapman MD.Molecular cloning of GermanCockroach(Blattella germanica)allergens.Int Arch Allergy Immunol 107295-297，1995.
98A Wu CH，Wang NM，Lee MF，Kao C[Iota]Y，Luo SF.1998.Cloning of theAmerican cockroach Cr-PII allergensEvidence for the existence of cross-reactiveallergens between species.J Allergy Clin Immunol 101832-840.
98B Melen E，Pomes A，Vailes LD，Arruda LK，Chapman MD.1999.Molecular cloningof Per a 1 and definition of the cross-reactive Group 1 cockroach allergens.J AllergyClin Immunol 103859-64.
98C Wu CH，Lee MF，Liao SC，Luo SF.Sequencing analysis of cDNA clonesencoding the American cockroach Cr-PI allergens.J Biol Chem 27117937-17943，1996.
98D Wu CH，Lee MF，Wang NM，Luo SF.Sequencing and immunochemicalcharacterization of the American cockroach Per a 3(Cr-PI)isoallergenic variants.Molecular Immunol 341-8，1997.
98E Santos ABR，Chapman MD，Aalberse RC，Vailes LD，Ferriani VPL，Oliver C，Rizzo MC，Naspitz CK，Arruda LK.1999.Cockroach allergens and asthma in BrazilIdentification of tropomyosin as a major allergen with potential cross-reactivity withmite and shrimp allergens.J Allergy Clin Immunol 104329-337.
98F Asturias JA，G[omicron]mez-Bay[omicron]n N，Arilla MC，Martinez A，Palacios R，Sanchez-Gascon，Martinez J.1999.Molecular characterization of American cockroachtropomyosin(Periplaneta americana allergen 7)，a cross-reactive allergen.J Immunol1624342-4348.
99 Mazur，G.，X.Baur，and V.Liebers.1990.Hypersensitivity to hemoglobins of theDiptera family ChironomidaeStructural and functional studies of theirimmunogenic/allergenic sites.Monog.Allergy 28121-137.99A Moneo I，Vega JM，Caballero Mb，Vega J，Alday E.Isolation and characterization of Tha p 1，a majorallergen from the pine processionary caterpillar Thaumetopoea pityocampa.Allergy 5834-37，2003.
100 Soldatova，L.，L.Kochoumian，and T.P. King.1993.Sequence similarity of ahornet(D.mac-ulata)venom allergen phospholipase Al with mammalian lipases.FEBSLetters 320145-149.
101 Lu，G.，L.Kochoumian and T.P.King.Whiteface hornet venom allergenhyaluronidasecloning and its sequence similarity with other proteins(abst.).1994.J.Allergy Clin.Immunol.93224.
102 Fang，K.S.F.，M.Vitale，P.Fehlner，and T.P.King.1988.cDNA cloning andprimary structure of a white-faced hornet venom allergen，antigen 5.Proc.Natl.Acad.Sex.，DSA 85895-899.
103 King，T.P.，D.C.Moran，D.F.Wang，L.Kochoumian，and B.T.Chait.1990.Structural studies of a hornet venom allergen antigen 5，DoI m V and its sequencesimilarity with other proteins.Prot.Seq.Data Anal.3263-266.
104.Lu，G.，M.Villalba，M.R.Coscia，D.R.Hoffman，and T.P. King.1993.Sequenceanalysis and antigen cross reactivity of a venom allergen antigen 5 from hornets，waspsand yellowjackets.J.Immunol.1502823-2830.
105.King，T.P.and Lu，G.1997.Unpublished data.
105A.King TP，Lu G，Gonzalez M，Qian N and Soldatova L.1996.Yellow jacketvenom allergens，hyaluronidase and phospholipasesequence similarity and antigeniccross-reactivity with their hornet and wasp homologs and possible implications forclinical allergy.J.Allergy Clin.Immunol.98588-600.
106.Hoffman，D.R.1993.Allergens in hymenoptera venom XXVThe amino acidsequences of antigen 5 molecules and the structural basis of antigenic cross-reactivity.J.Allergy Clin.Immunol.92707-716.
107.Hoffman DR.1992.unpublished data.
108.Hoffman DR.The complete amino acid sequence of a yellowjacket venomphospholipase(abst).J.Allergy Clin.Immunol.91187，1993.
109.Jacobson RS，Hoffman DR，Kemeny DM.The cross-reactivity between bee andvespid hyalur- onidases has a structural basis(abst).J.Allergy Clin.Immunol.89292，1992.
110.Hoffman DR.Allergens in Hymenoptera venom XXIVThe amino acid sequencesof imported fire ant venom allergens Sol i II，Sol i III，and Sol i IV.J.Allergy Clin.Immunol 9171-78，1993.
111.Schmidt M，Walker RB，Hoffman DR，McConnell TJ.Nucleotide sequence ofcDNA encoding the fire ant venom protein Sol i II.FEBS Letters 319138-140，1993.
111A.Paddock CD，McKerrow JH，Hansell E，Foreman KW，Hsieh I，Marshall N.Identification，cloning，and recombinant expression of procalin，a maj or triatomineallergen.J Immunol 1672694-2699，2001.
112.Elsayed S，Bennich H.The primary structure of Allergen M from cod.Scand JImmunol 3683-686，1974.
113.Elsayed S，Aas K，Sletten K，Johansson SGO.Tryptic cleavage of a homogeneouscod fish allergen and isolation of two active polypeptide fragments.Imtnunochemistry 9647-661，1972.
114.Hoffman，D.R.1983.Immunochemical identification of the allergens in egg white.J.Allergy Clin.Immunol.71481-486.
115.Langeland，T.1983.A clinical and immunological study of allergy to hen′s eggwhite.IV.specific IgE antibodies to individual allergens in hen′s egg white related toclinical and immunolgical parameters in egg-allergic patients.Allergy 38493-500.
116 Daul CB，Slattery M，Morgan JE，Lehrer SB.1993.Common Crustacea allergensidentification of B cell epitopes with the shrimp specific monoclonal antibodies.In″Molecular Biology and Immunology of Allergens″(D.Kraft and A.Sehon，eds.).CRCPress，Boca Raton，pp.291-293.
116A Shanti KN，Martin BM，Nagpal S，Metcalfe DD，Subba Rao PV.Identification oftropomyosin as the major shrimp allergen and characterization of its IgE-bindingepitopes.J.Immunol.1515354-5363，1993.
117 Yu CJ，Lin YF，Chiang BL，Chow LP.Proteomics and Immunological Analysis ofa Novel Shrimp Allergen，Pen m 2.J Immunol 170445-453，2003.117A Miyazawa M，Fukamachi H，Inagaki Y，Reese G，Daul CB，Lehrer SB，Inouye S，Sakaguchi M.Identification of the first major allergen of a squid(Todarodes pacificus).J.AllergyClin.Immunol.98948-953，1996.
117B Asturias JA，Eraso E，Arilla MC，Gomez-Bayon N，Inacio F，Martinez A.Cloning，isolation，and IgE-binding properties of Helix aspersa(brown garden snail)tropomyosin.Int Arch Allergy Immunol 12890-96，2002.
117C Lopata AL，Zinn C，Potter PC.Characteristics of hypersensitivity reactions andidentification of a unique 49 kd IgE-binding protein(Hal-iti-1)in abalone(Haliotismidae).J.Allergy Clin.Immunol.100642-648，1997.
117D Hoffmann-Sommergruber K，O′Rlordain G，Ahorn H，Ebner C，Laimer DaCamara Machado M，Ptthringer H，Scheiner O，Breiteneder H.Molecularcharacterization of Dau c 1，the Bet v 1 homologous protein from carrot and itscross-reactivity with Bet v 1 and Api g 1.Clin.Exp.Allergy 29840-847，1999.
118 Monsalve RI，Gonzalez de Ia Pena MA，Menendez-Arias L，Lopez-Otin C，VillalbaM，Rodriguez R.Characterization of a new mustard allergen，Bra j IE.Detection of anallergenic epitope.Bio-chem.J.293625-632 1993.
118A.Monsalve RI，Gonzalez de Ia Pena MA，Lopez-Otin C，Fiandor A，Fernandez C，Villalba M，Rodriguez R.1997.Detection，isolation and complete amino acid sequenceof an aeroallergenic protein from rapeseed flour.Clin Exp Allergy 27833-841.
119.Mena，M.，R.Sanchez-Monge，L.Gomez，G.Salcedo，and P.Carbonero.A majorbarley allergen associated with baker′s asthma disease is a glycosylated monomericinhibitor of insect alpha-amylasecDNA cloning and chromosomal location of the gene.Plant Molec.Biol.20451-458，1992.
119A.Palosuo K，Varjonen E，Kekki OM，Klemola T，Kalkkinen N，Alenius H，Reunala T.Wheat omega-5 gliadin is a major allergen in children with immediateallergy to ingested wheat.J.Allergy Clin.Immunol.108634-638，2001.
119B.Xu H，Theerakulpisut P，Goulding N，Suphioglu C，Singh M.B.Bhalla P.L.Cloning expression and immunological characterization of Ory s 1，the major allergenof rice pollen.Gene 164255-259，1995.
