专利名称：：用于免疫分析的甲基苯丙胺衍生物和结合物的制作方法
技术领域：
：本发明一般涉及用于确定生物样品中的药物滥用的免疫分析方法的领域，尤其是，涉及用于确定苯丙胺类药物的免疫分析方法，更尤其涉及可因此使用的曱基苯丙胺衍生物和结合物。
背景技术：
：通常称作"迷幻类药物"的一类违法设计师药物的使用和滥用近年来已显著增加。这些化合物是特征在于具有稠合亚曱基二氧基苯基环体系的苯丙胺的衍生物，包括MDA(3,4-亚曱基二氧基苯丙胺)，MDMA,还称作"迷幻剂"(3,4-亚甲基二氧基-N-曱基苯丙胺)，MDEA,还称作"Eve"(3,4-亚甲基二氧基-N-乙基苯丙胺)，BDB(3,4-亚甲基二氧基苯基-2-丁胺)，和MBDB(3,4-亚曱基二氧基苯基-N-曱基丁胺)。迄今，用于检测迷幻类药物的方法主要涉及原先开发用于检测苯丙胺和/或曱基苯丙胺的免疫分析。通过这些分析对迷幻类药物的检测依赖于可在苯丙胺和/或甲基苯丙胺抗体之间同时存在的有限相互反应性。通过这种分析得到的实际结果仍不能表明亚曱基二氧基(MD)类衍生物的何种特定物质或成分存在于样品中。一般来说，苯丙胺和曱基苯丙胺免疫分析对迷幻类药物是相对不敏感的，和无-特定性的。这些分析具有特别有限的对MDEA衍生物的识别。本发明涉及这些和其它问题的改善，其中涉及使用常规苯丙胺和/或甲基苯丙胺免疫分析用于检测亚曱基二氧基类，或迷幻类药物成分。在用于药物滥用的测试中，免疫分析，尤其竟争性结合免疫分析已被证实是尤其有利的。在竟争性结合免疫分析中，生物样品中的分析物与标记试剂，或分析物类似物，或示踪剂竟争该分物和分析物类似物所特定的抗体上的有限数目的受体结合位。酶如P-半乳糖苷酶和过氧化酶，荧光分子如荧光素化合物，放射性化合物如1251,和微颗粒是常用作示踪剂的标记物质。分析物在样品中的浓度决定结合至抗体上的分析物类似物的量。分析物类似物的结合量与分析物在样品中的浓度成反比，因为分析物和分析物类似物分別以其相应的浓度结合至抗体上。游离或结合分析物类似物的量可随后通过适合所用特殊标签的方法而确定。目前流行的是基于^1颗粒在溶液中的动力学相互作用(通过透光度的变化而度量)的自动分析。在不存在样品药物的情况下，游离抗体结合至药物-微颗粒结合物上，导致形成颗粒聚集体。随着聚集作用在不存在样品药物的情况下进行，吸光率增加。如果样品包含所讨论的药物，药物与颗粒-结合药物衍生物竟争游离抗体。结合至样品药物上的抗体不再可用于促进颗粒聚集，和随后颗粒晶格形成得到抑制。样品药物的存在消除了吸光率的增加，这与药物在样品中的浓度成比例。样品药物含量相对药物的已知的截断值浓度所得的值而测定。苯丙胺类药物分析的一个问题在于，已有技术方法不提供足够的与抗体的交叉反应性和置换作用使得以足够的灵敏度测定样品中所有的苯丙胺类分析物，尤其苯丙胺，曱基苯丙胺，3,4-亚甲基二氧基苯丙胺(MDA),3,4-亚曱基二氧基-N-曱基苯丙胺(MDMA),和3,4-亚甲基二氧基-N-乙基苯丙胺(MDEA)。本发明的甲基苯丙胺衍生物通过提供与曱基苯丙胺抗体的所需交叉反应性和置换作用而克服这些问题，灵敏地测定苯丙胺，曱基苯丙胺，和迷幻类化合物。本发明所克服的另一问题在于，半抗原通过甲基苯丙胺半抗原上的游离氨基基团而不必要地共轭。本发明衍生物避免了该问题。U.S.专利5,135,863(1992年8月4日授予Hu等人)描述了包含通过石克醇键结合至苯丙胺或曱基苯丙胺类似物上的标签的结合物。该结合物进一步包含在间-或对-位上键接至苯环的连接剂，和苯丙胺氮未被保护。U.S.专利申请2001/0051158(2001年12月13曰出版，Owens等人)描述了免疫化学半抗原，它们是曱基苯丙胺的间位衍生物。甲基苯丙胺半抗原上的游离氨基基团未被保护。发明概述苯丙胺半抗原的氮上的保护基团的曱基苯丙胺衍生物。这些化合物具有结构其中Ri是包含2-15个碳原子和0-6个杂原子的烷基连接剂，R2是离去基团，和R3是保护基团。本发明还涉及具有以下结构式的化合物其中Ri是包含2-l5个碳原子和0-6个杂原子的烷基连接剂和R2是多糖或孩i颗粒。本发明进一步涉及用于确定样品中的甲苯丙胺的免疫分析，包括步骤(a)将被怀疑包含曱基苯丙胺的样品与对甲基苯丙胺特定的抗体和具有以下结构的标记分析物类似物结合、^/NH其中Ri是包含2-15个碳原子和0-6个杂原子的烷基连接剂和R2是多糖或微颗粒，这样甲基苯丙胺和分析物类似物竟争性地结合至抗体上，和(b)确定结合或未键接至抗体上的标记类似物量的作为对样品中的甲基苯丙胺的度量。