用于抑制无义突变的化合物及其使用方法

专利名称：用于抑制无义突变的化合物及其使用方法
技术领域：
本发明涉及通过给予本发明的化合物或组合物用于治疗或预防与mRNA中无义突变相关的疾病的方法、化合物和组合物。更具体地，本发明涉及用于抑制与mRNA中无义突变相关的翻译提前终止的方法、化合物和组合物。
背景技术：
细胞内的基因表达取决于依次进行的转录和翻译过程。这些过程一起从相应基因的核苷酸序列制得蛋白。
转录包括通过RNA聚合酶由DNA合成mRNA。转录从基因的启动子区域开始并继续进行直到诱导终止，例如通过在初生RNA中形成茎-环(stem-loop)结构或者结合ρ基因产物。
然后，蛋白是由mRNA在tRNA、tRNA合成酶及各种其他种类蛋白和RNA的帮助下在核糖体上进行翻译过程而制得的。翻译包括三步起始、延伸和终止。翻译是通过形成起始复合体而起始的，所述起始复合物由识别mRNA上的指示翻译机器开始在mRNA上进行翻译的信号的蛋白因子、mRNA、tRNA、辅助因子和核糖体亚基组成。一旦形成起始复合物，通过核糖体以及tRNA和tRNA合成酶的肽基转移酶活性，重复增加氨基酸，从而多肽链增长。核糖体A位点的三个终止密码子(UAA、UAG、UGA)之一的存在发出信号使多肽链释放因子(RF)结合并识别终止信号。然后，位于核糖体P位点的tRNA的3′核苷酸与初生多肽链之间的酯键水解，释放出完成的多肽链，核糖体亚基循环用于又一轮翻译。
其中碱基数目发生改变的DNA序列突变归类为插入或缺失突变(例如，移码突变)并且使大部分基因组破裂。将一个碱基变为另一个碱基并导致氨基酸替代的DNA突变标记为错义突变。碱基替代细分为转换类(一个嘌呤转换为另一嘌呤，或者一个嘧啶转换为另一嘧啶)和颠换类(嘌呤颠换为嘧啶，或者嘧啶颠换为嘌呤)。
转换突变和颠换突变可以导致将氨基酸密码子变为三种终止密码子之一的无义突变。这些提前终止密码子可以使翻译提前终止从而在细胞中产生异常的蛋白。必要基因中的无义突变可能是致命的并且还可以导致许多人类疾病，仅举几个例子，如癌症、溶酶体贮积症、肌营养不良、囊性纤维化症和血友病。
在人类癌症中，人类p53基因是最常见的突变基因(Zambetti，G.P.以及Levine，A.，FASEB 7855-865(1993))。在遗传性癌症和自发性癌症中均发现，超过50种不同的人类癌症含有p53突变并且全部人类癌症的50-55％发生该基因的突变(Hollstein，M.，等，Nucleic Acids Res.223551-55(1994)；International Agency for Research on Cancer(IARC)database)。大约70％的直肠癌、50％的肺癌和40％的乳癌含有突变体p53(Koshland，D.，Science 2621953(1993))。畸形p53与不佳的预后、更加迅速蔓延的肿瘤、转移瘤以及低于5年的存活率有关(Id.)。人们认为p53在诱导细胞生长停滞和/或DNA损伤细胞凋亡的作用对于破坏否则将获得生长优势的变异细胞是必要的。此外，p53使快速分裂的细胞对调亡信号敏感。在报道的多于15,000种p53基因突变中，大约7％为无义突变。因此，对于p53无义突变需要安全有效的治疗。
在具有无义突变的细菌和真核菌株中，tRNA分子之一突变以致突变体tRNA能识别无义密码子、参与翻译过程的蛋白的突变、核糖体(核糖体RNA或核糖体蛋白)突变、或者添加公知的改变翻译过程的化合物(例如，环己酰亚胺或者氨基糖苷抗生素)，均可导致发生无义突变的抑制。结果是氨基酸将在无义突变位点结合到多肽链中，并且翻译不再在无义密码子处提前终止。插入的氨基酸不必与野生型蛋白的原始氨基酸相同，但是许多氨基酸替换对蛋白结构或功能没有总作用。因此，通过抑制无义突变而得到的蛋白可能具有与野生型蛋白接近的活性。该方案提供了通过抑制无义突变而避免翻译提前终止以治疗与无义突变有关的疾病的机会。
氨基糖苷抗生素促进连读真核生物终止密码子的能力已经引起了对这些药物作为由无义突变引起的人类疾病的潜在性治疗剂的兴趣。这种治疗策略可行的一种疾病为典型的晚婴儿型神经元蜡样质脂褐素沉积病(late infantile neuronal ceroidlipofuscinosis，LINCL)，目前还未有效治疗的致命性幼年神经退化疾病。编码溶酶体三肽基-肽酶1(TPP-I)的基因CLN2中的提前终止密码子突变与大约一半的诊断患有LINCL的儿童的疾病有关。已经考察了氨基糖苷庆大霉素恢复LINCL细胞系TPP-I活性的能力。在来自患者的一种用于常见无义突变(Arg208Stop)和不同的罕见无义突变而杂合配制的细胞系中，用庆大霉素治疗最大程度地恢复大约7％的TPP-I正常水平。这些结果表明通过氨基糖苷或功能类似的药品来药理学抑制无义突变可能具有LINCL治疗潜力(Sleat等，Eur.J.Ped.Neurol.5Suppl A 57-62(2001))。
在囊性纤维化症横跨膜电导调节(Cystic Fibrosis Transmembrane ConductanceRegulator，CFTR)基因具有提前终止密码子的培养细胞中，用氨基糖苷治疗导致生成全长CFTR(Bedwell等，Nat.Med.31280-1284(1997)；Howard等，Nat.Med.2467-469(1996))。在杜兴肌营养不良的小鼠模型中，观察到庆大霉素硫酸盐在提前终止密码子处抑制翻译终止，导致生成全长肌养蛋白(Barton-Davis等，J.Clin.Invest.104375-381(1999))。全长肌养蛋白的少量增加提供了对mdx小鼠中收缩诱导损伤的保护。在这些研究中没有确定插在无义密码子位点的氨基酸。
因此，通过介导无义密码子误读而抑制翻译提前终止的小分子疗法或预防法可能用于治疗许多疾病。可以为公众带来可用于抵抗由无义突变引起的疾病的广谱选择性疗法或预防法的小分子药物特别是口服可生物利用的药物的发现才刚开始。
Clitocine(6-氨基-5-硝基-4-(β-D-核-呋喃糖基氨基)嘧啶)为首先从蘑菇卷边杯伞(Clitocybe inversa)中分离的天然存在的外环氨基核苷(Kubo等，Tet.Lett.274277(1986))。还报道了clitocine的全合成(Moss等，J.Med.Chem.31786-790(1988)以及Kamikawa等，J.Chem.Soc.Chem.Commun.195(1988))。已经报道clitocine具有杀虫活性和抵抗白血病细胞系的细胞抑制活性(Kubo等，Tet.Lett.274277(1986)以及Moss等，J.Med.Chem.31786-790(1988))。但是至今还没有公开clitocine作为用于与无义突变有关的疾病的治疗剂的用途。也没有报道开发出可用作与无义突变有关的癌症或疾病的治疗剂的clitocine类似物或衍生物。
因此，为了开发用于治疗或预防与mRNA无义突变有关的疾病的新药物，还需要开发表征并优化前导分子。因此，本发明的目的是提供这样的化合物。
在此提及的所有文献都并入本发明作为参考，如同它们完全在此阐明一样。

发明内容
根据本发明，鉴定了能抑制与mRNA中无义突变相关的翻译提前终止的化合物，并提供了它们的使用方法。
根据本发明的一个方面，提供了可用于抑制与mRNA中无义突变相关的翻译提前终止，并可用于治疗与mRNA中无义突变相关的疾病的式(1)的化合物或者式1所示化合物的药物学可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、多晶型物、外消旋物或立体异构体 其中W、X、Y和Z独立地选自N或C-Ra，其中Ra为氢或C1-C4的烷基，其中W、X、Y或Z中的至少一个为N；n为0、1、2或3；R1为氰基；任选地由一个或两个C1-C4烷基取代的氨基甲酰基；或由羟基、C1-C4烷基、或C1-C4烷氧基取代的羰基；R为羟基；卤素；任选地由一个或多个独立地选择的卤素或羟基取代的C1-C4烷基；任选地由一个或多个独立地选择的卤素或苯基取代的C1-C4烷氧基；任选地由一个或多个独立地选择的C1-C4烷基取代的C4-C8环烷基；-Rb基；-O-Rb基；任选地由一个或多个独立地选择的C1-C4烷基、氧代或-Rb基取代的五元到六元杂环；具有两个环结构的九元至十元杂环；由羟基、C1-C4烷基或C1-C4烷氧基取代的羰基；任选地由一个或两个C1-C4烷基取代的氨基甲酰基；硝基；氰基；任选地由羟基、C1-C4烷基或-Rb基取代的硫；任选地由羟基、C1-C4烷基或-Rb基取代的磺酰基；任选地由一个或两个独立地选择的C1-C4烷基、磺酰基、或羰基取代的氨基，其中，所述氨基磺酰基任选地由羟基、C1-C4烷基或-Rb基取代，并且其中氨基羰基任选地由C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、苯甲酸基或任选地由-Rb基取代的氨基所取代；或两个R基与它们连接的苯环一起形成苯并[1，3]间二氧杂环戊烯或2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英基，其中-Rb为任选地由下列一个或多个基团取代的C6-C8芳基羟基、卤素、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基或任选地由一个或多个C1-C4烷基取代的氨基。
根据本发明的另一个方面，提供一种用于抑制与无义突变相关的翻译提前终止的方法，以及用于预防或治疗与mRNA无义突变相关的疾病的方法。这种疾病包括但不限于由与无义突变相关的翻译提前终止引起的基因疾病如中枢神经系统疾病(CNS disease)、炎症性疾病、神经退化疾病、自身免疫性疾病、心血管病或肺病；更优选所述疾病为癌症(或其它增殖疾病)、淀粉样变性病、阿尔茨海默病、动脉粥样硬化、巨人症、侏儒症、甲状腺机能减退、甲状腺机能亢进、囊性纤维化症、衰老症、肥胖症、帕金森症、尼曼匹克症(Nieman Pick’s disease)、家族性高胆固醇血症、视网膜色素变性、马凡氏综合症、溶酶体贮积症、肌营养不良、囊性纤维化症、血友病、或典型的晚婴儿型神经元蜡样质脂褐素沉积病(LINCL)。
在一种实施方式中，本发明涉及用于抑制与mRNA中无义突变相关的翻译提前终止的方法，该方法包括对有此需要的患者给药无义抑制量的至少一种本发明的化合物。
在另一种实施方式中，提供了用于治疗癌症、溶酶体贮积症、肌营养不良、囊性纤维化症、血友病、或典型的晚婴儿型神经元蜡样质脂褐素沉积病的方法，该方法包括对有此需要的患者给药治疗有效量的至少一种本发明的化合物。
参照下面的优选实施方式和具体描述，本发明的这些和其它方面将变得更容易理解。
1、一种治疗或预防由体细胞突变引起的疾病的方法，该方法包括对有此需要的患者给药有效量的式1化合物或者式1所示化合物的药物学可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、多晶型物、外消旋物或立体异构体
其中W、X、Y和Z独立地选自N或C-Ra，其中Ra为氢或C1-C4的烷基，其中W、X、Y或Z中的至少一个为N；n为0、1、2或3；R1为氰基；任选地由一个或两个C1-C4烷基取代的氨基甲酰基；或由羟基、C1-C4烷基、或C1-C4烷氧基取代的羰基；R独立地选自羟基；卤素；任选地由一个或多个独立地选择的卤素或羟基取代的C1-C4烷基；任选地由一个或多个独立地选择的卤素或苯基取代的C1-C4烷氧基；任选地由一个或多个独立地选择的C1-C4烷基取代的C4-C8环烷基；-Rb基；-O-Rb基；任选地由一个或多个独立地选择的C1-C4烷基、氧代或-Rb基取代的五元到六元杂环；具有两个环结构的九元至十元杂环；由羟基、C1-C4烷基或C1-C4烷氧基取代的羰基；任选地由一个或两个C1-C4烷基取代的氨基甲酰基；硝基；氰基；任选地由羟基、C1-C4烷基或-Rb基取代的硫；任选地由羟基、C1-C4烷基或-Rb基取代的磺酰基；任选地由一个或两个独立地选择的C1-C4烷基、磺酰基、或羰基取代的氨基，其中，所述氨基磺酰基任选地由羟基、C1-C4烷基或-Rb基取代，并且其中氨基羰基任选地由C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、苯甲酸基或任选地由-Rb基取代的氨基所取代；或两个R基与它们连接的苯环一起形成苯并[1，3]间二氧杂环戊烯或2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英基；其中-Rb为任选地由下列一个或多个基团取代的C6-C8芳基羟基、卤素、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基或任选地由一个或多个C1-C4烷基取代的氨基。
2、根据实施方式1所述的方法，其中，所述式1的化合物或其药物学可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、多晶型物、外消旋物或立体异构体以含有所述化合物和药物学可接受的载体或稀释剂的组合物形式给药。
3、根据实施方式1所述的方法，其中，所述给药为静脉内给药。
4、根据实施方式1所述的方法，其中，R1在间位或对位。
5、根据实施方式1所述的方法，其中，W、Y和Z各自为N，X为C-Ra(式1-A) 6、根据实施方式5所述的方法，其中，R1为羧基，并位于间位或对位。
7、根据实施方式5所述的方法，其中，Ra为氢。
8、根据实施方式5所述的方法，其中，n为1或2。
9、根据实施方式5所述的方法，其中，R独立地选自卤素、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基或C1-C4烷氧基。
10、根据实施方式5所述的方法，其中，R位于间位和/或对位上。
11、根据实施方式1所述的方法，其中，Y和Z均为N，并且W和X均为C-Ra(式1-B) 12、根据实施方式11所述的方法，其中，R1为羧基，并位于间位或对位。
13、根据实施方式11所述的方法，其中，Ra为氢。
14、根据实施方式11所述的方法，其中，n为1或2。
15、根据实施方式11所述的方法，其中，R独立地选自卤素、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基、氨基或吡咯基。
16、根据实施方式11所述的方法，其中，R位于间位和/或对位上。
17、根据实施方式1所述的方法，其中，W和Y均为N，并且X和Z均为C-Ra(式1-C) 18、根据实施方式17所述的方法，其中，R1为羧基，并位于间位或对位。
19、根据实施方式17所述的方法，其中，Ra为氢。
20、根据实施方式17所述的方法，其中，n为1或2。
21、根据实施方式17所述的方法，其中，R独立地选自C1-C4烷基。
22、根据实施方式17所述的方法，其中，R位于间位和/或对位上。
23、根据实施方式1所述的方法，其中，W和Z均为N，并且X和Y均为C-Ra(式1-D) 24、根据实施方式23所述的方法，其中，R1为羧基，并位于间位或对位。
25、根据实施方式23所述的方法，其中，Ra独立地选自氢或甲基。
26、根据实施方式23所述的方法，其中，n为1或2。
27、根据实施方式23所述的方法，其中，R位于间位和/或对位上。
28、根据实施方式1所述的方法，其中，W为N，并且X、Y和Z各自为C-Ra(式1-E) 29、根据实施方式28所述的方法，其中，R1为羧基，并位于间位或对位。
30、根据实施方式28所述的方法，其中，Ra为氢。
31、根据实施方式28所述的方法，其中，n为1或2。
32、根据实施方式28所述的方法，其中，R独立地选自C1-C4烷基。
33、根据实施方式28所述的方法，其中，R位于间位和/或对位上。
34、根据实施方式1所述的方法，其中，X为N，并且W、Y和Z各自为C-Ra(式1-F) 35、根据实施方式34所述的方法，其中，R1为羧基，并位于间位或对位。
36、根据实施方式34所述的方法，其中，Ra为氢。
37、根据实施方式34所述的方法，其中，n为1或2。
38、根据实施方式34所述的方法，其中，R独立地选自C1-C4烷基。
39、根据实施方式34所述的方法，其中，R位于间位和/或对位上。
40、根据实施方式1所述的方法，其中，Y为N，并且W、X和Z各自为C-Ra(式1-G)
41、根据实施方式40所述的方法，其中，R1为羧基，并位于间位或对位。
42、根据实施方式40所述的方法，其中，Ra为氢。
43、根据实施方式40所述的方法，其中，n为1或2。
44、根据实施方式40所述的方法，其中，R独立地选自C1-C4烷基。
45、根据实施方式40所述的方法，其中，R位于间位和/或对位上。
46、根据实施方式1所述的方法，其中，Z为N，并且W、X和Y各自为C-Ra(式1-H) 47、根据实施方式46所述的方法，其中，R1为羧基，并位于间位或对位。
48、根据实施方式46所述的方法，其中，Ra为氢。
49、根据实施方式46所述的方法，其中，n为1或2。
50、根据实施方式46所述的方法，其中，R独立地选自C1-C4烷基。
51、根据实施方式46所述的方法，其中，R位于间位和/或对位上。
52、一种治疗或预防自身免疫性疾病、血液病、胶原疾病、糖尿病、神经退化疾病、心血管病、肺病、炎症性疾病或中枢神经系统疾病的方法，该方法包括对有此需要的患者给药有效量的式l化合物或其药物学可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、外消旋物或立体异构体。
53、根据实施方式52所述的方法，其中，所述给药为静脉内给药。
54、根据实施方式52所述的方法，其中，所述自身免疫性疾病为类风湿性关节炎或移植物抗宿主病。
55、根据实施方式52所述的方法，其中，所述炎症性疾病为关节炎。
56、根据实施方式52所述的方法，其中，所述中枢神经系统疾病为多发性硬化、肌营养不良、杜兴肌营养不良、阿尔茨海默病、神经退化疾病或帕金森症。
57、根据实施方式52所述的方法，其中，所述血液病为血友病、冯·维勒布兰德病(Von Willebrand disease)、共济失调性毛细血管扩张症(ataxia-telangiectasia)、β地中海贫血症(β-thalassemia)或肾结石。
58、根据实施方式52所述的方法，其中，所述胶原疾病为成骨不全症(osteogenesisimperfecta)或硬化。
59、一种治疗或预防家族性红细胞增多症、免疫缺陷、肾疾病、囊性纤维化症、家族性高胆固醇血症、视网膜色素变性、淀粉样变性病、血友病、阿尔茨海默病、家族黑蒙性痴呆(Tay Sachs disease)、尼曼匹克症(Niemann Pick disease)、帕金森症、动脉粥样硬化、巨人症、侏儒症、甲状腺机能亢进、衰老症、肥胖症、杜兴肌营养不良或马凡氏综合症(Marfan syndrome)的方法，该方法包括对有此需要的患者给药有效量的式1化合物或其药物学可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、外消旋物或立体异构体。
60、根据实施方式59所述的方法，其中，所述给药为静脉内给药。
61、一种治疗或预防人类癌症的方法，该方法包括对有此需要的人类给药有效量的式1化合物或其药物学可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、外消旋物或立体异构体。
62、根据实施方式61所述的方法，其中，所述给药为静脉内给药。
63、根据实施方式61所述的方法，其中，所述癌症为头和颈、眼、皮肤、口、咽喉、食管、胸、骨、血、肺、结肠、乙状结肠、直肠、胃、前列腺、乳房、卵巢、肾、肝、胰腺、脑、肠、心脏或肾上腺的癌症。
64、根据实施方式61所述的方法，其中，所述化合物或其药物学可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、或立体异构体包括药物学可接受的载体或稀释剂。
65、根据实施方式61所述的方法，其中，所述癌症为实体瘤。
66、根据实施方式61所述的方法，其中，所述癌症为肉瘤、癌、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰癌、乳癌(breast cancer)、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管源性癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、维尔姆斯瘤、子宫颈癌(cervical cancer)、睾丸瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、卡波西肉瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤(menangioma)、黑素瘤、成神经细胞瘤、视网膜母细胞瘤、血液产生的肿瘤(blood-born tumor)或多发性骨髓瘤。
67、根据实施方式61所述的方法，其中，所述癌症为急性成淋巴细胞性白血病、急性B淋巴细胞白血病、急性T淋巴细胞白血病、急性原粒细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、急性单核细胞性白血病、急性红白血病(acute erythroleukemicleukemia)、急性成巨核细胞白血病、急性髓单核细胞白血病、急性非淋巴细胞白血病(acute nonlymphocyctic leukemia)、急性未分化型白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病或多发性骨髓瘤。
68、一种治疗或预防与p53基因突变相关的疾病的方法，该方法包括对有此需要的患者给药有效量的式1化合物或其药物学可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、外消旋物或立体异构体。
69、根据实施方式68所述的方法，其中，所述给药为静脉内给药。
70、根据实施方式68所述的方法，其中，所述疾病为肉瘤、癌、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰癌、乳癌(breast cancer)、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管源性癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、维尔姆斯瘤、子宫颈癌(cervical cancer)、睾丸瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、卡波西肉瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤(menangioma)、黑素瘤、成神经细胞瘤、视网膜母细胞瘤、血液产生的肿瘤(blood-born tumor)或多发性骨髓瘤。
71、一种抑制癌细胞生长的方法，该方法包括使癌细胞与有效量的式1化合物或其药物学可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、外消旋物或立体异构体接触。
72、一种在哺乳动物内选择性制备蛋白质的方法，该方法包括在哺乳动物内转录含有无义突变的基因；以及将有效量的本发明的化合物提供给所述哺乳动物，其中所述蛋白质通过所述哺乳动物制得。


图1提供了表示用于评价无义突变抑制的基于荧光素酶测定用构建体的示意图；图2提供了表示为使荧光素酶蛋白质的N-端带有一个或多个表位标签而制造的荧光素酶构建体的示意图；图3提供了表示用于评价连读效率(readthrough efficiency)的基于荧光素酶测定用构建体的示意图。
具体实施例方式
翻译提前终止能够产生可能致死或能够引起多种疾病包括但不限于癌症、溶酶体贮积病、肌肉萎缩、囊性纤维化症和血友病的异常蛋白质。根据本发明，已经鉴定了抑制无义突变的化合物并提供了它们的使用方法。
A、本发明的化合物根据本发明的一个方面，提供了本发明的化合物，该化合物可用于抑制无义突变。在特定实施方式中，本发明的化合物特异性地抑制无义突变，而在其它实施方式中，本发明的化合物抑制无义突变的同时还治疗疾病，所述疾病包括但不限于癌症、溶酶体贮积病、肌营养不良、囊性纤维化症和血友病。
可用于抑制无义突变的本发明优选的化合物包括下式(1)所示的那些化合物或者式1所示化合物的药物学可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、多晶型物、外消旋物或立体异构体