119C.Pastorello EA，Ortolani C，Farioli L，Pravettoni V，Ispano M，Borga A，BengtssonA，Incor-vaia C，Berti C，Zanussi C.Allergenic cross-reactivity among peach，apricot，plum，and cherry in patients with oral allergy syndromean in vivo and in vitro study.J.Allergy Clin.Immunol.94699-707，1994.
119D.Diaz-Perales A，Tabar AI，Sanchez-Monge R，Garcia BE，Gomez B，Barber D，Salcedo G.Characterization of asparagus allergensa relevant role of lipid transferproteins.J Allergy Clin Immunol 110790-796，2002.
119E Galleguillos F，Rodriguez JC.Asthma caused by bromelin inhalation.ClinAllergy 821-24，1978.
119F Baur X.Studies on the specificity of human IgE-antibodies to the plant proteasespapain and bromelain.Clin Allergy 9451-457，1979.
119G Gailhofer G，Wilders-Truschnig M，Smolle J，Ludvan M.Asthma caused bybromelainan occupational allergy.Clin Allergy 18445-450，1988.
120.Menendez-Arias，L.，I.Moneo，J.Dominguez，and R.Rodriguez.1988.Primarystructure of the major allergen of yellow mustard(Sinapis alba L.)seed，Sin a I.Eur.J.Biochem.177159-166.
120A Gonzalez R，Varela J，Carreira J，Polo F.Soybean hydrophobic protein andsoybean hull allerg y.Lancet 34648-49，1995.
120B Kleine-Tebbe J，Vogel L，Crowell DN，Haustein DF，Vieths S.Severe oral allergysyndrome and anaphylactic reactions caused by a Bet v 1-related PR-10 protein insoybean，SAM22.J Allergy Clin Immunol 110797-804，2002.
120C Sanchez-Monge R，Pascual CY，Diaz-Perales A，Fernandez-Crespo J，Martin-Esteban M，Salcedo G.Isolation and characterization of relevant allergens fromboiled lentils.J.Allergy Clin.Immunol.106955-961，2000.
121 Gavrovic-Jankulovic M，clrkovic T，Vuckovic O，Atanaskovic-Markovic M，Petersen A，Gojgic G，Burazer L，Jankov RM.Isolation and biochemicalcharacterization of a thaumatin-like kiwi allergen.J Allergy Clin Immunol 110805-810，2002.
121A Pastorello EA，Varin E，Farioli L，Pravettoni V，Ortolani C，Trambaioli C，Fortunato D，Gi-uffrida MG，Rivolta F，Robino A，Calamari AM，Lacava L，Conti A.The major allergen of sesame seeds(Sesamum indicum)is a 2S albumin.J.Chromatogr.B Biomed.Sci.Appl.75685-93，2001.
121B Moneo I，Caballero ML，Gomez F，Ortega E，Alonso MJ.Isolation andcharacterization of a major allergen from the fish parasite Anisakis simplex.J.AllergyClin.Immunol.106177-182，2000.
121C Asturias JA，Eraso E，Martinez A.2000.Is tropomysoin an allergen in Anisakis？Allergy 55898-890.
122 Christie，J.F.，B.Dunbar，I.Davidson，and M.W.Kennedy.1990.N-terminal aminoacid sequence identity between a major allergen of Ascaris lumbricoides and Ascarissuum and MHC-re-stricted IgE responses to it.Immunology 69596-602.
122A Baur X，Konig G，Bencze K，Fruhmann G，Clinical symptoms and results of skintest，RAST and bronchial provocation test in thirty-three papain workersevidence forstrong immunogenic potency and clinically relevant′proteolytic effects of airbornepapain′.Clin Allergy 129-17，1982.
122B Onizuka R，Kamiya H，Muramoto K，Goto R，Inoue K，Kumamoto K，Nakajima Y，Iida S，Ishigami F.Purification of the major allergen of red soft coral(Dendronephthyanipponica).Int Arch Allergy Immunol 125135-143，2001.
123.Czuppon AB，Chen Z，Rennert S，Engelke T，Meyer HE，Heber M，Baur X.Therubber elongation factor of rubber trees(Hevea brasiliensis)is the major allergen inlatex.J Allergy Clin Immunol 92690-697，1993.
124.Attanayaka DPSTG，Kekwick RGO，Franklin FCH.1991.Molecular cloning andnucleotide sequencing of the rubber elongation factor gene from hevea brasiliensis.Plant Mol Biol 1610/9-1081.
125.Chye ML，Cheung KY.1995.J 1，3-glucanase is highly expressed in Laticifers ofHevea brasiliensis.Plant MoI Biol 26397-402.
126.Alenius H，Palosuo T，Kelly K，KurupV，Reunala T，Makinen-Kiljunen S，Turjanmaa K Fink J.1993.IgE reactivity to 14-kD and 27-kD natural rubber proteins inLatex-allergic children with Spina bifida and other congenital anomalies.Int ArchAllergy Immunol 10261-66.
127.Yeang HY，Cheong KF，Sunderasan E，Hamzah S，Chew NP，Hamid S，HamiltonRG，Cardosa MJ.1996.The 14.6kD(REF，Hev b 1)and 24kD(Hev b 3)rubberparticle proteins are recognized by IgE from Spina Bifida patients with Latex allergy.JAllerg Clin Immunol in press.