另外，本发明包括一种用于确定样品中的甲基苯丙胺的试验盒，包含(a)对甲基苯丙胺特定的抗体和(b)具有以下结构的标记分析物类似物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>ZNH其中R4是包含2-15个碳原子和0-6个杂原子的烷基连接剂和R2是多糖或微颗粒。本发明优选的化合物是具有以下结构的4-{[4-(3-{(3)-2-[曱基-(2,2,2-三氟-乙酰基)-氨基]-丙基)-苯氧基)-丁酰基氨基]-曱基)-苯甲酸2,5-二氧代-吡咯烷-l-基酯<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>如果结合至氨基右旋糖酐上，随后去保护N-三氟乙酸酯基团，该化合物提供一种结合物，它在用于免疫分析(其中它与游离曱基苯丙胺竟争用于结合至被固定在微颗粒上的曱基苯丙胺-特定抗体)时提供与相应苯丙胺-氨基右旋糖酐-抗体体系拟合良好的标准曲线。附图的简要描述图1是示意图，显示例如描述于实施例1和2化合物1的合成。图2和3是示意图，显示例如描述于实施例3至8的化合物8的合成。图4是示意图，显示例如描述于实施例9和10的化合物10的合成。图5是示意图，显示本发明化合物与BSA的配合和氮的去保护，得到例如描述于实施例11的化合物11。图6是示意图，显示本发明化合物与氨基右旋糖酐的配合，随后去保护N-三氟乙酸酯基团，得到化合物12例如描述于实施例16。图7是示意图，显示例如描述于实施例12的化合物15的合成。图8是示意图，显示例如描述于实施例13的化合物17的合成。图9是示意图，显示例如描述于实施例14的化合物18的合成。图10是示意图，显示例如描述于实施例15的化合物19的合成。图ll是使用本发明的氨基右旋糖酐结合物12与甲基苯丙胺抗体-涂覆颗粒生成的剂量响应曲线。图12是使用本发明氨基右旋糖酐结合物12与N-乙基苯丙胺抗体-涂覆颗粒生成的剂量响应曲线。发明详述在该描述和在所附权利要求书中，要理解以下定义。术语"半抗原"是指部分或不完全抗原。半抗原是不能刺激抗体形成但与抗体反应的无蛋白质的物质，最低分子量物质。苯丙胺，甲基苯丙胺，亚甲基二氧基曱基苯丙胺，和其它苯丙胺类化合物是半抗原。术语"活化半抗原"是指例如，通过连接携带反应性部分的连接基团而具有可得反应位的半抗原，所述基团可用于将半抗原连接至载体，免疫原，标签，示踪剂或其它部分。术语"分析物"是指其存在或量要被确定的任何物质或物质组。本文所用的术语分析物包括术语"抗原"(是指可结合至抗体上的任何化合物)。本文所用的术语"苯丙胺"和"苯丙胺类药物"是指苯丙胺，曱基苯丙胺，亚曱基二氧基苯基烷基胺的苯丙胺类似物，还称作"设计师"苯丙胺，如，亚曱基二氧基甲基苯丙胺(MDMA，还称作迷幻)，和这些药物的代谢物。术语"衍生物"是指通过一种或多种化学反应由母化合物制成的化学化合物或分子。术语"结合物"是指由两个部分结合在一起而形成的任何物质。按照本发明的代表性结合物包括通过小分子和大分子结合在一起而形成的那些，如蛋白质。术语结合物包括术语"免疫原"。本文所用的"连接基团"或"连接剂"是指连接两种或多种子结构的化学结构的一部分如半抗原，载体，免疫原，标签，示踪剂或其它连接剂。连接基团具有至少l条在子结构之间延伸的除氢之外的原子(或其它单价原子)的不间断链。连接基团的原子和连接基团内的链的原子本身通过化学键连接。连接剂可以是直或支，饱和或不饱和，碳链。它们也可包括一个或多个在链内或在链末端上的杂原子。"杂原子"是指除碳之外的选自氧，氮和硫的原子。连接基团也可包括环状或芳族基团作为链的一部分或作为链中的一个原子上的取代基。连接基团或连接剂中的原子的数目通过计算除氢之外的原子而确定。连接基团内的链中的原子数通过沿着所连接的子结构之间的最短路径计算除氬之外的原子的数目而确定。连接基团可用于活化，如，在半抗原上提供可得位用于合成半抗原与标签或载体的结合物。术语"烷基基团"是指任何直，支化，环状，无环，饱和或不饱和碳链。代表性烷基基团包括烷烃，烯烃，烷炔，环烷烃，环烯烃，环烷炔，芳基，和类似物，和其组合。词语"视需要取代的"是指一个或多个取代基在烷基基团上的可有可无的连接。术语"离去基团"是指可被与其反应的试剂替代的底物的任何化学部分。合适的离去基团包括，但不限于，卣化物，甲磺酸盐，甲苯磺酸盐，烷氧基，季铵盐，和类似物。按照目前优选实施方案的优选离去基团由活化酯，如，三氟乙氧基酯，N-羟基琥珀酰亚胺酯，p-硝基苯基酯，五氟苯基酯，咪唑基酯，和N-羟基苯并三唑基酯提供，这样连接到羰基碳上的酯的含氧部分在反应过程中被替换。