其中W、X、Y和Z独立地选自N或C-Ra，其中Ra为氢或C1-C4的烷基，其中W、X、Y或Z中的至少一个为N；n为0、1、2或3；R1为氰基；任选地由一个或两个C1-C4烷基取代的氨基甲酰基；或由羟基、C1-C4烷基、或C1-C4烷氧基取代的羰基；R为羟基；卤素；任选地由一个或多个独立地选择的卤素或羟基取代的C1-C4烷基；任选地由一个或多个独立地选择的卤素或苯基取代的C1-C4烷氧基；任选地由一个或多个独立地选择的C1-C4烷基取代的C4-C8环烷基；-Rb基；-O-Rb基；任选地由一个或多个独立地选择的C1-C4烷基、氧代或-Rb基取代的五元到六元杂环；具有两个环结构的九元至十元杂环；由羟基、C1-C4烷基或C1-C4烷氧基取代的羰基；任选地由一个或两个C1-C4烷基取代的氨基甲酰基；硝基；氰基；任选地由羟基、C1-C4烷基或-Rb基取代的硫；任选地由羟基、C1-C4烷基或-Rb基取代的磺酰基；任选地由一个或两个独立地选择的C1-C4烷基、磺酰基、或羰基取代的氨基，其中，所述氨基磺酰基任选地由羟基、C1-C4烷基或-Rb基取代，并且其中氨基羰基任选地由C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、苯甲酸基或任选地由-Rb基取代的氨基所取代；或两个R基与它们连接的苯环一起形成苯并[1，3]间二氧杂环戊烯或2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英基，其中-Rb为任选地由下列一个或多个基团取代的C6-C8芳基羟基、卤素、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基或任选地由一个或多个C1-C4烷基取代的氨基。
在另一种式1的优选实施方式中，优选本发明可用于抑制无义突变的化合物包括这些式(1)化合物或者式1所示化合物的药物学可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、多晶型物、外消旋物或立体异构体，其中n为0、1或2；R1为氰基；氨基甲酰基；或由羟基取代的羰基；
R为独立地选自羟基；卤素；任选地由一个或多个独立地选择的卤素取代的C1-C4烷基；任选地由一个或多个独立地选择的卤素取代的C1-C4烷氧基；-Rb基；五元到六元杂环；任选地由一个或两个独立地选择的C1-C4烷基取代的氨基；或两个R基与它们连接的苯环一起形成苯并[1，3]间二氧杂环戊烯或2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英基；其中-Rb为C6-C8芳基。
如本领域技术人员认识到的一样，本发明某些化合物可以包括至少一个手性中心，并因此可以存在外消旋混合物或光学异构纯组合物。在此所用“光学异构纯”表示基本由单异构体组成优选由90％、92％、95％、98％、99％或100％的单异构体组成的组合物。
在此所用术语“烷基”一般指饱和直链、支链或环状结构烃基，包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、正己基、环己基、正庚基、辛基、正辛基等。在某些实施方式仲，烷基取代基可以是C1-C8、C1-C6或C1-C4烷基。在某些实施方式中，烷基可以任选地由一个或多个卤素或烷氧基取代。例如，烷基可以为卤代烷基包括单卤代烷基、双卤代烷基和三卤代烷基。
在此所用“烯基”一般指具有一个或多个碳碳双键的直链、支链或环状烯基，例如C2-C6烯基，包括3-丙烯基。
在此所用“芳基”指碳环芳基环状结构。包括在芳基范围内为具有5-20个碳原子的芳环。芳环结构包括具有一个或多个环结构的化合物，如单、双或三环化合物。芳基的例子包括苯基、甲苯基、蒽基(anthracenyl)、芴基、茚基、薁基(azulenyl)、菲基(phenanthrenyl)(即菲)以及萘基(即萘)环结构。在某些实施方式中，芳基可以任选地被取代。
在此所用“杂环”指其中环上的一个或多个原子即杂原子为不同于碳原子的原子的环状结构。杂原子一般为O、S或N原子。包括在该范围内的杂环可独立地选自O、N和S杂环结构。杂环结构可以包括具有一个或多个环结构的化合物，如单、双或三环化合物，可以为芳环，即所述环状结构可以为杂芳基。杂环基的例子包括吗啉基、吡咯烷酮基(pyrrolidinonyl)、吡咯烷基、哌啶酮基、哌嗪基、乙内酰脲基、戊内酰胺基(valerolactamyl)、环氧乙烷基(oxiranyl)、氧杂环丁烷基(oxetanyl)、四氢呋喃基、四氢吡喃基、四氢吡啶基、四氢嘧啶基(tetrahydroprimidinyl)、四氢噻吩基或四氢噻喃基等。在某些实施方式中，杂环可以选择性被取代。
在此所用“杂芳环”指环中的一个或多个原子为不同于碳元素的杂原子的芳环结构。杂原子典型的为O、S或N原子。包括在杂芳基范围内的可独立选择的是O、N和S杂芳环结构。环结构可以包括具有一个或多个环结构的化合物，如单-、双-或三环化合物。在某些实施方式中，杂芳基可以选自含有两个或更多个杂原子、三个或更多个杂原子或者四个或更多个杂原子的杂芳基。杂芳基环结构可以选自那些含有五个或更多个原子、六个或更多个原子、八个或更多个原子的杂芳基环结构。在优选实施方式中，杂芳基包括5-10个原子。杂芳环结构的例子包括吖啶、苯并咪唑、苯并噁唑、苯并间二氧杂环戊烯(benzodioxole)、苯并呋喃、1，3-二嗪、1，2-二嗪、1，2-二唑、1，4-二氮萘、呋喃、呋咱(furazan)、咪唑、吲哚、异噁唑、异喹啉、异噻唑、噁唑、嘌呤、哒嗪、吡唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、吡咯、喹啉、喹喔啉、噻唑、噻吩、1，3，5-三嗪、1，2，4-三嗪、1，2，3-三嗪、四唑和喹唑啉。
在此所用“烷氧基”一般指具有-O-R结构的基团。在某些实施方式中，R可以为烷基，如C1-C8烷基、C1-C6烷基或C1-C4烷基。在某些实施方式中，烷氧基的R基可以任选地由至少一个卤素取代。例如，烷氧基的R基可以为卤代烷基，即卤代烷氧基。
卤素取代基可以独立地选自卤素如氟、氯、溴、碘和砹。
为了本发明的目的，包括优选的实施方式，当本发明的化合物含有一个或多个官能团或取代基时，出现在公开的化合物的任何位置的各个官能团或取代基可以独立地选择，并且可以适当地独立地被取代。另外，在本发明分子任何位置阐明的更概括性的(generic)取代基应该理解为该概括性取代基可以被更特定的取代基代替，并且所得分子也在本发明分子范围内。
参照式1，在一种实施方式中，R优选在间位和/或对位，并且优选为卤素、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基、任选地由一个或多个C1-C4烷基取代的氨基、-Rb基团、吡咯基、咪唑基、或两个R基与它们连接的苯环一起形成苯并[1，3]间二氧杂环戊烯或2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英基。优选的R基团包括下表中所示基团。
在式1的一种实施方式中，R优选为卤素、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基、任选地由一个或多个C1-C4烷基取代的氨基、-Rb基团、五元到六元杂环、或两个R基与它们连接的苯环一起形成苯并[1，3]间二氧杂环戊烯或2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英基。
在式1的一种实施方式中，R为卤素。在式1的另一种实施方式中，R为氟、氯或溴。
在式1的一种实施方式中，R为五元到六元杂环。在式1的另一种实施方式中，R为包括一个或多个氮的五元杂环。在式1的一种实施方式中，R为包括一个氮的五元杂环。在式1的一种实施方式中，R为包括两个氮的五元杂环。在式1的一种实施方式中，R为包括三个氮的五元杂环。在式1的一种实施方式中，R为包括一个氧的五元杂环。在式1的一种实施方式中，R为包括两个氧的五元杂环。在式1的一种实施方式中，R为包括三个氧的五元杂环。在式1的另一种实施方式中，R为包括一个或几个氧和一个或几个氮的五元杂环。
在式1的另一种实施方式中，R为包括一个或多个氮的六元杂环。在式1的一种实施方式中，R为包括一个氮的六元杂环。在式1的一种实施方式中，R为包括两个氮的六元杂环。在式1的一种实施方式中，R为包括三个氮的六元杂环。在式1的一种实施方式中，R为包括一个氧的六元杂环。在式1的一种实施方式中，R为包括两个氧的六元杂环。在式1的一种实施方式中，R为包括三个氧的六元杂环。在式1的另一种实施方式中，R为包括一个或几个氧和一个或几个氮的六元杂环。
在式1的实施方式中，特别优选的R基团包括下表中所示基团。
在式1的实施方式中，n为2并且两个R基团均为相同的基团。
在式1的实施方式中，n为3并且三个R基团均为相同的基团。
在式1的另一种实施方式中，R1优选在间位或对位，并且优选为氰基、氨基甲酰基或由羟基、C1-C4烷基或C1-C4烷氧基取代的羰基。在另一种实施方式中，特别优选的R1基团包括下表中所示基团。
在优选实施方式中，W、Y和Z各自为N，并且X为C-Ra(式1-A) 参照式1-A，在实施方式中，R1优选为羧基，并优选位于间位或对位。在式1-A的另一种优选实施方式中，Ra为氢。在式1-A的另一种优选实施方式中，R1为位于间位或对位的羧基，并且Ra为氢。在另一种实施方式中，Ra优选为氢且n优选为1或2。在另一种优选实施方式中，Ra为氢且n为1。在式1-A的另一种优选实施方式中，R1为位于间位或对位的羧基，Ra为氢，并且n为1或2。在式1-A的进一步优选实施方式中，R1为位于间位或对位的羧基，Ra为氢，并且n为1。R优选地独立选自卤素、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基或C1-C4烷氧基，并优选位于间位和/或对位上，更优选位于对位上。在另一种优选实施方式中，R独立地选自甲基、氟、甲氧基、乙氧基和三氟甲基。
在另一种优选实施方式中，Y和Z均为N，并且W和X均为C-Ra(式1-B)
参照式1-B，在优选实施方式中，Ra为氢，并且n为0、1或2。在另一种优选实施方式中，Ra为氢，并且n为1或2。在式1-B的进一步优选实施方式中，Ra为氢，并且n为1。
在式1-B的另一种实施方式中，R独立地选自卤素、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基、氨基或吡咯基，并且R位于间位和/或对位上，优选位于对位上。在一种优选实施方式中，R独立地选自卤素、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基和氨基，并且R优选位于间位和/或对位上，更优选位于对位上。在式1-B的进一步优选实施方式中，Ra为氢，n为1，并且R独立地选自卤素、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基和氨基。
在另一种优选实施方式中，R独立地选自氟、氯、氨基、甲基、异丙醇、叔丁基、甲基、三氟甲基、甲氧基、三氟甲氧基。在式1-B的进一步优选实施方式中，Ra为氢，n为1，并且R独立地选自氟、氯、氨基、甲基、异丙醇、叔丁基、甲基、三氟甲基、甲氧基、三氟甲氧基。
在另一种优选实施方式中，W和Y均为N，并且X和Z均为C-Ra(式1-C)
参照式1-C，在实施方式中，R1优选为羧基，并优选位于间位或对位。在式1-C的另一种实施方式中，Ra优选为氢，并且n为1或2。在式1-C的另一种实施方式中，Ra优选为氢，并且n优选为1。在一种实施方式中，R优选为C1-C4烷基，并优选位于间位和/或对位上，更优选为对位。在式1-C的一种优选实施方式中，R为甲基。在式1-C的另一种优选实施方式中，Ra优选为氢，n优选为1，并且R为C1-C4烷基。在式1-C的另一种优选实施方式中，Ra优选为氢，n优选为1，并且R为甲基。
在另一种优选实施方式中，W和Z均为N，并且X和Y均为C-Ra(式1-D) 参照式1-D，在优选实施方式中，R1为羧基，并优选位于间位或对位。在一种实施方式中，X为C-CH3并且Y为CH。在另一种实施方式中，X为CH并且Y为C-CH3。在式1-D的一种优选实施方式中，Ra优选独立地选自氢或C1-C4烷基，并且n优选为1或2。在式1-D的另一种优选实施方式中，Ra优选独立地选自氢或C1-C4烷基，并且n优选为1。
在进一步优选实施方式中，Ra独立地选自氢或甲基，并且n为1或2。在另一种优选实施方式中，Ra独立地选自氢或甲基，并且n为1。
在另一种优选实施方式中，W为N，并且X、Y和Z各自为C-Ra(式1-E)
参照式1-E，在一种实施方式中，R1优选为羧基，并优选位于间位或对位。在另一种实施方式中，Ra优选为氢，并且n优选为1或2。在优选实施方式中，Ra为氢，并且n为1。在式1-E的一种优选实施方式中，R优选独立地选自C1-C4烷基，并且位于间位和/或对位上，更优选位于对位上。在另一种实施方式中，Ra优选为氢，n优选为1，并且R优选为C1-C4烷基。在式1-E的另一种实施方式中，R优选独立地选自甲基或异丙基，并且位于间位和/或对位上，更优选位于对位上。在另一种实施方式中，Ra优选为氢，n优选为1，并且R优选为甲基或异丙基。
在另一种优选实施方式中，X为N，并且W、Y和Z各自为C-Ra(式1-F) 参照式1-F，在一种实施方式中，R1优选为羧基，并优选位于间位或对位。在式1-F的一种实施方式中，Ra优选为氢，并且n优选为1或2。在式1-F的一种优选实施方式中，Ra为氢，并且n为1。在另一种优选实施方式中，R优选独立地选自C1-C4烷基，并且优选位于间位和/或对位上，更优选位于对位上。在另一种优选实施方式中，Ra为氢，n为1，并且R为C1-C4烷基。在另一种优选实施方式中，R独立地选自甲基和异丙基，并且优选位于间位和/或对位上，更优选位于对位上。在另一种优选实施方式中，Ra为氢，n为1，并且R优选选自甲基和异丙基。
在另一种优选实施方式中，Y为N，并且W、X和Z各自为C-Ra(式1-G) 参照式1-G，在一种优选实施方式中，R1为羧基，并优选位于间位或对位。在另一种优选实施方式中，Ra优选为氢，并且n优选为1或2。在进一步优选实施方式中，Ra优选为氢，并且n优选为1。在一种优选实施方式中，R优选独立地选自C1-C4烷基，并且优选位于间位和/或对位上，更优选位于对位上。在另一种优选实施方式中，Ra为氢，n为1，并且R为C1-C4烷基。在一种优选实施方式中，R优选独立地选自甲基和异丙基，并且优选位于间位和/或对位上，更优选位于对位上。在另一种优选实施方式中，Ra为氢，n为1，并且R为甲基和异丙基。
在另一种优选实施方式中，Z为N，并且W、X和Y各自为C-Ra(式1-H) 参照式1-H，在一种优选实施方式中，R1优选为羧基，并优选位于间位或对位。在进一步优选实施方式中，Ra为氢，并且n优选为0或1。在一种优选实施方式中，n为1并且R为C1-C4烷基，并且R优选位于间位和/或对位上，更优选位于对位上。在另一种优选实施方式中，n为1，R为甲基或异丙基，并且R优选位于间位和/或对位上，更优选位于对位上。
在另一种实施方式中，本发明优选的化合物还包括式2的化合物或者式2所示化合物的药物学可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、多晶型物、外消旋物或立体异构体 其中W、X、Y和Z独立地选自N或C-Ra，其中Ra为氢或C1-C4的烷基；R1为氰基；任选地由一个或两个C1-C4烷基取代的氨基甲酰基；或由羟基、C1-C4烷基、或C1-C4烷氧基取代的羰基；R2独立地选自氢、卤素、C1-C4烷基或C1-C4卤代烷基；R3和R4独立地选自氢；卤素；C1-C4烷基；C1-C4卤代烷基；C1-C4烷氧基；C1-C4卤代烷氧基；任选地由一个或多个C1-C4烷基取代的氨基；-Rb基；吡咯基；咪唑基；或两个R基与它们连接的苯环一起形成苯并[1，3]间二氧杂环戊烯或2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英基，其中-Rb为任选地由下列一个或多个基团取代的C6-C8芳基羟基、卤素、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基或任选地由一个或多个C1-C4烷基取代的氨基。
参照式2，R1优选为氰基、氨基甲酰基、或羧基，并且优选在间位或对位上。在式2的一种实施方式中，优选R2、R3、和R4基团为独立地选自下表的基团。

在式2的一种优选实施方式中，W、Y和Z各自为N，并且X为C-Ra(式2-A) 参照式2-A，在优选实施方式中，R1优选为羧基，并优选位于间位或对位。在式2-A的另一种优选实施方式中，Ra和R2优选为氢。在式2-A的一种优选实施方式中，R3独立地选自氢、卤素和C1-C4烷氧基。在式2-A的另一种优选实施方式中，R3独立地选自氢、氟和甲氧基。在式2-A的一种优选实施方式中，R4为氢、卤素、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基或C1-C4烷氧基。在式2-A的另一种优选实施方式中，R4为氟、甲基、三氟甲烷、甲氧基或乙氧基。
在式2的另一种优选实施方式中，Y和Z均为N，并且W和X均为C-Ra(式2-B)
参照式2-B，在优选实施方式中，R1为羧基，并优选位于间位或对位。在式2-B的进一步优选实施方式中，Ra为氢。在式2-B的一种优选实施方式中，R2独立地选自氢、卤素、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基和C1-C4卤代烷氧基。在式2-B的另一种优选实施方式中，R2独立地选自氢、氟、氯、甲基、三氟甲基和三氟甲氧基。
在式2-B的一种实施方式中，R3优选独立地选自氢、卤素、C1-C4烷氧基和C1-C4卤代烷氧基。在式2-B的一种优选实施方式中，R3独立地选自氢、氟、氯、甲氧基和三氟甲氧基。
在式2-B的一种实施方式中，R4为氢、卤素、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基、氨基或吡咯基。在式2-B的另一种实施方式中，R4优选为氢、卤素、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基或氨基。在式2-B的一种优选实施方式中，R4为氢、氟、氯、甲基、异丙基、叔丁基、三氟甲基、甲氧基、三氟甲氧基或氨基。
在式2的另一种优选实施方式中，W和Y均为N，并且X和Z均为C-Ra(式2-C)
参照式2-C，在优选实施方式中，R1为羧基，并优选位于间位或对位。在式2-C的一种优选实施方式中，Ra为氢。在式2-C的另一种优选实施方式中，R3独立地选自氢或C1-C4烷基。在式2-C的进一步优选实施方式中，R3独立地选自氢或甲基。在式2-C的另一种优选实施方式中，R4为氢或C1-C4烷基。在式2-C的进一步优选实施方式中，R4为氢或甲基。
在式2的另一种优选实施方式中，W和Z均为N，并且X和Y均为C-Ra(式2-D)
参照式2-D，在一种实施方式中，R1优选为羧基，并优选位于间位或对位。在式2-D的另一种实施方式中，Ra优选独立地选自氢或甲基。在一种实施方式中，X为C-CH3并且Y为CH。在另一种实施方式中，X为CH并且Y为C-CH3。
在式2-D的一种实施方式中，R2优选独立地选自氢或卤素。在式2-D的一种优选实施方式中，R2独立地选自氢或氟。在式2-D的一种实施方式中，R3优选独立地选自氢、卤素、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基或与R4及R3和R4所连接的苯环一起形成苯并[1，3]间二氧杂环戊烯或2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英基。在式2-D的另一种实施方式中，R3独立地选自氢、卤素、C1-C4烷氧基或与R4及R3和R4所连接的苯环一起形成苯并[1，3]间二氧杂环戊烯或2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英基。在式2-D的一种优选实施方式中，R3优选独立地选自氢、氟、甲基、三氟甲基、甲氧基或与R4及R3和R4所连接的苯环一起形成苯并[1，3]间二氧杂环戊烯或2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英基。
在式2-D的一种实施方式中，R4优选为氢、卤素、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基、任选地由一个或两个C1-C4烷基取代的氨基、-Rb基、咪唑基、吗啉基、或与R3及R3和R4所连接的苯环一起形成苯并[1，3]间二氧杂环戊烯或2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英基。在式2-D的另一种实施方式中，R4优选为氢、卤素、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基、任选地由一个或两个C1-C4烷基取代的氨基、-Rb基、咪唑基或与R3及R3和R4所连接的苯环一起形成苯并[1，3]间二氧杂环戊烯或2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英基。在式2-D的一种优选实施方式中，R4选自下列基团氟、溴、甲基、异丙基、三氟甲基、甲氧基、三氟甲氧基、苯基、咪唑基、吗啉基、以及由两个甲基取代的氨基。
在式2的另一种优选实施方式中，W为N，并且X、Y和Z各自为C-Ra(式2-E) 参照式2-E，在一种实施方式中，R1优选为羧基，并优选位于间位或对位。在式2-E的另一种实施方式中，Ra、R2和R3优选为氢。在式2-E的一种优选实施方式中，R4为C1-C4烷基。在式2-E的另一种优选实施方式中，R4为甲基或异丙基。
在式2的另一种优选实施方式中，X为N，并且W、Y和Z各自为C-Ra(式2-F)
参照式2-F，在一种实施方式中，R1优选为羧基，并优选位于间位或对位。在式2-F的一种优选实施方式中，Ra、R2和R3优选为氢。在式2-F的另一种优选实施方式中，R4为C1-C4烷基。在式2-F的另一种优选实施方式中，R4为甲基或异丙基。
在式2的另一种优选实施方式中，Y为N，并且W、X和Z各自为C-Ra(式2-G) 参照式2-G，在一种实施方式中，R1优选为羧基，并优选位于间位或对位。在式2-G的一种优选实施方式中，Ra、R2和R3优选为氢。在式2-G的另一种优选实施方式中，R4为C1-C4烷基。在式2-G的另一种优选实施方式中，R4为甲基或异丙基。
在式2的另一种优选实施方式中，Z为N，并且W、X和Y各自为C-Ra(式2-H)
参照式2-H，在一种实施方式中，R1优选为羧基，并优选位于间位或对位。此外，在式2-H的一种优选实施方式中，Ra、R2和R3优选为氢。在另一种优选实施方式中，R4为氢或C1-C4烷基。在另一种优选实施方式中，R4为氢或甲基或异丙基。在进一步优选实施方式中，R4为氢。在另一种优选实施方式中，R4为甲基或异丙基。
本发明的优选化合物包括以下化合物








尤其优选的化合物为化合物编号10、33、35、36、37、40、42、43、56、60、63、64、65、66和71。
列出上述化合物仅仅是为了提供可以用于本发明方法的例子。基于上述直接公开，本领域技术人员将认识到的也包括在本发明权利要求范围内的其它化合物可用于在此所述的方法中。
B、本发明化合物的制备本发明的化合物可以以本领域公知的任何方式制备。通过举例，本发明的化合物可以根据下述关于单个吖嗪环核心结构的通用路线进行制备。例如，式1-A和式2-A的三嗪化合物可以按照下述路线A所示的方法制备 路线A根据路线A，式A1的苯甲酰胺底物用式(RN)2NCH(O烷基)2的试剂处理，其中RN通常为小烷基，或者两个RN基团一起形成五元或六元环(例如，吡咯烷、哌嗪、吗啉等)；O烷基为小烷氧基基团例如甲氧基或乙氧基。所述缩合反应既可以通过纯甲酰胺乙缩醛试剂，又可以在诸如乙醇或乙酸的较高沸点溶剂中进行，以得到式A2的苯甲酰基甲脒产物。
在单独的反应中，式A3的氰基苯甲酸试剂可以转变成式A4的酯化合物。RP基团可以代表直链或支链烷基。所述酯化反应为本领域技术人员公知，包括但不限于a)转化成苯甲酰氯，然后用相应的式RpOH的醇试剂在碱存在下处理；b)用如碳二亚胺的脱水试剂原位激活；或c)应用Mitsunobu条件，使用膦化合物和重氮羧酸酯(diazocarboxylate)试剂。优选Rp越大越好，可以为叔丁基，可以通过酸催化的反应与异丁烯结合，或者如上所述通过叔丁醇和苯甲酰氯缩合。在另一种实施方式中，固体支持物可以用作Rp，这样有助于中间产物的纯化。可以使用组合合成化学中常用的固体支持物，包括Wang树脂、Janda树脂等。
式A4化合物中的腈基然后可转化为脒基以得到式A5的化合物。这种转化可以通过用诸如六甲基二硅叠氮(hexamethyldisilazide)锂、六甲基二硅叠氮钠或六甲基二硅叠氮钾的试剂在诸如四氢呋喃、1，4-二噁烷的非质子溶剂中，在从零下到回流的温度范围内处理完成。然后可使用水处理(aqueous workup)和中和作用移除硅基(silicon group)并产生脒产物。其他这种转换可以包括酸催化的腈基氨化作用。
式A2和A5的化合物然后可以允许经历环化缩合反应形成式A6化合物中的三嗪环。该反应可以在诸如乙酸、甘醇二甲醚等较高沸点的溶剂中酸催化。该反应还可以通过使用微波反应器加速。如果需要，合成的最终步骤一般包括式A6化合物中的羧酸酯基团的脱保护。对非立体受阻(sterically-unhindered)的Rp基团，优选用氢氧化物盐(如氢氧化锂或氢氧化钠)在诸如乙醇、四氢呋喃等的溶剂中，通常在少量水存在下、于环境温度至高温的条件下处理完成。小的Rp基团(尤其是甲基)可以用诸如碘化锂的亲核试剂，在诸如二甲基亚砜或吡啶的极性溶剂中去除。最后，诸如叔丁基的对酸敏感的Rp基团可以在先前的反应(即得到A6)条件下断裂以直接提供羧酸，如果必要，采用强酸条件。
路线B中展示了用于嘧啶(式1-B和式2-B)合成中的通用方法。