128.Sunderasan E，Hamzah S，Hamid S，Ward MA，Yeang HY，Cardosa MJ.1995.Latex B-serum J-1，3-glucanase(Hev b 2)and a component of the microhelix(Hev b 4)are major Latex allergens.J nat Rubb Res 1082-99.
使用本剪接/头-尾倒置改性，可以获得致敏活性的显著降低。根据该方法，从野生型蛋白质过敏原中大部分消除这种活性。根据本发明的优选实施方案，通过与野生型过敏原相比至少10％，优选至少20％，尤其至少30％的抑制IgE结合能力的降低测量致敏活性的降低。优选方法显示在下列实施例章节。
另一优选的确定致敏活性降低的方法使用IgE结合的测量。过敏原致敏的患者血清的IgE抗体与所述衍生物的斑点印迹的结合的缺乏被视为大部分显著降低的指征。该方法同样显示在下列实施例章节中。
根据本发明获得的衍生物可以容易地与药用赋形剂结合，并最终制成药物制剂。
优选地，衍生物与合适的疫苗佐剂结合并最终制成药用疫苗制剂。
根据优选实施方案，本发明的衍生物与其它过敏原结合成组成疫苗。这类过敏原优选为野生型过敏原，尤其是野生型过敏原的混合物、重组野生型过敏原、野生型蛋白质过敏原的衍生物或它们的混合物。可以专门针对某一患者的需求(过敏原状况)制造这类混合物。
在优选实施方案中，这类药物制剂进一步含有过敏原提取物。
根据本发明的另一方面，提供了野生型蛋白质过敏原的过敏原衍生物，所述野生型蛋白质过敏原具有1至Z的氨基酸序列，其特征在于所述衍生物在氨基末端至羧基末端的方向上相邻地含有两种野生型过敏原片段X至Z和1至X，所述两种野生型过敏原片段具有降低的致敏活性或没有致敏活性。
优选地，本发明的过敏原衍生物的特征在于，X至Z和1至X为至少30个氨基酸残基长，优选至少50个氨基酸残基，尤其是至少60个氨基酸残基。
更优选地，X至Z和1至X的长度相差50％或更少，优选30％或更少，尤其是20％或更少。
本发明的尤其优选的过敏原衍生物选自I型过敏原，优选选自表A的过敏原，更优选为梯牧草(phelum pratense)花粉，尤其是Phl p 12，桦树(Betula verrucosa)花粉，尤其是Bet v 2和Bet v 4，黄蜂(Vespulavulgaris)毒液，纸巢蜂(Polistes annularis)毒液，parietaria judaica花粉，黑麦草花粉、尘螨过敏原，尤其是Der p 2，等等。
优选地，本发明的衍生物以过敏原组合物的形式供应，其中不只存在一种过敏原，而是存在两种或多种。本发明的衍生物还可以与过敏原提取物混合，在这些过敏原提取物中补充本发明的衍生物以替代天然提取物中足量过敏原特异性的缺乏。不只对一种过敏原具有过敏反应的患者尤其需要过敏原混合物。因此，本发明的衍生物优选与其它过敏原组合成组合疫苗。
本发明的过敏原衍生物因此优选与野生型过敏原组合成过敏原组合物，尤其是野生型过敏原的混合物、重组野生型过敏原、野生型蛋白质过敏原的衍生物或它们的混合物(各自是相同和/或不同的过敏原和/或其异构体或突变体；只要在作为整体的制剂中得到与野生型蛋白质或重组过敏原相比总体降低的致敏活性)。
优选地，本发明的制剂进一步含有过敏原提取物。
本发明的过敏原或过敏原组合物优选含有药用赋形剂。
本发明的另一方面涉及本发明的过敏原衍生物用于制备过敏原特异性免疫疗法药物的用途。
本发明的再一方面涉及本发明的过敏原衍生物或过敏原组合物用于制备被动免疫法药物的用途。
本发明的另一方面涉及本发明的过敏原衍生物或过敏原组合物用于制备预防免疫法药物的用途。
本发明的过敏原衍生物和组合物可用于个体的预防免疫法，从而有效预防过敏反应。由于本发明的过敏原衍生物和组合物，例如Der p2过敏原衍生物与野生型过敏原相比表现出降低的致敏免疫应答，它们不会导致不合意的副作用。有利地，这种药物可施用于1至3岁的儿童。这种在所述儿童与过敏原接触之前的疫苗接种防止在所述儿童体内形成过敏原特异性IgE抗体。
优选地，药物进一步含有其它合适的成分，例如佐剂、稀释剂、防腐剂、等等。
根据本发明的优选实施方案，每次施用的药物剂量包含10纳克至1克，优选100纳克至10毫克，尤其是0.5微克至200微克的所述重组过敏原衍生物。优选施用方法包括大体而言针对疫苗接种具体而言针对过敏原免疫疗法所描述和所提议的所有标准施用方式(口服、经皮、静脉内、鼻内、经粘膜，等等)。本发明包括通过施用有效量的本发明的药物制剂来治疗和预防过敏反应的方法。
本发明的另一方面涉及制造本发明的过敏原衍生物的方法，其特征在于包括下列步骤-提供为本发明的过敏原衍生物编码的DNA分子，-用所述DNA分子转化宿主细胞和-在所述宿主细胞中表达所述衍生物并分离所述衍生物。
优选地，所述宿主是具有高表达能力的宿主。
本文所用的“具有高表达能力的宿主”是以至少10毫克/升培养物，优选至少15毫克/升，更优选至少20毫克/升的量表达相关蛋白质的宿主。当然，表达能力还取决于所选宿主和表达体系(例如载体)。根据本发明的优选宿主是埃希氏大肠杆菌、甲醇酵母()、枯草芽孢杆菌(baciullus subtilis)、pant细胞(例如衍生自烟草)等等。
当然，本发明的过敏原还可以通过任何合适的方法，尤其是化学合成或半化学合成法制造。
本发明的另一方面涉及可通过本发明的方法获自第一野生型抑制蛋白(profilin)分子的抑制蛋白衍生物或本发明的第一野生型抑制蛋白分子的过敏原衍生物用于制造预防或治疗由第二野生型抑制蛋白分子引起的过敏症的药物的用途。
令人惊讶地证明，通过本发明的第一野生型抑制蛋白分子的抑制蛋白衍生物直接诱发的抗体还结合到其它野生型抑制蛋白分子上。因此，所述衍生物可用于治疗或预防许多过敏症。这类抑制蛋白衍生物可用作广谱疫苗，其能够仅用一种或两种致免疫分子使个体免疫。抑制蛋白代表在所有真核细胞中表达的过敏原并因此代表可以在过敏患者中引发吸入式过敏症(例如rhinoconjunctivits、哮喘)以及口服消化后的口腔过敏症(嘴唇和舌头发痒和肿胀)的pan-过敏原。
例如，改组Phl p 12衍生物，MP12在免疫后诱发识别来自花粉以及来自植物源食品的抑制蛋白的IgG抗体。MP12诱发的抗体抑制了患者的血清IgE与花粉中的抑制蛋白上以及与植物食品源抑制蛋白的结合。因此，MP12以及其它重组抑制蛋白分子适用于治疗可归因于抑制蛋白过敏反应的花粉-食品交叉致敏。
根据优选实施方案，所述第一和所述第二抑制蛋白分子选自Phl p12、Bet v 2、Art V 4、Ana c、Api g 4、Mus xp 1、Cor a 2和Dau c 4。
由于它们的结构相似性，这些过敏原尤其适合根据本发明使用。但是，明显地，可以相应使用彼此结构相似的其它过敏原。
所述第一抑制蛋白分子优选为Phl p 12，所述第二抑制蛋白分子优选选自Bet v 2、Art v 4、Ana c、Api g 4、Mus xp 1、Cor a 2和Dau c 4。
实验表明，Phl p 12的衍生物尤其可用作广谱疫苗。特别优选的衍生物由融合蛋白构成，其中野生型Phl p 12的氨基酸1至77在氨基末端融合到氨基酸78至131上(参见图1)。
本文所公开的并可通过本发明的方法获得的Bet v 2、Art v 4、Anac、Api g 4、Mus xp 1、Cor a 2和Dau c 4的抑制蛋白衍生物优选用于治疗和/或预防可归因于抑制蛋白过敏反应的花粉-食物致敏。


通过下列实施例和附图进一步描述本发明，但不限制本发明。
图1显示了MP12(本发明的改组Phl p 12过敏原)与Phl p 12野生型相比一级结构的示意图；图2显示了Phl p 12野生型和MP12的CD谱。对于一定范围的波长(x-轴)，显示Phl p 12和衍生MP12的平均残基椭圆率[Θ](y-轴)。
图3显示了载有用聚脯氨酸柱处理的重组MP12片段的14％SDSPAGE的Coomassie染色。M道代表分子量标记，第1道代表流过部分，第2-4道代表洗出(wash)部分，第5-6道代表洗脱部分。分子量(kDa)显示在左边界上；图4显示了硝化纤维素打点的Phl p 12和MP12的IgE反应性。使打点的蛋白质以及用于阴性对照用途的人血清白蛋白(HSA)暴露在来自24个Phl p 12-过敏患者的血清中(第1-24道)。N道代表来自非过敏对照个体的血清。用抗-人IgE抗体检测结合的IgE抗体。
图5显示了在两个Phl p 12过敏患者中嗜碱组胺释放的诱发。用各种浓度(x-轴)的Phl p 12(正方形)和MP12(圆形)培养患者的粒细胞。释放到上清液中的总组胺的百分比显示在y-轴上。
图6显示了兔抗血清与来自梯牧草、桦树和艾蒿花粉的抑制蛋白的反应性。通过ELISA测试针对Phl p 12(菱形)和MP12(正方形)培养的兔抗血清对Phl p 12(A)、Bet v 2(B)和艾蒿抑制蛋白(C)的反应性。血清的稀释度显示在x-轴上，相应的OD值显示在y-轴上。相应的免疫前血清没有表现出任何反应性；图7显示了抗-rPhl p 12(P12)和抗-MP12-诱发的IgG对rPhl p 12诱发的嗜碱细胞脱粒的抑制。已经在大鼠嗜碱细胞中加载Phl p 12特异性小鼠IgE；图8显示了Der p 2杂种(根据本发明的改组Der p 2过敏原)与Der p 2野生型相比的一级结构和生成(generation)的示意图；图9显示了Coomassie染色的SDS-PAGE，其含有作为his-标记蛋白质表达rDer p 2和rDer p 2衍生物的BL21蛋白质提取物(DE3)(第1道)、纯化rDer p 2、rDer p 2片段和rDer p 2杂种(第2道)和分子标记物(第M道)。