术语"保护基团"是指连接到反应性原子或中心以改变其常规的反应性的任何部分。合适的保护基团包括但不限于描述于题为有机合成中的保护基团，第三版，TheodoraW.Greene和PeterG.M.Wuts(JohnWiley&Sons，Inc.，NewYork,1999)的专著中的那些。用于胺的氮的各种保护基团是本领域已知的，其中三氟乙酰基是目前优选的氮保护基团。其它优选的保护基团的例子包括t-Boc(叔丁基氧基羰基)和CBZ(千基氧基羰基)。术语"分析物类似物"是指可用于竟争性免疫分析的任何物质或物质组，其性质在与抗体的结合亲合性方面类似于分析物。代表性分析物类似物包括药物和其异构体，药物衍生物，荷尔蒙，多肽，核苷酸，和类似物。词语"检测分析物"是指一般用于确定分析物，和尤其用于确定的苯丙胺药物的任何定量，半定量，或定性方法，以及至所有的其它方法。例如，仅检测苯丙胺药物在样品中的存在或不存在的方法在本发明的范围内，例如提供药物在样品中的量或浓度数据的方法。术语检测，确定，识别，和类似术语在本文中同义使用，且都在本发明范围内。"标签"，"检测器分子"，或"示踪剂"是产生，或可被诱导以产生，可检测信号的任何分子。标签可结合至分析物，免疫原，抗体，或至另一分子如受体或可结合至受体如配体，尤其半抗原上的分子上。标签的无-限定性例子包括放射性同位素，酶，酶链段，酶底物，酶抑制剂，共酶，催化剂，荧光团，染料，化学发光剂，发光剂，敏化剂，非^兹或i兹颗粒，固体载体，脂质体，配体，和受体。术语"试剂盒，"或"试验盒，"是指用于进行分析的材料的组件。试剂可被提供在同一或不同容器中的包装组合中，取决于其相互反应性和稳定性，和为液体或冻干形式。被提供在盒中的试剂的量和比例可选择成提供用于特定场合的最佳结果。体现本发明特征的试剂盒包含对苯丙胺化合物所特定的抗体。盒可进一步包含分析物的配体和校正和控制材料。试剂可保持液体形式或可^^冻干。词语"校正和控制材料"是指包含已知内的所要测定的分析物的任何标准或参考材料。被怀疑包含分析物和相应校正材料的样品在类似症状下分析。分析物浓度通过将未已知的试样所得的结果与标准所得的结果比较而计算。这通常通过构建校正或剂量响应曲线而进行。本发明化合物是具有在苯环上的间位取代的烷基或烷氧基连接剂和在氮上的保护基团的甲基苯丙胺衍生物。这些化合物具有结构其中R!是包含2-15个碳原子和0-6个杂原子的烷基连接剂，R2是离去基团，和R3是保护基团。衍生物在氮上携带保护基团。这种保护基团使得衍生物的活性酯部分与，通常，载体化合物的胺容易反应形成稳定的酰胺^:而不影响衍生物自身的胺。保护基团随后被适宜地去除以提供对应于游离药物的胺的所需未保护胺部分。在本发明实施方案中，R3是三氟乙酰基。在本发明另一实施方案中，R2是多糖或微颗粒，优选氨基右旋糖酐。本发明还涉及具有以下结构式的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>.NH其中Ri是包含2-15个碳原子和0-6个杂原子的烷基连接剂和R2是多糖或微颗粒，优选氨基右旋糖酐。另外，本发明涉及具有以下结构式的化合物[i^右旋糖肝本发明进一步涉及用于确定样品中的曱苯丙胺的免疫分析，包括步骤:(a)被怀疑包含曱基苯丙胺的样品与对曱基苯丙胺特定的抗体和具有以下结构的标记分析物类似物o<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>、>/NH其中R!是包含2-15个碳原子和0-6个杂原子的烷基连接剂和R2是多糖或微颗粒，优选氨基右旋糖酐合并，这样甲基苯丙胺和分析物类似物竟争性地结合至抗体上，和(b)确定结合或未键接至抗体上的标记类似物的量作为对样品中的曱基苯丙胺的度量。另外，本发明包括用于确定样品中的甲基苯丙胺的试验盒，包含(a)对曱基苯丙胺特定的抗体和(b)具有以下结构的标记分析物类似物o<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>zNH其中Ri是包含2-15个碳原子和0-6个杂原子的烷基连接剂和R2是多糖或微颗粒，优选氨基右旋糖酐。本发明优选的化合物是具有以下结构的4-{[4-(3-{(8)-2-[甲基-(2,2,2-三氟-乙酰基)-氨基]-丙基}-苯氧基)-丁酰基氨基]-曱基}_苯甲酸2,5-二氧代-吡咯烷-l-基酯O如果结合至载体分子如氨基右旋糖酐上，随后去保护N-三氟乙酸酯基团，那么这种化合物提供一种结合物，它在用于免疫分析方法(其中结合物与游离甲基苯丙胺竟争用于结合至被固定在微颗粒上的甲基苯丙胺-特定抗体)时提供与相应苯丙胺-氨基右旋糖肝-抗体体系具有良好相互关系的标准曲线。