路线B式B1的苯乙酮底物可以与甲酰胺乙缩醛试剂以与A1到A2转化相似的方式反应，得到式B2的产物。在单独的反应中，式B3的苄腈化合物可以以与A4到A5的转化类似的方式转化为式B4的脒。然后，式B2和式B4化合物的缩合反应可以产生式1-B或式2-B的嘧啶产物。该反应可以在碱(例如氢化钠、乙醇钠)存在下，在极性溶剂(例如乙醇或1，4-二噁烷)中在较高温度完成。通过式B5的腈化合物的反应，例证了R1基团的相互转换是可能的。该腈可以用强酸(盐酸或硫酸)的水溶液水解成羧酰胺(carboxamide)以得到式B6的化合物。同样地，碱性条件(例如，氢氧化钠)可以将所述腈基水解成式B7产物中的羧基。
路线C中展示了用于式1-C和式2-C的4，6-二芳基嘧啶合成中的通用方法。
路线C式C1的4，6-二卤代嘧啶可以用于与两个芳基基团的硼酸衍生物的连续Suzuki反应，其中X代表可以在芳基交叉偶联反应中被代替的基团，例如氯、溴、碘或三氟甲磺酰基。为了提高总转化的选择性，可能必需使用具有不同卤素的底物(即X≠X′)。另一途径可以包括使用为被掩蔽的卤素的X′基团；例如可以通过重氮化作用然后被卤素代替而转化成卤素的芳基氨基。在式C2或C3的化合物不能市售获得的情况下，它们可以通过金属-卤素交换(溴或碘与锂、镁、锌等)、然后用诸如三甲基硼酸酯或三异丙基硼酸酯的硼源淬灭(quenching)来制备。
所述交叉偶联反应可以通过诸如四(三苯基膦)、乙酸钯、二(三苯基膦)钯二氯化物的化合物，任选地加入诸如三苯基膦、BINAP等的膦配体而催化。所述反应还要求诸如碳酸钠、三磷酸钾或氟化铯的碱的存在。对Suzuki-型交叉偶联反应适用的试剂包括乙醇、甲苯、1，4-二噁烷或甘醇二甲醚，并且所述反应优选在无氧条件下进行，因此溶剂优选地脱气。所述中间产物单偶联化合物的分离有利于最终产物纯化。并且，如果需要，在最后一步可以移除羧酸酯保护基团，以得到式1-C和2-C的终产物。
如下面路线D中所示，在路线B中讨论的通用方法可以适用于式1-D和式2-D的相反的嘧啶区域异构体(regioisomer)。
路线D式D1的苯乙酮可以用于制备式D2的氨基丙烯酰化合物，D2然后可以与式D3的脒试剂(其合成上面已讨论)缩合产生式D4的嘧啶。如前面，如果需要，式1-D和式2-D的化合物中受保护的羧酸酯然后可以用于释放游离的羧基。
芳基交叉偶联途径与上述路线C类似，可以用于制备式1-E和式2-E的吡啶化合物(参见下面路线E)。
路线E式E1的吡啶试剂可以用作起始物质，其中X代表在芳基交叉偶联反应中能被代替的基团，例如氯、溴、碘或三氟甲磺酰基。所述偶联反应可以与诸如式E2的硼酸的试剂进行。在式E2化合物不能市售获得的情况下，它们可以通过金属-卤素交换(溴或碘与锂、镁、锌等)、然后与诸如三甲基硼酸酯或三异丙基硼酸酯的硼源骤冷制备。所述交叉偶联反应可以通过诸如四(三苯基膦)、乙酸钯、或二(三苯基膦)钯二氯化物的化合物，任选地加入诸如三苯基膦、BINAP等的膦配体而催化。所述反应还要求诸如碳酸钠、三磷酸钾或氟化铯的碱的存在。对Suzuki-型交叉偶联反应适用的试剂包括乙醇、甲苯、1，4-二噁烷或甘醇二甲醚。并且所述反应优选在无氧条件下进行，因此溶剂优选脱气。
一旦获得式E3的吡啶化合物，氮原子可以氧化成式E4的吡啶N氧化物化合物。用于这种转换的试剂包括间氯过苯甲酸(perbenzoic acid)或过氧化氢(加上各种添加剂)。然后所述氧化物可进行重排反应以产生式E5的化合物。用于这种转换的试剂包括磷酰氯、三溴化磷或三氟甲磺酸三甲基甲硅烷基酯。X′基团代表卤素或拟卤素(Cl、Br、OTf)，并且取决于所用的吡啶氧化物激活反应条件以及试剂。如果反应提供了2-吡啶酮，则可将其容易地转化成2-X′-吡啶；例如吡啶酮与磷酰氯反应得到2-氯吡啶。然后所述2-卤代吡啶可以用在与式E6的硼酸化合物的交叉偶联反应中，如上所述用Suzuki型钯催化的反应以产生式E7的2，4-二芳基吡啶化合物。如果需要，然后羧酸酯可以如上所述脱保护以产生式1-E和式2-E的终产物。
另一种双重交叉偶联路线与上述路线E相似，可用于式1-F和式2-F的吡啶化合物的合成(路线F)。
路线F式F1的3，5-二芳基吡啶与两种芳基的硼酸衍生物(式F2和式F3)用于连续Suzuki反应中。中间体单偶联的化合物的分离有利于最终产品纯化。为了提高总转化的选择性，需要使用具有不同卤素的底物(即X≠X′)。另一途径可以包括使用为被掩蔽的卤素的X′基团；例如芳基氨基可以通过重氮化作用然后被卤素代替而转化成卤素。如前所述，用于偶联反应的催化剂主要为Pd(0)或Pd(2)基。同样，如果需要，可以在最后步骤去除羧酸酯保护基团产生式1-F和式2-F的终产物。
式1-G和式2-G的吡啶化合物(路线G)可以用类似于式1-F和式2-F(路线F)的区域异构体的合成方式制备。
路线G制备式1-G和式2-G(路线G)的吡啶3，5-异构体的方法能够用于式1-H和式2-H(路线H)的2，6-异构体。如前所述，取决于怎样更方便，两个偶联反应能以任何顺序进行。
路线H在某些优选实施方式中，可以使用本领域任何方法将本发明化合物拆分成光学纯组合物或合成为光学纯组合物。通过实例的方式，本发明的化合物可以如下拆分通过对映体混合物的直接结晶，通过对映体的非对映体盐的形成，通过非对映体的形成和分离，或者通过外消旋混合物的酶拆分。
如本领域技术人员所认识到的一样，这些和其它反应方法可以用于制备本发明的化合物。对上述路线和方法的各种改变对于本领域技术人员来说是很显然的，本发明并不限于通过特定方法制备本发明的化合物。
C、本发明的方法本发明的另一方面提供了用于抑制可能与无义突变相关的翻译提前终止的方法，以及用于预防或治疗疾病的方法。在优选实施方式中，所述疾病与mRNA突变特别是无义突变相关。示例性的疾病包括但不限于癌症、溶酶体贮积症、肌营养不良、囊性纤维化症、血友病、大疱性表皮松解症以及典型的晚婴儿型神经元蜡样质脂褐素沉积病。在该实施方式中，提供了用于治疗癌症、溶酶体贮积症、肌营养不良、囊性纤维化症、血友病、或典型的晚婴儿型神经元蜡样质脂褐素沉积病的方法，该方法包括对有此需要的患者给药治疗有效量的至少一种本发明的化合物。
在一种实施方式中，本发明涉及用于增加一种或多种特异性、功能性蛋白表达的方法。本发明的任何化合物能用于特异性地增加功能性蛋白的表达。在另一种实施方式中，当翻译提前终止通过对有此需要的患者给药治疗有效量的至少一种本发明的化合物而被抑制时，发生了功能性蛋白表达的特异性增加。在优选实施方式中翻译提前终止与mRNA中的无义突变相关。在另一种实施方式中，当mRNA衰变(decay)在患者中减少时，发生了功能性蛋白表达的特异性增加。在优选实施方式中，患者异常由突变介导的mRNA衰变引起。在特别优选的实施方式中，突变介导的mRNA衰变为无义突变的结果。本发明的方法不限于任何特殊的理论。
本发明包括治疗和预防患者可通过抑制翻译提前终止、无义介导的mRNA衰变，或翻译提前终止和无义介导的mRNA衰变而改善的疾病或病症的方法，所述方法包括向需要这类治疗或预防的患者给药治疗有效量的本发明化合物。
在一种实施方式中，本发明包括治疗或预防与呈现翻译提前终止、无义介导的mRNA衰变，或翻译提前终止和无义介导的mRNA衰变的基因相关的任何疾病。在一种实施方式中，所述疾病部分地归因于由提前终止密码子引起的基因表达的缺乏或降低。可能呈现翻译提前终止和/或无义介导的mRNA衰变的基因以及与翻译提前终止和/或无义介导的mRNA衰变相关的疾病的具体实例见2002年6月21日提交的美国临时专利申请60/390747，题目为“Methods For Identifying Small Molecules ThatModulate Premature Translation Termination And Nonsense Mediated mRNA Decay”；以及于2003年6月23日提交的国际申请PCT/US03/19760。这两篇一并完整引入作为参考。
可以通过抑制翻译提前终止、无义介导的mRNA衰变，或翻译提前终止和无义介导的mRNA衰变而改善的疾病包括但不限于遗传疾病、躯体疾病(somaticdiseases)、癌症、自身免疫性疾病、血液病、胶原疾病、糖尿病、神经退化疾病、增殖疾病(proliferative diseases)、心血管病、肺病、炎症性疾病或中枢神经系统疾病。
在一种实施方式中，要通过对有此需要的患者给药治疗有效量的本发明的化合物进行治疗或预防的疾病包括但不限于淀粉样变性病、血友病、阿尔茨海默病、家族黑蒙性痴呆、尼曼匹克症、动脉粥样硬化、巨人症、侏儒症、甲状腺机能减退、甲状腺机能亢进、衰老症、肥胖症、帕金森症、囊性纤维化症、肌营养不良、心脏病、肾结石、共济失调性毛细血管扩张症、家族性高胆固醇血症、视网膜色素变性、杜兴肌营养不良、大疱性表皮松解症和马凡氏综合症。在一种实施方式中，所述疾病与无义突变相关。
在一种实施方式中，本发明所述化合物可用于治疗或预防自身免疫疾病。在一种实施方式中，所述自身免疫疾病与无义突变相关。在优选实施方式中，所述自身免疫性疾病为类风湿性关节炎或移植物抗宿主病。
在另一种实施方式中，本发明所述化合物可用于治疗或预防血液病。在一种实施方式中，所述血液病与无义突变相关。在优选实施方式中，所述血液病为血友病、冯·维勒布兰德病、共济失调性毛细血管扩张症、β地中海贫血症或肾结石。
在另一种实施方式中，本发明所述化合物可用于治疗或预防胶原疾病。在一种实施方式中，所述胶原疾病与无义突变相关。在优选实施方式中，所述胶原疾病为成骨不全症或硬化。
在另一种实施方式中，本发明所述化合物可用于治疗或预防糖尿病。在一种实施方式中，所述糖尿病与无义突变相关。
在另一种实施方式中，本发明所述化合物可用于治疗或预防炎症性疾病。在一种实施方式中，所述炎症性疾病与无义突变相关。在优选实施方式中，所述炎症性疾病为关节炎、类风湿性关节炎或骨关节炎。
在另一种实施方式中，本发明所述化合物可用于治疗或预防中枢神经系统疾病。在一种实施方式中，所述中枢神经系统疾病与无义突变相关。在一种实施方式中，所述中枢神经系统疾病为神经退化疾病。在优选实施方式中，所述中枢神经系统疾病为多发性硬化、肌营养不良、杜兴肌营养不良、阿尔茨海默病、家族黑蒙性痴呆、尼曼匹克症、晚婴儿型神经元蜡样质脂褐素沉积病(LINCL)或帕金森症。
在另一种实施方式中，本发明所述化合物可用于治疗或预防癌症，特别是人类癌症。在优选实施方式中，所述癌症为头和颈、眼、皮肤、口、咽喉、食管、胸、骨、血、肺、结肠、乙状结肠、直肠、胃、前列腺、乳房、卵巢、肾、肝、胰腺、脑、肠、心脏或肾上腺的癌症。在一种实施方式中，所述癌症为实体瘤。在一种实施方式中，所述癌症与无义突变相关。在另一种实施方式中，所述癌症与遗传的无义突变相关。在另一种实施方式中，所述癌症与体细胞突变相关。不受任何理论的限制，本发明的化合物的抗癌用途可能与其抗p53基因突变的作用有关。
在一种实施方式中，所述癌症不是血液癌。在另一种实施方式中，所述癌症不是白血病。在另一种实施方式中，所述癌症不是多发性骨髓瘤。在另一种实施方式中，所述癌症不是白血病。在另一种实施方式中，所述癌症不是前列腺癌。
在另一种优选实施方式中，本发明所述化合物可用于治疗或预防与肿瘤抑制基因变异有关的癌症。这种基因包括但不限于PTEN、BRCA1、BRCA2、Rb和p53基因。在一种实施方式中，所述突变为遗传突变。在另一种实施方式中，所述突变为体细胞突变。本发明的方法可特别用于治疗或预防与肿瘤抑制基因中的无义突变相关的癌症。在优选实施方式中，本发明的方法可特别用于治疗或预防与p53基因相关的归因于p53在细胞凋亡中的作用的癌症。不受任何理论的限制，认为通过用有效量的本发明化合物接触细胞导致无义突变的抑制，又允许全长p53的产生，从而能诱导细胞凋亡。无义突变已经在p53基因中鉴定，并且与癌症相关。p53基因中的几个无义突变已经被鉴定出来(参见例如Masuda等，2000，Tokai J Exp Clin Med.25(2)69-77；Oh等，2000，Mol Cells 10(3)275-80；Li等，2000，Lab Invest.80(4)493-9；Yang等，1999，Zhonghua Zhong Liu Za Zhi 21(2)114-8；Finkelstein等，1998，Mol Diagn.3(1)37-41；Kajiyama等，1998，Dis Esophagus.11(4)279-83；Kawamura等，1999，LeukRes.23(2)115-26；Radig等，1998，Hum Pathol.29(11)1310-6；Schuyer等，1998，Int JCancer 76(3)299-303；Wang-Gohrke等，1998，Oncol Rep.5(1)65-8；Fulop等，1998，JReprod Med.43(2)119-27；Ninomiya等，1997，J Dermatol Sci.14(3)173-8；Hsieh等，1996，Cancer Lett.100(1-2)107-13；Rall等，1996，Pancreas.12(1)10-7；Fukutomi等，1995，Nippon Rinsho.53(11)2764-8；Frebourg等，1995，Am J Hum Genet.56(3)608-15；Dove等，1995，Cancer Surv.25335-55；Adamson等，1995，Br J Haematol.89(1)61-6；Grayson等，1994，Am J Pediatr Hematol Oncol.16(4)341-7；Lepelley等，1994，Leukemia.8(8)1342-9；McIntyre等，1994，J Clin Oncol.12(5)925-30；Horio等，1994，Oncogene.9(4)1231-5；Nakamura等，1992，Jpn J Cancer Res.83(12)1293-8；Davidoff等，1992，Oncogene.7(1)127-33以及Ishioka等，1991，Biochem Biophys Res Commun.177(3)901-6；其公开全文并入此处作为参考)。与p53基因相关的编码翻译提前密码子的任何疾病，包括但不限于上述引用参考文献中所述的无义突变，均能通过本发明化合物得到治疗或预防。
在其它的实施方式中，要通过对有此需要的患者给药有效量的本发明化合物进行治疗或预防的疾病包括但不限于实体瘤诸如肉瘤、癌、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管源性癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、维尔姆斯瘤、子宫颈癌、睾丸瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、卡波西肉瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤、视网膜母细胞瘤、血液产生的肿瘤或多发性骨髓瘤。
在另一种实施方式中，要通过对有此需要的患者给药有效量的本发明的化合物进行治疗或预防的疾病包括但不限于血液产生的肿瘤，如急性成淋巴细胞性白血病、急性B淋巴细胞白血病、急性T淋巴细胞白血病、急性原粒细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、急性单核细胞性白血病、急性红白血病、急性成巨核细胞白血病、急性髓单核细胞白血病、急性非淋巴细胞白血病、急性未分化型白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病或多发性骨髓瘤。参见例如，Harrison′s Principles of Internal Medicine，Eugene Braunwald等，eds.，pp.491-762(15thed.2001)。
在另一种实施方式中，本发明包括对患有实体瘤和血液肿瘤的人类的治疗。
在优选实施方式中，本发明包括一种治疗或预防可通过调节翻译提前终止、无义介导的mRNA衰变，或翻译提前终止和无义介导的mRNA衰变而改善的疾病，或改善一种或多种与之相关的症状的方法，该方法包括使细胞与治疗有效量的本发明化合物接触。包括在本发明方法中的细胞包括动物细胞、哺乳动物细胞、细菌细胞以及病毒感染的细胞。在一种实施方式中，所述无义突变为遗传突变(即在祖DNA(progenitor DNA)中存在无义密码子)。在另一种实施方式中，所述无义密码突变为体细胞突变(即所述无义密码子自发或通过诱变产生)。
在一些实施方式中，本发明化合物作为对抗与翻译提前终止、无义介导的mRNA衰变，或翻译提前终止和无义介导的mRNA衰变相关的疾病的预防措施向对象给药，所述对象包括但不限于植物、爬行动物、鸟类、两栖动物或优选哺乳动物更优选人类。
在优选的实施方式中，首先确定患者患有与翻译提前终止和/或无义介导的mRNA衰变相关的疾病。在另一种实施方式中，患者经过筛选过程以确定存在无义突变，所述筛选过程包括通过可接受无义突变筛选测定，筛选对象或从所述对象中提取的细胞的步骤。在优选实施方式中，所述患者的DNA能通过测定其序列或进行DNA印迹(Southern Blot)、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)、应用短串联重复(short tandem repeat，STR)或限制性片段长度多态性(RFLP)分析，以确定是否在患者的DNA中存在无义突变。在一种实施方式中，通过与祖DNA对比确定所述无义突变是遗传突变还是体细胞突变。选择性地，能通过蛋白质印迹或其他免疫测定法，测定患者表达的无义突变蛋白水平是否变化来确定所述无义突变是遗传突变还是体细胞突变。在另一种实施方式中，所述患者为在子宫中接受无义突变存在筛选的未出生的孩子。本发明的化合物既可以在出生前也可以在出生后给药。在相关的实施方式中，所述治疗个人化，其中筛选患者进行无义突变筛选测定，并通过给药本发明化合物治疗；特别地，可以用例如依照疾病类型、细胞类型以及有问题的基因而定的特别适于所述的突变的化合物治疗所述患者。这种方法为本领域技术人员公知。
在另一种实施方式中，用例如如上所述的方法(即细胞的DNA能通过测定其序列或进行DNA印迹、聚合酶链式反应(PCR)、应用短串联重复(STR)或限制性片段长度多态性分析(RFLP)，以确定是否在患者的DNA中存在无义突变；细胞的RNA可以通过定量实时PCR以测定转录丰度)筛选出翻译提前终止和/或无义介导的mRNA衰变的细胞(例如动物细胞、哺乳动物细胞、细菌细胞、植物细胞以及病毒感染的细胞)。
本发明的具体方法还包括给药另外的治疗剂(即不同于本发明化合物的治疗剂)。在本发明的特定实施方式中，本发明的化合物可以与至少一种其他治疗剂结合使用。治疗剂包括但不限于非阿片类镇痛药、非甾体抗炎剂、甾类化合物、止吐剂、β-肾上腺素能阻滞剂、抗惊厥剂、抗抑郁药、Ca2+通道阻滞剂、抗癌剂及抗生素以及它们的混合物。
在特定实施方式中，本发明的化合物可以与抗癌剂联合给药或配制。合适的抗癌剂包括但不限于烷化剂、氮芥、叶酸拮抗剂(folate antagonists)、嘌呤拮抗剂、嘧啶拮抗剂、纺锤体抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、细胞凋亡诱导剂、血管生成抑制剂、鬼臼毒素、亚硝基脲、顺铂、卡铂、干扰素、天冬酰胺酶(asparginase)、他莫昔芬、亮丙瑞林、氟他米特、甲地孕酮、丝裂霉素、博来霉素、阿霉素、依立替康和紫杉酚。
在特定实施方式中，本发明的化合物可以与抗生素联合给药或配制。在特定实施方式中，所述抗生素为氨基糖苷(例如妥布霉素)、头孢菌素(例如头孢氨苄、头孢拉定、头孢呋新、头孢丙烯、头孢克洛、头孢克肟或头孢羟氨苄)、克拉霉素(例如克拉霉素)、大环内酯(例如红霉素)、青霉素(例如青霉素V)或喹诺酮(例如氧氟沙星、环丙沙星或诺氟沙星)。在优选实施方式中，所述抗生素具有抗绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)活性。
不受理论限制，认为本发明的方法通过抑制无义突变的联合机制起作用。在优选实施方式中，本发明方法包括给药治疗有效量的至少一种本发明的化合物例如式1所示的化合物。本发明化合物的相对活性可以通过本领域公知的任何方法测定，包括这里实施例2描述的测定。
本发明的化合物可以用体外荧光素酶无义突变抑制测定表征。荧光素酶测定包括在本发明的方法中。荧光素酶可以用作功能报道基因测定(只有蛋白有功能才产生光)，并且荧光素酶极端灵敏(光密度在nM范围与荧光素酶浓度成比例)。在一种实施方式中，本发明的测定为基于细胞的荧光素酶报道测定。在优选基于细胞的荧光素酶报道测定中，含有提前终止密码子(UGA、UAA或UAG)的荧光素酶报道构建体稳定转染入293人胚肾细胞中。
在本发明的另一个测定中，优选的测定为由兔网织红细胞溶胞产物和含有无义密码子的荧光素酶报道mRNA组成的生物化学测定。在本发明的另一个测定中，所述测定为由制备并优化的细胞提取物组成的生物化学测定(Lie & Macdonald，1999，Development 126(22)4989-4996以及Lie & Macdonald，2000，Biochem.Biophys.Res.Commun.270(2)473-481)。在生物化学测定中，含有提前终止密码子(UGA、UAA或UAG)的mRNA在体外翻译反应中用作报道基因，使用补加有tRNA、氯高铁原卟啉(hemin)、肌酸激酶、氨基酸、KOAc、Mg(OAc)2以及磷酸肌酸的兔网织红细胞溶胞产物。mRNA的翻译在病毒来源的前导序列中起始，因为不需要加帽的RNA，因此显著降低了测定的成本。使用T7启动子和MegaScript体外转录试剂盒(Ambion，Inc.；Austin，Texas)在体外制备合成mRNA。在本发明的测定中，添加已知的允许连读提前终止密码子的氨基糖苷庆大霉素导致增强的荧光素酶活性，并能用作内标。本发明的测定用于高通量筛选中。成百上千的化合物能够在本发明基于细胞的生物化学测定中筛选。在优选的方面，基于细胞的功能性测定与所述的测定类似。
本发明的化合物包括能提高特异性功能蛋白从包括提前终止密码子的mRNA分子表达的化合物。在一种实施方式中，本发明的化合物能优选抑制翻译提前终止。例如，如果突变产生UAA，则本发明的化合物能抑制该无义突变；但是如果突变产生UAG，则本发明的化合物不能抑制该无义突变。能发生的另一种非限定性的实例是，如果突变产生UAA并且在框内+1位置继之以胞嘧啶，则本发明的化合物能抑制该无义突变，但是如果突变产生UAA并且在框内+1位置继之以腺嘌呤，则本发明的化合物不能抑制该无义突变。
带有含UGA无义密码子荧光素酶基因的稳定细胞系可以用待测化合物处理。在此方面，细胞可以生长在补加有1％青霉素-链霉素(P/S)和10％胎牛血清的标准培养基中至70％铺满，并在处理前一天1∶1拆分。第二天，胰蛋白酶化细胞，并且在96孔组织培养皿的每一孔中加入40,000个细胞。制备每种化合物的系列稀释液，以产生跨越2个对数(30μM至0.3μM)的六个点的剂量响应曲线。二甲亚砜溶剂的终浓度保持恒定于每孔1％。用1％二甲亚砜处理后的细胞作为本底标准(backgroundstandard)，并且用庆大霉素处理后的细胞作为阳性对照。
为阐述特定遗传疾病中改变的mRNA上的无义抑制化合物(nonsense-suppressingcompound)的效果，可用本发明的化合物处理在1282氨基酸处(W 1282X)带有无义密码子的支气管上皮细胞系，并且用硫丙基喹啉(sulfopropylquinolinium，SPQ)测定监测作为cAMP激活的氯化物通道的囊性纤维化跨膜转导调节因子的功能(Yang等，Hum.Mol.Genet.2(8)1253-1261(1993)以及Howard等，Nat.Med.2(4)467-469(1996))。将在用本发明化合物处理的细胞中SPQ荧光的增加与用cAMP处理的细胞以及未经处理细胞的SPQ荧光进行比较。细胞中SPQ荧光的增加与CFTR介导的卤化物流出的刺激以及无义密码子连读的增加一致。全长CFTR从用本发明化合物处理后的含无义密码子的等位基因的表达证明，当用本发明化合物处理时，囊性纤维化细胞系提高了氯化物通道活性。
D、本发明化合物的代谢产物这里所述的化合物在体内的代谢产物同样落入本发明范围。这种产物可以源于主要归因于酶促过程的例如所给药的化合物的氧化、还原、水解、酰胺化、酯化等。因此，本发明包括通过如下方法产生的化合物，该方法包括使本发明的化合物与哺乳动物组织或哺乳动物接触足以产生该化合物的代谢产物的一段时间。这种化合物通常如下鉴定通过制备放射性标记的(例如C14或H3)本发明化合物，以可测剂量(高于约0.5毫克/千克)向诸如大鼠、小鼠、豚鼠、猴子的哺乳动物或者人给药，允许发生新陈代谢的足够的时间(通常约为30秒至30小时)，并且从尿、血或其他生物学样品中分离转化产物。这些产物由于被标记因此很容易分离(通过使用能结合在代谢产物上留存的表位的抗体分离其它物质)。所述代谢产物的结构以常规的方式鉴定，例如质谱(MS)或核磁共振(NMR)分析。一般而言，代谢产物的分析可以用本领域技术人员公知的与常规药物代谢研究相同的方法完成。所述转化产物，只要它们不在体内存在，即可用于本发明化合物治疗剂量的诊断测定，即使它们本身没有生物学活性。
