专利名称：用于分子成像的靶向剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及靶向对比剂(contrast agent)和靶向治疗剂、它们的生产方法以及用途。
在医学诊断方面有着非常重要作用的已知的成像技术包括正电子发射断层(PET)、计算机断层(CT)、磁共振成像(MRI)、单光子发射计算机断层(SPECT)和超声(US)。尽管目前的成像技术已经得到了很好的发展，但是它们几乎都依赖于区分病理组织和正常组织的非特异的、大体上的、物理上的、生理上的、或代谢上的改变。
靶向分子成像(MI)可以使得医学诊断达到新的高度。术语“靶向(targeting)”涉及天然的或合成的配体(结合剂)在体外或体内与相关分子(分子靶点)的高度特异的结合。
MI是短期内新出现的生物医学研究学科，其可以被定义为在细胞和亚细胞水平上视觉显示、特征化和定量出完整的活体生物体内的生物过程。这是一种新的多学科领域，其中所生成的图像反映出了生理真实环境背景中所存在的疾病的细胞和分子途径以及体内机制，而不是鉴定出造成疾病的分子事件。
现在，已知有一些不同的对比增强剂，它们的非特异的或非靶向的形式已经被临床常规使用。文献中报道了下面所列的一些实例。
例如，按照W.Krause的“对比剂I”(Springer Verlag 2002，第1页起)，Gd复合物可以作为MRI的对比剂。此外，超顺磁性颗粒是对比增强单元的另一个实例，它也可以作为MRI的对比剂(对比剂教科书，超顺磁性氧化物，Dawson，Cosgrove and Grainger Isis Medical Media Ltd，1999，第373页起)。如在W.Krause(Springer Verlag 2002，第73页起)的对比剂II中所述，充气性微气泡可以以相似的方式用作为超声的对比剂。此外，W.Krause的“对比剂II”(Springer Verlag 2002，第151页起)报告了碘化脂质体或脂肪酸作为x光成像的对比剂的用途。
用于功能成像的对比增强剂主要是为PET和SPECT而开发的。
这些对比剂的一个实例是18F标记分子例如脱氧葡萄糖(Beuthien-Baumann B，et al.，(2000)，Carbohydr.Res.，327，107)。在W.Krause的“对比剂II”(Springer Verlag 2002，第201页起)中描述了这些标记分子用作PET的对比剂的用途。但是，它们只蓄积于肿瘤组织内，没有任何先前的特异的细胞相互作用。此外，99Tc标记的分子例如抗体或肽可以用作SPECT的靶向对比剂(Verbruggen A.M.，Nosco D.L.，VanNerom CG.et al.，99mTc-L，L-ethylenedicysteinea renal imaging agent，Nucl.Med.1992，33，551-557)，但是这些复合分子的标记是非常困难的和非常昂贵的。
一些目前已经用于PET/SPECT的其它配体也同样如此，例如L-DOPA(多巴胺受体，帕金森)(Luxen A.，Guillaume M，Melega WP，PikeVW，Solin O，Wagner R，(1992)Int.J.Rad.Appl.Instrum.B 19，149)；5-羟色胺类似物(5-羟色胺受体)(Dyck CH，et al.，2000，J.Nucl.Med.，41，234)；生长抑素类似物(生长抑素，肿瘤学)(Maecke，H.R.et al.，Eur.J.Nucl.Med.Mol.Imaging，2004，Mar.17)；整联蛋白受体肽(血管生成)(Wicklinde，S.A.et al.，Cancer Res.，2003 Sep.15，63(18)，5838-43；Wicklinde，S.A.et al.，Circulation 2003 Nov.4，108，(18)，2270-4)。
WO 01/09193 A1和US 6,437,095 B1要求保护嵌合多肽、通过肽的直接连接和二硫键形成生成所述多肽的方法以及其用于多聚体药物试剂(治疗剂)的用途。静电作用促进了两种合成肽的直接连接以及随后的二硫键形成，如在S.A.Richter et al.，Protein Engineering，2001，vol.14，no.10，pp 775-783中所述的那样。