该组合还提供与所需(高相互反应性)和非所需(低相互反应性)分析物的合适的相互反应性。如果在低取代比率下结合至牛血清白蛋白上，这种化合物还提供一种适用于篩选甲基苯丙胺抗体的结合物。连接基团的取代位和醚键也被发现有利地调节抗体对衍生物结合物的亲合性，而氨基曱基苯曱酸酯部分的使用也有助于更容易表征该衍生物(较大UV吸光率)以及增加衍生物的固体性质(不同于胶体或液体)。完全意外地发现，本发明衍生物优选通过至少两种响应在结构上不同于该新型衍生物的免疫原而培养的抗体而识别。一种差异是取代的位置，它在两种免疫原的对位，但在結合物的间位。另一差异是用于免疫原的连接剂不具有象结合物那样来自苯环的氧原子。最后，免疫原中的氮被键接至曱基基团上，而本发明结合物中的氮被键接至乙基基团上。具体实施方案在以下实施例，黑体字号是指附图中的相应结构。闪蒸色谱在硅胶60(230-400网孔，EMScience)上进行。薄层色谱在珪胶板(0.25mm,EMScience,Cat弁5717-5)上进行和在紫外灯下观察。溶剂得自J.T.BakerCompany,除非另有所述。乙酸乙酯(EtOAc)，己烷(Hex)曱醇(MeOH),和二氯曱烷(012(^2)作为原样用于色谱和反应处理剂。无水CH2Cl2通过在氩和在回流下在氢化4丐上煮淬而得到。无水四氢呋喃(THF)通过在氩和在回流下在钠-二苯酮上煮沸而得到。无水二曱基甲酰胺(DMF)和无水二甲基亚砜(DMSO)在Sure/SealTM瓶中得自AldrichChemicalCompany。试剂和化学品得自Sigma隱AldrichChemicalCompany或FlukaChemicals,除非另有所述。质子核》兹共振光谱(^H-NMR)在配有Sun/Sparc工作站的VarianGemini2000(200MHz)上得到。光学旋转在PerkinElmer341旋光计上进行。3N高氯酸通过稀释70。/。高氯酸(11.7N)而制备。液体色谱质谱(LC-MS)和高性能液体色谱光谱(HPLC)在配有二极管排列检测器和季泵的AgilentHPllOOLC/MS体系上得到。对于LC-MS光谱/分析，色谱物流在柱后被输出到MSD检测器。除非另有所述，所用的分析柱是配有Phenomenexguardmodule(KJO-4282)的Vydac218TP54分析柱(300A，5m)。除非另有所述，使用在0.iy。TFA-H2O(A)中的0.1。/oTFA-MeCN(C)使用在(A)中的溶剂梯度5。/。(0min)至100。/。(20min)至5%(25min)(C)进行操作。实施例l合成化合物1，[(S)-2-(3-曱氧基-苯基)-l-曱基-乙基]-((S)-l-苯基-乙基)-胺将6.0g(0,0365mol)3-曱氧基苯基丙酮(TransWorldChem.)和4.47g(0.0369mol)S-(-)-oc-苯基乙基胺(Fluka)在100ml苯(Acros)中的溶液用6.0g4埃分子筛处理和加热回流3小时。将混合物过滤和在减压下浓缩。将残余物溶解在IOOml无水乙醇(Aldrich)中，放入包含2.4gRaney镍(在1120中的50%淤浆)的500mlParr瓶和在50psi下氢化24hrs。将催化剂滤过CELITE并将滤液在减压下浓缩。残余物通过在800g硅胶上的闪蒸色谱使用3%曱醇-CH2Cl2作为洗脱剂而纯化，得到5.0g产物作为浅黄色油。iH-NMR(CDCl3)相容;LC-MS:tR11.4min,结果M+H270,2;[a]D-36.6。(589nm,c=l,CHC13)。实施例2合成化合物2,(S)-2-(3-曱氧基-苯基)-l-曱基-乙基胺向500mlParr瓶中装入550mg10。/。Pd/C和5.0g(0.0186mol)化合物l在IOOml曱醇中的溶液并在50psi下氢化48小时。将催化剂滤过CELITE并将滤液在减压下浓缩成黄色油。通过在硅胶短柱(4cmW,5cmH)上的闪蒸色谱使用10%曱醇-CH2Cl2进行纯化以去除残余催化剂，得到2.84g黄色油。将它溶解在CH2Cl2中和过滤以去除残余硅胶，随后在减压下浓缩和在高真空下抽吸过夜，得到2.5g黄色油。^-NMR(CDCl3)相容;LC-MS:tR8.05min(ChiralcelOD國RH，DaicelChemicalIndustries;梯度5%(在0min)至85。/。