E、本发明的药物组合物虽然可能以纯的本发明化合物给药，但是优选将化合物配制成药物组合物。从而，在本发明另一个方面，提供了用于本发明方法中的药物组合物。本发明的药物组合物可以根据特定的给药方式以及剂型，与诸如载体、溶剂、稳定剂、佐剂(adjuvant)、稀释剂等的药物学可接受的赋形剂—同配制。所述药物组合物一般应当配制成达到生理适合的pH，根据剂型以及给药途径，范围可以从pH约3至pH约11，优选pH约3至pH约7。在另一种实施方式中，本发明药物组合物的pH可以调节到pH约4至pH约7的范围。在可选的实施方式中，优选地调节pH的范围为pH约5至pH约8。
更具体地，本发明的药物组合物包括治疗或预防有效量的至少一种本发明化合物，以及一种或多种药物学可接受的赋形剂。任选地，本发明的药物组合物可以包括本发明化合物的组合，或可以包括可用于治疗癌症、糖尿病性视网膜病变、渗出性黄斑变性的第二活性成分。
例如用于非胃肠道或口服给药的本发明的制剂通常多为固体、液体溶液、乳剂或混悬剂，而用于肺给药的可吸入制剂一般为液体或粉末，一般优选粉末制剂。本发明优选的药物组合物还可以配制成冻干固体制剂，在给药前用生理学可接受的溶剂复溶。可选的本发明药物组合物可以配制成糖浆剂、乳膏、软膏剂、片剂等。
本发明的药物组合物能通过现有技术公知的任何药物传递途径向对象给药。具体的示例性给药途径包括口、眼(ocular)、直肠、颊、局部、鼻、眼(ophthalmic)、皮下、肌内、静脉内(推注和滴注)、脑内、经皮，以及肺部给药。
术语“药物学可接受的赋形剂”是指用于给药诸如本发明化合物的药物的赋形剂。该术语指任何可给药而没有过度毒性的药物赋形剂。药物学可接受的赋形剂部分地由所给药的具体组合物以及用于给药该组合物的具体方法决定。因此，本发明药物组合物存在广泛多样的适合的制剂(参见例如Remington′s PharmaceuticalSciences，18thEd.，Mack Publishing Co.，1990)。
合适的赋形剂可以是包括大型、代谢慢的大分子例如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、多聚氨基酸、氨基酸共聚物以及灭活病毒颗粒的载体分子。其他示例性的赋形剂包括抗氧化剂如抗坏血酸，螯合剂如EDTA，碳水化合物如糊精、羟烷基纤维素、羟烷基甲基纤维素、硬脂酸，液体如油、水、生理盐水、甘油和乙醇，润湿或乳化剂，pH缓冲物质等。脂质体也包括在药物学可接受的赋形剂的定义内。
本发明药物组合物可以配制成任何适于所欲给药方法的形式。当意欲用于口服使用时，可以制备例如片剂、锭剂、糖锭、水混悬剂或油混悬剂、非水溶液、可分散性粉末或颗粒(包括微粉化的颗粒或纳米颗粒)、乳剂、硬胶囊或软胶囊、糖浆剂、或酏剂。意欲口服使用的组合物可以根据本领域公知的任何制备药物组合物的方法制备，并且所述组合物可以含有一种或多种包括甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂的试剂以提供可口的制剂。
特别适于与片剂结合使用的药物学可接受的赋形剂包括例如诸如纤维素、碳酸钠或碳酸钙、乳糖、磷酸钠或磷酸钙的惰性稀释剂，诸如交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮、玉米淀粉或褐藻酸的崩解剂，诸如聚维酮、淀粉、明胶或阿拉伯胶的粘合剂，以及诸如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石的润滑剂。片剂可以不包衣，或者用包括微囊法的公知技术包衣以延迟在胃肠道中的崩解以及吸收，从而在较长的时期里提供持续作用。例如可以单独或与蜡一起使用诸如单硬酯酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯的时间延迟物质。
口服使用的制剂还可以为硬明胶胶囊，其中活性成分与例如纤维素、乳糖、磷酸钙或高岭土的惰性固体稀释剂混合，或者为软明胶胶囊，其中活性成分与例如甘油、丙二醇、聚乙二醇、花生油、液体石蜡或橄榄油的非水或油性介质混合。
在另一种实施方式中，本发明药物组合物可以配制为混悬剂，所述混悬剂包括与至少一种适于制备混悬剂的药物学可接受的赋形剂混合的本发明化合物。在另一种实施方式中，本发明的药物组合物可以通过加入适宜的赋形剂配制成适于制备混悬剂的可分散粉末以及颗粒。
适合用于混悬剂的赋形剂包括助悬剂如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、西黄蓍胶、阿拉伯胶，分散剂或湿润剂如天然存在的磷脂(如卵磷脂)、烯烃氧化物与脂肪酸的缩合产物(如聚氧乙烯硬脂酸酯)、环氧乙烷与长链脂肪族醇的缩合产物(如十七烷乙烯氧基十六醇)、环氧乙烷与得自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物(如聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯)，以及增稠剂如卡波姆、蜂蜡、固体石蜡或鲸蜡醇。所述混悬剂还可以含有一种或多种诸如乙酸、对羟基苯甲酸甲酯和/或对羟基苯甲酸正丙酯的防腐剂，一种或多种着色剂，一种或多种调味剂以及一种或多种诸如蔗糖或糖精的甜味剂。
本发明药物组合物还可以为水包油型乳剂的形式。所述油相可以为例如橄榄油或花生油的植物油，例如液体石蜡的矿物油，或者它们的混合物。适合的乳化剂包括诸如阿拉伯胶或西黄蓍胶的天然存在的胶，诸如大豆卵磷脂的天然存在的磷脂，得自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯例如脱水山梨醇单油酸酯，以及这些偏酯与环氧乙烷的缩合产物例如聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯。所述乳剂还可以包括甜味剂和调味剂。糖浆剂和酏剂可以用诸如甘油、山梨醇或蔗糖的甜味剂配制。所述制剂还可以包括缓和剂、防腐剂、调味剂或着色剂。
此外，本发明的组合物可以配制成无菌可注射制剂的形式，例如无菌可注射水性乳剂或油状混悬剂。该乳剂或混悬剂可以根据已知的现有技术使用如上所述的合适的分散剂或湿润剂以及助悬剂配制。所述无菌可注射制剂还可以为无毒的非胃肠道可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或混悬剂，如在1，2-丙二醇中的溶液。所述无菌可注射制剂还可以制备成冻干粉末。可以使用的可接受载体和溶剂中包括水、林格氏液(Ringer′s solution)和等渗氯化钠溶液。此外，无菌不挥发油可以用作溶液或混悬剂介质。为此目的，可以使用任何温和不挥发油，包括合成单酸甘油酯或二酸甘油酯。此外，诸如油酸的脂肪酸同样可以用于制备可注射制剂。
一般而言，可用于本发明方法中的本发明化合物基本上不溶于水，并且在大多数药物学可接受的质子溶剂以及植物油中微溶。然而，所述化合物通常可溶于中链脂肪酸(例如辛酸和癸酸)或三酸甘油酯介质中，并在中链脂肪酸的丙二醇酯中具有高溶解度。本发明中还考虑了被取代或添加化学或生物化学部分(moiety)而修饰的化合物，所述部分使所述化合物更适合于给药(例如增加溶解度、生物活性、可口性、减少不良反应等)，例如，通过酯化作用、糖基化作用、聚乙二醇化作用等。
在优选实施方式中，在适合于低溶解度化合物的基于脂质的制剂中，本发明所述化合物可以配制成用于口服给药。基于脂质的制剂一般能提高这种化合物的口服生物利用度。因此，优选的本发明药物组合物包括治疗或预防有效量的本发明化合物以及至少一种药物学可接受的赋形剂，所述药物学可接受的赋形剂选自中链脂肪酸或其丙二醇酯(例如，诸如辛酸和癸酸的可食用脂肪酸的丙二醇酯)、以及诸如聚氧乙烯40氢化蓖麻油的药物学可接受的表面活性剂。
在可选的优选实施方式中，环糊精可以作为水溶解度增加剂加入。优选的环糊精包括α-、β-和γ-环糊精的羟丙基、羟乙基、葡萄糖基、麦芽糖基和麦芽三糖基衍生物。特别优选的环糊精水溶解度增加剂为羟丙基β-环糊精(hydroxypropyl-β-cyclodextrin，HPBC)，其可以加入上述任何组合物组中，以进一步提高本发明化合物的水溶解度特性。在一种实施方式中，所述组合物包括0.1％至20％的羟丙基β-环糊精，更优选1％至15％的羟丙基β-环糊精，甚至更优选2.5％至10％的羟丙基β-环糊精。使用的溶解度增加剂的量将取决于本发明的化合物在组合物中的量。
这里所用的治疗有效量是指本发明药物组合物治疗、改善或调节已鉴定的疾病或病症、或者显示出可测的治疗或抑制效果的量。所述效果能够通过例如本发明的测定法测得。所述效果还可以为预防在个体或高百分率的人群中预测到的疾病或病症。
用于对象的精确的有效量取决于对象的体重、体型(size)以及健康状况；病症的性质和程度；选择给药的治疗或治疗的组合、蛋白质的半衰期、mRNA的半衰期以及蛋白质的定位。给定情况下的治疗有效量可以通过临床医生技能和判断范围内的常规实验确定。
对于任何化合物，所述治疗有效量最初能够在例如肿瘤细胞的细胞培养测定中评估，或者在通常为大鼠、小鼠、兔、犬或猪的动物模型中评估。所述动物模型还可以用于测定合适的浓度范围和给药途径。然后上述信息能被用于测定人类中的有效剂量和给药途径。治疗/预防的有效性和毒性可以通过标准药学方法在细胞培养物或实验动物中测定，例如ED50(在50％群体中治疗有效的剂量)和LD50(在50％群体中致死的剂量)。毒性和治疗效果的剂量比为治疗指数，并且可以表达为比例LD50/ED50。优选显示出治疗指数大的药物组合物。得自细胞培养测定以及动物研究的数据可以用于计算用于人类的剂量范围。在这种组合物中含有的剂量优选为在包括低毒或无毒ED50的循环浓度的范围内。所述剂量可以根据所用剂型、患者敏感度以及给药途径在此范围内变化。
更具体地，观察到的与本发明化合物有关的浓度-生物学作用关系表明初始的靶血浆浓度的范围为从约5微克/毫升至约100微克/毫升，优选为从约10微克/毫升至约50微克/毫升，更优选为约10微克/毫升至约25微克/毫升。为了达到上述血浆浓度，根据给药途径，本发明化合物以从1毫克/千克至150毫克/千克的变化剂量给药。文献中提供了关于具体给药剂量和给药方法的指导，并且所述文献为本领域从业者普遍可得。一般而言，所述剂量范围为约1毫克/天至约10克/天，或者为约0.1克/天至约3克/天，或者为约0.3克/天至约3克/天，或者为约0.5克/天至约2克/天，以单次剂量、分份剂量或连续剂量向体重约40至约100千克的患者给药(其中剂量可以为高于或低于此体重范围的患者，特别是低于40千克的儿童进行调整)。
然而，本发明特定活性成分在处理急性或慢性疾病或病症中的预防或治疗剂量的大小将随疾病或病症的性质和严重程度，以及活性成分的给药途径而变化。所述剂量以及可能的剂量频率也将根据个体患者的年龄、体重和反应而变化。本领域技术人员能够容易地根据对上述因素适当考虑，而选择出合适的剂量方案。一般而言，对于这里所述的病症，推荐的每日剂量在每天约1毫克/千克至约150毫克/千克范围内。在一种实施方式中，本发明的化合物作为一天一次的单次剂量给予。在另一种实施方式中，本发明的化合物作为一天中的分剂量给予。更具体地，以单次剂量或相等的分剂量给予每日剂量。优选地，每日剂量范围应该为每天约5毫克/千克到约100毫克/千克，更优选地，为每天约10毫克/千克到约90毫克/千克，甚至更优选为每天20毫克/千克到60毫克/千克。在对患者进行处理中，所述治疗应该以较低剂量开始，可能约200毫克至约300毫克，根据患者的整体反应情况，如果必要作为单次剂量或分剂量增加至最多每天约600毫克至约4000毫克。对本领域普通技术人员显而易见，在某些情况下，可能必需使用超出这里公开的范围的活性成分剂量。此外，值得注意的是临床医师或治疗内科医师将了解如何以及何时结合个体患者的反应而中断、调整或终止治疗。
这里所用的词组“治疗有效量”、“预防有效量”和“治疗或预防有效量”包括上述剂量和剂量频率表。本领域普通技术人员很容易了解不同的治疗有效量可以用于不同的疾病和病症。类似地，足以治疗或预防所述疾病，但是不足以引起或足以减少伴随常规治疗的不利效果的量也包括在上述剂量的量和剂量频率表中。
精确剂量将由医师根据与要求治疗的对象相关的因素确定。调节剂量和给药以提供足够水平的活性物质或保持所需的效果。需要考虑的因素包括疾病状态的严重程度、对象的全身健康状态、对象的年龄、体重以及性别、饮食、时间、所述蛋白的半衰期、所述RNA的半衰期、给药的频率、药物组合、反应敏感性以及对治疗的耐受/反应。长效药物组合物可以根据具体制剂的半衰期和清除率每3至4天、每周或每两周给药一次。
F、联合疗法任何本发明的化合物均可与一种或多种可用于治疗这里所述的与mRNA无义突变相关的疾病的其它活性成分联合，包括用于同时或连续向需要治疗的患者给药的单一剂型、或单独的剂型中的化合物。当连续给药时，所述药物联合可能给药两次或者更多次。在可选实施方式中，本发明的一种或多种化合物以及一种或多种另外的活性成分可能以不同途径给药。
本领域技术人员会认识到可能起到增强或协同增强本发明化合物的抑制无义突变活性的各种活性成分均可与本发明化合物联合给药。
根据本发明的方法，活性成分的组合可以是(1)共同配制并且给药，或在组合制剂中同时给药；(2)作为单独制剂交替给药或平行给药；或(3)本领域公知的任何其它组合治疗方案。当在交替治疗中给药时，本发明所述方法可以包括连续给予或递送活性成分，例如在单独的溶液、乳剂、混悬剂、片剂、丸剂或胶囊剂中，或者通过单独的注射器进行不同的注射。一般而言，在交替治疗中，连续地，即顺次地给药每种活性成分的有效剂量，而在同时治疗中，一起给药两种或更多种活性成分的有效剂量。也可以使用各种顺序的间隔组合治疗。
G、基因治疗本发明的化合物或其它无义化合物(nonsense compound)能与基因治疗联合应用。在此实施方式中，基因可以被引入或提供给在所需基因中含有特定无义突变的哺乳动物，优选人类。在优选方面，所需基因选自由IGF1、EPO、p53、p19ARF、p21、PTEN、EI24和ApoAI组成的组中。当全长多肽是所需的多肽时，为了在患者或哺乳动物中得到该多肽的表达，向所述患者或哺乳动物提供有效量的本发明化合物或其它无义化合物。
主要有两种途径使含有无义突变的核苷酸(任选地包含于载体中)进入患者的细胞中体内和先体外后体内。对于体内给药，如果已知，通常在需要所述多肽的位点，即该多肽的合成位点，以及需要所述多肽的生物学活性的位点(例如实体瘤)直接将核苷酸注射给患者。对于先体外后体内治疗，移出患者细胞，将核苷酸引入所述分离的细胞，并将修饰的细胞直接给予患者，或者例如包被在多孔膜中植入患者(参见例如第4892538和5283187号美国专利)。有多种技术可供将核苷酸引入活细胞。所述技术根据核苷酸是转入体外培养的细胞，或是在体内转入预期宿主的细胞内而不同。适合于体外转移核苷酸进入哺乳动物细胞的技术包括应用脂质体、电致孔、显微注射、转导、细胞融合、DEAE-葡聚糖、磷酸钙沉淀法等。转导包括复制缺陷重组病毒(优选逆转录病毒)颗粒与细胞报道基因的结合，然后将含在所述颗粒中的核苷酸引入细胞。通常用于基因先体外后体内传递的载体为逆转录病毒。
现有的优选的体内核及转导技术包括用病毒或非病毒载体(例如腺病毒、慢病毒、单纯疱疹I型病毒或腺病毒相关病毒(adeno-associated virus，AAV))以及基于脂质的系统(可用于脂质介导的基因转移的脂质为例如DOTMA、DOPE和DC-Chol；参见例如，Tonkinson等，Cancer Investigation，14(1)54-65(1996))的转染。用于基因治疗最优选的载体为病毒，最优选腺病毒、AAV、慢病毒或逆转录病毒。例如逆转录病毒载体的病毒载体包括至少一个转录启动子/增强子或基因座定义元件(locus-defining element)，或者通过诸如交替剪接、核RNA导出、或者翻译后修饰信使的另外方式来控制基因表达的其它元件。此外，诸如逆转录病毒载体的病毒载体包括核酸序列，当转录编码多肽的基因时，该核酸序列可操作地连接于所述编码序列，并起翻译起始序列作用。这种载体构建体还包括包装信号，长末端重复(longterminal repeats，LTRs)或其部分，以及适合于所用病毒的正义链和反义链引物结合位点(如果这些没有存在于病毒载体中)。此外，这种载体通常包括用于从多肽所在的宿主细胞中分泌该多肽的信号序列。优选所述用于此目的的信号序列为哺乳动物信号序列，更优选为该多肽的天然(native)信号序列。任选地，所述载体构建体还可以包括指导多腺苷酸化的信号，以及一种或多种限制位点和翻译终止序列。举例而言，这种载体通常包括5’LTR、tRNA结合位点、包装信号、第二链DNA合成起始点，以及3’LTR或其部分。可以使用的其它载体为非病毒载体，例如阳离子脂质、聚赖氨酸和树枝状大分子。
在某些情况下，需要向核酸源提供靶向靶细胞的物质，如特异性细胞表面膜蛋白或靶细胞的抗体、靶细胞上受体配基等。在使用脂质体时，结合细胞表面膜蛋白的与内吞作用相关的蛋白可以用来靶向和/或促进摄取，例如趋向于特定细胞类型的壳体蛋白或其片段，在循环中经受细胞内摄作用的蛋白的抗体，以及靶向细胞内定位并提高细胞内半衰期的蛋白。受体介导(recpto-mediated)的内吞作用技术记载于例如Wu等，J.Biol.Chem.2624429-4432(1987)和Wagner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，873410-3414(1990)。为了回顾现有已知的基因标记和基因治疗方案，参见Anderson等，Science 256808-813(1992)，还参见WO 93/25673，以及其中引用的文献。
适合的基因治疗以及制备逆转录病毒颗粒和结构蛋白的方法可见例如US5,681,746、US 6,800,604和US 6,800,731。
提供以下实施例以辅助理解本发明。关于本发明的实验当然不应当解释为对本发明的具体限定，并且在本领域技术人员眼界中的现在已知或者以后发展出的本发明的变化都落入这里所述以及在下文中要求保护的本发明的范围中。
实施例参照下面的非限定性实施例来更详细地描述本发明，这些实施例用于更充分地说明本发明，而不应被认为是限定本发明的范围。这些实施例阐述了本发明某些化合物的制备，这些化合物的体内和/或体外测试。本领域技术人员将理解这些实施例所述的技术代表本发明人描述的能用于很好地实施本发明的技术，因此构成实施本发明的优选模式。然而，本领域技术人员应当理解的是，根据本发明公开的内容，对于公开的具体方法可以做出改变，并且仍可获得类似的结果，而不背离本发明的精神和范围。
实施例1本发明化合物的制备A3，5-三嗪的制备式1-A和2-A的三嗪一般可以根据路线A制备如下。
3-(4-p-甲苯基-[1，3，5]三嗪-2-基)苯甲酸(化合物43)的制备步骤A向10毫升微波管中加入4-甲基苯甲酰胺(0.99g、7.32mmol)和N，N-二甲基甲酰胺二甲基乙缩醛(2.23g、18.67mmol)。将所述微波管在250psi、300W下加热到150℃10分钟。通过加入醚/己烷(1∶1)沉淀出白色固体。通过过滤并用己烷洗涤收集所需产物(1.26g、91％产率)。通过液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)测定，所得化合物N-二甲基氨基亚甲基-4-甲基-苯甲酰胺纯度＞90％，MS(ES+)m/e191.17。
步骤B向二氯甲烷(15mL)中叔丁醇(3.50g，47.22mmol)、吡啶(3.72g，46.78mmol)以及催化剂DMAP的混合物中在0℃下逐滴加入二氯甲烷(10mL)中的3-氰基苯甲酰氯(6.81g，41.07mmol)和吡啶(3mL)。所得混合物在室温下搅拌20小时。蒸发溶剂，用快速分离色谱(1∶1二氯甲烷/己烷)纯化残留物得到白色固体3-氰基-苯甲酸叔丁基酯(6.84g，82.1％产率)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.24(1H，s)，8.20(1H，dd，J＝7.9，1.2Hz)，7.78(1H，dd，J＝6.7，1.1Hz)，7.52(1H，m)，1.58(9H，s)。
步骤C在氮气保护下，向3-氰基-苯甲酸叔丁基酯(6.54g，31.98mmol)的15毫升四氢呋喃(无水)溶液中加入六甲基二硅氮烷锂(8.65g，51.17mmol，1.0M四氢呋喃中)。在室温下搅拌溶液3小时，直到起始物质耗尽(TLC监测)。反应混合物倒入硅胶(80g)的四氢呋喃(120mL)浆状物中，并搅拌5分钟，然后过滤硅胶。用四氢呋喃/甲醇(2∶1)进一步洗涤滤饼。在真空中蒸发滤液并结晶残留物产生所需产品，3-甲脒基(carbamimidoyl)-苯甲酸叔丁基酯(5.80g，82.5％产率)。LC-MS测得所得化合物纯度＞90％。MS(ES+)m/e 212.20。
步骤D将N-二甲基氨基亚甲基-4-甲基-苯甲酰胺(221.9mg，1.15mmol)和3-甲脒基-苯甲酸叔丁基酯(196.0mg，0.89mmol)的混合物在无水乙酸中(8mL)在150W、250psi下于微波反应器中加热至115℃30分钟，直到用TLC测定全部起始物质耗尽。通过加入1N HCl沉淀白色固体，并通过过滤收集，然后用水和己烷洗涤。所得固体用快速柱色谱纯化，用甲醇/二氯甲烷(1∶20)洗脱得到目标产物(23.1mg，5.3％产率)，熔点298-300℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.40(1H，s)，8.63(2H，d，J＝8.3Hz)，8.48(2H，d，J＝8.0Hz)，8.13(2H，d，J＝8.0Hz)，7.41(2H，m)，2.41(3H，s)。MS(ES+)m/e 292.30。
上述实施例A中的方法可以用于制备下列本发明的化合物化合物443-[4-(4-氟-苯基)-[1，3，5]三嗪-2-基]-苯甲酸熔点266-269℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.43(1H，s)，9.08(1H，s)，8.77(1H，dd，J＝6.1，0.9Hz)，8.62(2H，m)，8.20(1H，dd，J＝6.2，1.0Hz)，7.74(1H，m)，7.43(2H，m)。MS(ES+)m/e 297.25(20)，296.28(100)。MS(ES-)m/e 295.24(20)，294.26(100)。
化合物453-[4-(4-乙氧基-苯基)-[1，3，5]三嗪-2-基]-苯甲酸熔点269-272℃。1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.33(1H，s)，9.09(1H，s)，8.74(1H，dd，J＝7.4，1.0Hz)，8.50(2H，d，J＝8.8Hz)，8.20(1H，dd，J＝6.4，0.8Hz)，7.71(1H，t，J＝7.9Hz)，7.13(2H，d，J＝8.8Hz)，4.14(2H，q，J＝6.6Hz)，1.36(3H，t，J＝6.8Hz)。MS(ES+)m/e 323.30(20)，322.33(100)。MS(ES-)m/e 321.30(20)，320.28(100)。
化合物464-(4-p-甲苯基-[1，3，5]三嗪-2-基)-苯甲酸熔点288-290℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.41(1H，s)，8.65(2H，d，J＝8.5Hz)，8.47(2H，d，J＝8.3Hz)，8.13(2H，d，J＝8.5Hz)，7.42(2H，d，J＝8.3Hz)，2.06(3H，s)。MS(ES+)m/e 293.31(20)，292.30(100)。MS(ES-)m/e 291.28(20)，290.30(100)。
化合物474-[4-(4-氟-苯基)-[1，3，5]三嗪-2-基]-苯甲酸熔点295-298℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.44(1H，s)，8.65(4H，m)，8.13(2H，d，J＝8.3Hz)，7.45(2H，m)。MS(ES+)m/e 297.24(20)，296.22(100)。MS(ES-)m/e 295.23(20)，294.21(100)。
化合物483-[4-(4-甲氧基-苯基)-[1，3，5]三嗪-2-基]-苯甲酸熔点307-309℃。MS(ES+)m/e309.27(20)，308.26(100)。MS(ES-)m/e 307.26(20)，306.25(100)。
化合物493-[4-(3-氟-苯基)-[1，3，5]三嗪-2-基]-苯甲酸熔点273-276℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.49(1H，s)，8.68(2H，m)，8.43(1H，dd，J＝7.7，1.1Hz)，8.31(1H，dd，J＝8.8，1.4Hz)，8.14(2H，m)，7.67(1H，m)，7.55(1H，m)。MS(ES+)m/e 297.27(20)，296.25(100)。MS(ES-)m/e 295.26(20)，294.24(100)。
化合物503-[4-(4-三氟甲基-苯基)-[1，3，5]三嗪-2-基]-苯甲酸熔点290-293℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.53(1H，s)，8.67(2H，d，J＝8.3Hz)，8.52(2H，m)，8.11(2H，m)，7.97(2H，d，J＝8.3Hz)。MS(ES+)m/e 347.23(20)，346.22(100)。MS(ES-)m/e345.21(20)，344.24(100)。