但是，对造成疾病的特殊分子事件的鉴定在医学上的重要性逐渐增加。因此，装配有分子识别机制使得对比增强剂在体内或体外特异地富集于特定组织内并容许阐明分子病理学的靶向剂对于诊断和未来的治疗都是非常关键的。
因此，本发明的一个目的是提供新一代的改良对比剂，其容许进行高敏感性和特异性的早期诊断以及鉴别诊断，以及用于生产所述改良对比剂的方法，其费用较为低廉且较为省时。提供生产方法和据此产生的靶向剂也是有利的，其可以被容易地应用于实际出现的那些必须在短时内、以较低的成本和人力解决的问题。与它们用于诊断成像的能力不同的是，靶向对比剂也在开发新的治疗药物方面起到了关键作用。目前仍不能获得这种靶向对比剂。
通过在下面以及权利要求书和实施例中所述的本发明可以有利地实现本发明的目的。在附图中描述了优选的变体，其并用于解释本发明，但无意于限制本发明。
本发明涉及一种用于生产靶向对比剂或靶向治疗剂的方法的有利的变体，所述方法包括步骤a)提供核心；b)给核心添加壳；c)通过附着至少第一种多肽修饰所述壳，所述第一种多肽包含至少一个半胱氨酸；d)提供携带第二种互补多肽的配体，所述第二种互补多肽包含至少一个半胱氨酸；和e)经连接单元将至少一个配体连接到所述壳上，所述连接单元是通过所述第一种多肽和所述第二种互补多肽之间的静电连接以及随后在所述半胱氨酸之间形成至少一个二硫键而形成的。
在所述方法的另一个实施方式中，在步骤b)中可以给核心添加多于一个的壳。或者换句话说，可以通过一个或数个内壳将外壳与核心分离开。在本发明的优选实施方式中，核心与外壳可以被1到100个内壳分离开，更优选地是1到50个内壳。因此，壳可以包含单层或多层。这些壳中的每个壳(在本发明的优选实施方式中，其可以包含单层的或多层的合适材料)的厚度约为0.5nm到100nm。在本发明的一个优选实施方式中，每个壳的厚度约为0.5nm到500nm。此外，每个壳或者甚至数个壳可以包含相同的材料或不同的材料。
在本发明的更多变体中，壳至少部分覆盖核心。当例如有机聚合物(例如聚乙二醇/PEG、聚乙烯醇/PVA、聚酰胺、聚丙烯酸酯、聚脲)、具有功能性端基的有机聚合物(例如1.2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[羧基(聚乙二醇)2000]铵盐(1，2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-N-[Carboxy(polyethyleneglycol)2000]ammonium salt))、生物聚合物(例如多糖例如葡聚糖、木聚糖、糖原、果胶、纤维素或多肽例如胶原、球蛋白)、半胱氨酸或高半胱氨酸含量的肽或磷脂作为壳时，优选地就是这种情况。本发明中的给核心添加壳表示完整地围绕核心、仅仅覆盖一些不同的区域、以及优选地是这些情形之间的所有范围。
对于特殊的应用，可能并不适合给核心添加一个或多个壳。因此，本发明也涉及用于生产靶向对比剂的变体方法，方法包括步骤a)提供核心；b)通过附着至少第一种多肽修饰所述壳，所述第一种多肽包含至少一个半胱氨酸；c)提供携带第二种互补多肽的配体，所述第二种互补多肽包含至少一个半胱氨酸；和d)经连接单元将至少一个配体连接到所述核心上，所述连接单元是通过所述第一种多肽和所述第二种互补多肽之间的静电连接以及随后在所述半胱氨酸之间形成二硫键而形成的。
通过所附的从属权利要求描述了用于生产靶向对比剂或靶向治疗剂的本方法的有利的变化形式。
本发明包括一些如下面详细描述的具体的有利的变化形式。
“核心”表示适合作为本发明的靶向对比剂的对比增强部分和/或治疗部分的材料。由于用作连接单元的多肽具有特殊的结构，使得所述核心与配体发生共价结合及离子键结合。
在本发明中，术语“配体”可以作为结合剂的同义词或者优选地作为生物活性配体的同义词。
术语“连接单元”表示在生产过程中至少两种多肽的连接。
有利地，“第一种多肽”包括1到3个半胱氨酸以及4到12个选自由精氨酸、赖氨酸和鸟氨酸组成的组中的碱性氨基酸或者4到12个选自由谷氨酸和天冬氨酸组成的组中的酸性氨基酸，“第二种互补多肽”包括1到3个半胱氨酸以及4到12个选自由谷氨酸和天冬氨酸组成的组中的酸性氨基酸或者4到12个选自由精氨酸、赖氨酸和鸟氨酸组成的组中的碱性氨基酸，其中为第一种和第二种多肽所选的碱性氨基酸组是不同的(wherein the group of basic amino acids selected for the first and secondpolypeptides are different)。