图10显示了纯化rDer p 2和rDer p 2衍生物的质谱分析。X-轴显示了质量/电荷比率，信号强度作为相对于最强信号的百分比显示在y-轴上。
图11显示了纯化重组Der p 2、rDer p 2片段和rDer p 2杂种的远紫外线CD谱。蛋白质的光谱表示为在给定波长(x-轴)下的平均残基椭圆率(y-轴)。
图12显示了重组Der p 2和重组Der p 2衍生物的IgE-识别。测试来自17个螨类过敏个体(第1-17道)、非过敏个体(第18道)的血清和不含血清的缓冲液(第19道)与斑点印迹的重组Der p 2、rDer p 2片段、rDer p 2杂种和BSA的IgE反应性。用125I-标记的抗-人IgE抗体检测结合的IgE并通过放射自显影法直观化。
图13显示了通过CD203c表达测得的重组Der p 2和rDer p 2衍生物的嗜碱细胞活化。使来自10个螨类过敏患者的血样暴露在10微克/毫升重组rDer p 2、单独Der p 2片段、片段混合物、αIgE或缓冲液中。显示了三个代表性患者的结果。通过FACS分析测定CD203c表达并作为平均荧光指数(MFI)显示。
图14显示了通过CD203c表达测得的重组Der p 2和rDer p 2衍生物的嗜碱细胞活化。使来自相同的10个螨类过敏患者的血样暴露在几种浓度的rDer p 2和rDer p 2杂种、αIgE或缓冲液(x-轴)中。显示了六个代表性患者的结果。通过FACS分析测定CD203c表达并作为刺激指数(SI)显示。
图15显示了用rDer p 2和rDer p 2衍生物使小鼠免疫而诱发的Derp 2特异性IgG1的演化。用纯化rDer p 2或rDer p 2衍生物使各由5只小鼠组成的组免疫，并通过ELISA测定诱发的IgG1抗体。Y-轴上显示的光密度值(OD 405纳米)对应于小鼠血清中的IgG1抗体水平。结果作为盒状图显示，其中50％的值在盒内且在条(bars)之间没有无关值。盒内的线代表中间值。开圆和星形代表各个小鼠组的无关值和极限。
图16显示了通过从RBL细胞中释放出β-氨基己糖苷酶而直观化的rDer p 2衍生物的低体内致敏活性。在大鼠嗜碱白血病(RBL)细胞中加载用rDer p 2野生型过敏原和rDer p 2衍生物免疫接种之前(免疫前血清)和之后(免疫血清)获得的小鼠血清。用rDer p 2诱发β-氨基己糖苷酶的释放，并显示为总β-氨基己糖苷酶释放的百分比(来自各个小鼠组的5份血清的平均值±SD)(y-轴)。
图17显示了兔抗血清与来自梯牧草花粉(Phl p 12)、桦树花粉(Betv 2)、艾蒿花粉(Art v 4)、腰果花粉(Ana c)、芹菜(Api g 4)、香蕉(Mus xp 1)、榛子(Cor a 2)和胡萝卜(Dau c 4)的抑制蛋白的反应性。通过ELISA测试针对Phl p 12(菱形)和MP12(正方形)培养的兔抗血清对所述抑制蛋白的反应性。血清稀释度显示在x-轴上，相应的OD值显示在y-轴上。相应的免疫前血清没有表现出任何反应性。
具体实施例方式
实施例在实施例1至5中，通过抑制蛋白过敏原、梯牧草花粉抑制蛋白Phlp 12例证本发明的原理。实施例6至11涉及主要螨类(屋尘螨)过敏原，Der p 2。实施例12和13显示了Phl p 12与梯牧草花粉以外的其它来源的抑制蛋白的交叉反应性，因此证实使用Phl p 12衍生物作为由其它抑制蛋白引起的过敏症的疫苗的适用性。
实施例1来自梯牧草花粉抑制蛋白的低致敏衍生物的表征a)来自梯牧草花粉抑制蛋白的低致敏变体，Phl p 12的生成、表达和提纯使用重叠PCR技术进行重组Phl p 12-衍生物的遗传工程学。PCR模板是为梯牧草花粉抑制蛋白，Phl p 12编码的cDNA，在pet17b表达载体中亚克隆。使用下列引物生成用于蛋白质提纯的含有重叠序列以及NdeI和EcoRI限制位点和为羧基末端6x Histidin残基编码的序列的两个PCR片段。对于片段1，使用引物MDE-15’CATATGAGGCCCGGCGCGGTCATC3’和引物MDE-25’GTACGTCTGCCACGCCATCATGCCTTGTTCAAC3’，对于片段2，使用引物MABC-15’GTTGAACAAGGCATGATGTCGTGGCAGACG3’和引物MABC-25’GAATTCTTAATGGTGATGGTGATGGTGACCCTGGATGACCATGTA3’。在下一步骤中，如所述获得的两种PCR产品均作为模板用于使用引物MDE-1和MABC-2的重叠PCR反应以生成为Phl p 12衍生物(即MP12)编码的DNA(示意性显示在图1中)。将MP-12编码DNA克隆到pBluescript载体体系(Stratagene)中，并通过双链定序法(MWGBiotech，Germany)确定DNA序列。
为了蛋白质提纯，MP12-编码cDNA必须使用NdeI和EcoRI限制酶亚克隆到pet17b表达载体体系中，并再通过双链定序法(MWGBiotech)确定DNA序列。
对于蛋白质提纯，MP-12在液体培养物中在大肠杆菌BL21(DE3)(Stratagene，East Kew，Australia)中表达。使大肠杆菌在含100毫克/升氨苄青霉素的LB-培养基中生长至0.4的OD600。通过添加异丙基-b-硫代半乳糖苷至1mM的最终浓度并进一步在37℃再培养4小时，诱发重组蛋白质的表达。通过离心收取来自500毫升培养物的大肠杆菌细胞，再悬浮在缓冲液A(100mM NaH2PO4，10mM Tris，8M脲，pH 7.5)中。以20,000rpm离心30分钟后，将上清液转移到Ni-NTA琼脂糖柱(Quiagen，Hilden，Germany)中，并使用具有递减pH值的缓冲液A进行6x His-标记MP12蛋白质的洗脱。蛋白质在4.9的pH值下洗脱，随后通过含有6-0M脲的缓冲液A，pH 7.5逐步渗析来折叠(refolded)。最终渗析步骤用磷酸盐缓冲盐水(PBS)进行，其中如离心实验所示MP12可溶。
通过SSDS PAGE确认蛋白质纯度并使用Micro BCA试剂盒(Pierce，USA)进行量化。
b)二级结构分析在Jasco J-715分光偏振器上使用在20℃平衡的0.1厘米路径长度小室进行圆二色性(CD)测量。以100纳米/分钟的扫描速度用0.5纳米分辨率记录光谱，结果获自3次扫描的平均。通过减去在相同条件下获得的相应MilliQ光谱，对最终光谱进行基线校准。结果与二级结构评估程序J-700相符。
结果显示出衍生物的相当量的二级结构。Phl p 12的光谱以在218纳米的最小值和小于200纳米的强最大值为特征，而衍生物的最小值转移至较小波长，且曲线的零交叉低于200纳米(图2)。这些发现表明了无规线圈二级结构在衍生物内的递增比例。
c)低致敏Phl p 12衍生物缺乏对聚脯氨酸的亲合力对聚脯氨酸的亲合力是来自各种生物体的抑制蛋白的共有特征。经证实，低致敏Phl p 12衍生物，MP12，不结合聚脯氨酸，因此表现出改变的生物化学性质。
将在PBS中的大约5微克纯化重组MP12在用PBS平衡的装有聚脯氨酸的CnBr活化琼脂糖柱(Amersham Bioscience，Uppsala，Sweden)处理。在收集流过物之后，将该柱用3体积(PBS)洗涤，并用5×1毫升分别含有2M或6M脲的PBS进行洗脱。对流过物、洗出部分和洗脱部分的10微升等分试样进行14％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)并通过Commassie染色使蛋白质直观化(图3)。结果表明由Phl p 12的一级结构的重组造成的聚脯氨酸结合位点的缺失。
实施例2MP12的IgE结合能力的降低a)MP12表现出显著降低的IgE结合能力使用来自24个抑制蛋白致敏患者的血清，通过斑点分析法，将重组MP12的IgE结合能力与重组Phl p 12野生型进行比较(图4)。将Phl p 12和MP12以及对照用的人血清白蛋白(HSA)点到硝化纤维素上，并用来自24个抑制蛋白致敏患者的血清探测。使用125I-标记抗-人-IgE抗体检测结合的IgE抗体。所有患者均表现出与Phl p 12野生型的IgE反应性，而24个患者中无一与MP12或与对照蛋白质HSA反应(图4)。
为了量化MP12的IgE结合能力的降低，实施流体相抑制。为此，将来自6个抑制蛋白致敏患者的血清用10微克Phl p 12或用MP12预培养，随后用ELISA板-结合Phl p 12(5微克/毫升)培养。用碱性磷酸酶-标记的抗-人IgE抗体(Pharmingen)检测结合的IgE抗体。用下式计算IgE结合的抑制抑制％＝100×[(A-B)/A]；A代表用BSA培养血清后获得的代表性OD值，B代表分别用Phl p 12或MP12培养血清后的OD值。
MP12抑制IgE与Phl p 12结合的能力在表2中作为抑制％显示，对于MP12，其为20-40％，平均抑制为31.2％，而Phl p 12实现的抑制为76-91(平均86％)。
表2使用Phl p 12和MP12，对抗体与固定Phl 12结合的抑制。通过用Phl p 12野生型或MP12预培养来自6个抑制蛋白致敏患者的血清，抑制IgE抗体结合。计算并显示抗体结合的平均抑制。

b)MP12表现出降低的致敏活性接着，比较改组Phl p 12与Phl p 12野生型诱发从来自抑制蛋白致敏患者的嗜碱细胞中释放出组胺的能力。