化合物513-[4-(3-甲氧基-苯基)-[1，3，5]三嗪-2-基]-苯甲酸熔点227-229℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.44(1H，s)，8.65(2H，m)，8.15(3H，m)，8.06(1H，s)，7.54(1H，t，J＝7.7Hz)，7.24(1H，dd，J＝8.0，1.2Hz)，3.87(3H，s)。MS(ES+)m/e 309.27(20)，308.26(100)。MS(ES-)m/e 307.26(20)，306.23(100)。
化合物534-[4-(4-甲氧基-苯基)-[1，3，5]三嗪-2-基]-苯甲酸熔点＞300℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.35(1H，s)，8.64(2H，d，J＝8.5Hz)，8.53(2H，d，J＝8.9Hz)，8.12(2H，d，J＝8.5Hz)，7.13(2H，d，J＝8.9Hz)，3.87(3H，s)。MS(ES+)m/e 309.27(20)，308.26(100)。MS(ES-)m/e 307.26(20)，306.25(100)。
B4，2-嘧啶的制备本发明的嘧啶一般可以根据路线B制备如下。
3-[2-(4-氨基-苯基)-嘧啶-4-基]-苄腈(化合物1)步骤A将装有无水乙醇(10mL)的烧瓶冷却到0℃，加入氢化钠(42mg，60％w/w以及矿物油1.05mmol)。搅拌0.5小时后，所述溶液用4-氨基苄脒二盐酸盐(104mg，0.50mmol)处理，所得混合物搅拌5分钟。然后加入3-(3-二甲基氨基-丙烯酰基)-苄腈(100mg，0.50mmol)，所得混合物加热回流3小时，然后冷却至环境温度，并搅拌至60小时。蒸发所述混合物，所得混合物与乙醚研磨并过滤。蒸发滤液得到黄色油，用柱色谱(1∶1乙酸乙酯-己烷)分离得到产物3-[2-(4-氨基-苯基)-嘧啶-4-基]-苄腈(76mg，56％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.75(1H，d，J＝6Hz)，8.49(1H，t，J＝2Hz)，8.37-8.31(3H，m)，7.75(1H，dt，J＝8，2Hz)，7.59(1H，t，J＝8Hz)，7.40(1H，d，J＝6Hz)，6.76(2H，d，J＝9Hz)，4.03(2H，br s)。13C NMR(CDCl3)δ164.6，160.8，158.0，149.2，138.2，133.6，131.0，130.7，129.8(2C)，129.5，127.2，118.5，114.5(2C)，113.0，112.9。MS(ES+)m/e 274(20)，273(100)。
3-[2-(4-异丙基-苯基)-嘧啶-4-基]-苯甲酰胺(化合物4)的制备将3-[2-(4-异丙基-苯基)-嘧啶-4-基]-苄腈(50mg，0.167mmol)和H2SO4水溶液(257μL，0.65M)的混合物加热到70℃12小时。冷却混合物并用氢氧化钠水溶液(1M)调节至pH7。所述混合物分配在水和乙酸乙酯中，所得有机层用饱和氯化钠溶液洗涤，硫酸镁干燥，过滤并蒸发得到目标化合物白色结晶固体(52mg，98％)，熔点167-169℃。1H NMR(300MHz，丙酮-d6)δ8.91(1H，d，J＝6Hz)，8.87(1H，t，J＝2Hz)，8.54(2H，d，J＝9Hz)，8.52(1H，ddd，J＝8，2，1Hz)，8.15(1H，ddd，J＝8，2，1Hz)，7.93(1H，d，J＝6Hz)，7.80(1H，br s)，7.68(1H，t，J＝8Hz)，7.41(2H，d，J＝9Hz)，6.96(1H，br s)，3.01(1H，七重峰，J＝7Hz)，1.30(6H，d，J＝7Hz)。13C NMR(丙酮-d6)δ205.9，168.4，164.8，163.4，159.0，152.4，137.8，136.2，135.9，130.6(2C)，129.7，128.9，127.2(2C)，126.8，115.4，34.7，24.1(2C)。MS(ES+)m/e 319(25)，318(100)。
4-[2-(4-异丙基-苯基)-嘧啶-4-基]-苯甲酸(化合物5)的制备步骤A将4-乙酰基苯甲酸甲酯(1.00g，5.61mmol)和二甲基甲酰胺-二甲基乙缩醛(746μL，5.61mmol)在乙醇(5mL)中的溶液加热回流12小时。冷却并蒸发所述溶液，所得残留物用柱色谱分离得到产物4-(3-二甲基氨基-丙烯酰基)苯甲酸甲酯和4-(3-二甲基氨基-丙烯酰基)苯甲酸乙酯的混合物(679mg)。部分所述物质(121mg)溶解于乙醇(5mL)中并用4-异丙基-苄脒(81mg)。所述溶液加热回流12小时，冷却，并通过硅藻土(celite)过滤，蒸发。所得残留物通过柱色谱(硅胶，1∶4乙酸乙酯-己烷)分离可得到产物4-[2-(4-异丙基-苯基)-嘧啶-4-基]-苯甲酸乙酯。
步骤B将4-[2-(4-异丙基-苯基)-嘧啶-4-基]-苯甲酸乙酯在四氢呋喃-水-乙醇(2mL/2mL/1mL)中的溶液用氢氧化锂水合物(60mg)处理，搅拌12小时。蒸发所述溶液，所得残留物分配在1M盐酸水溶液和乙酸乙酯中。所得有机相用水(20mL)洗涤，在硫酸镁上干燥，过滤并蒸发以获得目标化合物白色固体(65mg，41％)，熔点262-264℃。1H NMR(300MHz，丙酮-d6)δ8.96(1H，d，J＝6Hz)，8.48(2H，d，J＝9Hz)，8.23(2H，d，J＝9Hz)，8.12(2H，d，J＝9Hz)，7.98(1H，d，J＝6Hz)，7.44(2H，d，J＝9Hz)，3.02(1H，七重峰，J＝7Hz)，1.33(6H，d，J＝7Hz)。MS(ES+)m/e 320(20)，319(100)。MS(ES-)m/e 318(20)，317(100)。
下列化合物可以参考上述化合物5以类似的方式制备。
化合物104-(2-p-甲苯基-嘧啶-4-基)-苯甲酸熔点＞310℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.96(1H，d，J＝6Hz)，8.43(2H，d，J＝9Hz)，8.40(2H，d，J＝9Hz)，8.10(2H，d，J＝9Hz)，8.03(1H，d，J＝6Hz)，7.35(2H，d，J＝9Hz)，2.39(3H，s)。MS(ES+)m/e 292(20)，291(100)。MS(ES-)m/e 290(20)，289(100)。
3-(2-p-甲苯基-嘧啶-4-基)-苯甲酸(化合物9)的制备步骤A以上述方法用4-甲基苄腈制备4-甲基苄脒，并与3-(3-二甲基氨基-丙烯酰基)-苄腈一起在前述条件下，用于合成3-(2-p-甲苯基-嘧啶-4-基)-苄腈。
步骤B将3-(2-p-甲苯基-嘧啶-4-基)-苄腈(87mg，0.321mmol)在乙醇(2mL)中的溶液用氢氧化钠水溶液(1mL，10N)处理，所得溶液加热回流直至通过LC/MS检测起始物质耗尽。冷却后，蒸发所述溶液，并且进行水处理(aqueous workup)。所得萃取物含有酰胺和酸化合物的混合物，用柱色谱分离得到纯目标化合物(11mg)白色固体，熔点225-226℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.94(1H，d，J＝6Hz)，8.82(1H，s)，8.53(1H，d，J＝8Hz)，8.39(2H，d，J＝9Hz)，8.11(1H，d，J＝8Hz)，8.03(1H，d，J＝6Hz)，7.71(1H，t，J＝8Hz)，7.37(2H，d，J＝9Hz)，2.40(3H，s)。MS(ES+)m/e 292(20)，291(100)。MS(ES-)m/e 290(20)，289(100)。
下列化合物可以参考上述化合物9以类似的方式制备。
化合物164-[2-(3-甲氧基-苯基)-嘧啶-4-基]-苯甲酸熔点270-273℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ13.22(1H，br s)，9.00(1H，d，J＝5Hz)，8.44(2H，d，J＝8Hz)，8.14-8.03(5H，m)，7.48(1H，t，J＝8Hz)，7.16-7.11(1H，m)，3.86(3H，s)。MS(ES+)m/e 307.11(100)。MS(ES-)m/e 305.13(100)。
化合物174-[2-(4-叔丁基-苯基)-嘧啶-4-基]-苯甲酸熔点293-296℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ13.23(1H，br s)，8.97(1H，d，J＝5Hz)，8.43(4H，d，J＝8Hz)，8.12(2H，d，J＝8Hz)，8.03(1H，d，J＝5Hz)，7.57(2H，d，J＝8Hz)。MS(ES+)m/e 333.18(100)。MS(ES-)m/e 331.15(100)。
化合物184-[2-(4-氟-苯基)-嘧啶-4-基]-苯甲酸熔点＞300℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ13.21(1H，br s)，8.99(1H，d，J＝5Hz)，8.57(2H，dd，J＝8，6Hz)，8.44(2H，d，J＝8Hz)，8.11(2H，d，J＝8Hz)，8.08(1H，d，J＝5Hz)，7.38(2H，t，J＝8Hz)。MS(ES+)m/e295.10(100)。MS(ES-)m/e 293.06(100)。
化合物194-[2-(3-三氟甲氧基-苯基)-嘧啶-4-基]-苯甲酸熔点＞300℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.07-9.04(1H，m)，8.37(2H，d，J＝8Hz)，8.18-8.16(1H，m)，8.13-8.08(3H，m)，7.71-7.53(3H，m)。MS(ES+)m/e 361.09(100)。MS(ES-)m/e 359.05(100)。
化合物20
4-[2-(3-氯-苯基)-嘧啶-4-基]-苯甲酸熔点291-294℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.03(1H，d，J＝5Hz)，8.49-8.43(4H，m)，8.14-8.11(3H，m)，7.65-7.60(2H，m)。MS(ES+)m/e 311.07(100)。MS(ES-)m/e 309.06(100)。
化合物214-[2-(4-三氟甲基-苯基)-嘧啶-4-基]-苯甲酸熔点＞300℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ13.22(1H，br s)，9.06(1H，d，J＝5Hz)，8.70(2H，d，J＝8Hz)，8.46(2H，d，J＝8Hz)，8.15(1H，d，J＝5Hz)，8.12(2H，d，J＝8Hz)，7.93(2H，d，J＝8Hz)。MS(ES+)m/e 345.16(100)。
化合物614-[2-(2-三氟甲氧基-苯基)-嘧啶-4-基]-苯甲酸熔点258-261℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.05(1H5d，J＝5Hz)，8.36(2H，d，J＝8Hz)，8.16-8.06(4H，m)，7.70-7.51(3H，m)。MS(ES+)m/e 361.12(100)。
化合物224-[2-(4-氯-苯基)-嘧啶-4-基]-苯甲酸熔点＞300℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ13.24(1H，br s)，9.01(1H，d，J＝5Hz)，8.52(2H，d，J＝8Hz)，8.44(2H，d，J＝8Hz)，8.13-8.08(3H，m)，7.62(2H，d，J＝5Hz)。MS(ES+)m/e 311.11(100)。
化合物234-[2-(2-氟-苯基)-嘧啶-4-基]-苯甲酸熔点＞300℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ13.22(1H，br s)，9.04(1H，d，J＝5Hz)，8.39(2H，d，J＝8Hz)，8.14-8.08(4H，m)，7.62-7.58(1H，m)，7.40-7.36(2H，m)。MS(ES+)m/e 295.15(100)。
化合物624-[2-(3-三氟甲基-苯基)-嘧啶-4-基]-苯甲酸1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.04(1H，d，J＝5Hz)，8.82(1H，d，J＝8Hz)，8.76(1H，s)，8.42(2H，d，J＝8Hz)，8.16(1H，d，J＝5Hz)，8.07(2H，d，J＝8Hz)，7.94(1H，d，J＝8Hz)，7.82(1H，d，J＝8Hz)，7.55(1H，s)。MS(ES+)m/e 345.21(100)。
化合物254-[2-(3-氟-苯基)-嘧啶-4-基]-苯甲酸熔点300-303℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ13.22(1H，br s)，9.00(1H，d，J＝5Hz)，8.45-8.09(7H，m)，7.59(1H，m)，7.39(1H，m)。MS(ES+)m/e 295.15(100)。
化合物26
4-(2-o-甲苯基-嘧啶-4-基)-苯甲酸熔点198-200℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ13.21(1H，br s)，9.02(1H，d，J＝5Hz)，8.37(2H，d，J＝8Hz)，8.11-8.07(2H，m)，7.89(1H，d，J＝5Hz)，7.38-7.33(3H，m)，2.58(3H，s)。MS(ES+)m/e 291.20(100)。
化合物274-[2-(4-三氟甲氧基-苯基)-嘧啶-4-基]-苯甲酸熔点299-302℃。1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.02(1H，d，J＝5Hz)，8.62(2H，d，J＝8Hz)，8.44(2H，d，J＝8Hz)，8.12(1H，d，J＝5Hz)，8.11(2H，d，J＝8Hz)，7.54(2H，d，J＝8Hz)。MS(ES+)m/e 361.18(100)。
化合物284-(2-苯基-嘧啶-4-基)-苯甲酸熔点＞300℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.00(1H，d，J＝5Hz)，8.54-8.50(2H，m)，8.45(2H，d，J＝8Hz)，8.11(2H，d，J＝8Hz)，8.08(1H，d，J＝5Hz)，7.57-7.54(3H，m)。MS(ES+)m/e 277.22(100)。
化合物304-[2-(4-甲氧基-苯基)-嘧啶-4-基]-苯甲酸熔点＞300℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ13.20(1H，br s)，8.93(1H，d，J＝5Hz)，8.46(2H，d，J＝8Hz)，8.42(2H，d，J＝8Hz)，8.11(2H，d，J＝8Hz)，7.98(1H，d，J＝5Hz)，7.09(2H，d，J＝8Hz)，3.84(3H，s)。MS(ES+)m/e 307.27(100)。MS(ES-)m/e 305.23(100)。
化合物314-[2-(2-三氟甲基-苯基)-嘧啶-4-基]-苯甲酸熔点251-252℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.04(1H，d，J＝5Hz)，8.35(2H，d，J＝8Hz)，8.19(1H，d，J＝5Hz)，8.08(2H，d，J＝8Hz)，7.92-7.73(4H，m)。MS(ES+)m/e 345.29(100)。
实施例C4，6-嘧啶式1-C和2-C的4，6-嘧啶一般可以根据路线C制备如下。
4-(6-m-甲苯基-嘧啶-4-基)-苯甲酸(化合物2)的制备步骤A在50mL三颈圆底烧瓶中装入2，4-二氯嘧啶(0.58g，3.89mmol)、3-甲基苯基硼酸(0.31g，2.28mmol)、Na2CO3(0.73g，6.88mmol)、四(三苯基膦)钯(13.0mg，1.12×10-2mmol)。将所述烧瓶抽真空，用氮气再充满。然后向烧瓶中加入二甲基甲酰胺(DMF)(15mL，无水)。将所述烧瓶再次抽真空，用氮气再充满，反复两次。所述反应加热至100℃过夜。所述反应混合物在乙醚和水中分离。所得有机层用盐水洗涤，在MgSO4上干燥，然后移出。所得残留物用快速柱色谱纯化，用二氯甲烷/己烷(1∶10)洗脱得到45.7mg(5.8％产率)需要的产物。LC-MS测定所得化合物(4-氯-6-m-甲苯基-嘧啶)纯度＞80％。MS(ES+)m/e 205.23。
步骤B将4-氯-6-m-甲苯基-嘧啶(45.7mg，0.22mmol)、4-羧基苯基硼酸(39.2mg，0.23mmol)、(235.3mg，2.22mmol)、Na2CO3(70.6mg，0.67mmol)、四丁基碘化铵(83.0mg，0.22mmol)、乙酸钯(0.5mg，2.2×10-3mmol)和2mL水装入10mL微波管中。反应混合物在60W、250psi下于微波反应器中加热至150℃10分钟。将所得反应混合物加入到5mL的6N盐酸中，并用乙酸乙酯(10mL)萃取。所得有机部分用饱和NaHCO3和盐水洗涤，干燥(MgSO4)，并在旋转蒸发器上浓缩。油状残留物悬浮在乙酸乙酯/己烷(1∶1)中得到9.8mg(15.1％产率)白色粉末所需产物，熔点211-213℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.31(1H，s)，8.66(1H，s)，8.46(2H，d，J＝8.3Hz)，8.20(1H，s)，8.15(1H，dd，J＝8.0，1.2Hz)，8.09(2H，d，J＝8.3Hz)，7.45(1H，t，J＝7.7Hz)，7.38(1H，dd，J＝7.7，1.0Hz)。MS(ES+)m/e 291.58。
下列化合物可以参考上述化合物2以类似的方式制备。
化合物33-(6-p-甲苯基-嘧啶-4-基)-苯甲酸熔点201-203℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.19(1H，s)，8.69(1H，s)，8.30(1H，dd，J＝7.9，1.1Hz)，8.11(1H，dd，J＝7.7，1.0Hz)，8.06(1H，s)，7.97(2H，d，J＝8.2Hz)，7.52(1H，t，J＝7.7Hz)，7.25(2H，d，J＝8.2Hz)。MS(ES+)m/e 292.40(20)，291.37(100)。MS(ES-)m/e 291.46(20)，290.47(100)。
实施例D2，4-嘧啶的制备式1-D和2-D的2，4-嘧啶一般可以根据路线D制备如下。
3-[4-(4-氟-苯基)-嘧啶-2-基]-苯甲酸(化合物32)的制备。
步骤A将4-氟苯乙酮(1.01g，7.31mmol)和N，N-二甲基甲酰胺二甲基乙缩醛(0.87g，7.32mmol)装入10mL微波管中。将所述微波管在250psi、300W下加热至100℃10分钟。通过加入己烷沉淀黄色固体。通过过滤和用己烷洗涤来收集所需产物(1.03g，73.0％产率)。用LC-MS测定所得化合物3-二甲基氨基-1-(4-氟-苯基)-丙烯酮纯度＞90％。MS(ES+)m/e 194.14。
步骤B向3-甲脒基-苯甲酸叔丁基酯(220.2mg，0.94mmol)、3-二甲基氨基-1-(4-氟-苯基)-丙烯酮(182.6mg，0.95mmol)和氢化钠(39.2mg，1.63mmol，60％己烷中)的混合物中加入无水乙醇(5.0mL)。所得混合物搅拌回流8小时直到用TLC测定起始物质完全消耗。移除溶剂，并向残留物加入1N盐酸(15mL)沉淀黄色固体。用水和乙醚顺序洗涤之后，产生目标产物(137.8mg，41.3％产率)，熔点239-241℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.05(1H，s)，8.97(1H，d，J＝5.0Hz)，8.73(1H，dd，J＝7.7，1.2Hz)，8.38(2H，m)，8.11(1H，dd，J＝8.0，1.2Hz)，8.04(1H，d，J＝5.3Hz)，7.68(1H，t，J＝7.8Hz)，7.43(2H，m)。MS(ES+)m/e 295.27。
下列化合物可以参考上述化合物32以类似的方式制备。
化合物334-[4-(4-溴-苯基)-嘧啶-2-基]-苯甲酸熔点302-305℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.00(1H，d，J＝5.1Hz)，8.60(2H，d，J＝8.3Hz)，8.30(2H，d，J＝8.5Hz)，8.10(3H，m)，7.85(2H，d，J＝8.5Hz)。MS(ES+)m/e 358.13(20)，357.12(100)。MS(ES-)m/e 356.01(20)，355.08(100)。
化合物344-[4-(4-三氟甲氧基-苯基)-嘧啶-2-基]-苯甲酸熔点234-236℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.01(1H，d，J＝5.4Hz)，8.58(2H，d，J＝8.3Hz)，8.46(2H，d，J＝8.8Hz)，8.09(3H，m)，7.57(2H，d，J＝8.3Hz)。MS(ES+)m/e 362.22(20)，361.23(100)。MS(ES-)m/e 360.20(20)，359.20(100)。
化合物354-(4-p-甲苯基-嘧啶-2-基)-苯甲酸熔点287-289℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.94(1H，d，J＝5.4Hz)，8.60(2H，d，J＝8.3Hz)，8.23(2H，d，J＝8.3Hz)，8.10(2H，d，J＝8.5Hz)，8.02(1H，d，J＝5.4Hz)，7.38(2H，d，J＝8.1Hz)，2.40(3H，s)。MS(ES+)m/e292.29(20)，291.26(100)。MS(ES-)m/e 290.24(20)，289.26(100)。
化合物364-[4-(4-异丙基-苯基)-嘧啶-2-基]-苯甲酸熔点243-245℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.95(1H，d，J＝5.1Hz)，8.60(2H，d，J＝8.0Hz)，8.25(2H，d，J＝8.3Hz)，8.10(2H，d，J＝8.3Hz)，8.01(1H，d，J＝5.1Hz)，7.45(2H，d，J＝8.0Hz)，2.97(1H，m)，1.25(6H，d，J＝5.1Hz)。MS(ES+)m/e 320.30(20)，319.29(100)。MS(ES-)m/e 318.30(20)，317.30(100)。
化合物374-[4-(4-甲氧基-苯基)-嘧啶-2-基]-苯甲酸熔点263-265℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.89(1H，d，J＝5.5Hz)，8.59(2H，d，J＝7.2Hz)，8.32(2H，d，J＝7.5Hz)，8.10(2H，d，J＝7.2Hz)，8.00(1H，d，J＝5.5Hz)，7.12(2H，d，J＝7.5Hz)，3.84(3H，s)。MS(ES+)m/e 308.26(20)，307.25(100)。MS(ES-)m/e 306.34(20)，305.25(100)。
化合物384-[4-(3-氟-苯基)-嘧啶-2-基]-苯甲酸熔点249-252℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.02(1H，d，J＝5.5Hz)，8.61(2H，d，J＝8.0Hz)，8.12(5H，m)，7.65(1H，m)，7.41(1H，m)。MS(ES+)m/e 296.22(20)，295.20(100)。MS(ES-)m/e 294.26(20)，293.21(100)。
化合物394-(4-联苯基-4-基-嘧啶-2-基)-苯甲酸熔点293-296℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.01(1H，d，J＝5.2Hz)，8.63(2H，d，J＝8.5Hz)，8.45(2H，d，J＝8.0Hz)，8.12(3H，m)，7.89(2H，d，J＝8.3Hz)，7.77(2H，d，J＝8.3Hz)，7.44(3H，m)。MS(ES+)m/e 354.26(20)，353.24(100)。MS(ES-)m/e 352.25(20)，351.23(100)。
