治疗自身免疫病的方法

专利名称：治疗自身免疫病的方法
专利说明治疗自身免疫病的方法
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自身免疫病是复杂的、互相联系的生物学途径的表现或结果。在正常的生理系统中，对于响应创伤或损伤、启动创伤或损伤修复、及产生对抗外来生物体的先天性和获得性防御，这些生物学途径是关键性的。当这些正常的生理学途径与响应强度有关、由于异常调节或过度刺激的结果、由于对自身的反应、或这些的组合引起额外的创伤或损伤时，会出现疾病或病理。
虽然这些疾病的成因常常涉及多步途径，并且常常涉及多种不同的生物学系统/途径，但是对在一个或多个这些途径中的关键点的干预可具有改善或治疗效果。可通过拮抗有害过程/途径或刺激有益过程/途径产生治疗性干预。
哺乳动物的免疫系统由许多共同作用以防御宿主免受细菌、病毒、毒素和其它非宿主物质侵袭的独特细胞组成。淋巴细胞(T和B细胞二者)主要负责免疫系统的特异性。T细胞因在胸腺中发育而得名，而B细胞则因在骨髓中发育而得名。
T淋巴细胞(T细胞)是哺乳动物免疫应答的重要组分。T细胞识别与主要组织相容性复合体(MHC)内基因编码的自身分子结合的抗原。所述抗原可以与MHC分子一起展示在抗原呈递细胞、病毒感染的细胞、癌细胞、移植物等的表面。T细胞系统消除这些对宿主哺乳动物造成健康威胁的改变的细胞。T细胞包括辅助性T细胞(CD4+)和细胞毒性T淋巴细胞(CD8+)。辅助性T细胞(TH)在识别抗原呈递细胞上的抗原-MHC复合物之后大量增殖。辅助性T细胞还分泌多种细胞因子，诸如淋巴因子，它们在B细胞、细胞毒性T淋巴细胞和多种参与免疫应答的其它细胞的活化中起重要作用。细胞毒性T淋巴细胞能够引起其它细胞的破坏。
在体液和细胞介导的免疫应答二者中的一个重要事件是辅助性T细胞的活化和克隆扩增。辅助性T细胞的活化通过T细胞受体(TCR)-CD3复合物与抗原呈递细胞表面上的抗原-MHC的相互作用启动。该相互作用介导诱导静息(resting)辅助性T细胞进入细胞周期(G0到G1转变)的生化事件级联，并导致IL-2高亲和力受体的表达。活化的T细胞通过循环增殖和分化发展为记忆细胞或效应细胞。
T辅助细胞子集(Th1和Th2)确定了2种免疫途径细胞介导的免疫和体液免疫。Th1和Th2亚型的细胞因子释放谱影响效应物机制和细胞毒性细胞的选择(Mosmann等，1989，Adv.Immunol.，46111-147；Mosmann等，1996，Immunol.Today，17138-146)。Th1细胞(CD4+细胞的一个功能性子集)的特点在于它们推动细胞介导的免疫和产生细胞因子包括IL-2、干扰素-γ和淋巴毒素β的能力(Mosmann等，1989，1996，见上)。Th1细胞分泌的IL-2和干扰素-γ活化巨噬细胞和细胞毒性细胞。Th2细胞也是CD4+细胞，但与Th1细胞截然不同。Th2细胞的特点在于它们推动体液免疫诸如抗体产生的能力。Th2细胞产生细胞因子，包括IL-4、IL-5和IL-10(Mosmann等，1989，1996，见上)。Th2细胞分泌的IL-4、IL-5和IL-10增加了嗜酸性粒细胞和肥大细胞的产生，也增强了包括IgE的抗体的产生，并且降低了细胞毒性细胞的功能(Powrie等，1993，Immunol.Today，14270)。
Th1和Th2细胞因子释放调节互相抑制的Th1和Th2应答。例如，IL-4抑制Th1细胞表达干扰素-γ，而干扰素-γ则抑制Th2细胞表达IL-4(Mosmann等，1989，见上)。
四螺旋束细胞因子家族(Bazan，1990，PNAS，876934)的成员调节来自共同前体的T辅助细胞扩增和终末分化成不同的Th1和Th2效应细胞群(O′Garra，A.，1998，Immunity，8275-83)。例如，IL-4影响Th2细胞的发育，而IL-12则涉及Th1细胞的分化(Hsieh等，1993，Science，260547-9；Seder等，1993，PNAS，9010188-92)。
TCCR(T细胞细胞因子受体)是WS(G)XWS类的细胞因子受体，与IL-12β-2受体、G-CSFR和IL-6受体具有同源性。这些受体转导能控制细胞尤其是涉及血细胞生长和分化的细胞的生长和分化的信号。已经提出TCCR涉及T辅助细胞应答。具体而言，已经假定TCCR及其配体IL-27促进Th1应答(Chen等，2000，Nature，407916-920；Yoshida等，2001，Immunity，15569-578；Pflanz等，2002，Immunity，16779-790)。
Th1和Th2细胞任一或二者所产生的细胞因子的过表达给宿主造成医学疾病。例如，Th1细胞因子的过表达促成多种自身免疫病诸如多发性硬化和类风湿性关节炎的发病。Th2细胞因子的过表达促成变应性疾病的发病。
在有些自身免疫病中，CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)涉及组织的致病性破坏。例如，在自身免疫性I型糖尿病的病程中，CTL牵涉胰腺β细胞的破坏(Kagi等，1997，J.Exp.Med.，186989-997)。CTL还前述实验性自身免疫性脑脊髓炎(Huseby等，2001，J.Exp.Med.，194(5)669-676)。CTL介导与移植物抗宿主病(GVHD)有关的组织损伤(Graubert等，1997，J.Clin.Invest.，100904-911)。
多发性硬化(MS)是一种影响脑和脊髓的中枢神经系统疾病。MS的常见体征和症状包括四肢的一肢或多肢中、躯干中、或脸的一侧上感觉异常；腿或手无力或笨拙；或视觉障碍(例如部分失明和一只眼疼痛)、视觉模糊、或暗点。其它常见的早期症状为导致复视觉(复视)的眼原性麻痹、四肢的一肢或多肢短暂无力、四肢的轻微僵硬或罕见的易疲劳性、不严重的步态障碍、排尿控制困难、眩晕、和轻度情绪紊乱(Berkow等(编)，1999，Merck Manual ofDiagnosis and Therapy第17版)。目前用于MS的治疗包括皮质类固醇、β-干扰素(Betaferon，Avonex，Rebif)、醋酸格拉默(Copaxone)、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、环磷酰胺、克拉屈滨、巴氯芬、替扎尼定、阿米替林、卡马西平(Berkow等(编)，1999，见上)。
类风湿性关节炎(RA)是一种慢性自身免疫病，特征在于通常影响小和大关节的关节滑膜炎，导致它们的进行性破坏(Berkow等(编)，1999，见上)。RA的症状可包括僵硬、触痛、滑膜增厚、屈曲挛缩、内脏小结、引起腿溃疡或多发性单神经炎的血管炎、胸腔或心包积液、和发热(Berkow等(编)，1999，见上)。
目前用于RA的治疗包括非类固醇抗炎药(包括水杨酸(盐/酯))、金化合物、甲氨蝶呤、羟氯喹、柳氮磺吡啶、青霉胺、皮质类固醇、和细胞毒性或免疫抑制性药物(Berkow等(编)，1999，Merck Manual of Diagnosis and Therapy第17版)。
由于疗效有限和/或毒性显著，因此现有的用于自身免疫病的疗法都不能令人满意。因此，需要用于治疗自身免疫病诸如MS和RA的新方法。
发明概述 幼稚的、未分化的T细胞(Th-0)应答诱导Th-0细胞分化为成熟T辅助细胞的不同信号。现已发现细胞受体TCCR的活化，例如通过施用TCCR激动剂诸如IL-27，有效降低T淋巴细胞增殖。T淋巴细胞增殖的降低与IL-10和SOCS-3表达升高有关。业已发现表达TCCR的动物对自身免疫病较不易感。
在EAE疾病模型中的进一步研究指出IL-27受体(TCCR)缺陷型小鼠对自身免疫病高度敏感。对IL-27在Th细胞分化和免疫病中的作用的研究产生了惊人的发现，即IL-27是免疫抑制性的，在Th发育中的多个水平起作用。IL-27抑制Th-IL17细胞产生，抑制IL-6产生，以及抑制Th-IL17细胞因子包括IL-6的产生。IL-27诱导IL-10和IL-4(另一种Th-IL17细胞的抑制剂)产生，并刺激IL12受体产生和Th-1细胞分化。本文中披露的数据表明IL-27具有重要的免疫抑制功能，包括对Th-1、Th-2和Th-17细胞的重要抑制活性。
本发明提供了通过施用IL27R(TCCR)激动剂诸如IL-27，治疗自身免疫病包括多发性硬化(MS)和类风湿性关节炎(RA)的方法。有用的TCCR激动剂包括IL27R的变体和片段，IL27R配体诸如IL-27及其变体和片段，以及结合IL27R或IL27R配体并刺激、诱导或增强IL27介导的应答的激动性抗体。本发明还提供了抑制T淋巴细胞和/或细胞毒性T淋巴细胞包括Th-IL17细胞增殖的方法，该方法包括施用刺激、诱导或增强IL27/IL27R应答的激动剂。
附图简述

图1是TCCR/IL-27受体复合物的结构的示意图。
图2是显示表达人TCCR的Ba/F3细胞应答单克隆抗体2685-IgG2a、2686-IgG1、2688-IgG1、对照同种型IgG2a和对照同种型IgG1的增殖的图。
图3是显示表达人TCCR的Ba/F3细胞应答鼠IL-3(阳性对照)和抗体2686的增殖的图。
图4是显示表达人TCCR、鼠TCCR的Ba/F3细胞和两者都不表达的对照细胞应答抗体2686的增殖的图。
图5是显示与不表达TCCR的脾细胞的增殖相比，表达TCCR的脾细胞应答抗CD3刺激的增殖的图。
图6是显示与不表达TCCR的CD4+T细胞的增殖相比，表达TCCR的CD4+T细胞应答抗CD3刺激的增殖的图。
图7是显示与不表达TCCR的CD8+T细胞的增殖相比，表达TCCR的CD8+T细胞应答抗CD3刺激的增殖的图。
图8是显示在敲除型(TCCR-/-)和野生型(TCCR+/+)小鼠中MOG诱导的EAE的临床进展的图。
图9是显示在敲除型(TCCR-/-)和野生型(TCCR+/+)小鼠中MBP诱导的EAE的临床进展的图。
图10是显示在EAE模型中敲除型(TCCR-/-)和野生型(TCCR+/+)小鼠脑和脊髓切片的平均组织学炎症得分的图。
图11是显示在EAE模型中敲除型(TCCR-/-)和野生型(TCCR+/+)小鼠脑和脊髓切片的平均组织学脱髓鞘得分的图。
图12是显示在EAE模型中敲除型(TCCR-/-)和野生型(TCCR+/+)小鼠脑和脊髓切片的最大组织学炎症得分的图。
图13是显示在EAE模型中敲除型(TCCR-/-)和野生型(TCCR+/+)小鼠脑和脊髓切片的最大组织学脱髓鞘得分的图。
图14是显示在CFSE标记测定中，与不表达TCCR的CD4+T细胞的增殖相比，表达TCCR的CD4+T细胞应答抗CD3刺激的增殖的图。
图15是显示在CFSE标记测定中，与不表达TCCR的CD8+T细胞的增殖相比，表达TCCR的CD8+T细胞应答抗CD3刺激的增殖的图。
图16A-C是显示在中性(16A)、Th1偏爱(16B)和Th2偏爱(16C)条件下，在不同时间点，IL-2应答IL-27处理的诱导的图。数据表示的是IL-27依赖性诱导的倍数。
图17A-C是显示在中性(17A)、Th1偏爱(17B)和Th2偏爱(17C)条件下，在不同时间点，IL-10应答IL-27处理的诱导的图。数据表示的是IL-27依赖性诱导的倍数。
图18A-C是显示在中性(18A)、Th1偏爱(18B)和Th2偏爱(18C)条件下，在不同时间点，SOCS-3应答IL-27处理的诱导的图。数据表示的是IL-27依赖性诱导的倍数。
图19是显示在中性、Th1偏爱和Th2偏爱条件下，CD4+细胞应答IL-27处理的增殖的图。
图20A-B是显示抗IL-2抗体不存在(20A)或存在(20B)下，脾细胞应答IL-27和/或IL-6处理的增殖的图。
图21是IL-27及其受体IL-27R(TCCR)的图。
图22是显示在IL-12细胞因子组内，IL-27与细胞因子IL-6簇的关系的图。