(在17.5min时)O.l%TFA/乙腈，在O.l%TFA/水中；0.5mL/min流速),结果M+H166.1，单峰;HPLC:tR30.0min(d-异构体)，33.7min(l-异构体)，比率/1=97.2/2.8在200nm(CrownpakCR(+)，DaicelChemicalIndustries;等度lml/min含水高氯酸pH1.35(~0.2%)，包含5%MeOH);[oc]D+31.7。(589nm,c=l,CHC13)。实施例3合成化合物3,2,2,2-三氟-^[(3)-2-(3-甲氧基-苯基)-1-甲基-乙基]-乙酰胺将2.4g(0.0145mol)化合物2在24ml吡啶(Aldrich)中的溶液在氩下冷却至-20。C和用3.2ml三氟乙酸酐在36ml醚(E.M.Science)中的溶液处理和在-20。C下搅拌15min。将混合物用3x100ml乙酸乙酯提取。将合并的乙酸乙酯提取物用2x150ml饱和盐水溶液洗涤，在无水Na2S04上干燥和在减压下浓缩，得到3.79g黄色固体。^-NMR(CDCl3)相容。实施例4合成化合物4，2,2,2-三氟-N-[(S)-2-(3-羟基-苯基)-l-甲基-乙基]-乙酰胺将包含3.77g(0.0144mol)化合物3和70.0g(0.6057mol)吡啶'HCl的压力容器用氩清洗和在210。C下加热45min。固体熔化和变得均相。将反应混合物冷却，使它凝固。将固体溶解在H2O中和倒入400ml冰水中。将它用5x250mlCH2Cl2提取。将CH2Cl2提取物合并，在无水Na2S04上干燥和在减压下浓缩，随后在高真空下抽吸过夜，得到3.34g黄色油。^-NMR(CDCl3)相容;LC-MS相容。在另一操作中，320mg化合物3和5.94g吡咬盐酸盐在压力容器中进行类似反应，在类似处理之后，得到213mg化合物4，具有:^-NMR相容;LC-MS:tR11.4min,结果M+H248.1,M+Na270丄实施例5合成化合物5，4-{3-[(8)-2-(2,2,2-三氟-乙酰基氨基)-丙基]-苯氧基}-将1.08g(0.027mol)NaH(在矿物油中的6(P/。分散体)和10ml无水DMF(Aldnch)的混合物在氩下用在5分钟内滴加的在33ml无水DMF(Aldrich)中的3.3g(0.0133mol)化合物4处理。将混合物在环境温度下搅拌IOmm,随后用3.4ml(0.0238mol)乙基-4-溴丁酸盐(Fluka)处理和在室温下搅拌过夜。将混合物倒入250ml1M磷酸钾緩冲剂pH7,随后用2x250ml乙酸乙酯提取。将有机提取合并和用2x150ml1M磷酸钾緩冲剂pH7洗涤，在无水Na2S04上干燥和在减压下浓缩。将残余物通过在250g硅胶上的闪蒸色谱使用30%EtOAc-己烷作为洗脱剂而纯化，得到浅黄色油，放置结晶得到3.9g白色固体。iH-NMR(CDCl3)相容;LC-MS:tR15.7min,结果M+H362.1，M+H20379.1，M+Na384.1。实施例6合成化合物6，4-(3-{(3)-2-[甲基-(2,2,2-三氟-乙酰基)-氨基]-丙基}-苯氧基)-丁酸乙基酯将3.8g(0.0105mol)化合物5在72ml无水DMF(Aldrich)中的溶液在氩下用9.5m1(0.1526mol)捵曱烷和l1.74g(0.0507mol)氧化银(I)处理和在40。C下搅拌过夜。将混合物滤过CELITE,将滤饼用450ml乙酸乙酯洗涤，并将滤液再次过滤以去除白色沉淀物。将滤液用2x250mlHbO洗涤。将H20洗涤物合并和用200ml乙酸乙酯提取。将有机提取合并，在无水Na2S04上干燥，在减压下浓缩和在高真空下抽吸过夜，得到3.84g浅黄色油。^-NMR(CDCl3)相容，2:1比率的旋转异构体。实施例7合成化合物7，4-(3-((S)-2-[曱基-(2,2,2-三氟-乙酰基)-氨基]-丙基卜苯氧基)-丁酸将3.8g(0,0101mol)化合物6在50ml蒸馏THF中的溶液用50ml3N高氯酸(由得自Aldrich的70。/。高氯酸制备)处理和在50。C下加热4hrs。将混合物冷却和用2x200ml乙酸乙酯提取。将有机提取合并，用4x200mlH20，2x200ml饱和盐水溶液洗涤，在无水Na2S04上干燥，在减压下浓缩和在高真空下抽吸过夜，得到3.5g浅黄色油。iH-NMR(CDCl3)相容，2:1比率的旋转异构体。