通过葡聚糖沉降，从梯牧草花粉过敏患者的肝素化血样中分离出粒细胞。分离之后，将细胞用各种浓度的Phl p 12、MP12或对照用的单克隆抗-人IgE抗体(Immunotech，Marseille，France)培养。通过放射免疫测定法(Immunotech)测量释放到上清液中的组胺。在细胞冻-融后测定总组胺。结果表示为重复测定的平均值，并代表总组胺的百分比。
如图5中所例证，Phl p 12在来自两种患者的嗜碱细胞中诱发强的和剂量依赖型的组胺释放，其在10-5至10-4微克/毫升的浓度下产生最大组胺释放，而使用mp12，在直至10-2微克/毫升的浓度下也没有观察到组胺释放，这表明致敏活性降低了1000倍以上。此外，添加MP12后嗜碱细胞的最大组胺释放明显低于用Phl p 12野生型实现的量。
实施例3用MP12免疫接种诱发了IgG抗体，其识别出Phl p 12野生型以及来自其它花粉的抑制蛋白。
为了测试用改组Phl p 12免疫接种是否诱发与Phl p 12野生型和来自其它花粉的抑制蛋白反应的IgG抗体，使用Freund’s完全和不完全佐剂(200微克/次注射)(Charles River，Kisslegg，Germany)，用Phl p 12或MP12将兔子免疫三次。以四周为间隔获得血清样品。将血清储存在-20℃直至分析。
通过ELISA分析MP12和Phl p 12诱发的IgG抗体的反应性(图6)。将Phl p 12以及来自桦树(Bet v 2)和艾蒿的抑制蛋白涂布到ELISA板上(5微克/毫升)，并用兔抗血清的连续稀释物(1∶2000-1∶64000)培养。用1∶1000稀释的过氧化物酶标记的驴抗-兔抗血清(AmershamPharmacia Biotech)检测结合的兔抗体。
MP12诱发IgG抗-Phl p 12抗体应答，其与用Phl p 12野生型诱发的相当(图6A)。此外，Phl p 12-和MP12诱发的IgG抗体均与来自桦树和艾蒿的抑制蛋白交叉反应(图6B，C)。
实施例4抗-MP12抗体抑制了来自草花粉过敏患者的血清IgE与完整Phl p 12的结合。
通过ELISA竞争检定法研究MP12诱发的兔IgG抑制过敏患者的IgE与Phl p 12结合的能力。ELISA板(Nunc Maxisorp，Rosklide，Denmark)用Phl p 12(1微克/毫升)涂布并用抗-MP12抗血清或Phl p12-抗血清各自的1∶250稀释物和用对照用的相应免疫前血清预培养。洗涤后，用来自7个Phl p 12致敏草花粉过敏患者的1∶3稀释血清培养板，并用稀释1∶1000的单克隆鼠抗人IgE抗体(Pharmingen，San Diego，CA)，然后用1∶2000稀释的HRP偶联羊抗鼠Ig抗血清(Amersham)检测结合IgE抗体。用抗-肽或抗-突变体抗血清预培养实现的对IgE结合的抑制百分比如下计算IgE结合的抑制％＝100-ODI/ODp×100。ODI和ODp分别代表用兔免疫血清和相应的免疫前血清预培养之后的衰减(extinctions)。如表3中所示，用抗-Phl p 12抗体实现的对患者IgE与Phl p 12结合的抑制为30.2-66.7％(49.8％的平均抑制)。同样地，使用针对MP12培养的抗体观察到抗-Phl p 12IgE反应性的显著降低，为10.8-27.6％(20.8％平均抑制)(表3)。
表3兔抗体对过敏患者的IgE与rPhl p 12结合的抑制。对于7个Phl p 12过敏患者，表示用兔抗血清(兔抗-Phl p 12，抗-MP12)预培养实现的对IgE与rPhl p 12结合的抑制百分比，并显示计算出的平均抑制。

实施例5抗-MP12抗血清抑制嗜碱细胞脱粒。在指定细胞模型系统中使用加载了过敏原特异性IgE的鼠嗜碱细胞白血病(RBL)细胞研究肽诱发IgG抗体的生物关联性和可能的保护能力。
将RBL-2H3细胞在96孔组织培养板(4×104个细胞/孔)中平板接种，使用7％CO2在37℃培养24小时。用最终稀释度为1∶30的含有抑制蛋白反应性IgE的鼠血清进行被动致敏2小时。通过在Tyrode’s缓冲液(137mM NaCl、2.7mM KCl、0.5mM MgCl2、1.8mM CaCl2、0.4mMNaH2PO4、5.6mM D-葡萄糖、12mM NaHCO3、10mM HEPES和0.1％w/vBSA，pH 7.2)中洗涤细胞层2次，去除未结合的抗体。使预先加载了Phl p 12-特异性鼠IgE的RBL细胞暴露在rPhl p 12(0.005微克/毫升)中。将Phl p 12在Tyrode’s缓冲液中用0、2、5、7.5或10％v/v来自Phl p 12-免疫兔、MP12-免疫兔的兔抗血清或相应的免疫前血清在37℃预培养2小时。
将预培养Phl p 12在湿润气氛中在37℃添加到RBL细胞中30分钟，并通过用80μM 4-甲基伞形基-N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷(Sigma-Aldrich，Vienna，Austria)在柠檬酸盐缓冲液(0.1M，pH 4.5)中在37℃培养1小时来分析它们上清液的β-氨基己糖苷酶活性。添加100微升氨基乙酸缓冲液(0.2M氨基乙酸，0.2M NaCl，pH 10.7)终止反应，并使用荧光微板读数器(Spectrafluor，Tecan，Austria)在λex360/λem465纳米测量荧光。结果表示为荧光单位和用1％Triton X-100溶解细胞后释放出的总β-氨基己糖苷酶的百分比。
如图7中所例证，用递增浓度(2-10％v/v)的兔抗-MP12抗体和用兔抗-Phl p 12抗体预培养Phl p 12均导致对rPhl p 12诱导的从已经预先加载Phl p 12-特异性鼠IgE的RBLs中进行介质释放的剂量依赖型抑制。当过敏原用相同浓度的免疫前Ig预培养时，没有观察到嗜碱细胞脱粒的抑制。
实施例6来自屋尘螨过敏原Der p 2(Der p 2杂种)的低致敏衍生物的表达、提纯和表征屋尘螨(HDM)过敏反应属于世界上最常见的过敏反应，其侵扰超过50％的过敏患者。在欧洲，屋尘螨被确定为屋尘中最重要的过敏原来源。
迄今已经识别出20组螨过敏原，组2过敏原被确定为主要螨过敏原，其使80％以上的螨过敏患者过敏且主要位于螨排泄物中。组2过敏原首先以具有高IgE结合活性的14000-18000Da过敏原为特征。为Der p 2编码的cDNA克隆的分离和分析表明，Der p 2包含具有129个氨基酸残基、分子量计算值为14000Da且没有N-糖基化位点的过敏原。组2过敏原含有三个二硫键并由两个反向平行β-片层构成。Der p 2的T-细胞抗原决定簇位于蛋白质的所有区域中，且IgE-抗原决定簇表现为是构象的(conformational)。
用粗制螨提取物进行的免疫疗法研究已经证实，在用HDM提取物进行免疫疗法的过程中可能发生危险的全身副作用(Akcakaya，N.，等人(2000)Ann Allergy Asthma Immunol 85317)以及诱发对海鲜的新IgE反应性(Van Ree，R.，等人(1996)Allergy 51108)。
为了克服提取物基免疫疗法的缺点，已经使用几种方案开发低致敏过敏原衍生物。在Der p 2的情况下，通过定点诱变破坏二硫键、通过氨基-和羧基-末端删除破坏二硫键、或引入突变，由此开发出具有降低的IgE反应性的突变体。但是，它们的生物活性是有疑问的。
在下列实施例中，制造屋尘螨组2过敏原(Der p 2)的两个包含aa 1-53和aa 54-129的重组片段，以破坏构象B-细胞抗原决定簇和保持主要的T-细胞抗原决定簇。此外，构造重组Der p 2杂种分子(aa54-129+1-53)，其中两个rDer p 2片段通过PCR基基因SOEing倒序重组。
通过如实施例1所述的PCR-扩增构建Der p 2的包含氨基酸(aa)1-53和aa54-129的两个重组片段(参见图8)。通过PCR基基因SOEing(Linhart等人，FASEB J.16(2002)，1301-1303)倒序(aa 54-129+1-53)生成Der p 2杂种分子。
a)Der D 2、Der D 2片段和Der D 2杂种在大肠杆菌中的表达和提纯使用如表4中所示的引物(MWG，Ebersberg Germany)通过PCR扩增生成为His-标记的Der p 2、Der p 2片段(aa 1-53和aa 54-129)和Der p 2杂种(aa 54-129+1-53)编码的cDNAs，并通过由Der p RNA逆转录来获得Der p 2 cDNA。
表4 显示了正向(F)、反向(R)和重叠引物。EcoRI位点和NdeI位点加了下划线。为His-tags编码的核苷酸显示在粗斜体字母中。
引物1和4用于rDer p 2 c DNA的扩增，引物1和2用于rDer p 2片段1(aa 1-53)的编码cDNA，引物3和4用于rDer p 2片段2(aa54-129)的cDNA。使用引物2和3和两个重叠引物5和6通过PCR基基因SOEing生成r Derp 2杂种。上游引物含有NdeI和EcoRI位点，下游引物含有EcoRI位点以及6个His密码子。用NdeI/EcoRI切下PCR产物，凝胶提纯并亚克隆到质粒pET17b的NdeI/EcoRI位点中。使用氯化钙法将质粒转化到大肠杆菌株XL-1 B1ue中。通过NuceloBond AX试剂盒-maxi-prep(Macherey-Nagel，Germany)分离质粒DNA并通过在自动化定序系统(MWG，Germany)上将两条DNA束测序来确定cDNA插入物的序列。
通过用0.5mM异丙基-b-硫代半乳糖苷(IPTG)在1的OD600下在37℃培养5小时，在液体培养物中在大肠杆菌株BL21(DE3)中表达含羧基末端六聚组氨酸尾的重组蛋白质。通过在4℃以4,000x g离心15分钟，收取细胞。