图23是显示辅助性T细胞分化的图。
图24是显示在IL-27R缺陷型小鼠中对EAE的高度敏感性的图。
图25显示了在野生型和IL-27R敲除型小鼠中EAE表型的组织学分析。
图26是测试T细胞中IL-27关系的方案的示意图。
图27显示了IL-27对T细胞发育的影响的测试结果。对于以下细胞因子，将细胞因子应答IL-27的降低与野生型对照进行了比较IFN-γ、IL-2、TFN、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、GM-CSF和IL-17。
图28图示了IL-2和GM-CSF应答IL-10、IL-27以及IL-10和IL-27的组合而产生的结果。
图29图示了IL-10应答IL-27的强诱导，IL-10敲除型小鼠中EAE的严重程度。
图30是描绘TH-17在EAE中的作用的图。
图31图示了EAE疾病对IL-23和TH-IL-17细胞的要求。
图32图示了IL-27对TH-IL-17细胞因子的抑制。
图33图示了IL-27对IL-17的抑制。
图34图示了IL-27介导的IL-17抑制是不依赖IFN-γ的。
图35图示了IL-27对IL-17的抑制是通过STAT-1介导的。
图36图示了IL-17-R敲除型小鼠的再刺激的淋巴细胞的TH-IL-17细胞因子分泌。
图37显示了在IL-27-R缺陷型小鼠中，IL-17应答诱导疾病的MOG或KLH的产生。
图38图示了浸润CNS的CD4T细胞的IL-17表达。
图39是显示不同细胞因子与T辅助细胞分化的关系的图。
图40是显示IL-6敲除型小鼠中EAE抗性的图。
图41图示了IL-6对TH-IL-17细胞因子和应答的诱导。
图42是显示IL-27对IL-6增殖效应的拮抗作用的图。
图43是显示IL-27和IL-6在TH-IL-17发育中的作用的图。
图44是显示IL-27的多个作用水平的图。
图45图解了IL-27在诱导细胞因子表达变化中的作用。
序列简述 表24 发明详述 T淋巴细胞的过度增殖或Th1或Th2细胞过度产生细胞因子引起宿主的医学疾病。例如，与Th1应答有关的细胞因子的过量产生或CD8+细胞毒性T淋巴细胞的过度增殖可引起自身免疫病，包括同种异体移植物排斥、自身免疫性甲状腺病(例如格雷夫斯氏(Graves)病和桥本氏(Hashimoto)甲状腺炎)、自身免疫性葡萄膜视网膜炎、巨细胞性动脉炎、炎性肠病(包括克罗恩氏(Crohn)病、溃疡性结肠炎、局限性回肠炎、肉芽肿性肠炎、远端回肠炎、节段性回肠炎和末端回肠炎)、胰岛素依赖型糖尿病、多发性硬化、恶性贫血、银屑病、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、和系统性红斑狼疮。
下文实施例中详述的研究证明在应答非特异性T细胞刺激中，缺少TCCR的T细胞比表达TCCR的T细胞增殖更多(见实施例1)。先前，有人提出TCCR及其配体IL-27促进Th1应答(Chen等，2000，Nature，407916-920；Yoshida等，2001，Immunity，15569-578；Pflanz等，2002，Immunity，16779-790)。但是，令人惊奇的发现，与缺少TCCR的小鼠相比，表达TCCR的小鼠对特征部分为Th1应答的自身免疫病较不易感，诸如实验性变应性脑脊髓炎(EAE)，一种用于多发性硬化的动物模型(见实施例2)。
如下文实施例所示，通过给细胞施用TCCR激动剂抑制了T淋巴细胞的增殖。同样显示的是，与TCCR-/-动物相比，在表达TCCR的动物(TCCR+/+)中存在自身免疫性炎性疾病临床进展减缓和症状较不严重。
这些资料说明TCCR激动剂可用于降低T细胞增殖。具体而言，这些资料说明TCCR激动剂可用于治疗自身免疫介导的疾病，诸如多发性硬化(MS)和类风湿性关节炎(RA)。
定义 术语“自身免疫”指免疫系统组分诸如抗体或淋巴细胞攻击或损害产生它们的生物体的分子、细胞或组织的过程。
术语“自身免疫病(autoimmune disorders)”指其中损伤诸如组织损伤或发病至少部分是自身免疫过程的结果的疾病。举例来说，术语“自身免疫病(autoimmune disease)”包括那些至少部分通过Th1应答或CD8+细胞毒性T淋巴细胞介导的疾病。自身免疫病包括同种异体移植物排斥、自身免疫性甲状腺病(诸如格雷夫斯氏病和桥本氏甲状腺炎)、自身免疫性葡萄膜视网膜炎、巨细胞性动脉炎、炎性肠病(包括克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、局限性回肠炎、肉芽肿性肠炎、远端回肠炎、节段性回肠炎和末端回肠炎)、胰岛素依赖型糖尿病、多发性硬化、恶性贫血、银屑病、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病和系统性红斑狼疮。
术语“Th1应答”指T辅助细胞由前体分化为不同Th1效应细胞群，包括由Th1细胞分泌细胞因子，诸如IFN-γ、IL-2和TNF-β。术语“Th1偏爱条件”指促成T辅助细胞由前体分化为不同Th1效应细胞群的条件。
术语“Th1细胞因子”指那些在Th1应答中表达的细胞因子，包括IFN-γ、IL-2和TNF-β(Powrie等，1993，Immunol.Today，14270)。
术语“Th1介导的疾病”指主要或部分由Th1细胞因子过量产生介导的疾病。术语“Th1介导的疾病”包括那些可能由T细胞分化为Th1亚型中的过量产生或偏爱引起的疾病。这样的疾病包括自身免疫病，例如RA和MS。
术语“Th2应答”指T辅助细胞由前体分化为不同Th2效应细胞群，包括由Th2细胞分泌细胞因子，诸如IL-4、IL-5、IL-10和IL-13(Powrie等，1993，Immunol.Today，14270)。术语“Th2偏爱条件”指促成T辅助细胞由前体分化为不同Th2效应细胞群的条件。
在本文中使用时，术语“TCCR肽”、“TCCR蛋白”和“TCCR”涵盖天然序列TCCR和TCCR肽变体。TCCR肽可分离自多种来源，诸如人组织或其它来源，或通过重组和/或合成方法制备。“天然序列TCCR”是具有与衍生自自然界的TCCR肽相同的氨基酸序列的肽。这样的天然序列TCCR可分离自自然界或可通过重组和/或合成方法产生。术语“天然序列TCCR”具体涵盖TCCR的天然存在的截短和分泌形式(诸如胞外结构域序列)、天然存在的截短形式(诸如可变剪接形式)和天然存在的等位变体。在一个实施方案中，天然序列人TCCR是包含SEQ ID NO1的氨基酸1-636的成熟或全长的天然序列TCCR。类似的，天然序列鼠TCCR是包含SEQ ID NO2的氨基酸1-623的成熟或全长的天然序列TCCR。虽然SEQ ID NO1和SEQ ID NO2显示为以本文中指定为氨基酸第1位的甲硫氨酸残基起始，但是可以想到且有可能的是另一个位于SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的氨基酸第1位的上游或下游的甲硫氨酸残基可作为TCCR肽的起始氨基酸残基。
“TCCR肽胞外结构域”或“TCCR ECD”指TCCR肽的一种形式，即基本上不含跨膜结构域和胞质结构域。通常，TCCR肽ECD将包含少于约1％的所述跨膜结构域和/或胞质结构域，优选将包含少于约0.5％的所述结构域。应当理解，为本发明的TCCR肽鉴定的任何跨膜结构域是依照常规用于鉴定那种类型的疏水结构域的标准而鉴定的。跨膜结构域的准确边界可有所变化，但最有可能不超过起初所鉴定的结构域任一末端的约5个氨基酸。因此，在一个实施方案中，人TCCR肽的胞外结构域包含氨基酸1或约33至X1，其中X1是SEQ ID NO1的残基512至残基522的任意氨基酸残基。类似的，鼠TCCR肽的胞外结构域包含氨基酸1或约25至X2，其中X2是SEQ ID NO2的残基509至残基519的任意氨基酸残基。
术语“TCCR变体肽″意指具有TCCR肽的至少一种生物学活性以及与下列氨基酸序列具有至少约80％氨基酸序列同一性的肽 (a1)SEQ ID NO1的人TCCR肽的残基1或约33至636； (a2)SEQ ID NO2的鼠TCCR肽的残基1或约25至623； (b1)SEQ ID NO1的人TCCR肽的X3至636，其中X3是SEQ ID NO1的氨基酸残基27至37任一； (b2)SEQ ID NO2的鼠TCCR肽的X4至623，其中X4是SEQ ID NO2的氨基酸残基20至30任一； (c1)1或约33至X1，其中X1是SEQ ID NO1的残基512至残基522的任意氨基酸残基； (c2)1或约25至X2，其中X2是SEQ ID NO2的残基509至残基519的任意氨基酸残基； (d1)X5至636，其中X5是SEQ ID NO1的残基533至543的任意氨基酸； (d2)X6至623，其中X6是SEQ ID NO2的残基527至537的任意氨基酸；或 (e)SEQ ID NO1和SEQ ID NO2的氨基酸序列的另外具体衍生的片段。
这样的TCCR变体肽包括例如其中在SEQ ID NO1和SEQ ID NO2序列的N-和/或C-末端以及在一个或多个内部结构域中添加或删除一个或多个氨基酸残基的TCCR肽。通常，TCCR变体肽将与下列氨基酸序列具有至少约80％的氨基酸序列同一性，可以是至少约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性 (a1)SEQ ID NO1的人TCCR肽的残基1或约33至636； (a2)SEQ ID NO2的鼠TCCR肽的残基1或约25至623； (b1)SEQ ID NO1的人TCCR肽的X3至636，其中X3是SEQ ID NO1的氨基酸残基27至37任一； (b2)SEQ ID NO2的鼠TCCR肽的X4至623，其中X4是SEQ ID NO2的氨基酸残基20至30任一； (c1)1或约33至X1，其中X1是SEQ ID NO1的残基512至残基522的任意氨基酸残基； (c2)1或约25至X2，其中X2是SEQ ID NO2的残基509至残基519的任意氨基酸残基； (d1)X5至636，其中X5是SEQ ID NO1的残基533至543的任意氨基酸； (d2)X6至623，其中X6是SEQ ID NO2的残基527至537的任意氨基酸；或 (e)SEQ ID NO1和SEQ ID NO2的氨基酸序列的另外具体衍生的片段。
在本文中使用时，术语“IL-27”涵盖天然序列IL-27异二聚体、天然序列IL-27组分EBI3和p28、IL-27异二聚体变体(在本文中有进一步定义)、及EBI3和p28的变体。IL-27异二聚体及其组分可分离自多种来源，诸如人组织类型或其它来源，或可通过重组和/或合成方法制备。“天然序列IL-27”包括具有与衍生自自然界的IL-27异二聚体相同的氨基酸序列的异二聚体。这样的天然序列IL-27异二聚体可分离自自然界或可通过重组和/或合成方法产生。术语“天然序列IL-27”具体涵盖IL-27异二聚体的天然存在的截短和分泌形式(诸如胞外结构域序列)、天然存在的截短形式(诸如可变剪接形式)、及天然存在的等位变体。
术语“IL-27变体”指那些与能活化TCCR的天然序列IL-27包括天然序列IL-27组分EBI3和p28具有同源性的肽。IL-27变体可包括那些由EBI3变体和p28变体形成的变体。IL-27变体还可包括那些能招募(engage)TCCR和gp130二者的变体。IL-27变体可包括那些能形成TCCR同二聚体的变体。IL-27变体包括PEG化IL-27。
在本文中使用时，术语“p28”涵盖天然序列p28和p28肽变体。p28可分离自多种来源，诸如人组织类型或其它来源，或可通过重组和/或合成方法制备。“天然序列p28”包括具有与衍生自自然界的p28肽相同的氨基酸序列的肽。这样的天然序列p28可分离自自然界或可通过重组和/或合成方法产生。术语“天然序列p28”具体涵盖p28的天然存在的截短或分泌形式(诸如胞外结构域序列)、天然存在的截短形式(诸如可变剪接形式)及天然存在的等位变体。