因此，“互补序列”表示碱性或酸性氨基酸或者任何其它的氨基酸，它们彼此相互作用的静电电荷是相反的。
“壳”表示能容许较好地分散靶向对比剂的材料，根据用作壳的材料的不同，其可以降低其毒性或者可以预防不良作用。如果纳米颗粒被用作核心，合适的壳(例如ZnS壳)的应用可以减少纳米颗粒的表面缺陷的数目。这些缺陷非常显著地降低了纳米颗粒所生成的对比作用。因此，减少缺陷的数目将产生更好的靶向对比增强剂。
在温和的反应条件下，在水介质中可以产生所述多肽之间的离子键和共价键，使得配体优选地保持其完整的生物学活性。这是可能的，因为两种互补多肽之间的静电相互作用容许在特别温和的条件下形成二硫键以及因为结合单元和对比增强核心(或者最后的核心/壳组件)都是水溶性的。
“温和条件”优选地表示本领域已知的条件，在所述条件下，配体分别保留其活性和特异性，条件例如是水溶液或血液或血清溶液、生理pH值和室温。
“连接”是在分别附着到核心和/或壳或配体的所述多肽的半胱氨酸上位点特异性进行的。因为可以按直接调节的和高度选择性的方式将所述多肽固定到配体(或核心/壳)上，所以配体的催化或调控中心或者特异结合的识别位点仍将保留其天然的活性或者避免配体的失活。
应该按与所述多肽固定到配体上相同的方式理解术语“经附着修饰核心/壳”的含义。
壳还可以包括其他组分，例如使得完整的靶向剂能够通过例如细胞膜的蛋白(例如HIV-tat肽等)或者能够增加生物相容性或降低毒性的蛋白。
在本发明中所述的方法可以适用于任何配体和任何对比增强材料或者治疗材料，因此为制备任何类型的靶向对比剂或靶向治疗剂提供了非常多能的和容易适应的系统。
本发明还涉及靶向对比剂和靶向治疗剂以及其用途。
本发明的靶向对比剂具有下面的的特征，这些特征用于描述本发明，但是这并非是限制性的。
根据对比增强材料的不同，靶向对比剂可以应用于不同的成像方法例如MRI、US、SPECT、CT、PET、光学成像、或者多模块方法例如PET/CT。
靶向对比剂包含对比增强核心(例如磁性纳米颗粒)或治疗核心，所述核心可以被一个或多个壳所覆盖，以便提高稳定性和/或生物相容性和/或降低体内毒性(例如PEG壳)。
如果纳米颗粒被用作核心，这些颗粒的大小可以从约1nm到200nm不等。在本发明的优选的实施方式中，颗粒的大小可以从1nm到100nm不等。
如果聚合物被用作壳，这些聚合物的分子量可以从200g/mol到200000g/mol不等。在本发明的优选的实施方式中，这些聚合物的分子量可以从200g/mol到100000g/mol不等。
靶向对比剂包含靶向配体。
本发明的靶向对比剂的最优选的变体包含核心、至少一种连接单元和至少一个配体。
此外，本发明涉及包含核心、至少一个壳、至少一个连接单元和至少一个配体的靶向对比剂或靶向治疗剂的有利的规格。
本发明的目的还包括用任一所述的或要求保护的方法产生的靶向对比剂或靶向治疗剂。
本发明的靶向对比剂或靶向治疗剂适用于诊断或治疗，优选地适用于靶向分子成像。
本发明也包含用于CT、MRI、PET、SPECT或US的靶向对比剂。
此外，本发明的靶向对比剂或靶向治疗剂用于生产适用于诊断或治疗的化合物的用途以及靶向对比剂或靶向治疗剂用于生产适用于靶向分子成像的化合物的用途都是本发明的目的。另外，本发明涉及本发明的靶向对比剂用于生产适用于CT、MRI、PET、SPECT或US的化合物的用途。
图1示意性地描述了本发明的靶向对比剂的最优选的变体。
附图的详细说明图1-核心(1)例如(但不限于此)用于以下用途的对比增强材料、或者治疗材料-MRI例如(但不限于此)亚铁磁性材料、反铁磁性材料、铁磁性材料或超顺磁性材料，例如铁(Fe)、氧化铁γFe2O3或Fe3O4或具有尖晶石结构(spinell structure)的铁酸盐MFe2O4(M＝Mn、Co、Ni、Cu、Zn、Cd)或具有石榴石结构(granat structure)的铁酸盐M3Fe5O12(M＝Y，La，Ce，Pr，Nd，Sm，Eu，Gd，Tb，Dy，Ho，Er，Tm，Yb，Lu)或具有磁性铅酸盐结构(magnetoplumbit structure)的铁酸盐MFe12O19(M＝Ca，Sr，Ba，Zn)或其它六方形的铁酸盐结构例如Ba2M2Fe12O22(M＝Mn，Fe，Co，Ni，Zn，Mg)；在所有情况中，核心可以掺加额外的0.01到5.00mol％的Mn、Co、Ni、Cu、Zn或F。