将获自11个液体培养物的细菌沉淀物(pellet)再悬浮在10毫升25mM咪唑，pH 7.4，0.1％v/v Triton X-100中，并用100微克溶菌酶在室温处理30分钟。通过3个冷冻/解冻循环(-70℃/+50℃)裂解细胞。通过用1微克Dnase I在室温培养10分钟，使DNA降解，并通过在4℃以10,000x g离心30分钟来去除细胞碎片。在可溶部分中发现rDer p 2片段1并在Ni-NTA树脂亲和柱(QIAGEN，Germany)上在天然条件下提纯。
在用8M脲、100mM NaH2PO4、10mM Tris-Cl，pH 8在室温增溶60分钟的包含体部分中的沉淀物中发现rDer p 2、rDer p 2片段2和rDerp 2杂种。通过离心(10,000x g，15分钟，4℃)去除不溶残余物，并在Ni-NTA树脂亲和柱(QIAGEN)上在变性条件下提纯rDer p 2、rDerp 2片段2和rDer p 2杂种。
使含有超过90％纯度的重组蛋白质的部分对50mM NaH2PO4pH 7渗析，并通过Micro BCA蛋白质检定试剂盒(Pierce，USA)测定最终蛋白质浓度。
上述杂种分子的构造中断了Der p 2的两个β-片层中的至少一个片层和C8与C119之间的二硫键，并由此破坏Der p 2的构象IgE抗原决定簇和保存主要的T-细胞抗原决定簇。rder p 2衍生物过度表达，因为大肠杆菌中的可见带产生明显的积聚(图9，第1道)。在可溶部分中发现rDer p 2片段1，而其它蛋白质积聚在不溶包含体部分中，但可以在脲中增溶。rDer p 2和rDer p 2衍生物通过镍亲和色谱法(图9，第2道)提纯，产生20至30毫克蛋白质/升大肠杆菌培养物。在通过渗析折叠后，rDer p 2、rDer p 2片段1和rDer p 2杂种在生理缓冲液中以0.5毫克/毫升至1毫克/毫升的浓度保持可溶，而rDer p 2片段2仅以低于0.1毫克/毫升的浓度保持可溶。SDS-PAGE分析表明，蛋白质纯度高于90％，其以单体形式和二聚物形式迁移(图9，第2道)。
b)rDer p 2和rDer p 2衍生物的基质辅助激光解吸和电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱分析用飞行时间Compact MALDI II设备(Kratos，U.K.；piCHEM，Austria)以线型模式获取激光解吸质谱。将样品溶于10％乙腈、0.1％三氟乙酸，并使用α-氰基-4羟基-肉桂酸(溶于60％乙腈、0.1％三氟乙酸)作为基质。对于样品制备，将蛋白质与基质溶液的1∶1混合物沉积到靶上，并风干。
通过MALDI-TOF质谱法分析四种蛋白质，表明对于rDer p 2、rDerp 2片段1、rDer p 2片段2和rDer p 2杂种，分子量分别为15072.9Da、6806.7Da、9216.3Da和15001.8Da，这与由其氨基酸序列计算出的蛋白质的理论质量相符(图10)。
c)圆二色性(CD)分析在已经根据制造商的建议用钕玻璃进行波长校准的JASCO J715分光偏振器上记录纯化重组蛋白质的CD谱。在室温下用溶于重蒸馏水的rDer p 2和rDer p 2衍生物(c＝0.1至0.5毫克/毫升)进行CD测量。使用路径长度为0.1厘米的圆形石英比色皿，并以50纳米/分钟的扫描速度用0.2纳米分辨率记录光谱。通过累积至少三次扫描来对该光谱进行信号平均，结果表示为在给定波长下的平均残基椭圆率。
纯化重组Der p 2的远紫外线CD谱表现出在217纳米的负带，表明β-片层构象(图11)。相反，rDer p 2衍生物的CD谱表明这些蛋白质主要无折叠。rDer p 2片段1表现出由在大约200纳米的负带确定的典型的无规线圈构象。rDer p 2片段2也表现出主要的无规线圈构象，尽管信号强度非常低。rDer p 2杂种谱主要吸附具有少量β-片层结构的无规线圈构象(图11)。可以通过圆二色性分析证实三维构象的破坏，其表明与rDer p 2野生型相比，rDer p 2衍生物中β片层-结构的缺失和减少。
实施例7重组Der p 2杂种(rDer p 2杂种)表现出显著降低的IgE结合能力。
通过非变性斑点印迹分析法测试纯化重组Der p 2、两个rDer p 2片段——片段1(aa 1-53)和片段2(aa 54-129)——和rDer p 2杂种的IgE反应性。将2微升纯化蛋白质(0.1毫克/毫升)和对照用的BSA点到硝化纤维素膜带(Shleicher & Schuell，Germany)上。将含有斑点印迹蛋白质的硝化纤维素带在缓冲液A(40mM Na2HPO4、0.6mMNaH2PO4，pH 7.5，0.5％[v/v]Tween 20，0.5％[w/v]BSA，0.05％[w/v]NaN3)中封闭，并用来自螨类过敏患者的血清、来自非过敏个体的血清(稀释1∶10)和无血清缓冲液A培养。用125I标记的抗-人IgE抗体检测结合的IgE抗体并通过放射自显影术直观化。
通过非变性斑点印迹分析法将rDer p 2野生型过敏原的IgE结合能力与两个rDer p 2片段和rDer p 2杂种进行比较。来自17个螨类过敏个体的血清(第1-17道)表现出与硝基纤维素打点的rDer p 2的不定的IgE反应性，而几乎没有检测出与rDer p 2片段1的IgE反应性。只有3个血清表现出非常微弱的与rDer p 2片段2的结合且2个血清预rDer p 2杂种反应(图12)。来自非过敏个体的血清以及无血清缓冲液表现出对rDer p 2和对rDer p 2衍生物没有IgE反应性(图12，第18、19道)。没有发现对对照蛋白质——BSA的IgE反应性(图12)。由于构象缺失和由此的构象IgE-抗原决定簇(参见实施例7)，可以证明，rDer p 2衍生物与rDer p 2野生型相比几乎完全丧失其IgE结合能力。
实施例8通过CD 203c表达测得的rDer p 2衍生物的降低的致敏活性从过敏患者中获得肝素化血样。将血样(100微升)用各种浓度的rDer p 2、rDer p 2片段、rDer p 2杂种、单克隆抗-IgE抗体(Immunotech，Marseille，France)和PBS培养15分钟(37℃)。如Hauswirth，A.W.，等人(2002)J Allergy Clin Immunol 100102所述测定CD 203c表达。
CD 203c的上调已经被描述为是过敏原诱发的嗜碱细胞活化和脱粒的替代指标(Hauswirth，A.W.，等人(2002))。因此，通过在来自屋尘螨过敏患者的嗜碱细胞上测量CD 203c上调，比较重组Der p 2、rDerp 2片段和rDer p 2杂种的致敏活性(图13，14)。图13显示了来自3个患者的代表性结果。用10微克/毫升rDer p 2野生型进行的嗜碱细胞培养在各个受试患者中显著上调了CD 203c表达，而使用相同浓度的单独片段或两个片段的等摩尔混合物，没有获得上调(图13)。此外，使来自相同10个患者的嗜碱细胞在1∶5稀释步骤中暴露在不同浓度(5微克/毫升-0.32纳克/毫升)的rDer p 2和rDer p 2杂种中。图14显示了来自6个代表性患者的结果。嗜碱细胞与rDer p 2杂种的接触以40纳克/毫升至5000纳克/毫升的浓度引起CD 203c表达的上调，而rDer p2野生型在8-200纳克/毫升的浓度诱发CD 203c的上调。在10个患者中的8个中，rDer p 2杂种与rDer p 2相比，激活嗜碱细胞的能力降低10倍以上。
抗-人IgE抗体在来自所有患者的嗜碱细胞上引发CD 203c表达的上调，而仅用缓冲液没有获得任何上调(图13+14)。
在来自螨类过敏患者的嗜碱细胞上的CD 203c表达的测定表明rDer p 2杂种与rDer p 2野生型相比降低的生物活性，用rDer p 2片段没有观察到生物活性。此外，使用RBL细胞的嗜碱细胞活化检定法表明，用衍生物诱发的IgE Abs较不致敏。这些结果表明，当用于免疫疗法时，低致敏rDer p 2衍生物与Der p 2野生型过敏原相比引起较低的IgE介导的副作用。
实施例9rDer p 2衍生物与rDer p 2野生型过敏原类似地在螨类中诱发rDer p 2特异性IgG抗体各由5只8周大雌BALB/c鼠组成的组用5微克纯化蛋白质(rDerp 2、rDer p 2片段1、rDer p 2片段2和rDer p 2杂种)免疫，在20周期间内以4周为间隔在颈部皮下吸附到200微升AluGel-S(SERVA电泳，Germany)中。在每次免疫前一天收集血样并储存在-20℃。
在4℃用在PBS中稀释的rDer p 2(c＝5微克/毫升)涂布ELISA板(Greiner，Austria)过夜。将板用PBST(PBS；0.05％v/v Tween 20)洗涤，并在室温下用封闭缓冲液(PBST；1％w/v BSA)封闭3小时。将小鼠血清在PBST中稀释1∶1000以测量Der p 2-特异性IgG1；在4℃在每孔中添加0.5％w/v BSA和100微升这种稀释物过夜。
将板用PBST洗涤5次，并用单克隆大鼠抗-小鼠IgG1抗体(BDPharmingen，USA)检测结合IgG1抗体，然后如Vrtala，S.，等人(1996)J Allergy Clin Immunol 98913所述添加辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体(Amersham Bioscience，Sweden)。