术语“p28肽变体”涵盖与天然序列人p28(SEQ ID NO3)或鼠p28(SEQID NO4)具有至少73％、75％、80％、90％、95％或99％序列同一性的肽。p28肽变体包括p28中能够结合TCCR和gp130的部分。p28肽变体包括p28中能够活化TCCR的部分。p28肽变体包括含有来自p28的第一和第三α螺旋的残基及位于第一螺旋末端和第四螺旋起始的残基的肽，认为前者结合TCCR中在TCCR上发现的细胞因子受体同源结构域的区，认为后者结合gp130上发现的IG结构域。
在本文中使用时，术语“EBI3”涵盖天然序列EBI3和EBI3肽变体。EBI3肽可分离自多种来源，诸如人组织类型或其它来源，或可通过重组和/或合成方法制备。“天然序列EBI3”包括具有与衍生自自然界的EBI3肽相同的氨基酸序列的肽。这样的天然序列EBI3可分离自自然界或可通过重组和/或合成方法产生。术语“天然序列EBI3”具体涵盖EBI3的天然存在的截短和分泌形式(诸如胞外结构域序列)、天然存在的截短形式(诸如可变剪接形式)及天然存在的等位变体。
举例来说，术语“融合蛋白”指由编码两种不同蛋白质的两种基因融合所产生的表达产物。该术语还包括由编码两种不同蛋白质的部分的两种基因的部分融合所产生的表达产物。该术语包括那些由翻译后发生的融合所产生的蛋白质。如本文所使用的，该术语将包括融合有异源肽的IL-27、其组分(EBI3和p28)、或其部分。该术语还将包括融合有异源肽的TCCR或其部分。该术语还将包括与p28融合以形成功能性单链细胞因子的EBI3(Pflanz等，2002，Immunity，16779-790)。该术语包括偶联有人Fc标记的IL-27。
如本文所使用的，相对于给定肽的“异源肽”指具有不同序列的肽，与起源无关。例如，相对于天然序列TCCR，异源肽指具有不同于天然序列TCCR的序列的肽。相对于天然序列IL-27，异源肽指具有不同于天然序列IL-27的序列的肽。
术语“激动剂”包括任何增强或刺激天然序列肽的生物学活性的分子。合适的激动剂分子具体包括激动剂肽、激动剂抗体或抗体片段、本发明天然肽的片段或氨基酸序列变体、等等。鉴定TCCR激动剂的方法包括例如使TCCR肽或表达TCCR肽的细胞与候选的激动剂分子接触，并测量一种或多种TCCR生物学活性的可检测变化。
如本文所使用的，“TCCR生物学活性”指TCCR介导的应答，诸如压制或抑制T细胞增殖。TCCR生物学活性包括压制或抑制Th1应答或Th1介导的疾病。TCCR生物学活性包括提高IL-10和SOCS-3的表达。TCCR生物学活性还包括与TCCR活化有关的发信号，例如信号转导和转录因子诸如Stat1、Stat3、Stat4和Stat5的磷酸化(Lucas等，2003，PNAS，100(25)15047-52)。
术语“抗体”和“免疫球蛋白”以最宽泛的含义使用，具体包括多克隆抗体、单克隆抗体(包括激动剂和拮抗剂抗体)、多价抗体(诸如二价抗体)、多特异性抗体(诸如展现出期望生物学活性的双特异性抗体)、具有多表位特异性的抗体组合物、亲和力成熟的抗体、人源化抗体、人抗体、嵌合抗体、以及展现出期望生物学活性的抗原结合片段(诸如Fab、F(ab′)2、scFv和Fv)。天然存在的抗体包含四条肽链，即通过二硫键互相连接的两条相同的重(H)链和两条相同的轻(L)链。每条重链包含一个重链可变区(VH)和一个重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域，CH1、CH2和CH3。每条轻链包含一个轻链可变区(VL)和一个轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域，CL。VH和VL结构域可进一步细分成通过序列限定的互补决定区(CDR)(参见Kabat等，1991，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md)或通过三维结构限定的高变环(HVL)(Chothia等，1987，J.Mol.Biol.，196901-917)，之间散布着称为构架区(FR)的更保守的区。每个VH和VL通常由三个CDR(或HVL)和四个FR组成，从氨基末端至羧基末端以如下顺序排列FR1，CDR1(HVL1)，FR2，CDR2(HVL2)，FR3，CDR3(HVL3)，FR4。
抗体(免疫球蛋白)根据其重链恒定区的氨基酸序列分为不同的类。有五大类免疫球蛋白IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些进一步分成亚类(同种型)，诸如IgG1、IgG2、IgA1、IgA2、等等。对应于不同类的免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构造是众所周知的，一般性描述于例如Abbas等，2000，Cellular and Mol.Immunology，第4版。抗体可以是更大融合分子的一部分，所述融合分子通过抗体与一种或多种其它蛋白质或肽共价或非共价结合而形成。
术语“全长抗体”指以其基本上完整的形式存在的抗体，包含至少2条重链和2条轻链，并且不是下文所定义的抗体片段。该术语特别指重链包含Fc区的抗体。全长抗体可以是天然序列抗体或重组抗体。全长抗体可以是人的、人源化的和/或亲和力成熟的。
如本文所使用的，术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即除在产生抗体的过程中可能产生的变体外，构成该群的单个抗体是基本上相同的。
在此描述的单克隆抗体明确包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而所述链的剩余部分则与衍生自另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及这样的嵌合抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(美国专利号4,816,567；Morrison等，1984，PNAS，816851-6855)。
非人(如鼠)抗体的“人源化”形式是包含衍生自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白链、或其片段(诸如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或抗体的其它抗原结合亚序列)。在大多数情况下，人源化抗体是如下的人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的一个或多个互补决定区(CDR)或高变环(HVL)的残基为具有期望的抗原特异性、亲和力和能力、来自非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠或兔的一个或多个CDR或HVL的残基所替换。在有些情况下，人免疫球蛋白的特定Fv构架区(FR)残基为相应的非人残基所替换。此外，人源化抗体可包含既不见于受体抗体，也不见于输入CDR(或HVL)或框架序列的残基。进行这些修饰以进一步改进抗体性能并使之最大化。一般而言，人源化抗体将包含至少一个，通常两个可变区的基本上整个，其中整个或基本上整个CDR或HVL对应于非人免疫球蛋白的那些，以及整个或基本上整个FR是人免疫球蛋白序列的那些。
所选择的人可变区(轻链和重链二者)可用于生成人源化抗体。根据“最适(bestfit)”法，例如，用啮齿类动物抗体的可变区序列筛选已知人可变区序列的整个文库。将与啮齿类动物最接近的人序列用作人源化抗体的人框架区(FR)(Sims等，1993，J.Immunol.，1512296)。或者，受体框架区可衍生自人抗体轻链或重链特定亚群的共有序列。所述相同框架区可被使用或修饰，并可用于产生几种不同的人源化抗体(Carter等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，894285；Presta等，1993，J.Immunol.，1512623)。人源化抗体任选包含至少一部分的免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的。欲知详情，参见例如Jones等，1986，Nature，321522-525；Reichmann等，1988，Nature，332323-329；Presta，1992，Curr.Op.Struct.Biol.，2593-596。人源化抗体还可以是PRIMATIZED抗体，其中抗体的抗原结合区衍生自通过用目的抗原免疫猕猴所产生的抗体。
可生成能在免疫接种后在不产生内源免疫球蛋白的情况下产生人抗体全集的转基因动物(如小鼠)。例如，嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合删除导致内源抗体生成的完全抑制。在这样的种系突变小鼠中转移大批(array)人种系免疫球蛋白基因导致在抗原攻击后产生人抗体。参见例如Jakobovits等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，902551；Jakobovits等，1993，Nature，362255-258；Bruggermann等，1993，Year in Immuno.，733。人抗体还可衍生自噬菌体展示文库，例如如Hoogenboom等，1991，J.Mol.Biol.，227381；Marks等，1991，J.Mol.Biol.，222581-597中所述。
“人抗体”是具有对应于人所产生的和/或使用任何在此披露的用于生成人抗体的技术所生成的抗体的氨基酸序列的抗体。
“亲和力成熟的”抗体是在一个或多个高变区中具有一处或多处改变，导致抗体对抗原的亲和力与不具有这些改变的亲本抗体相比有所改善的抗体。优选的亲和力成熟的抗体将对靶抗原具有纳摩尔或甚至皮摩尔的亲和力。亲和力成熟的抗体通过已知流程生成。参见例如Marks等，1992，Bio/Technology10779-783，描述了通过VH和VL结构域改组进行的亲和力成熟。CDR和/或框架残基的随机诱变描述于Barbas等，1994，Proc.Nat.Acad.Sci.USA913809-3813；Scier等，1995，Gene 169147-155；Yelton等，1995，J.Immunol.1551994-2004；Jackson等，1995，J.Immunol.154(7)3310-9；Hawkins等，1992，J.Mol.Biol.226889-896。
“抗体片段”仅包含完整抗体的一部分，通常包括完整抗体的抗原结合位点，因此保留结合抗原的能力。本发明定义所涵盖的抗体片段的例子包括 (i)Fab片段，具有VL、CL、VH和CH1结构域，在重链和轻链之间有一个链间二硫键； (ii)Fab’片段，其是在CH1结构域的C-末端具有一个或多个半胱氨酸残基的Fab片段； (iii)Fd片段，具有VH和CH1结构域； (iv)Fd’片段，具有VH和CH1结构域及在CH1结构域C-末端的一个或多个半胱氨酸； (v)Fv片段，具有抗体单臂的VL和VH结构域； (vi)dAb片段，由VH结构域组成； (vii)无铰链抗体，包括至少VL、VH、CL、CH1结构域并缺少铰链区； (viii)F(ab’)2片段，包括在铰链区通过二硫键连接的两个Fab’片段的二价片段； (ix)单链抗体分子(如单链Fv；scFv)； (x)“双抗体”，具有两个抗原结合位点，包含在同一肽链中连接至轻链可变区(VL)的重链可变区(VH)； (xi)单臂抗原结合分子，包含轻链、重链和N-末端截短的重链恒定区，所述N-末端截短的重链恒定区足以形成能够延长单臂抗原结合域半衰期的Fc区； (xii)“线性抗体”，包含一对串联的Fd片段(VH-CH1-VH-CH1)，其与互补的轻链肽一起形成一对抗原结合区。