-基于顺磁性离子(例如镧系元素、锰、铁、铜)的对比增强单元，例如钆螯合物如Gd(DTPA)、Gd(BMA-DTPA)、Gd(DOTA)、Gd(DO3A)；寡聚体结构；大分子结构，例如白蛋白Gd(DTPA)20-35、葡聚糖Gd(DTPA)、Gd(DTPA)-24-串级聚合物(Gd(DTPA)-24-cascade-polymer)、聚赖氨酸-Gd(DTPA)、MPEG聚赖氨酸-Gd(DPTA)；基于镧系元素的树状结构的对比增强单元；基于锰的对比增强单元，例如Mn(DPDP)、Mn(EDTA-MEA)、聚Mn(EED-EEA)和聚合物结构；作为顺磁性离子的载体的脂质体，例如脂质体Gd(DTPA)；非质子成像剂；-光学成像例如(但不限于)发光材料，例如纳米磷光体(例如掺加YPO4或LaPO4的稀土)或半导体纳米晶体(所谓的量子点(quantumdots)；例如CdS、CdSe、ZnS/CdSe、ZnS/CdS)；羰花青染料；基于四吡咯的染料(卟啉、二氢卟酚、酞菁以及相关结构)；δ-氨基乙酰丙酸；荧光镧系元素螯合物；荧光素或5-氨基荧光素或异硫氰酸荧光素(FITC)或其它的荧光素相关的荧光体，例如Oregon Green、萘荧光素(naphthofluorescein)；-US例如(但不限于这些)壳(例如蛋白、脂质、表面活性剂或聚合物)包囊化气体(例如空气、八氟丙烷(perfluorpropane)、十二氟烷(dodecafluorcarbon)、六氟化硫(sulphur hexafluride)、全氟碳化合物(perfluorcarbon))；气泡(例如Amersham的Optison、Schering的Levovist)；壳(例如蛋白、脂质、表面活性剂或聚合物)包囊化小滴；纳米颗粒(例如铂、金、钽)；-X光例如(但不限于)碘化的对比增强单元例如2，4，6-三碘苯的离子和非离子衍生物；基于硫酸钡的对比增强单元；金属离子螯合物例如基于钆的化合物；具有高比例碘的硼簇(boron clusters)；聚合物，例如碘化多糖、聚合三碘苯；表现出低水溶性的碘化化合物的颗粒；含有碘化化合物的脂质体；碘化脂质例如甘油、脂肪酸；-PET例如(但不限于)基于11C、13N、15O、66/8Ga、60Cu、52Fe、55Co、61/2/4Cu、62/3Zn、70/14As、75/6Br、82Rb、86Y、89Zr、110In、120/4I、122Xe和18F的示踪剂，例如18F-FDG(葡萄糖代谢)；11C-甲硫氨酸、11C-酪氨酸、18F-FMT、18F-FMT或18F-FET(氨基酸)；18F-FMISO、64Cu-ATSM(低氧)；18F-FLT、11C-胸腺嘧啶、18F-FMAU(增殖)；-SPECT例如(但不限于)基于放射性核素的对比增强单元，例如99mTc、123/5/131I、67Cu、67Ga、111In、201Tl；-治疗性材料例如(但不限于这些)毒素、放射性同位素和化疗剂；发射UV-C的纳米颗粒例如YPO4:Pr；光动力学治疗(PDT)剂，例如基于扩展性卟啉结构(expanded porphyrin structures)的化合物；用于放疗的核素，例如157Sm、177Lu、212/3Bi、186/8Re、67Cu、90Y、131I、114mIn、At、Ra、Ho；-自动化对比增强单元(Smart contrast-enhancing units)，例如(但不限于这些)化学交换饱和转移(chemical exchange saturation transfer(CEST))；热敏性MRI对比剂(例如脂质体)；pH敏感性MRI对比剂；氧分压或酶应答性MRI对比剂；金属离子浓度依赖性MRI对比剂；-多模块上述内容的组合。
-壳(2)例如(但不限于)可以包含羧酸、酰基卤、胺、酸酐、活化的酯、马来酰亚胺、异硫氰酸酯、胺、金、SiO2、多磷酸盐(例如多磷酸钙)、氨基酸(例如半胱氨酸)、有机聚合物(例如聚乙二醇/PEG、聚乙烯醇/PVA、聚酰胺、聚丙烯酸酯、聚脲)、有机的功能性聚合物(例如1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[羧基(聚乙二醇)2000]铵盐)、生物聚合物(例如多糖例如葡聚糖、木聚糖、糖原、果胶、纤维素或多肽例如胶原、球蛋白)、半胱氨酸或具有高半胱氨酸含量的肽、或磷脂。