实施例8合成化合物8,4-(3-((S)-2-[(2,2-二曱基-丙酰基)-甲基-氨基]-丙基}-苯氧基)-丁酸2,5-二氧代-吡咯烷-l-基酯将3.5g(O.OlOlmol)化合物7在220ml无水CH2Cl2中的溶液在氩下用1.4g(0.0122mol)NHS和2.4g(0.0125mol)EDC(Sigma)处理和在室温下搅拌过夜。将混合物用200ml0.1NHC1,2x200mlH20,2x200ml饱和NaHC03溶液，200ml饱和盐水溶液洗涤，在无水Na2S04上干燥和在减压下浓缩，得到4.42g透明油。^-NMR(CDCl3)相容，3:2比率的旋转异构体。实施例9合成化合物9，4-{[4-(3-{(S)-2-[甲基-(2,2,2-三氟-乙酰基)-氨基]-丙基}-苯氧基)-丁酰基氨基]-曱基}-苯甲酸将1.6g(0.0106mol)4-氨甲苯酸在60ml1120和120ml蒸馏THF中的混合物用10mlINNaOH处理。将所得溶液用4.4g(O.Olmol)化合物8在120ml蒸馏TH中的溶液处理。反应随后用4ml1NNaOH(—次加入lml)处理以保持pH9。反应在室温下搅拌l小时。THF在减压下去除并将含水残余物用2NHCl中和至pH6。将它用2x250ml乙酸乙酯提取。将有机提取合并，在无水Na2S04上干燥和在减压下浓缩，得到4.65g白色固体。iH-NMR(CDCl3)相容，3:2比率旋转异构体。实施例IO合成化合物10,4-{[4-(3-{(S)-2-[曱基-(2,2,2-三氟-乙酰基)-氨基]-丙基}-苯氧基)-丁酰基氨基]-曱基}-苯曱酸2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯将l.Og(0.002mol)化合物9在100ml无水CH2Cl2中的溶液在氩下用300mg(0.0026mol)NHS和480mg(0.0025mol)EDC(Sigma)处理和在室温下搅拌过夜。将混合物用100ml0.1NHCl，2xl00mlH2O,2x100ml饱和NaHCCb溶液，100ml饱和盐水溶液洗涤，在无水Na2S04上干燥和在减压下浓缩，得到1.13g白色无定形固体。H-NMR(CDCl3)相容，3:2比率旋转异构体；LC-MS:tR14.5min,结果M+H578.2，M+Na600.2;[a]D+15.7。(589nm，c=l，CHC13)。实施例ll合成化合物11,去保护4-(3-((S)-2-[(2,2-二曱基-丙酰基)-曱基-氨基]-丙基卜苯氧基)-丁酸2,5-二氧代-吡咯烷-l-基酯结合物与BSA将1.0g牛血清白蛋白(BSA;PentexFractionV;MilesInc.,Kankakee,IL,USA)在16ml50mM磷酸钾(KPi)pH7.5中的溶液在冰浴中冷却和用慢慢滴加的22mlDMSO处理。在加入完成之后，滴加13.4mg化合物8在2mlDMSO中的溶液并在搅拌下时反应达到室温。按照类似方式另外制备100mgBSA在1.6ml50mMKPipH7.5和2.4mlDMSO中的参考样品，但不加入半抗原。在搅拌过夜之后，将反应和参考样品分别转移至渗析管线(SpectraPor7;10,000分子量截断值)和针对60%DMSO-50mMKPi,pH7.5(两次，在室温下/4h每次;在室温下一次性过夜)随后顺序针对40y。至20y。至10y。DMSO-50mMKPi,pH7.5,随后针对50mMKPipH7.5透析。继续针对50mM碳酸钾(四次变化)在室温下4天以去保护三氟乙酰基基团，随后针对50mMKPipH7.5在4。C在几天内(六次变化)进行渗析。回收渗余物，得到结合物ll作为灰色溶液(68ml)，以及参考BSA。使用参考BSA[蛋白质浓度，UV]的CoomassieBlue蛋白质分析得到标准曲线，显示结合物11为14.0mg/ml蛋白质。实施例12合成化合物15,[2-(3-{(S)-2-[曱基-(2,2,2-三氟-乙酰基)-氨基]-丙基}-苯氧基)-乙基]-曱酰胺酸叔丁基酯化合物13，2,2,2-三氟-N-[(S)-2-(3-甲氧基-苯基)-l-曱基-乙基]-N-曱基-乙酰胺。将384mg化合物3在10ml无水二曱基甲酰胺(DMF)中的溶液在氩下用1.33ml碘甲烷和1.64g氧化银(I)处理和在40。C下搅拌过夜。将混合物滤过CELITE并将滤饼用乙酸乙酯洗涤。将滤液再次过滤以去除白色沉淀物。将滤液用2x50mlH2O洗涤。将含水洗涤物合并和用50ml乙酸乙酯提取。将乙酸乙酯部分合并，在无水碌u酸钠上干燥，和在减压下浓缩，得到330mg黄色油。将它在50g硅胶上使用CH2Cl2作为洗脱剂进行色谱处理，得到220mg产物，化合物13,作为浅黄色油。