如本文所使用的，“治疗”或“处理”指试图改变所治疗个体或细胞的天然病程的尝试中的临床干预，可以为了预防或在临床病理学的过程中执行。期望的治疗效果包括预防疫病的发生或复发、减轻症状、减少疾病的任何直接或间接病理结果、预防转移、降低疾病进展的速度、改善或减轻疾病状况、及康复或预后改善。
TCCR TCCR(WSX-1)是WS(G)XWS类的细胞因子受体，与IL-12β-2受体、G-CSFR和IL-6受体具有同源性。与IL-12β-2受体同源性最高(26％同一性)。这些受体转导控制细胞尤其是涉及血细胞生长和分化的细胞的生长和分化的信号。下文实施例中所列数据说明TCCR活化直接或间接诱导对自身免疫进程的抑制，包括CD8+T淋巴细胞增殖或Th1应答。
对自身免疫进程的抑制可通过诱导细胞因子信号抑制物(SOCS)蛋白质家族成员而发生(Alexander等，2004，Ann.Rev.Immunol.，22503)，其可使T细胞不响应其它促有丝分裂刺激。具体而言，SOCS-3是结合Janus激酶活化环的蛋白质，抑制激酶活性并由此抑制细胞因子发信号(Masuhara等，1997，Biochem.Biophys.Res.Commun.，239439-446)。已有报道，有些试剂诸如过氧化物酶体增殖物活化的受体(PPAR)-γ激动剂(如罗西格列酮)的抗炎作用通过诱导SOCS1和SOCS3转录起作用(Park等，2003，J.Biol.Chem.，27814747-14752)。下文实施例中所列数据显示TCCR活化直接或间接诱导SOCS3的表达。
对自身免疫进程的抑制还通过诱导IL-10而发生。IL-10是由活化的T细胞、B细胞、单核细胞和角质形成细胞产生的细胞因子。IL-10抑制多种细胞因子的产生，包括IL-2、IL-3、IFN-γ、GM-CSF和TNF。IL-10在限制和终止炎症应答中起主要作用(Moore等，2001，Ann.Rev.Immunol.，19683)。下文实施例中所列数据显示TCCR活化直接或间接诱导IL-10的表达。
人TCCR的氨基酸序列已经公布(1996年5月23日提交的WO97/44455)，可以从GenBank凭入藏登记号4759327获得。该序列还描述于Sprecher等，1998，Biochem.Biophys.Res.Commun.246(1)82-90。人TCCR(hTCCR)序列的长度是636个氨基酸，示于下表1中(SEQ ID NO1)。已经鉴定了位于SEQID NO1氨基酸残基1-32的信号肽，和氨基酸残基517-538的跨膜结构域。已经鉴定了位于残基51-54、76-79、302-305、311-314、374-377、382-385、467-470、563-566的N-糖基化位点及位于残基107-112、240-245、244-249、281-286、292-297、373-378、400-405、459-464、470-475、531-536和533-538的N-肉豆蔻酰化位点。原核膜脂蛋白脂质附着位点位于残基522-532，生长因子和细胞因子受体家族标记1位于残基41-54。残基183-191处还有一个与人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)受体的第二亚基具有显著同源性的区。TCCR在TCCR上的细胞因子受体同源域，即SEQ ID NO1的残基41-230处与IL-27亚基p28结合。所述所有hTCCR残基都依据SEQ ID NO1的序列编号。
在成人中，hTCCR在胸腺中最高度表达，但表达也见于外周血白细胞(PBL)、脾，以及在肺中弱表达。胎儿组织展现出肺和肾中的弱TCCR表达。
鼠TCCR(mTCCR)的氨基酸序列已经公布(1996年5月23日提交的WO97/44455)，可以从GenBank凭入藏登记号7710109获得。该序列还描述于Sprecher等，1998，Biochem.Biophys.Res.Commun.246(1)82-90。mTCCR序列的长度是623个氨基酸，示于下表1中(SEQ ID NO2)。已经鉴定了位于SEQ ID NO2的氨基酸残基1-24的信号肽，和氨基酸残基514-532的跨膜结构域。已经鉴定了位于残基46-49、296-299、305-308、360-361、368-371和461-464的N-糖基化位点。已经鉴定了位于残基10-13、93-96、130-133、172-175、184-187、235-238、271-274、272-275、323-326、606-609和615-618的酪蛋白激酶II磷酸化位点。已经鉴定了位于残基202-209附近的酪氨酸激酶磷酸化位点。已经鉴定了位于残基43-48、102-107、295-300、321-326、330-335、367-342、393-398、525-530和527-532附近的N-肉豆蔻酰化位点及位于残基240-243附近的酰胺化位点。原核膜脂蛋白脂质附着位点位于残基516-526附近，生长因子和细胞因子受体家族标记1位于残基36-49附近。残基14-51附近存在与人红细胞生成素具有显著同源性的区，残基211-219处存在与鼠白介素-5受体具有显著同源性的区。所述所有mTCCR残基都依据SEQ ID NO2的序列编号。
表1 人TCCR和鼠TCCR 102030 40 hTCCR MRGGRGGPFW LWPLPKLALL PLLWVLFQRT RPQGSAGPLQ mTCCR -----MNRLR VARLTPLELL LSLMSLLLGT RPHGSPGPLQ 50 60 70 80 hTCCR CYGVGPLGDL NCSWEPLGDL GAPSELHLQS QKYRSNKTQT mTCCR CYSVGPLGIL NCSWEPLGDL ETPPVLYHQS QKYHPNRVWE 90100110 120 hTCCR VAVAAGRSWV AIPREQLTMS DKLLVWGTKA GQPLWPPVFV mTCCR VKVPSKQSWV TIPREQFTMA DKLLIWGTQK GRPLWSSVSV130140150 160 hTCCR NLETQMKPNA PRLGPDVDFS EDDPLEATVH WAPPTWPSHK mTCCR NLETQMKPDT PQIFSQVDIS EEATLEATVQ WAPPVWPPQK170180190 200 hTCCR VLICQFHYRR CQEAAWTLLE PELKTIPLTP VEIQDLELAT mTCCR ALTCQFRYKE CQAEAWTRLE PQLKTDGLTP VEMQNLEPGT210220230 240 hTCCR GYKVYGRCRM EKEEDLWGEW SPILSFQTPP SAPKDVWVSG mTCCR CYQVSGRCQV ENGYP-WGEW SSPLSFQTPF LDPEDVWVSG250260270 280 hTCCR NLCGTPGGEE PLLLWKAPGP CVQVSYKVWF WVGGRELSPE mTCCR TVCETSGKRA ALLVWKDPRP CVQVTYTVWF GAGDITTTQE290300310320 hTCCR GITCCCSLIP SGAEWARVSA VNATSWEPLT NLSLVCLDSA mTCCR EVPCCKSPVP AWMEWAVVSP GNSTSWVPPT NLSLVCLAPE330340350360 hTCCR SAPRSVAVSS IAGSTELLVT WQPGPGEPLE HVVDWARDGD mTCCR SAPCDVGVSS ADGSPGIKVT WKQGTRKPLE YVVDWAQDGD370380390400 hTCCR PLEKLNWVRL PPGNLSALLP GNFTVGVPYR ITVTAVSASG mTCCR SLDKLNWTRL PPGNLSTLLP GEFKGGVPYR ITVTAVYSGG410420430440 hTCCR LASASSVWGF REELAPLVGP TLWRLQDAPP GTPAIAWGEV mTCCR LAAAPSVWGF REELVPLAGP AVWRLPDDPP GTPVVAWGEV450460470480 hTCCR PRHQLRGHLT HYTLCAQSGT SPSVCMNVSG NTQSVTLPDL mTCCR PRHQLRGQAT HYTFCIQSRG LSTVCRNVSS QTQTATLPNL 490500510520 hTCCR PWGPCELWVT ASTIAGQGPP GPILRLHLPD NTLRWKVLPG mTCCR HSGSFKLWVT VSTVAGQGPP GPDLSLHLPD NRIRWKALPW 530540 550 560 hTCCR ILFLWGLFLL GCGLSLATS----G RCYHLRHKVL PRWVWEKVPD mTCCR FLSLWGLLLM GCGLSLASTRCLQA RCLHWRHKLL PQWIWERVPD 570580590600 hTCCR PANSSSGQPH MEQVPEAQPL GDLPILEVEE MEPPPVMESS mTCCR PANSNSGQPY IKEVSLPQPP KDGPILEVEE VELQPVVES- 610620630636 hTCCR QPAQATAPLD SGYEKHFLPT PEELGLLGPP RPQVLA[SEQ ID NO1] mTCCR --PKASAPIY SGYEKHFLPT PEELGLLV(623)[SEQ ID NO2] IL-27 IL-27是TCCR的一种配体(Pflanz等，2002Immunity 16(6)779-790)。IL-27是由EBI3(EB病毒诱导的基因3)和p28蛋白亚基构成的异二聚体细胞因子。p28是具有三个接触面的四螺旋束细胞因子。第一接触面结合EBI3，包含第二和第四α螺旋的残基。第二接触面结合TCCR中的细胞因子受体同源域，包含第一和第三α螺旋的残基。第三接触面结合IG结构域，诸如在gp130发现的IG结构域，包含第一螺旋末端和第四螺旋起始的残基。
人p28的肽序列(SEQ ID NO3)的长度是243个氨基酸，而鼠p28的肽序列(SEQ ID NO4)的长度是234个氨基酸(Pflanz，NCBI登记号AAM34499)。如下表2所示，这些序列享有73％的序列同一性。
表2 人和鼠p28 10 20 30 40 hp28 MGQTAGDLGW RLSLLLLPLL LVQAGVWGFP RPPGRPQLSL mp28 MGQVTGDLGW RLSLLLLPLL LVQAGSWGFP TDP----LSL 50 60 70 80 hp28 QELRREFTVS LHLARKLLSE VRGQAHRFAE SHLPGVNLYL mp28 QELRREFTVS LYLARKLLSE VQGYVHSFAE SRLPGVNLDL 90100 110120 hp28 LPLGEQLPDV SLTFQAWRRL SDPERLCFIS TTLQPFHALL mp28 LPLGYHLPNV SLTFQAWHHL SDSERLCFLA TTLRPFPAML 130140150160 hp28 GGLGTQGRWT NMERMQLWAM RLDLRDLQRH LRFQVLAAGF mp28 GGLGTQGTWT SSEREQLWAM RLDLRDLHRH LRFQVLAAGF 170180 190 200 hp28 NLPEEEEEEE EEEEEERKGL -LP-GALGSALQ GPAQVSWPQL mp28 KCSKEEEDKE EEEEEEEEEK KLPLGALGGPNQ VSSQVSWPQL 210220230 243 hp28 LSTYRLLHSL ELVLSRAVRE LLLLSKAGHS VWPLGFPTLSPQP mp28 LYTYQLLHSL ELVLSRAVRD LLLLSLPRRP GSAWDS (234) hp28(SEQ ID NO3) mp28(SEQ ID NO4) EBI3具有可溶性细胞因子受体的结构并结合p28上的特异性结合位点。人EBI3的长度是229个氨基酸(Devergne等，1996，J.of Virology 70(2)1143-1153)并具有下表3所示的肽序列(SEQ ID NO5)。