在获自用rDer p 2和rDer p 2衍生物免疫的小鼠的血清样品中测定Der p 2特异性IgG1水平。rDerp 2以及rDerp 2衍生物均是致免疫的，并在二次免疫(8周)后诱发IgG1应答(图15)。在二次免疫后，用rDerp 2片段1和rDer p 2杂种诱发的IgG1应答甚至高于用rDer p 2诱发的应答(图15)。在最后一次免疫后，用rDer p 2衍生物诱发的IgG1应答与用rDer p 2野生型分子诱发的相当(图15)。
实施例10用rDer p 2衍生物免疫接种而诱发的IgG1抗体抑制了螨类过敏患者的IgE与rDer p 2野生型的结合用100微升纯化rDer p 2涂布ELISA板(Greiner，Austria)，用PBS稀释至5微克/毫升的浓度，在4℃过夜。用PBST洗涤两次并在室温用封闭缓冲液(PBST；1％w/v BSA)封闭3小时，将板在4℃用抗-rDerp 2、抗-rDer p 2片段1、抗-rDer p 2片段2和抗-rDer p 2杂种抗血清和相应的免疫前血清培养过夜。在PBST；0.5％w/v BSA中将鼠抗血清稀释1∶20，兔抗血清稀释1∶100。洗涤之后，用来自螨类过敏患者的1∶10稀释血清将板在4℃培养过夜，并用如(44，45)所述的在PBST；0.5％w/v BSA中稀释1∶2500的HRP偶联羊抗人IgE抗体(KPL，USA)检测结合的人IgE抗体。如下计算对IgE结合的抑制百分比100-(Ods/Odp)×100，其中Ods和Odp分别代表用免疫血清和免疫前血清预培养后的衰减系数。
通过ELISA竞争实验研究用rDer p 2和rDer p 2衍生物免疫接种而诱发的鼠IgG1抗体对螨类过敏患者的IgE与rDer p 2结合的抑制能力。
鼠IgG抗体对过敏患者的IgE与rDer p 2野生型结合的抑制百分比显示在表5和6中。
用鼠抗-rDer p 2抗体获得的抑制为61至87％(平均75％)，而鼠抗-rDer p 2杂种抗体、抗-rDer p 2片段1抗体和抗-rDer p 2片段2抗体对血清IgE与rDer p 2野生型结合的抑制分别为47至76％(平均62％)，48至66％(平均54％)和24至52％(平均41％)(表5)。
表5对IgE结合的抑制％

在附加实验中，用纯化rDer p 2和三种rDer p 2衍生物将兔子免疫。兔抗-血清抑制螨类过敏患者的IgE与rDer p 2结合的能力也通过ELISA抑制检定法测定，结果与鼠血清的类似(表6)。兔抗-rDer p 2抗体对患者IgE与rDer p 2结合的抑制为47至89％(平均66％)，而抗-rDer p 2杂种抗体对人IgE结合的抑制为20至86％(平均59％)。用兔抗-rDer p 2片段抗体获得的抑制为26至70％(平均52％)，用兔抗-rDer p 2片段2抗体获得的抑制为32至54％(平均42％)。使用抗-片段1和抗-片段2抗体的混合物，对患者IgE与rDer p 2野生型的结合的抑制仅略微提高至平均55％(表6)。
表6对IgE结合的抑制％

小鼠的免疫接种表明所有三种rDer p 2衍生物通过其诱发IgG抗体应答的能力而产生的免疫原性。每一rDer p 2衍生物诱发的IgG抗体均抑制了来自螨类过敏患者的IgE与Der p 2的结合，但与用两个单独片段诱发的IgG抗体相比，甚至与片段1和2的混合物诱发的IgG抗体相比，rDer p 2杂种诱发的IgG抗体表现出更好的抑制能力。这些结果是重要的，因为封闭抗体表明在用重组过敏原的SIT中发挥主要作用。
小鼠的免疫接种诱发的抗-rDer p 2和抗-rDer p 2衍生物抗体如ELISA抑制检定法所示抑制了过敏患者的IgE与rDer p 2的结合。
Der p 2杂种在本小鼠模型中诱发封闭抗体；片段改组显著提高了免疫原性。
实施例11基于rDer p 2衍生物的疫苗与基于rDer p 2野生型的疫苗相比，在体内具有降低的变应原性。
在37℃，5％CO2，将大鼠嗜碱细胞白血病(RBL)细胞(亚系RBL-2H3)在细胞培养基(100毫升RPMI 1649，10％FCS，4mM L-谷氨酰胺、2mM丙酮酸钠、10mM HEPES，100μM2-巯基乙醇、1％Pen/Strep)中平板接种在ELISA板(Nuc，Denmark)上(100微升4×104个细胞)过夜。
在37℃在细胞中加载2微升获自用rDer p 2、rDer p 2片段1、rDerp 2片段2和rDer p 2杂种免疫接种的小鼠的血清2小时，用200微升Tyrode/BSA缓冲液(137mM NaCl、2.7mM KCl、0.5mM MgCl2、1.8mMCaCl2、0.4mM NaH2PO4、5.6mM D-葡萄糖、12mM NaHCO3、10mM N-2-羟乙基-哌嗪-N’-2-乙烷磺酸(HEPES)、0.1％牛血清白蛋白，pH 7.2)(Sigma-Aldrich，Austria)洗涤两次并用rDer p 2(c＝0.3微克/毫升)刺激。通过添加10微升10％v/v Triton X-100(Merck，Germany)，诱发总β-氨基己糖苷酶释放。
为了测量β-氨基己糖苷酶的释放，将50微升化验溶液(80μM4-甲基伞形基-N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷，在0.1M柠檬酸盐缓冲液中，pH 4.5)用50微升上清液在37℃，5％CO2培养1小时。
添加100微升对羟苯基甘氨酸缓冲液(0.2M甘氨酸、0.2M NaCl，pH 10.7)终止反应，并使用荧光微板读数器(Dynatech MR 7000，Dynatech Laboratories，USA)在λex360λem465纳米测量荧光。结果表示为总β-氨基己糖苷酶释放的平均百分比。
为了研究用rDer p 2衍生物免疫接种是否诱发对Der p 2野生型过敏原的过敏免疫应答，分别用rDer p 2、rDer p 2片段1、rDer p 2片段2和rDer p 2杂种将小鼠免疫。然后使用来自小鼠的血清样品加载RBL细胞以通过RBL脱粒实验量化对rDer p 2野生型过敏原的过敏免疫应答。在载有鼠抗-rDer p 2片段1、抗-rDer p 2片段2和抗-rDer p 2杂种抗体的RBLs中用rDer p 2野生型过敏原获得的释放为0至16.6％(平均6.4％)，0.2至28.6％(平均13.2％)和4.7至37.1％(平均18.3％)，而载有抗-rDer p 2野生型抗体的RBLs在用rDer p 2野生型刺激后的释放为35至39％(平均37％)(图16)。
实施例12MP12诱发的IgG抗体，其识别出Phl p 12野生型、来自其它花粉的抑制蛋白和植物-食品源抑制蛋白。
为了测试用MP12免疫接种后诱发的抗体是否识别来自花粉以及来自植物源食品的抑制蛋白，进行ELISA实验。
将来自梯牧草花粉(Phl p 12)、桦树花粉(Bet v 2)、艾蒿花粉(Artv 4)、和来自不同植物食品，腰果(Ana c)、芹菜(Api g 4)、香蕉(Musxp 1)、榛子(Cor a 2)和胡萝卜(Dau c 4)的抑制蛋白涂布到ELISA板(5微克/毫升)上，并用兔抗血清的连续稀释物(1∶2000-1∶64000)培养。用POX标记的驴抗兔抗血清检测结合的兔抗体。
MP 12诱发的IgG抗体应答与Phl p 12野生型诱发的相当(图17)。Phl p 12和P12诱发的Ig抗体均与来自花粉(草、树、杂草)的proflins和植物源食品抑制蛋白交叉反应(图17)。
实施例13抗-MP12抗体抑制了来自草花粉过敏患者的血清IgE与完整Phl p 12以及与来自其它花粉的抑制蛋白(树和杂草)和与植物食品抑制蛋白的结合。
通过ELISA竞争实验研究MP12诱发的兔IgG抑制过敏患者的IgE与Phl p 12、与来自不同花粉的抑制蛋白和与植物食品源抑制蛋白结合的能力。
用来自梯牧草(rPhl p 12)、桦树花粉(rBet v 1)、胡萝卜(rDau c4)、榛子(rCor a 2)、香蕉(rMus xp 1)和腰果(rAna c)的抑制蛋白涂布ELISA板(Nunc Maxisorp，Denmark)，并用抗-Phl p 12抗血清、抗-MP 12抗血清的1∶50稀释物和用对照用的相应免疫前血清预培养。洗涤后，将板用1∶3稀释的来自8个抑制蛋白过敏患者的血清培养，并用HRP标记的来自羊的抗人IgE抗血清(KPL，USA)检测结合的IgE抗体。用抗-Phl p 12和抗-MP 12抗血清预培养实现的对IgE结合的抑制百分比如下计算对Ig结合的抑制％＝100-ODI/ODP×100。ODI和ODP分别代表用兔免疫血清和相应的免疫前血清预培养后的衰减(表7)。
表7对IgE与下列材料的结合的抑制百分比

用Phl p 12诱发的抗体和MP12诱发的抗体实现的对IgE与梯牧草花粉抑制蛋白结合的平均抑制分别相当于83.8％和72.3％(表7)。与用Phl p 12诱发的抗体(平均抑制64.8％)相比，用MP12特异性抗体更强地抑制了IgE与桦树花粉抑制蛋白，Bet v 2的结合(平均抑制74.5％)。两种抗血清在非常相似的程度上抑制了IgE与植物食品抑制蛋白的结合(Cor a 2用抗-Phl p 12-IgG 62.3％平均抑制，用抗-MP12-IgG 58.1％；Dau c 4用抗-Phl p 12-IgG 73.3％平均抑制，用抗-MP12-IgG 74.6％；Ana c 1用抗-Phl p 12-IgG 56.8％平均抑制，用抗-MP12-IgG 53.6％)。抗-MP 12-IgG(36.1％)与抗-Phl p 12-诱发的IgG(71.4％)相比，只较低抑制了IgE与香蕉抑制蛋白的结合(表7)。