化合物404-[4-(2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英-6-基)-嘧啶-2-基]-苯甲酸熔点272-274℃。1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.89(1H，d，J＝5.3Hz)，8.58(2H，d，J＝8.4Hz)，8.09(2H，d，J＝8.4Hz)，7.97(1H，d，J＝5.3Hz)，7.87(2H，m)，7.03(1H，d，J＝9.1Hz)，4.32(4H，t，J＝1.2Hz)。MS(ES+)m/e 336.27(20)，335.25(100)。MS(ES-)m/e 334.31(20)，333.29(100)。
化合物414-[4-(4-咪唑-1-基-苯基)-嘧啶-2-基]-苯甲酸熔点＞305℃。MS(ES+)m/e 344.25(20)，343.23(100)。MS(ES-)m/e 342.28(20)，341.27(100)。
化合物634-[4-(3-三氟甲基-苯基)-嘧啶-2-基]-苯甲酸熔点271-273℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.04(1H，d，J＝5.2Hz)，8.60(4H，m)，8.20(1H，d，J＝5.2Hz)，8.10(2H，d，J＝8.3Hz)，7.95(1H，dd，J＝7.4，0.9Hz)，7.82(1H，t，J＝7.4Hz)。MS(ES+)m/e 346.28(20)，345.26(100)。MS(ES-)m/e 344.25(20)，343.25(100)。
化合物644-(4-m-甲苯基-嘧啶-2-基)-苯甲酸熔点220-222℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.97(1H，d，J＝4.3Hz)，8.60(2H，d，J＝7.4Hz)，8.12(4H，m)，8.06(1H，d，J＝4.3Hz)，7.45(2H，m)，2.43(3H，s)。MS(ES+)m/e 292.29(20)，291.28(100)。MS(ES-)m/e 290.29(20)，289.29(100)。
化合物654-[4-(2-氟-苯基)-嘧啶-2-基]-苯甲酸熔点234-236℃。MS(ES+)m/e 296.22(20)，295.20(100)。MS(ES-)m/e 294.25(20)，293.23(100)。
化合物664-[4-(4-三氟甲基-苯基)-嘧啶-2-基]-苯甲酸熔点282-285℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.05(1H，d，J＝5.2Hz)，8.59(2H，d，J＝7.7Hz)，8.51(2H，d，J＝8.3Hz)，8.14(1H，d，J＝5.2Hz)，8.09(2H，d，J＝7.7Hz)，7.92(2H，d，J＝8.3Hz)。MS(ES+)m/e346.39(20)，345.42(100)。MS(ES-)m/e 344.45(20)，343.45(100)。
化合物674-[4-(4-吗啉-4-基-苯基)-嘧啶-2-基]-苯甲酸熔点289-291℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.83(1H，d，J＝5.5Hz)，8.58(2H，d，J＝8.3Hz)，8.22(2H，d，J＝8.5Hz)，8.08(2H，d，J＝8.3Hz)，7.90(1H，d，J＝5.5Hz)，7.08(2H，d，J＝8.5Hz)，3.74(4H，t，J＝1.2Hz)，3.26(4H，t，J＝1.2Hz)。MS(ES+)m/e 363.32(20)，362.31(100)。MS(ES-)m/e361.31(20)，360.29(100)。
化合物683-[4-(4-溴-苯基)-嘧啶-2-基]-苯甲酸熔点＞300℃。MS(ES+)m/e 357(100)，355(100)。
化合物693-[4-(4-三氟甲氧基-苯基)-嘧啶-2-基]-苯甲酸熔点241-243℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.05(1H，s)，9.00(1H，d，J＝5.5Hz)，8.73(1H，dd，J＝8.0，1.1Hz)，8.43(2H，d，J＝8.6Hz)，8.07(2H，m)，7.68(1H，t，J＝8.0Hz)，7.57(2H，d，J＝8.6Hz)。MS(ES+)m/e 362.24(20)，361.23(100)。MS(ES-)m/e 360.25(20)，359.25(100)。
化合物703-[4-(4-异丙基-苯基)-嘧啶-2-基]-苯甲酸熔点242-244℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.07(1H，s)，8.94(1H，d，J＝5.2Hz)，8.73(1H，dd，J＝7.7，1.0Hz)，8.23(2H，d，J＝8.4Hz)，8.10(1H，dd，J＝8.0，1.2Hz)，7.98(1H，d，J＝5.2Hz)，7.69(1H，t，J＝7.7Hz)，7.45(2H，d，J＝8.4Hz)，2.95(1H，m)，1.23(6H，d，J＝6.9Hz)。MS(ES+)m/e320.30(20)，319.29(100)。MS(ES-)m/e 318.40(20)，317.30(100)。
化合物713-[4-(4-甲氧基-苯基)-嘧啶-2-基]-苯甲酸熔点243-244℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.06(1H，s)，8.89(1H，d，J＝5.2Hz)，8.72(1H，dd，J＝7.4，1.0Hz)，8.30(2H，d，J＝9.0Hz)，8.09(1H，dd，J＝7.4，1.0Hz)，7.95(1H，d，J＝5.5Hz)，7.66(1H，t，J＝7.7Hz)，7.13(2H，d，J＝9.0Hz)，3.85(3H，s)。MS(ES+)m/e 308.30(20)，307.29(100)。MS(ES-)m/e 306.26(20)，305.25(100)。
化合物723-[4-(2-氟-苯基)-嘧啶-2-基]-苯甲酸熔点201-203℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.01(2H，m)，8.70(1H，dd，J＝7.7，1.0Hz)，8.23(1H，t，J＝6.9Hz)，8.10(1H，dd，J＝7.7，0.9Hz)，7.85(1H，d，J＝3.6Hz)，7.61(2H，m)，7.41(2H，m)。MS(ES+)m/e 296.27(20)，295.27(100)。MS(ES-)m/e 294.28(20)，293.26(100)。
化合物423-[4-(2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英-6-基)-嘧啶-2-基]-苯甲酸熔点239-241℃。1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.05(1H，s)，8.88(1H，d，J＝5.2Hz)，8.70(1H，dd，J＝8.0，1.2Hz)，8.09(1H，d，J＝7.4Hz)，7.95(1H，d，J＝5.0Hz)，7.86(1H，s)，7.82(1H，m)，7.67(1H，t，J＝7.7Hz)，7.01(1H，dd，J＝8.3，1.3Hz)，4.32(4H，t，J＝1.2Hz)。MS(ES+)m/e336.27(20)，335.25(100)。MS(ES-)m/e 334.22(20)，333.23(100)。
化合物733-(4-p-甲苯基-嘧啶-2-基)-苯甲酸熔点252-253℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.06(1H，s)，8.93(1H，d，J＝5.0Hz)，8.73(1H，dd，J＝7.4，1.0Hz)，8.22(2H，d，J＝7.7Hz)，8.09(1H，dd，J＝6.9，0.8Hz)，7.99(1H，d，J＝5.2Hz)，7.68(1H，t，J＝7.4Hz)，7.39(2H，d，J＝7.7Hz)，2.38(3H，s)。MS(ES+)m/e 292.30(20)，291.28(100)。MS(ES-)m/e290.33(20)，289.15(100)。
化合物743-[4-(3-氟-苯基)-嘧啶-2-基]-苯甲酸熔点253-255℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.05(1H，s)，9.00(1H，d，J＝5.0Hz)，8.74(1H，dd，J＝7.2，1.0Hz)，8.18(4H，m)，7.68(2H，m)，7.43(1H，m)。MS(ES+)m/e 296.41(20)，295.39(100)。MS(ES-)m/e 294.41(20)，293.42(100)。
化合物753-(4-联苯基-4-基-嘧啶-2-基)-苯甲酸熔点296-299℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.18(1H，s)，9.00(1H，d，J＝5.4Hz)，8.77(1H，dd，J＝7.8，1.1Hz)，8.43(2H，d，J＝8.0Hz)，8.17(2H，m)，7.95(2H，d，J＝8.0Hz)，7.87(3H，m)，7.43(3H，m)。MS(ES+)m/e 354.28(20)，353.31(100)。MS(ES-)m/e 352.29(30)，351.21(100)。
化合物763-(4-m-甲苯基-嘧啶-2-基)-苯甲酸熔点217-219℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.06(1H，s)，8.96(1H，d，J＝5.5Hz)，8.77(1H，dd，J＝7.9，1.0Hz)，8.13(3H，m)，8.02(1H，d，J＝5.5Hz)，7.69(1H，t，J＝7.0Hz)，7.41(2H，m)，2.43(3H，s)。MS(ES+)m/e 292.30(20)，291.28(100)。MS(ES-)m/e 290.18(20)，289.26(100)。
化合物773-[4-(3-三氟甲基-苯基)-嘧啶-2-基]-苯甲酸熔点271-273℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.02(2H，m)，8.70(1H，dd，J＝8.8，1.2Hz)，8.68(2H，m)，8.15(1H，d，J＝5.2Hz)，8.08(1H，dd，J＝7.2，1.0Hz)，7.91(1H，m)，7.80(1H，m)，7.67(1H，t，J＝7.0Hz)。MS(ES+)m/e 346.26(20)，345.26(100)。MS(ES-)m/e 344.26(20)，343.25(100)。
化合物783-[4-(4-三氟甲基-苯基)-嘧啶-2-基]-苯甲酸熔点271-273℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.04(2H，m)，8.72(1H，dd，J＝7.7，1.0Hz)，8.49(2H，d，J＝8.3Hz)，8.10(2H，m)，7.93(2H，d，J＝8.3Hz)，7.68(1H，t，J＝7.4Hz)。MS(ES+)m/e 346.26(20)，345.26(100)。MS(ES-)m/e 344.22(20)，343.24(100)。
化合物793-[4-(4-咪唑-1-基-苯基)-嘧啶-2-基]-苯甲酸熔点＞310℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.64(1H，s)，9.03(2H，m)，8.73(1H，dd，J＝7.8，1.0Hz)，8.52(2H，d，J＝8.3Hz)，8.32(1H，s)，8.15(4H，m)，7.70(2H，m)。MS(ES+)m/e 344.30(20)，343.30(100)。MS(ES-)m/e 342.27(20)，341.27(100)。
化合物574-[4-(3，4-二甲氧基-苯基)-嘧啶-2-基]-苯甲酸熔点250-252℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.89(1H，d，J＝5.5Hz)，8.59(2H，d，J＝8.5Hz)，8.10(2H，d，J＝8.5Hz)，8.01(1H，d，J＝5.5Hz)，7.93(1H，d，J＝8.5Hz)，7.88(1H，s)，7.12(1H，d，J＝8.5Hz)，3.90(3H，s)，3.84(3H，s)。MS(ES+)m/e 338.27(20)，337.22(100)。MS(ES-)m/e336.26(20)，335.26(100)。
化合物583-[4-(3，4-二甲氧基-苯基)-嘧啶-2-基]-苯甲酸熔点240-243℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.90(1H，d，J＝5.2Hz)，8.60(2H，m)，8.09(2H，m)，8.02(1H，d，J＝5.2Hz)，7.86(1H，dd，J＝8.5，1.3Hz)，7.70(1H，s)，7.14(1H，dd，J＝8.3，1.2Hz)，3.91(3H，s)，3.84(3H，s)。MS(ES+)m/e 338.28(20)，337.25(100)。MS(ES-)m/e 336.27(20)，335.26(100)。
化合物594-[4-(4-二甲基氨基-苯基)-嘧啶-2-基]-苯甲酸熔点292-295℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.78(1H，d，J＝5.5Hz)，8.58(2H，d，J＝8.5Hz)，8.21(2H，d，J＝9.1Hz)，8.09(2H，d，J＝8.5Hz)，7.85(1H，d，J＝5.5Hz)，6.84(2H，d，J＝9.1Hz)，3.02(6H，s)。MS(ES+)m/e 321.32(20)，320.30(100)。MS(ES-)m/e 319.33(20)，318.30(100)。
化合物603-[4-(4-二甲基氨基-苯基)-嘧啶-2-基]-苯甲酸熔点281-283℃。MS(ES+)m/e321.32(50)，320.30(100)。MS(ES-)m/e 319.33(20)，318.29(100)。
4-[4-甲基-6-(4-三氟甲基-苯基)-嘧啶-2-基]-苯甲酸(化合物52)[PTC-0169003]的制备步骤A将4-三氟甲基苯乙酮(0.95g，7.32mmol)和二甲基甲酰胺二甲基乙缩醛(1.60g，12.01mmol).装入10mL微波管中。将所述微波管在250psi、300W下加热至140℃30分钟。通过加入己烷沉淀白色固体。通过过滤和己烷洗涤来收集所需产物(290.1mg，22.1％产率)。用LC-MS测定所得化合物3-二甲基氨基-1-(4-三氟甲基-苯基)-丁-2-烯-1-酮纯度＞90％。MS(ES+)m/e 258.20。
步骤B向3-二甲基氨基-1-(4-三氟甲基-苯基)-丁-2-烯-1-酮(290.1mg，1.13mmol)、4-甲脒基-苯甲酸叔丁基酯(220.3mg，1.00mmol通过与3-甲脒基-苯甲酸叔丁基酯相同的方法制备)和氢化钠(79.9mg，2.00mmol，60％己烷中)的混合物中加入无水乙醇(5.0mL)。所得混合物搅拌回流14小时直到用TLC测定起始物质完全消耗。移除溶剂，并用1N盐酸(15mL)中和残留物直至pH＜7沉淀白色固体。通过过滤收集沉淀然后用水和乙醚/己烷(1∶1)洗涤。所得固体用快速柱色谱进一步纯化，用甲醇/二氯甲烷(1∶40)洗脱，得到目标产物(10.7mg，2.7％产率)，熔点272-275℃。1H NMR(300MHz，CDCl3+2滴DMSO-d6)δ8.54(2H，d，J＝8.3Hz)，8.23(2H，d，J＝8.6Hz)，8.09(2H，d，J＝8.3Hz)，7.71(2H，d，J＝8.6Hz)，7.48(1H，s)，2.61(3H，s)。MS(ES+)m/e 359.27。
下列化合物可以参考上述化合物52以类似的方式制备。
化合物56
3-[4-(4-氟-苯基)-6-甲基-嘧啶-2-基]-苯甲酸熔点305-307℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.60(2H，d，J＝8.0Hz)，8.41(2H，m)，8.08(2H，d，J＝8.0Hz)，7.96(1H，s)，7.41(2H，m)，2.60(3H，s)。MS(ES+)m/e 310.34(20)，309.34(100)。MS(ES-)m/e308.30(20)，307.32(100)。
3-[4-(4-氟-苯基)-5-甲基-嘧啶-2-基]-苯甲酸(化合物55)步骤A将4-氟苯丙酮(1.83g，10.60mmol)和N，N-二甲基甲酰胺二甲基乙缩醛(4.45g，37.35mmol)的混合物加热回流16小时。除去溶剂得到的残留物(含有3-二甲基氨基-1-(4-氟-苯基)丙-1-酮)无需提纯，用于下一个步骤。
步骤B将无水乙酸(8mL)中的3-二甲基氨基-1-(4-氟-苯基)丙-1-酮(641.9mg，3.10mmol)和3-甲脒基-苯甲酸叔丁基酯(426.1mg，1.91mmol)的混合物在300W、250psi下于微波反应器中加热至130℃30分钟。通过加入1N盐酸沉淀白色固体，并且通过过滤收集后用水和己烷洗涤。所得固体用快速柱色谱进一步纯化，用甲醇/二氯甲烷(1∶40)洗脱，得到目标产物(114.1mg，12.0％产率)，熔点272-275℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.50(2H，d，J＝8.0Hz)，8.06(2H，d，J＝8.0Hz)，7.85(2H，m)，8.13(2H，m)，7.38(2H，m)，2.40(3H，s)。MS(ES+)m/e 309.34。
下列化合物可以参考上述化合物55以类似的方式制备。
化合物543-[4-(2-氟-苯基)-5-甲基-嘧啶-2-基]-苯甲酸熔点279-281℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.92(1H，s)，8.46(2H，m)，8.05(2H，m)，7.43(2H，m)，7.38(2H，m)，2.22(3H，s)。MS(ES+)m/e 310.29(20)，309.27(100)。MS(ES-)m/e 308.29(20)，307.27(100)。
实施例E2，4-吡啶的制备式1-E和2-E的2，4-吡啶一般可以根据路线E制备如下。
3-[4-(4-异丙基-苯基)-吡啶-2-基]-苯甲酸(化合物7)的制备步骤A将4-溴吡啶盐酸盐(1.0g，6.3mmol)在乙腈-水(50mL/20mL)中的溶液用4-异丙基苯基硼酸(1.04g，6.3mmol)和碳酸钠(2.1g，25.2mmol)处理。所得混合物脱两次气，并且加入催化量的四(三苯基膦)钯。所得混合物加热回流12小时，然后冷却倒入水(50mL)中。然后过滤并用乙酸乙酯萃取所得混合物(3×50mL)。混合所得萃取物，并用盐水洗涤，在硫酸镁上干燥，过滤并蒸发得到1.01克足够纯的产物，4-(4-异丙基-苯基)-吡啶。
步骤B将4-(4-异丙基-苯基)-吡啶(1.01g，5.1mmol)在二氯甲烷(20mL)中的溶液冷却至0℃，并逐滴加入间氯过氧化苯甲酸(1.33g，7.6mmol)在二氯甲烷(20mL)中的溶液。所得混合物允许在12小时内于搅拌下暖至环境温度，然后加热回流2小时。加入间氯过氧化苯甲酸(0.5g)，并继续回流2小时。所述溶液冷却并依次用10％亚硫酸钠水溶液、10％碳酸钠水溶液和饱和盐水洗涤。有机相在无水硫酸镁上干燥并且蒸发。残留物用快速色谱分离，得到4-(4-异丙基-苯基)-吡啶-N-氧化物(0.85g，78％)。
步骤C将4-(4-异丙基-苯基)-吡啶-N-氧化物(126mg，0.59mmol)和磷酰氯(5mL)加热回流12小时。冷却并蒸发所述混合物，并将残留物溶于水，用饱和碳酸钠水溶液中和，并用乙酸乙酯萃取。所得萃取物用盐水洗涤，在硫酸镁上干燥，过滤并蒸发。所得残留物用柱色谱分离，得到2-氯-4-(4-异丙基-苯基)-吡啶(110mg，81％)。
步骤D将2-氯-4-(4-异丙基-苯基)-吡啶(110mg，0.48mmol)在乙腈-水(1mL/0.5mL)中的溶液用3-乙氧羰苯基硼酸(186mg，0.96mmol)、碳酸钠(153mg，1.44mmol)以及四(三苯基膦)钯(催化量)处理。混合物加热回流12小时，然后冷却并在水和乙酸乙酯中分配。有机相用盐水洗涤，在硫酸镁上干燥，过滤并蒸发。所得残留物通过柱色谱分离，得到3-[4-(4-异丙基-苯基)-吡啶-2-基]-苯甲酸乙酯(116mg，70％)。
步骤E3-[4-(4-异丙基-苯基)-吡啶-2-基]-苯甲酸乙酯(116mg，0.34mmol)在甲醇-水(3mL/1mL)中的溶液用氢氧化锂水合物(41mg，1.7mmol)处理。混合物在环境温度(ambiemperature)下搅拌12小时，然后在水和二乙基醚中分离。所得水相用3N盐酸水溶液中和至pH7，并用乙酸乙酯萃取。所得萃取物用盐水洗涤，在硫酸镁上干燥，过滤并蒸发，得到目标产物白色粉末(92mg，85％)，熔点233-234℃。1H NMR(300MHz，甲醇-d4)δ8.66(1H，s)，8.65(1H，d，J＝8Hz)，8.25(1H，d，J＝8Hz)，8.14-8.11(2H，m)，7.78(2H，d，J＝9Hz)，7.69-7.62(2H，m)，7.42(2H，d，J＝9hz)，3.00(1H，七重峰，J＝7Hz)，1.30(6H，d，J＝7Hz)。MS(ES+)m/e x。MS(ES-)m/e 319(20)，318(100)。
下列化合物可以参考上述化合物7以类似的方式制备。
化合物134-(4-p-甲苯基-吡啶-2-基)-苯甲酸熔点288-291℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.78(1H，d，J＝7Hz)，8.42(1H，s)，8.30(2H，d，J＝9Hz)，8.08(2H，d，J＝9Hz)，7.94-7.90(3H，m)，7.38(2H，d，J＝9Hz)，2.39(3H，s)。MS(ES+)m/e 291(19)，290(100)。
实施例F3，5-吡啶式1-F和2-F的3，5-吡啶一般可以根据路线F制备如下。
3-[5-(4-异丙基-苯基)-吡啶-3-基]-苯甲酸(化合物11)的制备步骤A将3，5-二溴吡啶(1.0g，4.2mmol)和4-异丙基苯基硼酸(346mg，2.1mmol)在乙醇-甲苯-水(10mL/5mL/3mL)混合物中的溶液用碳酸钠(450mg)处理。所得混合物脱两次气，并且用催化量的四(三苯基膦)钯处理，并在搅拌下加热至80℃12小时。所得混合物冷却、过滤并蒸发。所得残留物在水和乙酸乙酯中分配，有机相用盐水洗涤，在硫酸钠上干燥，过滤并蒸发。所得残留物用柱色谱分离，得到3-溴-5-(4-异丙基-苯基)-吡啶(300mg，55％)。
步骤B将3-溴-5-(4-异丙基-苯基)-吡啶(300mg，1.1mmol)和3-乙氧羰苯基硼酸(180mg，1.1mmol)在乙醇-甲苯-水(10mL/5mL/3mL)中的溶液用碳酸钠(345mg)处理，脱两次气，用催化量的四(三苯基膦)钯处理。所得混合物在搅拌下加热至80℃至TLC测定起始物质耗尽。然后，所述混合物冷却、过滤并蒸发，并且残留物在水和乙酸乙酯中分配。所得有机相用盐水洗涤，在硫酸钠上干燥，过滤并蒸发。残留物用柱色谱分离，得到3-[5-(4-异丙基-苯基)-吡啶-3-基]-苯甲酸乙酯(252mg，79％)。
步骤C将3-[5-(4-异丙基-苯基)-吡啶-3-基]-苯甲酸乙酯(100mg)在甲醇-水(3mL/1mL)中的溶液用水合氢氧化锂(50mg)处理，所得溶液加热至40-50℃12小时。冷却后，所得溶液用3N盐酸中和至pH7，并用乙酸乙酯萃取。所得萃取物用盐水洗涤，在硫酸钠上干燥、过滤并蒸发得到目标化合物粉末(80mg，87％)，熔点155-156℃。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.93-8.90(2H，m)，8.44(1H，s)，8.21-8.19(2H，m)，7.89(1H，d，J＝7Hz)，7.64(1H，t，J＝8Hz)，7.61(2H，d，J＝9Hz)，7.39(2H，d，J＝9Hz)，3.00(1H，七重峰，J＝7Hz)，1.30(6H，d，J＝7Hz)。MS(ES+)m/e 319(22)，318(100)。
下列化合物可以参考上述化合物11以类似的方式制备。
化合物154-(5-p-甲苯基-吡啶-3-基)-苯甲酸熔点260-262℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.92(2H，s)，8.38(1H，s)，8.05(2H，d，J＝9Hz)，7.98(2H，d，J＝9Hz)，7.75(2H，d，J＝9Hz)，7.33(2H，d，J＝9Hz)，2.36(3H，s)。MS(ES+)m/e 291(20)，290(100)。