-壳(3)例如(不限于这些)包含或者已经附着了由1到3个半胱氨酸和4到12个选自由精氨酸、赖氨酸和鸟氨酸组成的组中的碱性氨基酸或者选自由谷氨酸和天冬氨酸组成的组中的酸性氨基酸组成的多肽链。另外，还可以掺入生物分子例如蛋白，使得完整的组件能通过例如细胞膜(例如HIV-tat肽等)或者增加生物相容性或降低毒性。如果所述多肽被附着到对比增强单元(例如核心是由对比增强材料组成的)，这里就不需要壳。
核心与外壳可以被1到100个内壳分离开。在本发明的优选的实施方式中，核心与外壳可以被1到50个内壳分离开。这些壳中的每个壳(在本发明的优选的实施方式中，其可以由单层或多层合适的材料组成)的厚度约为0.5nm到100nm。在本发明的优选的实施方式中，每个壳的厚度约为0.5nm到500nm，并且可以由不同的材料或相同的材料制成。此外，壳至少可以部分地覆盖核心。
-连接单元(4)-例如(不限于)嵌合多肽单元，其包含经1到3个基于半胱氨酸的二硫键化学连接的第一种和第二种多肽链；-例如(不限于此)第一种多肽链是由1到3个半胱氨酸和4到12个选自由精氨酸、赖氨酸和鸟氨酸组成的组中的碱性氨基酸组成的；-例如(不限于此)第二种多肽链是由1到3个半胱氨酸和4到12个选自由谷氨酸和天冬氨酸组成的组中的酸性氨基酸组成的；-例如(不限于此)一种多肽经其C或N末端与对比增强单元或外壳相连接，以及另一种多肽链与配体相连接；-例如(不限于此)嵌合多肽单元经1到3个基于半胱氨酸的二硫键得以化学地连接；-配体(5)-例如(不限于此)配体，其通过它的特异性识别机制使得对比剂富集于不同的组织或相关的靶区域内(例如通过抗体抗原相互作用)；-例如(不限于此)该配体已经附着了由1到3个半胱氨酸和4到12个选自由精氨酸、赖氨酸和鸟氨酸组成的组中的碱性氨基酸或者选自由谷氨酸和天冬氨酸组成的组中的酸性氨基酸组成的多肽链；-配体例如可以是(但不限于)-抗体(单克隆抗体、多克隆抗体、小鼠抗体、小鼠-人嵌合抗体、人抗体、单链抗体、Diabody等)，例如Trastuzumab(乳腺癌)、Rituximab(非霍奇金淋巴瘤)、Alemtuzumab(慢性淋巴细胞白血病)、Gemtuzumab(急性髓细胞白血病)、Edrecolomab(结肠癌)、Ibritumomab(非霍奇金淋巴瘤)、Cetuximab(结肠癌)、Tositumomab(非霍奇金淋巴瘤)、Epratuzumab(非霍奇金淋巴瘤)、Bevacizumab(肺癌和结肠癌)、抗CD33(急性髓细胞白血病)、Pemtumomab(卵巢癌和胃癌))、Mittumomab(肺癌和皮肤癌)、抗MUC 1(腺癌)、抗CEA(腺癌)、抗CD 64(plaques)等；-肽、多肽、肽模拟物，例如生长抑素类似物、血管活性肽类似物、神经肽Y、RGD肽等；-蛋白，例如膜联蛋白V、组织纤溶酶原激活物、转运蛋白等；-大分子，例如乙酰透明质酸、Apcitide、硫酸软骨素；-核酸，例如Apatamer、反义DNA/RNA/PNA、小干扰RNA等；-脂质，例如磷脂等-凝集素，例如白细胞刺激性凝集素-糖图2用Cys-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu(＝Cys-Glu8)官能团对对比增强单元进行表面修饰的反应方案通过与对比增强单元相连的羧酸和1-乙基-3-(二甲氨基丙基)碳化二亚胺氢氯化物(EDC)的一步式反应(onepot reaction)生成了o-Acylisourea中间物(室温、pH约为5)。该中间物与硫代NHS反应，得到硫代NHS-酯中间物。通过加入2-巯基乙醇淬火过量的EDC。最后，与含有Cys-Glu8的伯胺的反应生成了所需的酰胺键(室温，pH约为7)。
-核心(1)＝对比增强单元CdSe/ZnS量子点；-壳(2)羧酸；-壳(3)末端为胺的Cys-Glu8多肽链。