LC-MS:tR15.4min,结果M+H276.0,M+Na298.0。化合物14，2,2,2-三氟-^[(3)-2-(3-羟基-苯基)-1-曱基-乙基]->1-甲基-乙酰胺。将220mg化合物13和3.87g吡啶盐酸盐的混合物在210。C下在压力容器中加热l小时。将所得熔体冷却和溶解在水中。将它用5x50mlCH2Cl2提取，将合并的CH2Cl2提取在无水硫酸钠上干燥和在减压下浓缩，得到IOOmg化合物14作为黄色油。LC-MS:tR12.9mm,结果M+H262.0,M+Na284.0。化合物15。将25mg化合物14在10ml千丙酮中的溶液用2-(BOC-氨基)乙基溴在lml无水DMF,77mg无水碳酸钾，和催化量18-冠-6中的溶液处理。将混合物在60。C下加热过夜。将混合物冷却和用CH2Cl2稀释，用&0洗涤3次，在无水疏酸钠，和在减压下浓缩至包含化合物15的红色油。LC-MS:tR16.5min,结果M+Na427.1。实施例13合成化合物17化合物15用三氟乙酸处理和在室温下搅拌2hrs。将混合物在减压下浓缩，得到胺化合物16。将联苯-二-羧酸NHS酯，化合物20(Ghoshal等人，U.S.专利6,794,496),在无水THF中的溶液在氩下用1当量化合物16在无水THF中的溶液处理，同时滴加2当量三乙基胺。将混合物在室温下搅拌过夜。混合物在减压下浓缩。通过色谱纯化，得到化合物17。实施例14合成化合物18将对苯二曱酸二(N-羟基琥珀酰亚胺)酯化合物21(Ghoshal等人，欧洲专利申请1,148,339)在无水THF中的溶液在氩下用用1当量化合物16在无水THF中的溶液处理，同时滴加2当量三乙基胺。混合物在室温下搅拌过夜。混合物在减压下浓缩。通过色谱纯化，得到化合物18。实施例15合成化合物19将4-异硫代氰酸根合苯曱酰氯，化合物22(Ghoshal等人，U.S.专利6,794,496)，在无水THF中的溶液在氩下用冰浴冷却和用1当量化合物16在无水THF中的溶液处理，同时滴加2当量三乙基胺。混合物在室温下搅拌过夜。混合物在减压下浓缩。通过色谱纯化，得到化合物19。实施例16使用具有曱基苯丙胺抗体的本发明结合物的分析曱基苯丙胺-氨基右旋糖酐结合物，化合物12制备如下:将90mg氨基右旋糖酐溶解在5mlDMSO中。将10mg化合物10溶解在lmlDMSO中和滴加至聚合物载体的溶液和在室温下搅拌过夜。将混合物放入10,000MW截断值渗析管线(PierceSnake皮肤顶)和在室温下在1升80%DMSO中透析过夜。将它随后在室温下使用在1升60。/。DMSO，1升40。/。DMSO，l升20y。DMSO，4升去离子水中的递减梯度，透析每次至少3hr。将它随后用1升100mMK2CO3(用KOH调节至pH13)透析2天，其中4次改变緩冲剂。最终渗析步骤包括4升去离子水至少2天，4次改变。将结合物随后冻千。随后制备包含0.125昭/ml曱基苯丙胺结合物12,144mM哌嗪-l,4-二(2-乙烷磺酸)二钠盐，31mM哌。秦-l,4-二(2-乙烷磺酸)，0.1%(w/v)BSA，0.09。/。(w/v)叠氮化钠，和1.5。/。(w/v)聚丙烯酸的结合物试剂，pH7.1。抗体-微颗粒试剂制备如下:将100ml50mg/ml对甲基苯丙胺特定的单克隆抗体在室温下用在50mMMES緩冲剂，pH6.5中的100ml1%0.201mm胶乳颗粒培养过夜。将颗粒用在50mMMES緩冲剂，pH6.5中的IOml100mg/mlBSA阻断2小时。胶乳用50mMMOPS緩冲剂，pH7.1，使用切线流动过滤体系洗涤。该抗体相应描述于U.S.5,501,987(第3栏，结构2，其中蛋白质是牛甲状球蛋白)中的免疫原而培养。随后制备包含0.1%固体抗体-涂覆微颗粒，25mM3-吗啉代丙烷磺酸，25mM3-吗啉代丙烷磺酸，钠盐，0.1%(w/v)BSA，和0.09。/。(w/v)叠氮化钠的微颗粒试剂，pH7.1。分析在Roche/Hitachi917分析器上进行。将IOml样品吸移到比色杯中和随后立即加入180ml结合物试剂(Rl)。将混合物培养90秒，和将80ml微颗粒试剂(R2)加入比色杯。反应混合物在37。C下培养约8min，在此过程中在505nm下监控颗粒凝聚反应。基于在R2加入之后的2-点端测量而"i殳计标准曲线。%相互反应性在免疫分析中确定。标准曲线可使用已知量的目标分析物曱基苯丙胺而确立。已知量的各种苯丙胺有关的药物作为样品在免疫分析中被分析，和这些药物的表观浓度由标准曲线产生。