表3 人EBI3 10 2030 40 MTPQLLLALV LWASCPPCSG RKGPPAALTL PRVQCRASRY 50 6070 80 PIAVDCSWTL PPAPNSTSPV SFIATYRLGM AARGHSWPCL 90 100110120 QQTPTSTSCT ITDVQLFSMA PYVLNVTAVH PWGSSSSFVP 130 140 150160 FITEHIIKPD PPEGVRLSPL AERQLQVQWE PPGSWPFPEI 170 180 190200 FSLKYWIRYK RQGAARFHRV GPIEATSFIL RAVRPRARYY 210 220229 VQVAAQDLTD YGELSDWSLP ATATMSLGK (SEQ ID NO5) TCCR/IL-27受体复合物 图1显示了TCCR/IL-27受体复合物的结构。完整的IL-27受体包含gp130和TCCR亚基。细胞因子受体同源域位于gp130中，SEQ ID NO6的残基126-323附近。gp130上存在的其它同源域包括位于SEQ ID NO6的残基324-423、424-518和519-614附近的三个III型纤连蛋白结构域，及位于残基22-122附近的免疫球蛋白结构域。还知道gp130是IL-6、IL-11、CNTF、LIF、CT1和CLC的受体的组分(Hibi等，1990，Cell，63(6)1149-1157)。gp130的氨基酸序列(SEQ ID NO6)示于下表4中。
表4 gp130 10 20 30 40 MLTLQTWVVQ ALFIFLTTES TGELLDPCGY ISPESPVVQL 50 60 70 80 HSNFTAVCVL KEKCMDYFHV NANYIVWKTN HFTIPKEQYT 90 100110120 IINRTASSVT FTDIASLNIQ LTCNILTFGQ LEQNVYGITI 130140150160 ISGLPPEKPK NLSCIVNEGK KMRCEWDGGR ETHLETNFTL 170180190200 KSEWATHKFA DCKAKRDTPT SCTVDYSTVY FVNIEVWVEA 210220230240 ENALGKVTSD HINFDPVYKV KPNPPHNLSV INSEELSSIL 250260270280 KLTWTNPSIK SVIILKYNIQ YRTKDASTWS QIPPEDTAST 290300310320 RSSFTVQDLK PFTEYVFRIR CMKEDGKGYW SDWSEEASGI 330340350360 TYEDRPSKAP SFWYKIDPSH TQGYRTVQLV WKTLPPFFAN 370380390400 GKILDYEVTL TRWKSHLQNY TVNATKLTVN LTNDRYLATL 410420430440 TVRNLVGKSD AAVLTIPACD FQATHPVMDL KAFPKDNMLW 450460470480 VEWTTPRESV KKYILEWCVL SDKAPCITDW QQEDGTVHRT 490500510520 YLRGNLAESK CYLITVTPVY ADGPGSPESI KAYLKQAPPS 530540550560 KGPTVRTKKV GKNEAVLEWD QLPVDVQNGF IRNYTIFYRT 570580590600 IIGNETAVNV DSSHTEYTLS SLTSDTLYMV RMAAYTDEGG 610620630640 KDGPEFTFTT PKFAQGEIEA IVVPVCLAFL LTTLLGVLFC 650660670680 FNKRDLIKKH IWPNVPDPSK SHIAQWSPHT PPRHNFNSKD 690700710720 QMYSDGNFTD VSVVEIEAND KKPFPEDLKS LDLFKKEKIN 730740750760 TEGHSSGIGG SSCMSSSRPS ISSSDENESS QNTSSTVQYS 770780790800 TVVHSGYRHQ VPSVQVFSRS ESTQPLLDSE ERPEDLQLVD 810820830840 HVDGGDGILP RQQYFKQNCS QHESSPDISH FERSKQVSSV 850860870880 NEEDFVRLKQ QISDHISQSC GSGQMKMFQE VSAADAFGPG 890900910 918 TEGQVERFET VGMEAATDEG MPKSYLPQTV RQGGYMPQ (SEQ ID NO6) IL-27对TCCR的活化诱导主要Th1特异性转录因子T-bet的表达(Lucas等，2003，PNAS，10015047-52)。TCCR活化的效应是通过Stat(转录的信号转导物和活化物)介导的。具体来说，TCCR活化引起Stat1、Stat3、Stat4和Stat5磷酸化(Lucas等，2003，见上)。下文实施例中所列数据说明TCCR活化直接或间接诱导对自身免疫进程的抑制，包括CD8+T淋巴细胞增殖或Th1应答。TCCR和T淋巴细胞亚型 如上所述，四螺旋束细胞因子家族(Bazan，J.F.，1990，Proc Natl Acad SciUSA，876934-8)的成员在T辅助细胞的增殖及由共同前体终末分化为不同Th1和Th2效应细胞群中起作用(O′Garra，1998，Immunity，8275-83)。IL-4主要影响Th2细胞的发育，而IL-12则是Th1细胞分化中的主要因子(Hsieh等，1993，Science，260547-9；Seder等，1993，Proc Natl Acad Sci USA，9010188-92；Le Gros等，1990，J Exp Med，172921-9；Swain等，1991，Immunol Rev，123115-44)。因此，IL-4(Kuhn等，1991，Science，254707-10)、IL-4受体α链(Noben-Trauth等，1997，Proc Natl Acad Sci USA，9410838-43)或IL-4特异性转录因子STAT6(Shimoda等，1996，Nature，380630-3)缺陷型小鼠在Th2应答方面是有缺陷的，而IL-12(Magram等，1996，Immunity，4471-81)、IL-12受体(IL-12R)β1链(Wu等，1997，J Immunol，1591658-65)或IL-12特异性转录因子STAT4(Kaplan等，1996，Nature，382174-7)缺陷型小鼠则具有受损的Th1应答。
Th1和Th2细胞亚型衍生自共同的前体，TH-0细胞。Th1和Th2细胞的细胞因子释放谱影响效应物机制和细胞毒性细胞的选择。Th1细胞分泌的IL-2和干扰素-γ活化巨噬细胞和细胞毒性细胞，而Th2细胞分泌的IL-4、IL-5、IL-6和IL-10则倾向于提高嗜酸性粒细胞和肥大细胞的产生，以及增强抗体包括IgE的产生并降低细胞毒性细胞的功能(Powrie等，1993，Immunol.Today，14270)。一旦建立，Th1或Th2应答模式通过产生通常抑制其它细胞子集产生细胞因子的细胞因子来保持。例如，IL-4抑制Th1克隆产生干扰素-γ，而干扰素-γ则抑制Th2克隆产生IL-4(Mosmann等，1989，Adv.Immunol.，46111-147；Mosmann等，1989，Annu.Rev.Immunol.，7145-173)。在许多免疫应答过程中，该负反馈回路加强了极化细胞因子谱的产生。
细胞毒性T淋巴细胞(CD8+)能够快速破坏其它细胞。细胞毒性T淋巴细胞利用两种主要的细胞溶解途径穿孔蛋白依赖性胞吐途径和Fas配体/Fas途径。细胞毒性T淋巴细胞还是促炎细胞因子诸如干扰素-γ的产生者。
与Th1应答有关的细胞因子的过量生成或CD8+细胞毒性T淋巴细胞的过度增殖可引起自身免疫病，包括同种异体移植物排斥、自身免疫性甲状腺病(例如格雷夫斯氏病和桥本氏甲状腺炎)、自身免疫性葡萄膜视网膜炎、巨细胞性动脉炎、炎性肠病(包括克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、局限性回肠炎、肉芽肿性肠炎、远端回肠炎、节段性回肠炎和末端回肠炎)、胰岛素依赖型糖尿病、多发性硬化、恶性贫血、银屑病、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病和系统性红斑狼疮。
下文实施例中详述的研究证明在应答非特异性T淋巴细胞刺激中，缺少TCCR的T淋巴细胞比表达TCCR的T淋巴细胞增殖更多(见实施例1)。此外，令人惊奇的发现，与缺少TCCR的小鼠相比，表达TCCR的小鼠对自身免疫病较不易感，诸如实验性变应性脑脊髓炎(EAE)，一种用于多发性硬化的动物模型(见实施例2)。
这些资料说明TCCR直接或间接介导对T淋巴细胞增殖的抑制和Th1介导的生物学活性。因此，TCCR的激动剂可用于抑制T细胞增殖和/或治疗自身免疫病，包括多发性硬化和类风湿性关节炎。
自身免疫病 如上所讨论的，T淋巴细胞的过度增殖或由Th1或Th2细胞产生的细胞因子的过度生成引起宿主的医学疾病。例如，与Th1应答有关的细胞因子的过量生成或CD8+细胞毒性T淋巴细胞的过度增殖可引起自身免疫病，包括同种异体移植物排斥、自身免疫性甲状腺病(例如格雷夫斯氏病和桥本氏甲状腺炎)、自身免疫性葡萄膜视网膜炎、巨细胞性动脉炎、炎性肠病(包括克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、局限性回肠炎、肉芽肿性肠炎、远端回肠炎、节段性回肠炎和末端回肠炎)、胰岛素依赖型糖尿病、多发性硬化、恶性贫血、银屑病、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病和系统性红斑狼疮。
多发性硬化是认为依赖T淋巴细胞的一种自身免疫性脱髓鞘疾病。MS通常展现出复发-缓和的病程或慢性进行的病程。MS的病因未知，但是，病毒感染、遗传倾向性、环境和自身免疫力都似乎能促成该病。MS患者的损伤包括主要由T淋巴细胞介导的小神经胶质细胞的浸润和浸润巨噬细胞。CD4+T淋巴细胞是出现在这些损伤中的主要细胞类型。MS损伤的特点是斑，即在MRI扫描中看到的与通常的白质边界清楚的脱髓鞘区。MS斑的组织学外观随不同的疾病阶段而改变。在活动性损伤中，血脑屏障受损，由此使得血清蛋白质外渗进入胞外间隙。在血管周围套囊和整个白质中可见炎症细胞。CD4+T细胞，尤其是Th1，积聚在斑边缘的毛细血管后微静脉周围，还在白质中分散。在活动性损伤中，还观察到黏附分子及淋巴细胞和单核细胞活化的标记物诸如IL2-R和CD26的上调。活动性损伤中的脱髓鞘并不伴有少突胶质细胞的破坏。相反，在疾病的慢性期，损伤的特征为丧失少突胶质细胞，并因此在血液中出现髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)抗体。