图3将Cys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys(＝Cys-Lys8)结合到携带Cys-Glu8官能团的对比增强材料中的反应方案通过Cys-Lys8和携带Cys-Glu8官能团的对比增强材料的一步式反应，随后加入氧化剂GSSG(氧化型谷胱苷肽)造成二硫键形成。
-核心(1)＝对比增强单元CdSe/ZnS量子点；-壳(2)羧酸；-壳(3)末端为胺的Cys-Glu8多肽链。
实施例通过使用一个末端携带羧酸官能团而另一个末端携带1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺官能团的水溶性聚合物，通过酸用羧酸官能团对CdSe/ZnS量子点(对比增强单元)进行表面修饰。
通过混合下面的物质(50℃，4个小时)可以获得经COOH包被的量子点-100μl CdSe/ZnS(于氯仿中，1w/v％)；-100μl氯仿；-200μl DPPC(5mM)---DPPC＝1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱；-200μl DSPE-PEG2000-COOH(5mM)---DSPE-PEG2000-COOH1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[羧基(聚乙二醇)2000]铵盐最后通过真空装置去除氯仿，并通过超声波处理将经COOH包被的量子点分散于水中。
通过1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺端基的疏水性相互作用(或吸附)，可以将1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[羧基(聚乙二醇)2000]铵盐与纳米颗粒的表面结合。此外，1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[羧基(聚乙二醇)2000]铵盐提供了羧基官能团，当其在酸性pH中质子化时，可以得到羧酸。
DPPC用作替代物(dummy)(间隔物)，以便使得固定于纳米颗粒上的COOH官能团之间留有空间。实际上，仅仅用COOH官能团覆盖整个纳米颗粒表面也会有副作用，其在机体的非所需组织或非所需区域内产生相互作用，并因此出现对比效应。
通过经酸的结合，用Cys-Glu8官能团对对比增强单元进行表面修饰。
其它实例可以是经活化的酯、经马来酰亚胺或经异硫氰酸酯进行结合。
如下可以完成这一点1)修饰水溶性的CdSe/ZnS量子点(图2)-55μl水-40μl 10xPBS溶液(PBS＝磷酸缓冲液0.01M磷酸缓冲液、0.0027M氯化钾、0.137M氯化钠、pH 7.4)-100μl 0.1M EDC溶液(EDC＝1-乙基-3-(二甲氨基丙基)碳化二亚胺氢氯化物)-5μl 20mM硫代NHS溶液(N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐)-200μl 2μM CdSe/ZnS量子点(末端为羧基)溶液-室温下孵育(30分钟)-10μl 2-巯基乙醇-混合15分钟-50μl 20mM Cys-Glu8
-室温下混合(2小时)-离心分离QD2)Cys-Lys8与对比增强单元QD-Cys-Glu8单元(图3)的结合水溶液包含-50μM Cys-Lys8-50μM QD-Cys-Glu8-2mM EDTA-2.5mM氧化型谷胱苷肽(GSSG)-室温下孵育(5个小时)-超速离心分离QD-缀合物
权利要求
1.一种用于生产靶向对比剂或靶向治疗剂的方法，该方法包括步骤a) 提供核心；b)给核心添加壳；c) 通过附着至少第一种多肽修饰所述壳，所述第一种多肽包含至少一个半胱氨酸；d)提供携带第二种互补多肽的配体，所述第二种互补多肽包含至少一个半胱氨酸；和e) 经连接单元将至少一个配体连接到所述壳上，所述连接单元是通过所述第一种多肽和第二种互补多肽之间的静电作用以及随后在所述半胱氨酸之间形成至少一个二硫键而形成的。
2.权利要求1的方法，其中在步骤b)中，给核心添加多于一个的壳。
3.权利要求1或2中任一项的方法，其中壳包含单层或多层。
4.权利要求1到3中任一项的方法，其中每个壳包含相同的材料或不同的材料。
5.权利要求1到4中任一项的方法，其中壳至少部分地覆盖核心。