将药物的表观浓度除以实际的浓度并乘以IOO,得到该药物的％相互反应性。如此生成的标准(剂量响应)曲线在图ll中给出。曱基苯丙胺-涂覆颗粒与结合物12的相互反应性在下表中给出。<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>这些结果显示出不仅对d-曱基苯丙胺而且对迷幻类化合物如MDMA和MBDB的良好的相互反应性。与普通千扰性化合物如麻黄碱，假麻黄碱，芬特明，和酪胺的相互反应性是最小的，即，低于1%。实施例17使用具有N-乙基苯丙胺抗体的本发明结合物的分析结合物试剂如实施例16所述而制备。抗体-涂覆微颗粒如实施例16所述使用描述于U.S.2004/0077021的单克隆抗体NEAMP48.2而制备。微颗粒试剂随后如实施例16所述而制备。分析在Roche/Hitachi917分析器上如实施例16所述而进行。%相互反应性在免疫分析中确定。标准曲线使用已知量的目标分析物亚曱基二氧基乙基苯丙胺(MDEA)而确立。已知量的各种苯丙胺有关的药物作为样品在免疫分析中分析，和这些药物的表观浓度由标准曲线生成。药物的表观浓度除以实际的浓度并乘以IOO,得到该药物的％相互反应性。如此生成的标准(剂量响应)曲线在图12中给出。抗体-涂覆颗粒与结合物12的相互反应性在下表中给出。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>这些结果显示出不仅对亚曱基二氧基乙基苯丙胺的良好的相互反应性而且对d-曱基苯丙胺和对迷幻类化合物如MDMA和MBDB的相互反应性。同时，基本上没有与普通千扰性化合物如麻黄碱，假麻黄碱，芬特明，和酪胺的相互反应性。权利要求1.一种具有以下结构式的化合物其中R1是包含2-15个碳原子和0-6个杂原子的烷基连接剂，R2是离去基团，和R3是保护基团。2.权利要求l的化合物，其中R3是三氟乙酰基。3.权利要求l的化合物，其中R2是多糖或微颗粒。4.权利要求3的化合物，其中R2是氨基右旋糖酐。5.化合物4-([4-(3-((S)-2-[曱基-(2,2,2-三氟-乙酰基)-氨基]-丙基卜苯氧基)-丁酰基氨基]-曱基}-苯曱酸2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯，具有结构式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>6.—种具有以下结构式的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>其中Ri是包含2-15个碳原子和0-6个杂原子的烷基连接剂和R2是多糖或微颗粒。7.权利要求6的化合物，其中R2是氨基右旋糖酐。8.具有以下结构式的化合物嚴基右旋糖酐9.一种用于确定样品中的曱基苯丙胺的免疫分析，包括步骤:(a)将被怀疑包含甲基苯丙胺的样品与对曱基苯丙胺特定的抗体和具有以下结构的标记分析物类似物合并<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>^"^一zNH其中R4是包含2-15个碳原子和0-6个杂原子的烷基连接剂和R2是多糖或微颗粒，这样甲基苯丙胺和分析物类似物竟争性地结合至抗体上，和(b)确定结合或未键接至抗体上的标记类似物的量作为对样品中的曱基苯丙胺的度量。10.权利要求9的免疫分析，其中R2是氨基右旋糖酐。11.一种用于确定样品中的甲基苯丙胺的试验盒，包含(a)对甲基苯丙胺特定的抗体和(b)具有以下结构的标记分析物类似物其中Ri是包含2-15个碳原子和0-6个杂原子的烷基连接剂和R2是多糖或微颗粒。12.权利要求11的试验盒，其中R2是氨基右旋糖酐。全文摘要具有在苯环上的间位取代的烷基连接剂和在甲基苯丙胺半抗原的氮上的保护基团的甲基苯丙胺衍生物的化合物。这些化合物具有结构(I)，其中R1是包含2-15个碳原子和0-6个杂原子的烷基连接剂，R2是离去基团，和R3是保护基团。下式化合物(II)，其中R1是包含2-15个碳原子和0-6个杂原子的烷基连接剂和R2是多糖或微颗粒。用于确定样品中的甲苯丙胺的免疫分析和用于确定样品中的甲基苯丙胺的试验盒。文档编号A61K31/16GK101119963SQ200580048108公开日2008年2月6日申请日期2005年12月15日优先权日2004年12月17日发明者R·A·许,S·S·维托恩申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司