自身免疫病存在多种公认的动物模型。举例而言，EAE(实验性变应性脑脊髓炎、)是一种T细胞介导的自身免疫病，特征在于T细胞和单核细胞炎症以及随后中枢神经系统中轴突的脱髓鞘。通常认为EAE是与人中MS有关的动物模型(参见例如Bolton，C.，1995，Multiple Sclerosis，143)。可以对诸如候选的TCCR激动剂等试剂分析T细胞对免疫介导的脱髓鞘疾病的刺激或抑制活性，例如使用Current Protocols in Immunology，15.1和15.2单元；Coligan等编，National Institutes of Health，出版商John Wiley&Sons，Inc中描述的方案。也参见其中将少突胶质细胞或许旺氏细胞移植到中枢神经系统中的髓鞘疾病模型，例如如Duncan等，1997，Molec.Med.Today，554-561中所述。
关节炎的动物模型有胶原诱导的关节炎。参见例如McIndoe等，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，962210-2214。该模型具有人自身免疫性类风湿性关节炎的临床、组织学和免疫学特性，并且是人自身免疫性关节炎的公认模型。小鼠和大鼠模型的特征为滑膜炎、软骨侵蚀和软骨下骨。胶原诱导的关节炎具有人的类风湿性关节炎的许多特征，包括淋巴细胞浸润和滑膜肥大。参见例如McIndoe等，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，962210-2214。可利用这些模型的潜在的TCCR激动剂分析对自身免疫性关节炎的活性，例如使用Current Protocols in Immunology，15.5单元；Coligan等编，National Institutes ofHealth，出版商John Wiley&Sons，Inc中描述的方案。也参见Issekutz，A.C.等，Immunology(1996)88569中描述的利用针对CD18和VLA-4整联蛋白的单克隆抗体的模型。
皮肤同种异体移植物排斥的动物模型是测试T细胞介导体内组织破坏的能力的一种手段，即指示并测量它们在抗病毒和肿瘤免疫中的作用。最常见和公认的模型利用鼠尾部皮肤移植物。重复实验显示皮肤同种异体移植物排斥是通过T细胞、辅助性T细胞和杀伤-效应T细胞介导的，而非抗体。参见例如Auchincloss和Sachs，1998，在Fundamental Immunology中，第2版，W.E.Paul编，Raven Press，NY，第889-992页。一种合适的流程详述于CurrentProtocols in Immunology，4.4单元；Coligan等编，1995，National Institutes ofHealth，出版商John Wiley&Sons，Inc。其它可用于筛选候选的TCCR激动剂的移植排斥模型包括例如Tanabe等，1994，Transplantation，5823和Tinubu等，1994，J.Immunol.，4330-4338所描述的同种异基因心脏移植模型。
TCCR激动剂 TCCR激动剂是增强或刺激本文所披露的天然序列TCCR肽的生物学活性的分子。合适的激动剂分子具体包括激动剂抗体，包括人源化抗体或激动剂抗体片段，包括Fab、Fab’、Fd、Fd’、Fv、dAb、无铰链抗体、F(ab’)2片段、单链抗体分子、双抗体、单臂抗原结合分子和线性抗体、天然多肽的氨基酸序列变体或片段、肽、小分子、等等。
合适的TCCR激动剂还包括TCCR的肽片段、TCCR胞外结构域和与下列氨基酸序列具有至少约80％氨基酸序列同一性的TCCR变体 (a1)SEQ ID NO1的人TCCR肽的残基1或约33至636； (a2)SEQ ID NO2的鼠TCCR肽的残基1或约25至623； (b1)SEQ ID NO1的人TCCR肽的X3至636，其中X3是SEQ ID NO1的氨基酸残基27至37任一； (b2)SEQ ID NO2的鼠TCCR肽的X4至623，其中X4是SEQ ID NO2的氨基酸残基20至30任一； (c1)1或约33至X1，其中X1是SEQ ID NO1的残基512至残基522的任意氨基酸残基； (c2)1或约25至X2，其中X2是SEQ ID NO2的残基509至残基519的任意氨基酸残基； (d1)X5至636，其中X5是SEQ ID NO1的残基533至543的任意氨基酸； (d2)X6至623，其中X6是SEQ ID NO2的残基527至537的任意氨基酸；或 (e)SEQ ID NO1和SEQ ID NO2的氨基酸序列的另外具体衍生的片段。
TCCR激动剂包括例如其中在SEQ ID NO1和SEQ ID NO2序列的N-和/或C-末端或一个或多个内部结构域中添加或删除一个或多个氨基酸残基的TCCR肽。
TCCR激动剂包括天然序列IL-27、EBI3、p28、其具有与IL-27异二聚体通常有关的生物学活性的变体和片段。例如，TCCR激动剂包括与IL-27的天然序列组分具有至少80％、90％、95％或99％序列同一性的IL-27变体。TCCR激动剂还包括与天然序列人p28(SEQ ID NO3)或鼠p28(SEQ IDNO4)具有至少73％、75％、80％、90％、95％或99％序列同一性的p28变体。TCCR激动剂包括p28中能够结合TCCR和gp130的部分。举例来说，TCCR激动剂包括与天然序列人p28(SEQ ID NO3)或鼠p28(SEQ ID NO4)具有至少73％、75％、80％、90％、95％或99％序列同一性且能够结合TCCR和gp130的p28变体。TCCR激动剂包括含有来自p28的第一和第三α螺旋的残基及位于第一螺旋末端和第四螺旋起始的残基的p28肽变体，认为前者结合TCCR中在TCCR上发现的细胞因子受体同源结构域的区，认为后者结合gp130上发现的IG结构域。
TCCR激动剂包括例如能够结合并活化TCCR的分子。TCCR激动剂还包括能够使TCCR形成同二聚体的分子和/或那些能够使TCCR和gp130形成异二聚体的分子。例如，针对TCCR的抗体可能能够使TCCR形成同二聚体。作为进一步的例子，对TCCR和gp130两者特异的二价抗体可能能够使TCCR和gp130形成异二聚体。
鉴定TCCR肽的激动剂或拮抗剂的方法可包括使TCCR肽与候选的激动剂或拮抗剂分子接触，并测量与TCCR肽有关的一种或多种生物学活性的可检测变化。例如，为了鉴定激动剂，使表达TCCR肽的细胞与候选物接触，然后利用蛋白质印迹或其它合适的测定法，对发生接触的细胞分析TCCR的生物学活性，诸如Stat1、Stat3、Stat4或Stat5的磷酸化。为了鉴定TCCR激动剂，还可使经过改造而表达TCCR肽的细胞诸如Ba/F3细胞与候选的激动剂接触，然后例如通过测量[3H]标记的胸苷掺入或其它合适的测定法，对发生接触的细胞分析增殖。
单克隆抗体 已知多种用于生产单克隆抗体的技术。在一种方法中，例如，用TCCR或其一部分作为免疫原，在完全弗氏佐剂中乳化，并以1-100微克的量皮下或腹膜内注射，由此免疫小鼠诸如Balb/c。或者，免疫原在MPL-TDM佐剂(Ribi Immunochemical Research，Hamilton，MT)中乳化，并注射到动物的后爪垫中。然后在10-12天后用在选择的佐剂中乳化的追加的免疫原加强经过免疫的小鼠。此后，过几周，再用追加的免疫接种注射加强小鼠。通过眼窝后采血，可周期性获取小鼠的血清样品，供ELISA测试之用，以检测抗TCCR抗体。
在检测到合适的抗体滴度后，可以给抗TCCR抗体“阳性”的动物注射最后一次免疫原静脉内注射。3-4天后，处死小鼠并采集脾细胞。然后将脾细胞与选择的鼠骨髓瘤细胞系诸如可从ATCC，No.CRL 1597获得的P3X63AgU.1融合(使用35％聚乙二醇)。接着可将融合产生的杂交瘤细胞铺在装有HAT(次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷)培养基以抑制非融合细胞、骨髓瘤杂合体和脾细胞杂合体增殖的96孔组织培养板中。
可在ELISA或其它合适的测定法中对选择的杂交瘤细胞筛选针对TCCR的反应性。可将阳性杂交瘤细胞腹膜内注射到例如同基因Balb/c小鼠中以产生含有抗TCCR单克隆抗体的腹水。或者，可在例如组织培养瓶或滚瓶中培养杂交瘤细胞。可利用硫酸铵沉淀、接着通过凝胶排组层析或其它合适的方法进行腹水中所产生的单克隆抗体的纯化。或者，可利用基于抗体与蛋白A或蛋白G结合的亲和层析。
TCCR-/-小鼠 已经构建了不表达TCCR的“敲除型”小鼠(TCCR-/-)。这样的小鼠可例如通过编码TCCR的内源基因和导入动物胚细胞、编码相同肽的改变的基因组DNA之间的同源重组来制备。
例如，依据已建立的技术，编码特定肽的cDNA可用于克隆编码该肽的基因组DNA。编码特定肽的基因组DNA的一部分可删除或用另一种基因替换，诸如编码可用于监测整合的选择标志的基因。典型的，载体中包含几千碱基对的未改变的侧翼DNA(5′和3′末端都有)(关于同源重组载体的描述参见Thomas等，1987，Cell，51503)。将该载体导入胚胎干细胞系(诸如通过电穿孔)，并选择其中导入的DNA与内源DNA发生了同源重组的细胞。参见例如Li等，1992，Cell，69915。然后将选择的细胞注射到动物(诸如小鼠或大鼠)的胚泡中以形成聚集嵌合体，例如如Bradley等，1987，在Teratocarcinomasand Embryonic Stem CellsA Practical Approach中，E.J.Robertson编，IRL，Oxford，pp.113-152所述。接着可将嵌合胚植入合适的假孕雌性代孕动物，并使胚胎足月生产以创建“敲除型”动物。在其生殖细胞中具有同源重组DNA的后代可通过标准技术鉴定，并用于繁殖其中所有动物细胞都含有同源重组DNA的动物。
关于下文实施例中所使用的TCCR-/-小鼠的创建的描述见WO0129070(de Sauvage等)和Chen等，2000，Nature，407916，在此收入其内容作为参考。
组合物和治疗 可用于治疗自身免疫病的TCCR激动剂包括但不限于调控免疫功能例如T细胞增殖/活化、淋巴因子释放或免疫细胞浸润的蛋白质、抗体、片段和变体、有机小分子、肽、磷酸肽、等等。具体而言，本文中所描述的TCCR激动剂可用于抑制、减少或降低T淋巴细胞增殖、T淋巴细胞细胞因子释放和自身免疫病。
可通过上无讨论的任一筛选测定法和/或任何其它已知筛选技术来鉴定TCCR激动剂。
根据已知方法，可配制本发明的TCCR激动剂以制备有用的组合物，由此TCCR激动剂与可接受的载体结合。通过将具有期望纯度的TCCR激动剂与任选的可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合，以冻干剂型或水溶液的形式制备用于存储的配制剂。参见例如RemingtonThe Science and Practice ofPharmacy，第20版，Gennaro编(2000)。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(小于约10个残基)肽；蛋白质，诸如血清请蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖醇，诸如甘露醇或山梨醇；成盐抗衡离子，诸如钠；和/或非离子型表面活性剂，诸如TWEEN、PLURONICS或PEG。
将要用于体内施用的配制剂必须是无菌的。这可在冻干和重建之前或之后容易的通过无菌滤膜过滤来实现。
在本文中，组合物通常置于具有无菌出入口的容器中，例如静脉注射溶液袋或具有皮下注射针头能刺穿的塞子的小瓶。
施用途径与已知方法一致，诸如通过静脉内、腹膜内、脑内、肌肉内、眼内、动脉内或损伤内途径注射或输注，局部施用，或通过持续释放系统。施用途径还可包括作为转染合适载体诸如腺病毒载体的结果的体内表达。