6.一种用于生产靶向对比剂的方法，该方法包括步骤a)提供核心；b)通过附着至少第一种多肽修饰所述核心，所述第一种多肽包含至少一个半胱氨酸；c)提供携带第二种互补多肽的配体，所述第二种互补多肽包含至少一个半胱氨酸；和d)经连接单元将至少一个配体连接到所述核心上，所述连接单元是通过所述第一种多肽和第二种互补多肽之间的静电作用以及随后在所述半胱氨酸之间形成二硫键而形成的。
7.权利要求1到6中任一项的方法，其中a)第一种多肽包含1到3个半胱氨酸和4到12个选自由精氨酸、赖氨酸和鸟氨酸组成的组中的碱性氨基酸或者4到12个选自由谷氨酸和天冬氨酸组成的组中的酸性氨基酸；和b)第二种互补多肽包含1到3个半胱氨酸和4到12个选自由谷氨酸和天冬氨酸组成的组中的酸性氨基酸或4到12个选自由精氨酸、赖氨酸和鸟氨酸组成的组中的碱性氨基酸，其中为第一种和第二种多肽所选的碱性氨基酸组是不同的。
8.权利要求1到7中任一项的方法，其中第一种多肽以其C末端或N末端与所述壳或核心相连接，以及第二种互补多肽以其C末端或N末端与所述配体相连接。
9.权利要求1到8中任一项的方法，其中用作核心的材料选自亚铁磁性材料、反铁磁性材料、铁磁性材料或超顺磁性材料，例如铁(Fe)、氧化铁γ-Fe2O3或Fe3O4或具有尖晶石结构的铁酸盐MFe2O4(M＝Mn、Co、Ni、Cu、Zn、Cd)或具有石榴石结构的铁酸盐M3Fe5O12(M＝Y、La、Ce、Pr、Nd、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu)或具有磁性铅酸盐结构的铁酸盐MFe12O19(M＝Ca、Sr、Ba、Zn)或其它六方形的铁酸盐结构例如Ba2M2Fe12O22(M＝Mn、Fe、Co、Ni、Zn、Mg)；在所有情况中，所述核心可以掺加额外的0.01到5.00mol％的Mn、Co、Ni、Cu、Zn或F；基于顺磁性离子(例如镧系元素、锰、铁、铜)的对比增强单元，例如钆螯合物如Gd(DTPA)、Gd(BMA-DTPA)、Gd(DOTA)、Gd(DO3A)；寡聚体结构；大分子结构，例如白蛋白Gd(DTPA)20-35、葡聚糖Gd(DTPA)、Gd(DTPA)-24-串级聚合物、聚赖氨酸-Gd(DTPA)、MPEG聚赖氨酸-Gd(DPTA)；基于镧系元素的树状结构的对比增强单元；基于锰的对比增强单元，例如Mn(DPDP)、Mn(EDTA-MEA)、聚Mn(EED-EEA)和聚合物结构；作为顺磁性离子的载体的脂质体，例如脂质体Gd(DTPA)；非质子成像剂。
10.权利要求1到5和7到8中任一项的方法，其中用作核心的材料选自发光材料例如纳米磷光体(例如掺加YPO4或LaPO4的稀土)或半导体纳米晶体(所谓的量子点；例如CdS、CdSe、ZnS/CdSe、ZnS/CdS)；羰花青染料；基于四吡咯的染料(卟啉、二氢卟酚、酞菁以及相关结构)；δ-氨基乙酰丙酸；荧光镧系螯合物；荧光素或5-氨基荧光素或异硫氰酸荧光素(FITC)或其它的荧光素相关的荧光体例如Oregon Green、萘荧光素。
11.权利要求1到8中任一项的方法，其中用作核心的材料选自包囊化气体(例如空气、八氟丙烷、十二氟烷、六氟化硫、全氟碳化合物)；气泡(例如Amersham的Optison、Schering的Levovist)；包囊化小滴；纳米颗粒(例如铂、金、钽)。
12.权利要求1到5和7到8中任一项的方法，其中用作核心的材料选自碘化对比增强单元，例如2，4，6-三碘苯的离子和非离子衍生物；基于硫酸钡的对比增强单元；金属离子螯合物，例如基于钆的化合物；具有高比例碘的硼簇；聚合物例如碘化多糖、聚合三碘苯；表现出低水溶性的碘化化合物的颗粒；含有碘化化合物的脂质体；碘化脂质如甘油、脂肪酸。
13.权利要求1到8中任一项的方法，其中用作核心的材料选自基于11C、13N、15O、66/8Ga、60Cu、52Fe、55Co、61/2/4Cu、62/3Zn、70/1/4As、75/6Br、82Rb、86Y、89Zr、110I4、120/4I、122Xe和18F的示踪剂，例如18F-FDG(葡萄糖代谢)；11C-甲硫氨酸、11C-酪氨酸、18F-FMT、18F-FMT或18F-FET(氨基酸)；18F-FMISO、64Cu-ATSM(低氧)；18F-FLT、11C-胸腺嘧啶、18F-FMAU(增殖)。