抑制蛋白代表了在所有真核细胞中表达的过敏原并因此代表可能在过敏患者中引发吸入式过敏症(例如rhinoconjunctivits、哮喘)以及口服后的口腔过敏症状(嘴唇和舌头发痒和肿胀)的pan-过敏原。
重组Phl p 12衍生物，MP12，在免疫后诱发识别来自花粉以及来自植物源食品的抑制蛋白的IgG抗体。MP12诱发的抗体抑制了患者的血清IgE与来白花粉的抑制蛋白以及与植物食品源抑制蛋白的结合。因此，MP12适用于治疗可归因于抑制蛋白过敏反应的花粉-食品交叉致敏。
序列表<110>碧欧美产品及海德尔公司<120>蛋白质过敏原衍生物<130>R 46550<140>PCT/AT2005/000486<141>2005-12-02<150>AT A 2028/2004<151>2004-12-02<160>12<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>24<212>DNA<213>人工<220>
<223>人工序列<400>1catatgaggc ccggcgcggt catc<210>2<211>33<212>DNA<213>人工<220>
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<220>
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<223>人工序列<400>4gaattcttaa tggtgatggt gatggtgacc ctggatgacc atgta45<210>5<211>130<212>PRT<213>Phleum pratense<400>5Met Ser Trp Gln Thr Tyr Val Asp Glu His Leu Met Cys Glu Ile Glu1 5 10 15Gly His His Leu Ala Ser Ala Ala Ile Leu Gly His Asp Gly Thr Val20 25 30Trp Ala Gln Ser Ala Asp Phe Pro Gln Phe Lys Pro Glu Glu Ile Thr35 40 45Gly Ile Met Lys Asp Phe Asp Glu Pro Gly His Leu Ala Pro Thr Gly50 55 60Met Phe Val Ala Gly Ala Lys Tyr Met Val Ile Gln Gly Glu Pro Gly
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<223>人工序列<400>6Met Glu Pro Gly Ala Val Ile Arg Gly Lys Lys Gly Ala Gly Gly Ile1 5 10 15Thr Ile Lys Lys Thr Gly Gln Ala Leu Val Gly Ile Tyr Asp Glu Pro20 25 30Met Thr Pro Gly Gln Cys Asn Met Val Val Glu Arg Leu Gly Asp Tyr35 40 45Leu Val Glu Gln Gly Met Met Ser Trp Gln Thr Tyr Val Asp Glu His50 55 60
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<223>人工序列
<400>12catgctaaaa tccgcgatga tcaagtcgat gtcaaa 3权利要求
1.具有降低的致敏活性的野生型蛋白质过敏原衍生物的制造方法，其特征在于包括下列步骤-提供具有致敏活性的野生型蛋白质过敏原，-将所述野生型蛋白质过敏原剪切成两部分，所述两部分具有降低的致敏活性或缺乏致敏活性，并-将所述两个片段以相反方向重新接合。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于所述衍生物作为重组蛋白质在宿主中，尤其是具有高表达能力的宿主中制成。
3.根据权利要求1或2的方法，其特征在于所述野生型过敏原选自抑制蛋白，尤其是Phl p12，桦树过敏原，尤其是Bet v4，尘螨过敏原，尤其是Der p2，储螨过敏原，尤其是Lep d2，梯牧草过敏原，尤其是Phl p7。
4.根据权利要求1至3任一项的方法，其特征在于通过与野生型过敏原相比至少10％，优选至少20％，尤其至少30％的IgE结合能力抑制的降低测量致敏活性的降低。
5.根据权利要求1至4任一项的方法，其特征在于通过过敏原致敏的患者血清的IgE抗体与所述衍生物的斑点印迹的结合的缺乏测量致敏活性的降低。
6.根据权利要求1至5任一项的方法，其特征在于所述衍生物与药用赋形剂结合，并最终制成药物制剂。
7.根据权利要求1至6任一项的方法，其特征在于所述衍生物与合适的疫苗佐剂结合并最终制成药用疫苗制剂。
8.根据权利要求7的方法，其特征在于所述衍生物与其它过敏原结合成组成疫苗。
9.根据权利要求8的方法，其特征在于所述过敏原是野生型过敏原，尤其是野生型过敏原的混合物、重组野生型过敏原、野生型蛋白质过敏原的衍生物或它们的混合物。
10.根据权利要求6至9任一项的方法，其特征在于所述制剂进一步含有过敏原提取物。
11.野生型蛋白质过敏原的过敏原衍生物，所述野生型蛋白质过敏原具有1至Z的氨基酸序列，其特征在于所述衍生物在氨基末端至羧基末端的方向上相邻地含有两种野生型过敏原片段X至Z和1至X，所述两种野生型过敏原片段具有降低的致敏活性或没有致敏活性。
12.根据权利要求11的过敏原衍生物，其特征在于X至Z和1至X为至少30个氨基酸残基长，优选至少50个氨基酸残基，尤其是至少60个氨基酸残基。
13.根据权利要求11或12的过敏原衍生物，其特征在于X至Z和1至X的长度相差50％或更少，优选30％或更少，尤其是20％或更少。
14.根据权利要求11至13任一项的过敏原衍生物，其特征在于所述野生型过敏原选自I型过敏原，优选选自表A，更优选为梯牧草(phelum pratense)花粉，尤其是Phl p12，桦树(Betula verrucosa)花粉，尤其是Bet v4，黄蜂(Vespula vulgaris)毒液，纸巢蜂(Polistesannularis)毒液，parietaria judaica花粉，黑麦草花粉、尘螨过敏原，尤其是Der p2的过敏原或其混合物。
15.过敏原组合物，其包含根据权利要求11至14任一项的过敏原衍生物和其它过敏原，优选野生型过敏原，尤其是野生型过敏原的混合物、重组野生型过敏原、野生型蛋白质过敏原的衍生物或它们的混合物。
16.根据权利要求15的过敏原组合物，其特征在于所述组合物进一步含有过敏原提取物。
17.根据权利要求15或16的过敏原组合物，其特征在于其含有药用赋形剂。
18.根据权利要求11至17任一项的过敏原衍生物用于制备过敏原特异性免疫疗法药物的用途。
19.根据权利要求11至17任一项的过敏原衍生物或过敏原组合物用于制备被动免疫法药物的用途。
20.根据权利要求11至17任一项的过敏原衍生物或过敏原组合物用于制备预防免疫法药物的用途。
21.根据权利要求18至20任一项的用途，其特征在于所述药物进一步含有佐剂、稀释剂、防腐剂或它们的混合物。
22.制造根据权利要求18至21任一项的用途，其特征在于其包含10纳克至1克，优选100纳克至10毫克，尤其是0.5微克至200微克的所述重组过敏原衍生物。
23.制造根据权利要求11至17任一项的过敏原衍生物的方法，其特征在于包括下列步骤-提供为根据权利要求11至17任一项的过敏原衍生物编码的DNA分子，-用所述DNA分子转化宿主细胞和-在所述宿主细胞中表达所述衍生物并分离所述衍生物。
24.根据权利要求23的方法，其特征在于所述宿主是具有高表达能力的宿主。
25.制造根据权利要求11至17任一项的过敏原衍生物的方法，其特征在于其通过化学合成法制造。
26.可通过根据权利要求1至10或23至25任一项的方法获自第一野生型抑制蛋白分子的抑制蛋白衍生物或根据权利要求11至14任一项的第一野生型抑制蛋白分子的过敏原衍生物用于制造预防或治疗由第二野生型抑制蛋白分子引起的过敏症的药物的用途。
27.根据权利要求26的用途，其特征在于所述第一和所述第二抑制蛋白分子选自Phl p12、Bet v2、Art v4、Ana c、Api g4、Musxp1、Cor a2或Dau c4。
28.根据权利要求26的用途，其特征在于所述第一抑制蛋白分子是Phl p 12，所述第二抑制蛋白分子选自Bet v2、Art v4、Ana c、Api g4、Mus xp1、Cor a2或Dau c4。
29.根据权利要求27或28的用途，用于制造治疗和/或预防可归因于抑制蛋白过敏反应的花粉-食物交叉致敏的药物。
全文摘要
本发明涉及具有降低的致敏活性的野生型蛋白质过敏原衍生物的制造方法，其特征在于包括下列步骤提供具有致敏活性的野生型蛋白质过敏原，将所述野生型蛋白质过敏原剪切成两部分，所述两部分具有降低的致敏活性或缺乏致敏活性，并将所述两个片段以相反方向重新接合；还涉及过敏原衍生物。
文档编号A61K38/16GK101068830SQ200580041627
公开日2007年11月7日 申请日期2005年12月2日 优先权日2004年12月2日
发明者K·韦斯特恩, M·弗克, P·瓦朗, W·凯勒, R·瓦伦察 申请人:碧欧美公司