本发明药物组合物的剂量和期望药物浓度可随预期的具体用途而变化。适宜施用剂量或途径的确定完全在普通医师的技术范围内。动物实验提供了对确定用于人治疗的有效剂量的可靠指导。有效剂量的物种间缩放可遵循Mordenti，J.和Chappell，W.，″The use of interspecies scaling in toxicokinetics″，在Toxicokinetics and New Drug Development中，Yacobi等编，Pergamon Press，New York 1989，pp.42-96所制定的原则进行。
在采取体内施用TCCR激动剂时，根据施用途径，正常的剂量可在每天约10ng/kg至100mg/kg哺乳动物体重或更多之间变化，例如约1μg/kg/天至10mg/kg/天。文献中提供了关于投递的具体剂量和方法的指导；参见例如美国专利号4,657,760；5,206,344；或5,225,212。可以预料，不同配制剂将对不同治疗和不同疾病有效，而且旨在治疗特定器官或组织的施用可能必需以不同于其它器官或组织的方式进行投递。
在具有适合于治疗任何需要施用TCCR激动剂的疾病或病症的释放特性的剂型中期望TCCR激动剂持续释放施用时，设想将TCCR激动剂微囊化。用于持续释放的重组蛋白的微囊化已经成功的在人生长激素(rhGH)，干扰素-α、-β、-γ，白介素-2和MN rgp120上实现。参见例如Johnson等，1996，Nat.Med.2795-799；Yasuda，1993，Biomed.Ther.，1221-1223；Hora等，1990，Bio/Technology，755-758；Cleland，1995，″Design and Production of SingleImmunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems″，在Vaccine DesignThe Subunit and Adjuvant Approach中，Powell和Newman编，Plenum PressNew York，第439-462页；WO 97/03692，WO 96/40072，WO96/07399和美国专利号5,654,010。
可利用聚乳酸-共-乙醇酸(PLGA)，一种展示出强生物相容性水平和广泛的生物可降解特性的聚合物，来开发TCCR激动剂的持续释放剂型。PLGA的降解产物，乳酸和乙醇酸，可从人体中快速清除。此外，根据其分子量和组成，该聚合物的可降解性能可在几个月到几年的范围内调节。详情参见Lewis，″Controlled Release of Bioactive Agents from Lactide/Glycolidepolymer″，在Biogradable Polymers as Drug Delivery Systems中，M.Chasin和R.Langeer编，Marcel DekkerNew York，1990，第1-41页。
实施例 参照下文实施例可以更好的理解本发明。这些实施例旨在代表本发明的具体实施方案，而非意在限制本发明的范围。
实施例1TCCR介导的对T细胞应答的抑制 通过分析野生型(TCCR+/+)和敲除型(TCCR-/-)脾细胞的诱导的T细胞增殖，测试TCCR活性对T细胞应答的效应。T细胞受体与CD3结合，形成T细胞受体复合物。足够剂量的抗CD3抗体非特异性刺激T细胞的增殖，所述T细胞通常与T细胞受体复合物和抗原呈递细胞(APC)的II类MHC分子(CD4)的相互作用有关。
野生型(TCCR+/+)和敲除型(TCCR-/-)混合淋巴细胞、分离的CD4+T细胞、及分离的CD8+T细胞的增殖受抗CD3抗体(BD Pharmingen，San Diego，CA，克隆145-2c11)所刺激。将细胞在增湿的CO2培养箱中培养3天，并通过在该测定的最后8-16小时期间测量的[3H]-胸苷掺入测定增殖。令人惊奇的是，如表5和图5所示，在亚最大(submaximal)的抗CD3剂量下，抗CD3抗体诱导的获自敲除型小鼠(TCCR-/-)的混合淋巴细胞的增殖显著高于获自野生型小鼠(TCCR+/+、)的淋巴细胞的增殖。该数据说明TCCR活性的保护效应，例如，抑制受到刺激的T细胞增殖，以及用激动剂刺激TCCR可能可用于直接或间接抑制T细胞应答，诸如T细胞增殖。
表5 但是，分别如图6(表6)和图7(表7)所示，在野生型和敲除型细胞之间，抗CD3抗体诱导的分离的CD4+T细胞和分离的CD8+T细胞的增殖没有显著差异。该数据说明IL-27，TCCR的一种配体，是由CD4+T细胞和CD8+T细胞以外的淋巴细胞产生的。
表6 表7 接着，在CFSE(二醋酸羧基荧光素，琥珀酰亚胺酯)标记测定中测量CD4+和CD8+细胞应答抗CD3抗体刺激的增殖。因为在每次细胞分裂后标记细胞失去它们荧光强度的50％，故CFSE标记使得细胞分裂数得以监测。用CFSE标记野生型(TCCR+/+)和敲除型(TCCR-/-)混合淋巴细胞悬浮液以在细胞悬浮液中形成0.5μM CFSE(Sigma，St.Louis，MO)的浓度。然后将细胞悬浮液在37℃温育10分钟。标记后，FCS添加到5％终浓度，细胞立刻离心并用冰冷的PBS洗涤。用2.5μg/ml浓度的抗CD3抗体(BD Pharmingen，San Diego，CA，克隆145-2c11)刺激野生型(TCCR+/+)和敲除型(TCCR-/-)混合淋巴细胞的增殖。
接着将细胞在37℃温育2天。此刻用CD4+和CD8+的标志物(CD4-Cychrome或CD8-Cychrome)标记细胞并通过流式细胞术分析。
下文所示数据显示了在TCCR敲除型细胞中CD4+和CD8+两种阳性T细胞都是过度增殖的(见表8)。图10和11描绘了在温育期经历了0、1、2、3、4或5次细胞分裂的细胞数。对于CD4+和CD8+两种T细胞，与野生型相比，在敲除型中有更多的细胞经历了3、4和5次分裂(即在CD4+细胞(图14)和CD8+细胞(图15)中敲除型细胞的线右移)。
表8 实施例2表达TCCR的小鼠对EAE较不易感 实验性变应性脑脊髓炎(EAE)是一种用作多发性硬化(MS)动物模型的CNS自身免疫病。与MS类似，EAE是一种脱髓鞘疾病，其中免疫介导的对髓鞘的损害产生可观察到的症状。认为EAE是通过CD4+Th1细胞(Fife等，2001，J.of Immun.，1667617-7624)和CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)(Huseby等，2001，J.EXp.Med.，194(5)669-676)介导的。为了检验TCCR对EAE的作用，在表达TCCR的野生型小鼠(TCCR+/+)和缺少TCCR的敲除型小鼠(TCCR-/-)中检查EAE的临床进展。如下所示，与缺少TCCR的小鼠相比，表达TCCR的小鼠对CD4+Th1和CD8+介导的疾病EAE较不易感。
敲除型TCCR-/-小鼠如WO0129070(de Sauvage等)中所述产生，回交到C57BL/6背景上，并从N12建立者(founders)繁殖。野生型TCCR+/+对照是购自Jackson Laboratory(Bar Harbor，ME)的C57BL/6小鼠。
MOG诱导的EAE MOG 35-55肽具有氨基酸序列MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK(SEQID NO7)，在Rainin Quartet自动化肽合成仪(Rainin，Oakland，CA)上使用9-芴基甲氧羰基化学法合成。将该肽从树脂上切下并使用制备性反相HPLC纯化，流动相中具有水/乙腈/0.1％TFA梯度。通过电喷射质谱法确认肽的身份(identity)。
给野生型TCCR+/+和敲除型TCCR-/-小鼠皮内免疫200μl含有溶于100μl PBS和100μl CFA(完全弗氏佐剂)中的200μg MOG 35-55肽的乳状液，以在第0天诱导EAE。通过将IFA(不完全弗氏佐剂)(Difco-BD DiagnosticSystems，Sparks，MD)与死亡且干燥的结核分枝杆菌(M.tuberculosis)H37A(Difco-BD Diagnostic Systems，Sparks，MD)混合至8mg/ml结核分枝杆菌的浓度来制备CFA(每只小鼠接种800μg死亡的结核分枝杆菌作为CFA的组分)。在第0天及再次在第2天，给每只小鼠腹膜内注射溶于100μl PBS中的200ng百日咳毒素(List Biological Laboratories，Campbell，CA)以帮助穿透血脑屏障。各成分的剂量概述于下表9中。
表9 MBP诱导的EAE Ac 1-11肽具有氨基酸序列ASQKRPSQRHG(SEQ ID NO8)，在RaininQuartet自动化肽合成仪(Rainin，Oakland，CA)上使用9-芴基甲氧羰基化学法合成。将该肽从树脂上切下并使用制备性反相HPLC纯化，流动相中具有水/乙腈/0.1％TFA梯度。通过电喷射质谱法确认肽的身份(identity)。
给野生型TCCR+/+和敲除型TCCR-/-小鼠皮内免疫溶于100μl CFA(完全弗氏佐剂)中的10μg Ac 1-11肽(ASQKRPSQRHG)，髓鞘碱性蛋白的一种组分，以在第0天诱导EAE。如上关于MOG诱导的EAE所讨论的，通过将IFA(不完全弗氏佐剂)与结核分枝杆菌H37A(死亡且干燥的)混合至8mg/ml结核分枝杆菌的浓度来制备CFA(每只小鼠接种800μg死亡的结核分枝杆菌作为CFA的组分)。在第2天及再次在第3天，给每只小鼠腹膜内注射溶于100μl PBS中的200ng百日咳毒素以帮助穿透血脑屏障。各成分的剂量概述于下表10中。
表10 对所有小鼠评估临床疾病，每周3次，在第1天开始。达到疾病4级的小鼠每日评估。对任何达到5级的动物实施安乐死。对那些在5天内未能改善为3级或更低的动物实施安乐死。所使用的临床分级系统如下表11所示 表11 在第40天，处死所有剩余动物并剥离脑和脊髓用于组织学分析。将脑切片，对于每个脑，四个水平中的每一水平切一片切片，并用H&E(苏木精曙红染料，Sigma，St.Louis，MO)染色以评估炎症。将脊髓切片，对于每个脊髓，三个不同水平中的每一水平切四片切片，并用H&E染色以评估炎症，以及用勒克司坚牢蓝(Luxol Fast Blue)(VWR Scientific，St.Paul，MN)染色以评估脱髓鞘。对于每个载玻片，报告炎症和脱髓鞘的最高得分和平均得分(每个载玻片上所有切片的平均得分)。所使用的炎症分级系统如下表12所示 表12 所使用的脱髓鞘分级系统如下表13所示 表13 与在敲除型(TCCR-/-)小鼠中诱导的EAE相比，在野生型(TCCR+/+)中MOG(髓鞘少突胶质细胞糖蛋白)诱导的EAE(实验性变应性脑脊髓炎)的临床进展较不严重(见图8)。类似的，与在敲除型(TCCR-/-)小鼠中诱导的EAE相比，在野生型(TCCR+/+)中MBP(髓鞘碱性蛋白)诱导的EAE的临床进展较不严重(见图9)。
如图8和9所示，缺少TCCR的动物(TCCR-/-)显示更严重的EAE临床症状，而表达的TCCR的小鼠(野生型)则显示出较不严重的症状和进展，说明TCCR活性对自身免疫病诸如EAE的保护效应。
图10-13中所示的组织学分析进一步支持了临床数据。与野生型小鼠相比，TCCR-/-小鼠具有更高的炎症和更高的脱髓鞘得分，表明与缺少TCCR的小鼠(TCCR-/-)相比，表达TCCR的小鼠(野生型)对CD4+Th1和CD8+介导的疾病EAE较不易感。
总之，数据说明TCCR活性对自身免疫病诸如EAE的保护、压制或抑制效应。