14.权利要求1到8中任一项的方法，其中用作核心的材料选自基于放射性核素的对比增强单元，例如99mTc、123/5/131I、67Cu、67Ga、111In、201Tl。
15.权利要求1到5和7到8中任一项的方法，其中用作核心的材料选自毒素、放射性同位素和化疗剂；发射UV-C的纳米颗粒，例如YPO4:Pr、光动力学治疗(PDT)剂，例如基于扩展性卟啉结构的化合物、用于放疗的核素，例如157Sm、177Lu、212/3Bi、186/8Re、67Cu、90Y、131I、114mIn、At、Ra、Ho。
16.权利要求1到8中任一项的方法，其中用作核心的材料选自化学交换饱和转移(CEST)、热敏性MRI对比剂(例如脂质体的)、pH敏感性MRI对比剂、氧分压或酶应答性MRI对比剂、金属离子浓度依赖性MRI对比剂。
17.权利要求1到16中任一项的方法，其中用作核心的材料是两种或两种以上材料的组合。
18.权利要求1到5和7到17中任一项的方法，其中用作壳的材料选自羧酸、酰基卤、胺、酸酐、活化的酯、马来酰亚胺、异硫氰酸酯、胺、金、SiO2、脂质、表面活性剂、多磷酸盐(例如多磷酸钙)、氨基酸(例如半胱氨酸)、有机聚合物(例如聚乙二醇/PEG、聚乙烯醇/PVA、聚酰胺、聚丙烯酸酯、聚脲)、具有功能性端基的有机聚合物(例如1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[羧基(聚乙二醇)2000]铵盐)、生物聚合物(例如多糖，如葡聚糖、木聚糖、糖原、果胶、纤维素或多肽如胶原、球蛋白)、半胱氨酸或具有高半胱氨酸含量的肽、或磷脂。
19.权利要求1到5和7到17中任一项的方法，其中还可以将其它组分掺入壳内。
20.权利要求1到19中任一项的方法，其中经1到3个基于半胱氨酸的二硫键化学连接所述连接单元的多肽。
21.权利要求1到20中任一项的方法，其中用作配体的材料选自抗体(单克隆抗体、多克隆抗体、小鼠抗体、小鼠-人嵌合抗体、人抗体、单链抗体、Diabody等)，例如Trastuzumab(乳腺癌)、Rituximab(非霍奇金淋巴瘤)、Alemtuzumab(慢性淋巴细胞白血病)、Gemtuzumab(急性髓细胞白血病)、Edrecolomab(结肠癌)、Ibritumomab(非霍奇金淋巴瘤)、Cetuximab(结肠癌)、Tositumomab(非霍奇金淋巴瘤)、Epratuzumab(非霍奇金淋巴瘤)、Bevacizumab(肺癌和结肠癌)、抗CD33(急性髓细胞白血病)、Pemtumomab(卵巢癌和胃癌))、Mittumomab(肺癌和皮肤癌)、抗MUC 1(腺癌)、抗CEA(腺癌)、抗CD 64(plaques)；肽、多肽、肽模拟物，例如生长抑素类似物、血管活性肽类似物、神经肽Y、RGD肽等；蛋白质，例如膜联蛋白V、组织纤溶酶原激活物蛋白、转运蛋白等；大分子例如乙酰透明质酸、Apcitide、硫酸软骨素；核酸，例如Apatamer、反义DNA/RNA/PNA、小干扰RNA；脂质，例如磷脂；凝集素，例如白细胞刺激性凝集素和糖。
22.靶向对比剂，其包含核心、至少一种连接单元以及至少一种配体。
23.靶向对比剂或靶向治疗剂，其包含核心、至少一个壳、至少一种连接单元以及至少一种配体。
24.通过权利要求1到21中任一项的方法产生的靶向对比剂或靶向治疗剂。
25.用于诊断或治疗的权利要求22到24中任一项的靶向对比剂或靶向治疗剂。
26.用于靶向分子成像的权利要求22到25中任一项的靶向对比剂或靶向治疗剂。
27.用于CT、MRI、PET、SPECT或US的权利要求22到25中任一项的靶向对比剂。
28.权利要求22到25中任一项的靶向对比剂或靶向治疗剂用于生产适用于诊断或治疗的化合物的用途。
29.权利要求22到25中任一项的靶向对比剂或靶向治疗剂用于生产适用于靶向分子成像的化合物的用途。
30.权利要求22到25中任一项的靶向对比剂或靶向治疗剂用于生产适用于CT、MRI、PET、SPECT或US的化合物的用途。
全文摘要
本发明公开了一种合成用于分子成像以及靶向诊断和治疗的靶向对比剂的方法、靶向对比剂和靶向治疗剂以及其用途。
文档编号A61K49/18GK101080241SQ200580043308
公开日2007年11月28日 申请日期2005年12月12日 优先权日2004年12月17日
发明者H·胡梅尔, V·U·魏勒 申请人:皇家飞利浦电子股份有限公司