实施例G4，2-吡啶式1-G和2-G的4，2-吡啶一般可以根据路线G制备如下。
3-[2-(4-异丙基-苯基)-吡啶-4-基]-苯甲酸(化合物8)的制备步骤A将4-溴吡啶(1.0g，5.2mmol)在乙腈-水(10mL/5mL)中的溶液用3-乙氧羰苯基硼酸(0.93g，5.2mmol)、碳酸钠(2.2g，21mmol)以及催化的四(三苯基膦)钯处理。所得溶液加热回流12小时，然后冷却并用乙酸乙酯萃取。所得萃取物用盐水洗涤，在硫酸钠上干燥，过滤并蒸发。所得残留物用快速色谱分离，得到3-吡啶-4-基-苯甲酸乙酯(1.0g，86％)。
步骤B将3-吡啶-4-基-苯甲酸乙酯(150mg，0.66mmol)在二氯甲烷(5mL)中的溶液用间氯过氧化苯甲酸(340mg，2.0mmol)处理。搅拌2天后，所得混合物进一步用350mg间氯过氧化苯甲酸处理，并且反应混合物加热回流过夜。所得溶液冷却并依次用10％亚硫酸钠水溶液、10％碳酸钠和盐水洗涤。所述有机相用无水硫酸镁干燥，过滤并蒸发，得到足够纯的3-吡啶-4-基-苯甲酸乙酯-N氧化物。所述物质溶解在磷酰氯中，加热回流12小时。所得反应混合物冷却并蒸发，并且残留物溶于乙酸乙酯。所得溶液用饱和碳酸钠水溶液、水和盐水洗涤，然后在硫酸镁上干燥，过滤并蒸发。所得残留物用快速色谱分离，得到3-(2-氯-吡啶-4-基)-苯甲酸乙酯(81mg，47％全部)。
步骤C将3-(2-氯-吡啶-4-基)-苯甲酸乙酯(81mg，0.31mmol)、碳酸钠(99mg，0.93mmol)以及4-异丙基苯基硼酸(60mg)在乙腈-水(2mL/5mL)中的溶液用催化量的四(三苯基膦)钯处理，并加热回流24小时。混合物倒入水(60mL)中，并且所述混合物用二乙基醚(3×60mL)萃取。合并萃取物，用盐水洗涤，在硫酸镁上干燥，过滤并蒸发，得到3-[2-(4-异丙基-苯基)-吡啶-4-基]-苯甲酸乙酯(75mg，76％)。
步骤D使用标准氢氧化锂酯水解方法，将3-[2-(4-异丙基-苯基)-吡啶-4-基]-苯甲酸乙酯转化成目标化合物，熔点247-249℃。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.80(1H，d，J＝8Hz)，8.45(1H，s)，8.21(1H，d，J＝8hz)，7.99(2H，d，J＝9Hz)，7.98-7.94(2H，m)，7.64(1H，t，J＝8Hz)，7.52-7.48(1H，m)，7.37(2H，d，J＝9Hz)，2.99(1H，七重峰，J＝7Hz)，1.30(6H，d，J＝7Hz)。MS(ES+)m/e 319(24)，318(100)。
下列化合物可以参考上述化合物8以类似的方式制备。
化合物12
4-(2-p-甲苯基-吡啶-4-基)-苯甲酸熔点286-289℃。1HNMR(300MHz，CDCl3)δ8.71(1H，br d，J＝6Hz)，8.22(1H，s)，8.12-8.02(6H，m)，7.30(2H，d，J＝9Hz)，2.36(3H，s)。MS(ES+)m/e 291(20)，290(100)。
实施例H2，6-吡啶式1-H和2-H的4，2吡啶一般可以根据路线H制备如下。
3-[6-(4-异丙基-苯基)-吡啶-2-基]-苯甲酸(化合物6)的制备。
步骤A将2，6-二溴吡啶(6.16g，26mmol)和3-乙氧羰苯基硼酸(0.5g，2.6mmol)在乙腈(20mL)中的溶液用碳酸钠(0.88g)在水(5mL)中的溶液处理。混合物脱两次气，并加入催化量的四(三苯基膦)钯。反应混合物搅拌下加热至80℃12小时，然后冷却、过滤并蒸发。所得残留物在水和乙酸乙酯中分配，有机相用饱和盐水洗涤，在硫酸钠上干燥，过滤并蒸发。所得残留物用柱色谱分离，得到3-(6-溴-吡啶-2-基)-苯甲酸乙酯(154mg，20％)。
步骤B将3-(6-溴-吡啶-2-基)-苯甲酸乙酯(154mg，0.5mmol)和4-异丙基苯基硼酸(83mg，0.5mmol)在乙腈中的溶液用碳酸钠(160mg)在水(1mL)中的溶液处理。混合物脱两次气，并在氮气保护下，加入催化量的四(三苯基膦)钯。反应混合物在80℃下搅拌直至通过TLC观察起始物质耗尽。所得混合物冷却、过滤并蒸发，并且所得残留物在水和乙酸乙酯中分配。有机相用盐水洗涤，在硫酸钠上干燥，过滤并蒸发。所得残留物用柱色谱提纯，得到3-[6-(4-异丙基-苯基)-吡啶-2-基]-苯甲酸乙酯(120mg，69％)。
步骤C将3-[6-(4-异丙基-苯基)-吡啶-2-基]-苯甲酸乙酯(90mg)在3mL甲醇-1mL水中的溶液用氢氧化锂水合物(50mg)处理。溶液搅拌下加热至40-50℃12小时，然后冷却，并用3N盐酸水溶液中和至pH7。所得混合物用乙酸乙酯萃取，并且所得萃取物用盐水洗涤，在硫酸钠上干燥、过滤并蒸发得到目标产物粉末(70mg，85％)，熔点215-216℃。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.86(1H，s)，8.47(1H，d，J＝8Hz)，8.18(1H，d，J＝8Hz)，8.08(2H，d，J＝9Hz)，7.85(1H，t，J＝7Hz)，7.77(1H，d，J＝7Hz)，7.76(1H，d，J＝7Hz)，7.62(1H，t，J＝8Hz)，7.38(2H，d，J＝9Hz)，2.99(1H，七重峰，J＝7Hz)，1.30(6H，d，J＝7Hz)。MS(ES+)m/e 319(20)，318(100)。
下列化合物可以参考上述化合物6以类似的方式制备。
化合物144-(6-p-甲苯基-吡啶-2-基)-苯甲酸熔点283-284℃。
3-(6-苯基-吡啶-2-基)-苯甲酸(化合物24)的制备步骤A将4-乙酰基苯甲酸甲酯(5.00g，28.1mmol)在乙醇(50mL)中的混悬剂用双(二甲基氨基)-甲氧基甲烷(7.50mL，56.1mmol)处理，并且所得混合物搅拌加热至80℃2天。在减压下移除溶剂，得到所需产物白色固体(4-(3-二甲基氨基-丙烯酰基)-苯甲酸甲酯)。
步骤B将4-(3-二甲基氨基-丙烯酰基)-苯甲酸甲酯(100mg)在乙酸(5mL)中的溶液用苯乙酮和乙酸铵(77mg)处理。所得混合物在氮气保护下，加热至80℃18小时，然后冷却并蒸发。所得固体在乙酸乙酯-己烷中重结晶，得到3-(6-苯基-吡啶-2-基)-苯甲酸甲酯。MS(ES+)m/e 290.2(100)。
步骤C3-(6-苯基-吡啶-2-基)-苯甲酸甲酯用氢氧化钠皂化，并且处理得到酸目标产物。MS(ES+)m/e 276(100)。
本发明某些优选化合物的熔点和质谱数据示于下表中。


















实施例2无义抑制活性以荧光素酶介导的化学发光为基础的基于细胞的翻译的功能性测定(于2003年7月23日提交的国际申请PCT/US2003/023185，全文引入作为参考)可以定量地评价无义抑制的水平。在含有胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的培养基中培养人胚肾细胞(293细胞)。这些细胞稳定转染有在氨基酸190位点含有提前终止密码子的荧光素酶基因。通过定点诱变引入3个可能的无义密码子(TAA、TAG或TGA)之一，以及紧随所述无义密码子的重要下游+1位点引入4个可能的核苷酸(腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶或鸟嘌呤)之一，以代替荧光素酶基因在该位点正常存在的苏氨酸密码子(ACA)。从而，含有提前终止密码子的荧光素酶基因中的氨基酸190为TAA、TAG或TGA。对于每一个终止密码子，在含有提前终止密码子的荧光素酶基因中的氨基酸190之后的核苷酸可被腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶或鸟嘌呤(A、T、C、G)之一取代，这样这些突变不会改变荧光酶基因的阅读框。在图1中展示了这些构建体的示意图。
由基于细胞的荧光素酶报道基因测定的如上所述的本发明的无义抑制活性如下表2所示。人胚肾293细胞稳定转染有在190位点含有UGA无义突变的荧光素酶报道基因构建体，该无义突变密码子框内接着为腺苷酸。
由含有UGA提前终止密码子的本发明构建体的基于细胞的荧光素酶报道基因测定，测得表2中活性测量结果。已知氨基糖苷抗生素庆大霉素允许提前终止密码子的连读，将其用作内标。活性测量基于在细胞内产生给定蛋白所需的化合物的最小浓度与在该浓度下细胞产生的蛋白的量的定性比。发现具有非常高效价和非常高蛋白质合成效能任一或两者的化合物分类为“*****”。发现具有中等的效能和/或蛋白质合成效率的化合物分类为“****”、“***”或“**”。类似地，发现具有较低的效能和/或蛋白质合成效率的化合物分类为“*”。




在如上所述测定中的对以下构建体的无义抑制活性示于下表3中在190位点具有在框内继之以腺苷酸的UAG无义突变构建体(UAGA)；在190位点具有在框内继之以腺苷酸的UAA无义突变的构建体(UAAA)。“POS WB”指当本发明化合物用在本发明带有继之以胞嘧啶核苷酸的UGA无义突变(UGAC)的测定中时，在蛋白质印迹中产生阳性信号。
表3

实施例3连读测定以荧光素酶介导的化学发光为基础的基于细胞的翻译功能性测定(于2003年7月23日提交的国际申请PCT/US2003/023185全文引入作为参考)可以评价mRNA中正常终止密码子的翻译连读。在含有胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的培养基中培养人胚肾细胞(293细胞)。这些细胞稳定转染有在氨基酸190位点含有提前终止密码子的荧光素酶基因。通过定点诱变引入3个可能的无义密码子(TAA、TAG或TGA)之一，以及在紧随所述无义密码子的重要下游+1位点引入4个可能的核苷酸(腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶或鸟嘌呤)之一，以代替荧光素酶基因在该位点正常存在的苏氨酸密码子(ACA)。从而，含有提前终止密码子的荧光素酶基因中的氨基酸190为TAA、TAG或TGA。对于每一个终止密码子，在含有提前终止密码子的荧光素酶基因中的氨基酸190之后的核苷酸可被腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶或鸟嘌呤(A、T、C、G)之一取代，这样这些突变不会改变荧光酶基因的阅读框。在图1中展示了这些构建体的示意图。
本发明的另一测定可以评估促进无义突变抑制的化合物。如上所述在图1中展示的荧光素酶构建体在荧光素酶蛋白的N-端设计为带有两个表位标签。基于荧光素酶蛋白的产生，所述构建体定性地评价翻译-连读的水平。通过免疫沉淀被抑制的荧光素酶蛋白(使用抗His标签的抗体)后，使用抗第二表位(the XpressTMepitope；Invitrogen；Carlsbad，California)抗体进行蛋白质印迹(western blotting)来测定通过所述提前终止密码子的抑制而产生的全长荧光素酶蛋白的存在。所述构建体在图2中展示。
当用本发明化合物处理带有图2构建体的细胞时，显示出全长蛋白产量增加。在处理20小时后，收集含有图2构建体的细胞，并使用识别His表位的抗体免疫沉淀荧光素酶蛋白。免疫沉淀后，使用XpressTM表位的抗体(Invitrogen；Carlsbad，California)进行蛋白质印迹以检测截短的荧光素酶(当没有无义抑制发生时产生)，并检测全长蛋白(由无义密码子的抑制产生)。用测试化合物处理的细胞产生全长蛋白而不是连读蛋白(例如见图3)。如果正常终止密码子的抑制发生，则产生所述连读蛋白。本发明的化合物抑制提前终止密码子即无义突变，但并不抑制荧光素酶mRNA中的正常终止密码子。
本发明的化合物选择性地作用于哺乳动物中的提前终止密码子，而不作用于正常终止密码子。
通过强饲法(口服)给予大鼠和犬高剂量化合物(达1800毫克/千克)，每天一次，共14天。治疗之后，收集组织，制备溶胞产物并进行蛋白质印迹分析。用于评价正常终止密码子连读的蛋白的选择，主要基于相应的在3’-UTR内具有与正常终止密码子在框内的第二终止密码子的mRNA。在该两个终止密码子之间，每一被选蛋白都具有核苷酸间插序列，该序列编码第一个终止密码子的核糖体连读事件中蛋白的延伸。如果所述化合物具有诱导非特异性、核糖体连读的能力，延伸的蛋白得以用蛋白质印迹与野生型蛋白区分开。收集大鼠的组织，并分析波形蛋白mRNA中正常终止密码子(UAA)的抑制。没有迹象表明发生抑制。收集用本发明化合物治疗的犬的组织。没有证据表明带有UAG终止密码子的β-肌动蛋白的正常终止密码子受抑制。
在健康人志愿者中，口服给予单次剂量(200毫克/千克)本发明化合物。收集血液样品，制备血浆，并用来自女性和男性受试者的血浆样品进行蛋白质印迹。使用带有UGA终止密码子的C-反应性蛋白(C-reactive protein，CRP)检测用本发明化合物治疗受试者是否导致了CRP mRNA中正常终止密码子的抑制。荧光素酶测定结合提前终止测定表明了提前终止密码子而不是正常终止密码子的选择性抑制。
实施例4动物模型动物模型系统还能用于指示本发明化合物的安全性和有效性。用感兴趣的疾病、病症或综合症的动物模型测试本发明化合物的生物学活性。所述动物模型包括设计含有靶RNA元件的连接功能性读出系统的动物，例如转基因小鼠。
囊性纤维化症囊性纤维化症的动物模型实例包括但不限于cftr(-/-)小鼠(参见例如，Freedman等，2001，Gastroenterology 121(4)950-7)、cftr(tmlHGU/tmlHGU)小鼠(参见例如，Bernhard等，2001，Exp Lung Res 27(4)349-66)、伴随缺陷环磷腺苷介导的Cl(-)转导(Cl(-)conductance)的囊性纤维化跨膜转导调节因子(CFTR)缺陷小鼠(参见例如，Stotland等，2000，Pediatr Pulmonol 30(5)413-24)和C57BL/6-Cftr(mlUNC)/Cftr(mlUNC)敲除小鼠(参见例如，Stotland等，2000，Pediatr Pulmonol30(5)413-24)。
肌营养不良肌营养不良的动物模型实例包括但不限于小鼠、仓鼠、猫、犬及线虫(C.elegans)。肌营养不良的小鼠模型实例包括但不限于dy-/-(参见例如，Connolly等，2002，J Neuroimmunol 127(1-2)80-7)、肌营养不良伴随肌炎(muscular dystrophywith myositis，mdm)小鼠突变(参见例如，Garvey等，2002，Genomics 79(2)146-9)、mdx小鼠(参见例如，Nakamura等，2001，Neuromuscul Disord 11(3)251-9)、utrophin-肌养蛋白敲除(utrophin-dystrophin knockout，dko)小鼠(参见例如，Nakamura等，2001，Neuromuscul Disord 11(3)251-9)、dy/dy小鼠(参见例如，Dubowitz等，2000，Neuromuscul Disord 10(4-5)292-8)、mdx(Cv3)小鼠模型(参见例如，Pillers等，1999，Laryngoscope 109(8)1310-2)以及肌强直的ADR-MDX突变小鼠(参见例如，Kramer等，1998，Neuromuscul Disord 8(8)542-50)。肌营养不良的仓鼠模型实例包括但不限于肌聚糖-缺陷(sarcoglycan-deficient)仓鼠(参见例如，Nakamura等，2001，Am J Physiol Cell Physiol 281(2)C690-9)和BIO 14.6营养不良仓鼠(参见例如，Schlenker & Burbach，1991，J Appl Physiol 71(5)1655-62)。肌营养不良的猫模型实例包括但不限于猫肥大性肌营养不良模型(参见例如，Gaschen & Burgunder，2001，ActaNeuropathol(Berl)101(6)591-600)。肌营养不良的犬模型实例包括但不限于金毛寻回犬(golden retriever)肌营养不良(参见例如，Fletcher等，2001，Neuromuscul Disord11(3)239-43)和犬X-连锁肌营养不良(参见例如，Valentine等，1992，Am J Med Genet42(3)352-6)。肌营养不良的线虫模型在Chamberlain & Benian，2000，Curr Biol10(21)R795-7以及Culette & Sattelle，2000，Hum MoI Genet 9(6)869-77中描述。
家族性高胆固醇血症家族性高胆固醇血症的动物模型实例包括但不限于缺乏功能性低密度脂蛋白受体报道基因的小鼠(参见例如，Aji等，1997，Circulation 95(2)430-7、Yoshida大鼠(参见例如，Fantappie等，1992，Life Sci 50(24)1913-24)、JCRLA-cp大鼠(参见例如，Richardson等，1998，Atherosclerosis 138(1)135-46)、猪(参见例如，Hasler-Rapacz等，1998，Am J Med Genet 76(5)379-86)和Watanabe遗传性高脂血症兔(参见例如，Tsutsumi等，2000，Arzneimittelforschung 50(2)118-21；Harsch等，1998，Br J Pharmacol124(2)227-82；和Tanaka等，1995，Atherosclerosis 114(1)73-82)。
人类癌症人类癌症动物模型实例一般包括但不限于伙伴动物(companion animals)的自发性产生肿瘤(参见例如，Vail & MacEwen，2000，Cancer Invest 18(8)781-92)。肺癌的动物模型实例包括但不限于Zhang和Roth描述的肺癌动物模型(1994，In Vivo8(5)755-69)以及p53功能丧失的转基因小鼠(参见例如，Morris等，1998，J La StateMed Soc 150(4)179-85)。乳癌的动物模型实例包括但不限于过度表达细胞周期蛋白D1的转基因小鼠(参见例如，Hosokawa等，2001，Transgenic Res 10(5)471-8)。结肠癌的动物模型实例包括但不限于TCRβ和p53双敲除小鼠(参见例如，Kado等，2001，Cancer Res 61(6)2395-8)。胰腺癌的动物模型实例包括但不限于Panc02鼠胰腺癌转移性模型(参见例如，Wang等，2001，Int J Pancreatol 29(1)37-46)和产生皮下胰腺肿瘤的裸鼠(nu-nu mice)(参见例如，Ghaneh等，2001，Gene Ther 8(3)199-208)。非何杰金氏淋巴瘤(non-Hodgkin′s lymphoma)的动物模型实例包括但不限于重度联合免疫缺陷症(severe combined immunodeficiency，″SCID″)小鼠(参见例如，Bryant等，2000，Lab Invest 80(4)553-73)以及IgHmu-HOX11转基因小鼠(参见例如，Hough等，1998，Proc Natl Acad Sci USA 95(23)13853-8)。食管癌的动物模型实例包括但不限于转有人乳头瘤病毒属型16E7致癌基因的转基因小鼠(参见例如，Herber等，1996，J Virol 70(3)1873-81)。结肠直肠癌的动物模型实例包括但不限于Apc小鼠模型(参见例如，Fodde & Smits，2001，Trends MoI Med 7(8)369-73和Kuraguchi等，2000，Oncogene 19(50)5755-63)。多发性神经纤维瘤的动物模型实例包括但不限于突变体NF1小鼠(参见例如，Cichowski等，1996，Semin Cancer Biol 7(5)291-8)。成视网膜细胞瘤的动物模型实例包括但不限于在视网膜内表达猿猴病毒40T抗原转基因小鼠(参见例如，Howes等，1994，Invest Ophthalmol Vis Sci 35(2)342-51和Windle等，1990，Nature 343(6259)665-9)和近亲交配大鼠(参见例如，Nishida等，1981，CurrEye Res 1(1)53-5和Kobayashi等，1982，Acta Neuropathol(Berl)57(2-3)203-8)。维尔姆斯氏肿瘤(Wilm′s tumor)的动物模型实例包括但不限于WT1敲除小鼠(参见例如，Scharnhorst等，1997，Cell Growth Differ 8(2)133-43)、具有肾胚细胞瘤高发病率的大鼠亚系(参见例如，Mesfin & Breech，1996，Lab Anim Sci 46(3)321-6)和具有维尔姆斯氏肿瘤的Wistar/Furth大鼠(参见例如，Murphy等，1987，Anticancer Res7(4B)717-9)。
视网膜色素变性视网膜色素变性的动物模型实例包括但不限于皇家外科医师学会(RoyalCollege of Surgeons，″RCS″)大鼠(参见例如，Vollrath等，2001，Proc Natl Acad SciUSA 98(22)；12584-9和Hanitzsch等，1998，Acta Anat(Basel)162(2-3)119-26)、视紫红质敲除大鼠(参见例如，Jaissle等，2001，Invest Ophthalmol Vis Sci 42(2)506-13)和Wag/Rij大鼠(参见例如，Lai等，1980，Am J Pathol 98(1)281-4)。
肝硬化肝硬化的动物模型实例包括但不限于四氯化碳暴露(CCl4-exposed)大鼠(参见例如，Kloehn等，2001，Horm Metab Res 33(7)394-401)以及细菌细胞成分或大肠炎引发的啮鼠动物模型(参见例如，Vierling，2001，Best Pract Res Clin Gastroenterol15(4)591-610)。
血友病血友病的动物模型实例包括但不限于血友病A的啮鼠动物模型(参见例如，Reipert等，2000，Thromb Haemost 84(5)826-32；Jarvis等，1996，Thromb Haemost 75(2)318-25；以及Bi等，1995，Nat Genet 10(1)119-21)、血友病A的犬模型(参见例如，Gallo-Penn等，1999，Hum Gene Ther 10(11)1791-802和Connelly等，1998，Blood91(9)；3273-81)、血友病B的鼠类模型(参见例如，Snyder等，1999，Nat Med 5(1)64-70；Wang等，1997，Proc Natl Acad Sci USA 94(21)11563-6；以及Fang等，1996，Gene Ther3(3)217-22)、血友病B的犬模型(参见例如，Mount等，2002，Blood 99(8)2670-6；Snyder等，1999，Nat Med 5(1)64-70；Fang等，1996，Gene Ther 3(3)217-22)；以及Kay等，1994，Proc Natl Acad Sci USA 91(6)2353-7)和血友病B的猕猴模型(参见例如，Lozier等，1999，Blood 93(6)1875-81)。
冯·维勒布兰德病冯·维勒布兰德病的动物模型实例包括但不限于近亲交配鼠品系RIIIS/J(参见例如，Nichols等，1994，83(11)3225-31和Sweeney等，1990，76(11)2258-65)、注射美洲矛头蝮毒蛋白的大鼠(参见例如，Sanders等，1988，Lab Invest 59(4)443-52)以及冯·维勒布兰德病的猪模型(参见例如，Nichols等，1995，Proc Natl Acad Sci USA92(7)2455-9；Johnson & Bowie，1992，J Lab Clin Med 120(4)553-8)；以及Brinkhous等，1991，Mayo Clin Proc 66(7)733-42)。
β地中海贫血症β地中海贫血症的动物模型实例包括但不限于珠蛋白基因突变的鼠类模型(参见例如，Lewis等，1998，Blood 91(6)2152-6；Raja等，1994，Br J Haematol 86(1)156-62；Popp等，1985，445432-44；和Skow等，1983，Cell 34(3)1043-52)。
肾结石肾结石的动物模型实例包括但不限于遗传性高钙尿大鼠(genetic hypercalciuricrats)(参见例如，Bushinsky等，1999，Kidney Int 55(1)234-43以及Bushinsky等，1995，Kidney Int 48(6)1705-13)、化学处理的大鼠(参见例如，Grases等，1998，Scand J UrolNephrol 32(4)261-5；Burgess等，1995，Urol Res 23(4)239-42；Kumar等，1991，J Urol146(5)1384-9；Okada等，1985，Hinyokika Kiyo 31(4)565-77；和Bluestone等，1975，Lab Invest 33(3)273-9)、高草酸尿的大鼠(参见例如，Jones等，1991，J Urol 145(4)868-74)、单侧退行性可曲肾镜检查(flexible nephroscopy)的猪(参见例如，Seifmah等，2001，57(4)832-6)以及上泌尿道梗阻的兔(参见例如，Itatani等，1979，Invest Urol17(3)234-40)。
共济失调性毛细血管扩张症共济失调性毛细血管扩张症的动物模型实例包括但不限于共济失调性毛细血管扩张症的鼠类模型(参见例如，Barlow等，1999，Proc Natl Acad Sci USA 96(17)9915-9和Inoue等，1986，Cancer Res 46(8)3979-82)。
溶酶体贮积症溶酶体贮积症的动物模型实例包括但不限于粘多糖增多症VII型小鼠模型(参见例如，Brooks等，2002，Proc Natl Acad Sci USA.99(9)6216-21；Monroy等，2002，Bone 30(2)352-9；Vogler等，2001，Pediatr Dev Pathol 4(5)421-33；Vogler等，2001，Pediatr Res.49(3)342-8；以及Wolfe等，2000，Mol Ther.2(6)552-6)、异染性脑白质营养不良小鼠模型(参见例如，Matzner等，2002，Gene Ther.9(1)53-63)、桑德霍夫病(Sandhoff disease)小鼠模型(参见例如，Sango等，2002，Neuropathol Appl Neurobiol28(1)23-34)、粘多糖增多症III A型小鼠模型(参见例如，Bhattacharyya等，2001，Glycobiology ll(1)99-10和Bhaumik等，1999，Glycobiology 9(12)1389-96.)、芳基硫酸酯酶A(arylsulfatase A，ASA)缺陷小鼠(参见例如，D′Hooge等，1999，Brain Res.847(2)352-6和D′Hooge等，1999，Neurosci Lett.273(2)93-6)、天冬氨酰葡糖胺尿症的突变小鼠(参见例如，Jalanko等，1998，Hum Mol Genet.7(2)265-72)、粘多糖增多症VI型猫模型(参见例如，Crawley等，1998，J Clin Invest.101(1)109-19和Norrdin等，1995，Bone 17(5)485-9)、尼曼匹克症C型猫模型(参见例如，March等，1997，ActaNeuropathol(Berl).94(2)164-72)、酸性鞘磷脂酶缺陷小鼠(参见例如，Otterbach &Stoffel，1995，Cell 81(7)1053-6)和甘露糖苷过多症牛(参见例如，Jolly等，1975，BirthDefects Orig Arctic Ser.11(6)273-8)。
结节性硬化症(Tuberous Sclerosis)结节性硬化症的动物模型实例包括但不限于TSC1小鼠模型(参见例如，Kwiatkowski等，2002，Hum Mol Genet.11(5)525-34)、Tsc1(TSC1同系物)敲除小鼠(参见例如，Kobayashi等，2001，Proc Natl Acad Sci USA.2001 Jul 17；98(15)8762-7)、TSC2基因突变体(Eker)大鼠模型(参见例如，Hino 2000，Nippon Rinsho 58(6)1255-61；Mizuguchi等，2000，J Neuropathol Exp Neurol.59(3)188-9；以及Hino等，1999，ProgExp Tumor Res.3595-108)和Tsc2(+/-)小鼠(参见例如，Onda等，1999，J Clin Invest.104(6)687-95)。
实施例5mdx小鼠动物模型研究已经证明引起427kDa肌养蛋白多肽翻译提前终止的mdx小鼠中的突变是在外显子23中3185位置上C到T的转变(Sicinski等，Science 244(4912)1578-1580(1989))。按照以前记载的方法制备得自1天龄mdx小鼠的原代骨髂肌培养物(Barton-Davis等，J.Clin.Invest.104(4)375-381(1999))。细胞在本发明化合物存在下培养10天。每四天更换培养基，并且通过以前记载的免疫染色法(Barton-Davis等，J.Clin.Invest.104(4)375-381(1999))测定成肌细胞培养物中肌养蛋白的存在。使用未经稀释的肌养蛋白C-端的第一单克隆抗体，结合抗鼠IgG的若丹明用作第二抗体。所述抗体检测通过抑制无义密码子产生的全长蛋白。用Leica DMR显微镜、数码相机以及关联的成像软件观察染色。
如以前记载(Barton-Davis等，J.Clin.Invest.104(4)375-381(1999))，通过植入麻醉小鼠皮下的Alzet渗透泵来传递化合物。本发明的每种化合物给药两个剂量。庆大霉素作为阳性对照，并且仅装有溶剂的泵作为阴性对照。泵中装载适量的化合物，从而暴露于组织的计算剂量为10mM和20mM。计算所述庆大霉素的浓度达到组织暴露大约200mM。在试验初期，治疗小鼠14天，之后用氯胺酮(ketamine)麻醉动物并放血。然后离体分离、冷冻实验动物的胫骨前肌(tibialis anterior，TA)，并用于免疫荧光分析横纹肌中的肌养蛋白的掺入。通过以前记载的免疫染色(Barton-Davis等，J.Clin.Invest.104(4)375-381(1999))检测TA肌肉中肌养蛋白的存在。
蛋白印迹分析使用市售的肌养蛋白抗体，通过蛋白印迹分析得自本发明化合物治疗4周的mdx小鼠的四头肌。提取自野生小鼠四头肌的蛋白作为阳性对照。观察在受治疗小鼠中全长肌养蛋白的产生。全长肌养蛋白产生的量，作为无义抑制的结果但不限于此理论，大约为野生表达水平的10％。
免疫荧光用本发明不同的化合物(每一种化合物至少n＝2)治疗雄性mdx小鼠(9-11周龄)。每天注射一次25毫克/千克的适量所述化合物，注射两周。在两周治疗后，处死小鼠移出肌肉检测肌养蛋白连读效率。
使用肌养蛋白抗体，在10微米冷冻切片上完成免疫荧光(Immunofluorescence，IF)。所述抗体识别mdx小鼠中发现的提前终止突变体C-端表位。图像分析以同样的方式在所有切片上分析。分析来自治疗或未治疗小鼠的图像，信号强于未治疗对照上的信号认为阳性，表明提前终止密码子抑制在肌养蛋白mRNA中发生。
肌肉力学离体全面肌肉力学在来自动物的长伸肌(extensor digitorum longus，EDL)肌肉上进行。最适肌肉长度(Optimum muscle length，Lo)定义为产生最大颤搐张力(twitchtension)的长度。最适肌肉长度处的最大强直性张力使用120赫兹、500毫秒脉冲在超大电压下测量。监测通过一系列5个偏心性强直收缩诱导的抗机械性损伤的保护。所述测量利用700毫秒刺激周期完成，在该期间内肌肉最初500毫秒保持等长收缩，然后以0.5Lo/秒的速率伸长8％或10％的Lo。抗机械性损伤的保护在80赫兹刺激频率下评定。以在第一次和最后一次偏心性收缩之间的力量损失测定损伤。
实施例6p53基因中的无义突变抑制为制备动物模型系统，将CAOV-3细胞(1×107)注射到裸鼠(nude/nude mice)的侧腹。12天后，小鼠随机分组(每组10只小鼠)，并用3毫克/千克本发明化合物皮下治疗(每周5天)，或用30毫克/千克本发明化合物腹膜内治疗(每周1天)。每周测量肿瘤体积。通过本发明的化合物在p53基因中的无义突变抑制能抑制癌症在体内生长。
实施例7本发明化合物能修饰对特异性核苷酸28S rRNA的接近以前的研究已经证明庆大霉素以及其他降低翻译忠实度的氨基糖苷家族的成员结合16S rRNA的A位点。通过化学足迹法(chemical footprinting)、紫外交联以及核磁共振，已证实庆大霉素在核苷酸1406、1407、1494和1496处结合所述16S rRNA的A位点(包括核苷酸1400-1410和1490-1500，大肠杆菌编号)(Moazed & Noller，Nature 327(6121)389-394(1978)；Woodcock等，EMBO J.10(10)3099-3103(1991)；以及Schroeder等，EMBO J.191-9(2000))。
从海拉细胞制备的核糖体与小分子(在100mM浓度下)孵育，然后用化学修饰剂(硫酸二甲酯(dimethyl sulfate，DMS)和乙氧丁酮醛(kethoxal，KE))处理。化学修饰后，用苯酚-氯仿萃取rRNA，并用乙醇沉淀，在引物延伸反应中使用末端标记的杂交三种rRNA不同区域的寡聚核苷酸分析，并在6％聚丙烯酰胺凝胶上拆分。引物延伸探针覆盖全部18S(7寡聚核苷酸引物)、28S(24寡聚核苷酸引物)和5S(一个引物)的rRNA。这些实验中的对照包括二甲亚砜(二甲亚砜诱导的rRNA中可接近性的变化对照)、巴龙霉素(18S rRNA结合标记)以及茴香霉素(28S rRNA结合标记)。
这里引用的所有出版物以及专利申请在此全文引入作为参考，如同每一单独出版物或专利申请具体地且个别地表明引入作为参考一般。
虽然一定的实施方式已在上文详细描述，本领域普通技术人员能够清楚地理解实施方式中许多可能的不背离其教导的变化。所有这些变化均包含在本发明的权利要求内。
权利要求
1.一种治疗或预防由体细胞突变引起的疾病的方法，该方法包括对有此需要的患者给药有效量的式1化合物或者式1所示化合物的药物学可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、多晶型物、外消旋物或立体异构体 其中W、X、Y和Z独立地选自N或C-Ra，其中Ra为氢或C1-C4的烷基，其中W、X、Y或Z中的至少一个为N；n为0、1、2或3；R1为氰基；任选地由一个或两个C1-C4烷基取代的氨基甲酰基；或由羟基、C1-C4烷基、或C1-C4烷氧基取代的羰基；R独立地选自羟基；卤素；任选地由一个或多个独立地选择的卤素或羟基取代的C1-C4烷基；任选地由一个或多个独立地选择的卤素或苯基取代的C1-C4烷氧基；任选地由一个或多个独立地选择的C1-C4烷基取代的C4-C8环烷基；-Rb基；-O-Rb基；任选地由一个或多个独立地选择的C1-C4烷基、氧代或-Rb基取代的五元到六元杂环；具有两个环结构的九元至十元杂环；由羟基、C1-C4烷基或C1-C4烷氧基取代的羰基；任选地由一个或两个C1-C4烷基取代的氨基甲酰基；硝基；氰基；任选地由羟基、C1-C4烷基或-Rb基取代的硫；任选地由羟基、C1-C4烷基或-Rb基取代的磺酰基；任选地由一个或两个独立地选择的C1-C4烷基、磺酰基、或羰基取代的氨基，其中，所述氨基磺酰基任选地由羟基、C1-C4烷基或-Rb基取代，并且其中所述氨基羰基任选地由C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、苯甲酸基或任选地由-Rb基取代的氨基所取代；或两个R基与它们连接的苯环一起形成苯并[1，3]间二氧杂环戊烯或2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英基；其中-Rb为任选地由下列一个或多个基团取代的C6-C8芳基羟基、卤素、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基或任选地由一个或多个C1-C4烷基取代的氨基。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述式1的化合物或其药物学可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、多晶型物、外消旋物或立体异构体以含有所述化合物和药物学可接受的载体或稀释剂的组合物形式给药。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述给药为静脉内给药。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，R1在间位或对位。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，W、Y和Z各自为N，而X为C-Ra(式1-A).
6.根据权利要求5所述的方法，其中，R1为羧基，并位于间位或对位。
7.根据权利要求5所述的方法，其中，Ra为氢。
8.根据权利要求5所述的方法，其中，n为1或2。
9.根据权利要求5所述的方法，其中，n为1。
10.根据权利要求5所述的方法，其中，R独立地选自卤素、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基或C1-C4烷氧基。
11.根据权利要求5所述的方法，其中，R位于一个或多个间位、一个或多个对位、或者一个或多个间位及对位。
12.根据权利要求1所述的方法，其中，Y和Z均为N，并且W和X均为C-Ra(式1-B)
13.根据权利要求12所述的方法，其中，R1为羧基，并位于间位或对位。
14.根据权利要求12所述的方法，其中，Ra为氢。
15.根据权利要求12所述的方法，其中，n为0、1或2。
16.根据权利要求12所述的方法，其中，n为1或2。
17.根据权利要求12所述的方法，其中，n为0或1。
18.根据权利要求12所述的方法，其中，R独立地选自卤素、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基或氨基。
19.根据权利要求12所述的方法，其中，R位于一个或多个间位、一个或多个对位、或者一个或多个间位及对位。
20.根据权利要求1所述的方法，其中，W和Y均为N，并且X和Z均为C-Ra(式1-C)
21.根据权利要求20所述的方法，其中，R1为羧基，并位于间位或对位。
22.根据权利要求20所述的方法，其中，Ra为氢。
23.根据权利要求20所述的方法，其中，n为1或2。
24.根据权利要求20所述的方法，其中，n为1。
25.根据权利要求20所述的方法，其中，R独立地选自C1-C4烷基。
26.根据权利要求20所述的方法，其中，R位于一个或多个间位、一个或多个对位、或者一个或多个间位及对位。
27.根据权利要求1所述的方法，其中，W和Z均为N，并且X和Y均为C-Ra(式1-D)
28.根据权利要求27所述的方法，其中，R1为羧基，并位于间位或对位。
29.根据权利要求27所述的方法，其中，Ra独立地选自氢或甲基。
30.根据权利要求27所述的方法，其中，n为1或2。
31.根据权利要求27所述的方法，其中，R位于一个或多个间位、一个或多个对位、或者一个或多个间位及对位。
32.根据权利要求1所述的方法，其中，W为N，并且X、Y和Z各自为C-Ra(式1-E)
33.根据权利要求32所述的方法，其中，R1为羧基，并位于间位或对位。
34.根据权利要求32所述的方法，其中，Ra为氢。
35.根据权利要求32所述的方法，其中，n为1或2。
36.根据权利要求32所述的方法，其中，n为1。
37.根据权利要求32所述的方法，其中，R独立地选自C1-C4烷基。
38.根据权利要求32所述的方法，其中，R位于一个或多个间位、一个或多个对位、或者一个或多个间位及对位。
39.根据权利要求1所述的方法，其中，X为N，并且W、Y和Z各自为C-Ra(式1-F)
40.根据权利要求39所述的方法，其中，R1为羧基，并位于间位或对位。
41.根据权利要求39所述的方法，其中，Ra为氢。
42.根据权利要求39所述的方法，其中，n为1或2。
43.根据权利要求39所述的方法，其中，n为1。
44.根据权利要求39所述的方法，其中，R独立地选自C1-C4烷基。
45.根据权利要求39所述的方法，其中，R位于一个或多个间位、一个或多个对位、或者一个或多个间位及对位。
46.根据权利要求1所述的方法，其中，Y为N，并且W、X和Z各自为C-Ra(式1-G)
47.根据权利要求46所述的方法，其中，R1为羧基，并位于间位或对位。
48.根据权利要求46所述的方法，其中，Ra为氢。
49.根据权利要求46所述的方法，其中，n为1或2。
50.根据权利要求46所述的方法，其中，n为1。
51.根据权利要求46所述的方法，其中，R独立地选自C1-C4烷基。
52.根据权利要求46所述的方法，其中，R位于一个或多个间位、一个或多个对位、或者一个或多个间位及对位。
53.根据权利要求1所述的方法，其中，Z为N，并且W、X和Y各自为C-Ra(式1-H)
54.根据权利要求53所述的方法，其中，R1为羧基，并位于间位或对位。
55.根据权利要求53所述的方法，其中，Ra为氢。
56.根据权利要求53所述的方法，其中，n为0、1或2。
57.根据权利要求53所述的方法，其中，n为1或2。
58.根据权利要求53所述的方法，其中，n为0或1。
59.根据权利要求53所述的方法，其中，R独立地选自C1-C4烷基。
60.根据权利要求53所述的方法，其中，R位于一个或多个间位、一个或多个对位、或者一个或多个间位及对位。
61.一种治疗或预防自身免疫性疾病、血液病、胶原疾病、糖尿病、神经退化疾病、心血管病、肺病、炎症性疾病或中枢神经系统疾病的方法，该方法包括对有此需要的患者给药有效量的式1化合物或其药物学可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、外消旋物或立体异构体。
62.根据权利要求61所述的方法，其中，所述给药为静脉内给药。
63.根据权利要求61所述的方法，其中，所述自身免疫性疾病为类风湿性关节炎或移植物抗宿主病。
64.根据权利要求61所述的方法，其中，所述炎症性疾病为关节炎。
65.根据权利要求61所述的方法，其中，所述中枢神经系统疾病为多发性硬化、肌营养不良、杜兴肌营养不良、阿尔茨海默病、神经退化疾病或帕金森症。
66.根据权利要求61所述的方法，其中，所述血液病为血友病、冯·维勒布兰德病、共济失调性毛细血管扩张症、β地中海贫血症或肾结石。
67.根据权利要求61所述的方法，其中，所述胶原疾病为成骨不全症或硬化。
68.一种治疗或预防家族性红细胞增多症、免疫缺陷、肾疾病、囊性纤维化症、家族性高胆固醇血症、视网膜色素变性、淀粉样变性病、血友病、阿尔茨海默病、家族黑蒙性痴呆(Tay Sachs disease)、尼曼匹克症、帕金森症、动脉粥样硬化、巨人症、侏儒症、甲状腺机能亢进、衰老症、肥胖症、杜兴肌营养不良或马凡氏综合症的方法，该方法包括对有此需要的患者给药有效量的式1化合物或其药物学可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、外消旋物或立体异构体。
69.根据权利要求68所述的方法，其中，所述给药为静脉内给药。
70.一种治疗或预防人类癌症的方法，该方法包括对有此需要的人类给药有效量的式1化合物或其药物学可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、外消旋物或立体异构体。
71.根据权利要求70所述的方法，其中，所述给药为静脉内给药。
72.根据权利要求70所述的方法，其中，所述癌症为头和颈、眼、皮肤、口、咽喉、食管、胸、骨、血、肺、结肠、乙状结肠、直肠、胃、前列腺、乳房、卵巢、肾、肝、胰腺、脑、肠、心脏或肾上腺的癌症。
73.根据权利要求70所述的方法，其中，所述化合物或其药物学可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、外消旋物或立体异构体包括药物学可接受的载体或稀释剂。
74.根据权利要求70所述的方法，其中，所述癌症为实体瘤。
75.根据权利要求70所述的方法，其中，所述癌症为肉瘤、癌、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管源性癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、维尔姆斯瘤、子宫颈癌、睾丸瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、卡波西肉瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤(menangioma)、黑素瘤、成神经细胞瘤、视网膜母细胞瘤、血液产生的肿瘤或多发性骨髓瘤。
76.根据权利要求70所述的方法，其中，所述癌症为急性成淋巴细胞性白血病、急性B淋巴细胞白血病、急性T淋巴细胞白血病、急性原粒细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、急性单核细胞性白血病、急性红白血病、急性成巨核细胞白血病、急性髓单核细胞白血病、急性非淋巴细胞白血病、急性未分化型白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病或多发性骨髓瘤。
77.一种治疗或预防与p53基因突变相关的疾病的方法，该方法包括对有此需要的患者给药有效量的式1化合物或其药物学可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、外消旋物或立体异构体。
78.根据权利要求77所述的方法，其中，所述给药为静脉内给药。
79.根据权利要求77所述的方法，其中，所述疾病为肉瘤、癌、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管源性癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、维尔姆斯瘤、子宫颈癌、睾丸瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、卡波西肉瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤、视网膜母细胞瘤、血液产生的肿瘤或多发性骨髓瘤。
80.一种抑制癌细胞生长的方法，其包括使癌细胞与有效量的式1化合物或其药物学可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、外消旋物或立体异构体接触。
81.一种在哺乳动物内选择性制备蛋白质的方法，其包括在哺乳动物内转录含有无义突变的基因；以及将有效量的式1化合物提供给所述哺乳动物，其中所述蛋白质通过所述哺乳动物制得。
82.式1的化合物或者式1所示化合物的药物学可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、多晶型物、外消旋物或立体异构体 其中W、X、Y和Z独立地选自N或C-Ra，其中Ra为氢或C1-C4的烷基，其中W、X、Y或Z中的至少一个为N；n为0、1、2或3；R1为氰基；任选地由一个或两个C1-C4烷基取代的氨基甲酰基；或由羟基、C1-C4烷基、或C1-C4烷氧基取代的羰基；R独立地选自羟基；卤素；任选地由一个或多个独立地选择的卤素或羟基取代的C1-C4烷基；任选地由一个或多个独立地选择的卤素或苯基取代的C1-C4烷氧基；任选地由一个或多个独立地选择的C1-C4烷基取代的C4-C8环烷基；-Rb基；-O-Rb基；任选地由一个或多个独立地选择的C1-C4烷基、氧代或-Rb基取代的五元到六元杂环；具有两个环结构的九元至十元杂环；由羟基、C1-C4烷基或C1-C4烷氧基取代的羰基；任选地由一个或两个C1-C4烷基取代的氨基甲酰基；硝基；氰基；任选地由羟基、C1-C4烷基或-Rb基取代的硫；任选地由羟基、C1-C4烷基或-Rb基取代的磺酰基；任选地由一个或两个独立地选择的C1-C4烷基、磺酰基、或羰基取代的氨基，其中，所述氨基磺酰基任选地由羟基、C1-C4烷基或-Rb基取代，并且其中所述氨基羰基任选地由C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、苯甲酸基或任选地由-Rb基取代的氨基所取代；或两个R基与它们连接的苯环一起形成苯并[1，3]间二氧杂环戊烯或2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英基；其中-Rb为任选地由下列一个或多个基团取代的C6-C8芳基羟基、卤素、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基或任选地由一个或多个C1-C4烷基取代的氨基。
83.根据权利要求83所述的化合物，其中，所述化合物选自化合物1-89。
84.具有下式的化合物(化合物No1)
全文摘要
本发明涉及通过给予本发明的化合物或组合物用于治疗或预防与mRNA无义突变相关的疾病的方法、化合物和组合物。更具体地，本发明涉及用于抑制与mRNA中无义突变相关的翻译提前终止的方法、化合物和组合物。
文档编号A61K31/495GK101076337SQ200580042808
公开日2007年11月21日 申请日期2005年10月13日 优先权日2004年10月13日
发明者N·阿尔姆斯戴德, G·M·卡普, R·怀尔德, E·韦尔奇, 任洪玉 申请人:Ptc医疗公司