实施例3用TCCR激动剂治疗自身免疫病 如实施例2所述，实验性变应性脑脊髓炎(EAE)是用作多发性硬化(MS)动物模型的CD4+Th1或CD8+介导的CNS自身免疫病。为了检验所施用的TCCR激动剂对自身免疫病的进展和病程的效应，在MS的实验模型系统诸如诱导的EAE中施用TCCR激动剂诸如IL-27。如例如上文实施例2所述，在小鼠中发起EAE。在表达TCCR(TCCR+/+)并接受TCCR激动剂诸如IL-27的小鼠中评估EAE的临床进展。与未治疗的TCCR+/+对照相比，用TCCR激动剂诸如IL-27治疗的小鼠预期显示出减轻的疾病临床症状或进展和/或对自身免疫病较不易感。
实施例4用TCCR激动剂治疗动物模型中的关节炎 可在几种可利用的动物模型系统之一中测试TCCR激动剂对自身免疫病的抑制和/或保护效应。小鼠中胶原诱导的关节炎是自身免疫病，类风湿性关节炎的模型。该模型描述于例如McIndoe等，1999，PNAS USA 962210-2214中。小鼠中胶原诱导的关节炎与人类风湿性关节炎具有许多共同特征，包括淋巴细胞浸润和滑膜肥大。
在小鼠例如C57BL/6小鼠或其它合适的实验室动物中检验胶原诱导的关节炎的临床进展。例如通过McIndoe等，见上中所描述的方法或其它已知方法，在测试动物中诱导关节炎。一般而言，通过将衍生自不同动物物种的II型胶原注射到测试动物中来产生模型动物，例如将牛II型胶原注射到小鼠中。胶原可以与佐剂诸如完全弗氏佐剂联合使用。
例如，在施用诱导关节炎的试剂之前、期间和/或之后，或者在关节炎症状发作之前、期间和/或之后，将TCCR激动剂诸如TCCR配体IL-27施用于测试动物。施用方法和剂量可以变化，包括例如施用载体中的肽配体诸如IL-27，例如以每天一剂在前(pre)和/或在后(post)剂量，以多剂量，在两剂或多剂在前和/或在后剂量的一段时期内每天一次，或对于将肽试剂施用于表达TCCR受体的细胞已知的其它合适剂量。或者包括通过自重组腺病毒表达肽来投递肽配体诸如IL-27，例如表达IL-27的两种亚基或连接的IL-27细胞因子。
例如如McIndoe等，见上中所述，监测测试和对照动物中临床疾病的进展。例如，在一段时期内监测疾病的物理和化学特征并对其打分。可对动物分析主要关节的淋巴细胞浸润、滑膜肥大、滑液中细胞因子含量、等等。在测试动物和对照动物之间比较这些参数。与实施例1和2中所证明的TCCR的保护/抑制效应一致，用TCCR激动剂治疗动物中诱导的关节炎预期提供抑制和/或保护效应，与未治疗的对照动物相比，展示出不及其严重的临床症状、结果和/或物理或化学特征。
实施例5针对TCCR的单克隆抗体的制备 使用hTCCR的胞外结构域制备针对hTCCR的单克隆抗体。免疫原是缺少跨膜部分(SEQ ID NO1的残基517-538)的hTCCR(SEQ ID NO1)，在羧基末端添加有8个组氨酸残基标记供纯化目的。通过镍NTA亲和层析纯化hTCCR(ECD)-(His)8肽。
将hTCCR(ECD)-(His)8肽(1-2微克)与25微升MPL-TDM佐剂(RibiImmunochemical Research，Hamilton，MT)混合，并注射到野生型balb/c小鼠(Charles River Laboratories，Wilmington，MA)的足垫中，每周两次，总共注射12次。
在第42天，处死小鼠并采集脾细胞。将脾细胞与鼠骨髓瘤细胞(P3X63AgU.1，可从ATCC，No.CRL 1597获得)融合(使用35％聚乙二醇)。然后将融合产生的杂交瘤细胞铺在装有HAT(次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷)培养基以抑制非融合细胞、骨髓瘤杂合体和脾细胞杂合体增殖的96孔组织培养板中。
然后在ELISA中对杂交瘤细胞筛选结合TCCR的抗体。鉴定出具有对TCCR的反应性的杂交瘤培养物包括培养物2685、2686和2688。杂交瘤培养物2686(抗体2686)于2004年12月15日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，Va)，入藏登记号ATCC PTA-6447。
实施例6单克隆Ab 2686活化人TCCR 使用表达重组TCCR的Ba/F3细胞分析抗TCCR抗体活化TCCR的能力。Ba/F3细胞是一种鼠IL-3依赖性细胞系。可通过测量表达TCCR的Ba/F3细胞应答候选激动剂的增殖来评估候选的TCCR激动剂。由于多核苷酸的合成增加，因此细胞增殖导致[3H]-胸苷掺入增加。例如通过测量[3H]-胸苷摄取来监测细胞增殖。如下所示，通过诱导表达TCCR的Ba/F3细胞增殖，单克隆抗体AB 2686展现出TCCR激动剂活性。
Ba/F3细胞(Palacios等，1985，Cell，41727-734)是一种鼠造血因子依赖性细胞系，其生长和生存都需要IL-3。Ba/F3细胞在补充有10％胎牛血清(GIBCO，Carlsbad，CA)和100pg/mL小鼠IL-3(R&D Systems，Minneapolis，MN)的RPMI-1640培养基(GIBCO，Carlsbad，CA)中培养。
通过电穿孔将带有新霉素抗性基因并包含编码人或鼠TCCR的多核苷酸序列的pMSCV载体(Clontech，Palo Alto，CA)转染到Ba/F3细胞中。用1mg/ml G418(Clontech，Palo Alto，CA)处理稳定的转染子以选择已经转染了含有新霉素抗性基因的载体的稳定真核细胞系。然后用藻红蛋白标记的识别TCCR的单克隆抗体处理细胞。通过FACS选择标记的表达TCCR的克隆。
用补充有10％胎牛血清但未补充IL-3的RPMI-1640培养基洗涤表达TCCR的细胞。然后将细胞以5×103个细胞/孔铺在100μl补充有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中，一式两份。以下表14所示的4∶1连续稀释的浓度添加纯化的重组鼠IL-3(阳性对照)或纯化的抗TCCR(人)单克隆抗体 2685-IgG2a、2686-IgG1、2688-IgG1、对照同种型IgG2a(BD Pharmingen，SanDiego，CA)或对照同种型IgG1(BD Pharmingen，San Diego，CA)。
表14 在48小时后，将1μCi[3H]-胸苷(Amersham-Pharmacia，Piscataway，NJ)添加到每个孔中。在又6小时后，在β-计数器(Packard Topcount，PerkinElmerLife and Analytical Sciences，Boston，MA)中测量掺入细胞中的[3H]-胸苷。
结果示于图2-4。表达人TCCR的Ba/F3细胞应答单克隆抗体2685-IgG2a、2686-IgG1、2688-IgG1和对照同种型IgG2a和同种型IgG1的增殖示于图2。与任何其它所测试的抗体相比，抗体2686诱导的[3H]-胸苷掺入显著更多，证明抗体2686是Ba/F3细胞中表达的人TCCR的有效激动剂。
表达人TCCR的Ba/F3细胞应答鼠IL-3(阳性对照)或抗体2686的增殖示于图3。如所示，虽然不如阳性对照IL-3，抗体2686在表达人TCCR的Ba/F3细胞中有效产生TCCR应答。
如图4所示，与表达鼠TCCR的Ba/F3细胞相比，表达人TCCR的Ba/F3细胞应答抗体2686处理掺入了显著更大量的[3H]-胸苷。该数据证实了抗体2686是人TCCR的特异性激动剂，并显示与鼠TCCR没有交叉反应性。
这些研究证明TCCR激动剂，诸如所证明的激动剂抗体，能结合并刺激TCCR受体以诱导TCCR介导的生物学活性，在这里指Ba/F3细胞的增殖。因此，该数据说明TCCR激动剂可用于在体内直接或间接诱导TCCR介导的活性。
实施例7其它TCCR激动剂的鉴定 为鉴定和验证具有TCCR激动活性的试剂，对推定的TCCR激动剂包括IL-27的片段和TCCR的变体分析与TCCR受体的结合。可在体外或体内分析TCCR结合。例如，将潜在的激动剂施用于表达TCCR的细胞，诸如经过改造而表达重组TCCR的COS细胞或Ba/F3细胞，如上文实施例3所述，并测量对潜在激动剂的细胞应答。
还可通过将潜在的肽激动剂表达为融合蛋白来分析受体结合，例如含有人IgG Fc结构域的免疫黏附素。为了检测受体-配体结合，可例如使免疫黏附素与表达TCCR的细胞相互作用。利用识别Fc融合结构域的荧光试剂，可在显微镜下观察到结合的免疫黏附素。可通过分析荧光或通过其它已知方法对结合定量。
可通过分析候选激动剂刺激TCCR介导的活性诸如IL-10或SOCS-3的表达的能力来筛选TCCR激动剂。例如，可使表达TCCR的T淋巴细胞与候选的激动剂接触。可例如通过ELISA、定量PCR等方法来测量IL-10和/或SOCS-3的表达。IL-10和/或SOCS-3表达相对于对照例如基础IL-10和/或SOCS-3水平的升高与TCCR刺激有关，表明是有用的TCCR激动剂。
实施例8IL-27介导的细胞增殖及细胞因子的诱导和抑制 在中性、Th1或Th2诱导条件下，在野生型(TCCR+/+)和敲除型(TCCR-/-)CD4+细胞中检验IL-27对细胞因子诱导的效应。在中性、Th1或Th2诱导条件下，在野生型(TCCR+/+)和敲除型(TCCR-/-)CD4+细胞中检验IL-27对细胞恢复(recall)增殖的效应。
在第0天，将野生型CD4+或TCCR敲除型CD4+细胞以2×105细胞/孔铺在事先已经用激动性抗CD3单克隆抗体(145-2C11，BD Pharmingen，SanDiego，CA，5ug/ml，在PBS中，过夜)包被的24孔板中。然后在中性、Th1偏爱或Th2偏爱条件下，诱导各个孔中的增殖。中性条件通过添加IL-2(R&D Systems，Minneapolis，MN)、抗IL-12抗体(BD Pharmingen，San Diego，CA)、抗IFN-γ抗体(BD Pharmingen，San Diego，CA)、抗IL-4抗体(BD Pharmingen，San Diego，CA)和CD-28(BD Pharmingen，San Diego，CA)创建。Th1偏爱条件通过添加IL-2、IL-12(R&D Systems，Minneapolis，MN)、抗IL-4抗体和CD-28创建。Th2偏爱条件通过添加IL-2、IL-4(R&D Systems，Minneapolis，MN)、抗IL-12抗体、抗IFN-γ抗体和CD28创建。对这些各个孔的处理如下表15所示。
表15 在37℃培养细胞。在24小时、48小时和/或72小时时采集上清液样品。对上清液样品进行ELISA，使用了针对TNF-α、IL-5、IL-2、IFN-γ、IL-10、IL-6、IL-4、GM-CSF的探针(试剂盒购自BD Pharmingen，San Diego，CA)。下文表16以IL-27依赖性诱导的倍数显示了ELISA数据。图16A-C显示了在中性(16A)、Th1偏爱(16B)和Th2偏爱条件(16C)下IL-2的IL-27依赖性诱导。图17A-C显示了在中性(17A)、Th1偏爱(17B)和Th2偏爱条件(17C)下IL-10的IL-27依赖性诱导。
数据显示TNF-α、IFN-γ和IL-4应答IL-27得到诱导。数据还显示IL-2、IL-6和GM-CSF应答IL-27得到抑制。数据显示在中性、Th1偏爱和Th2偏爱条件下IL-27诱导了IL-10。如上所述，IL-10在限制和终止炎症应答中起主要作用。由于IL-27诱导IL-10，数据说明IL-27能用于治疗免疫介导的疾病。
表16 IL-27诱导的细胞因子 *数据显示为IL-27的诱导倍数 从在24小时、48小时和/或72小时时采集的细胞样品中提取RNA，然后如下表17所示，用对SOCS-1、SOCS-3、PIAS-1和PIAS-3特异的探针进行定量PCR(TAQMAN)。
表17 下表18以IL-27依赖性诱导的倍数显示了定量PCR数据。图18A-C显示了在中性(18A)、Th1偏爱(18B)和Th2偏爱条件(18C)下，SOCS-3的IL-27依赖性诱导。
数据显示在中性、Th1偏爱和Th2偏爱条件下，IL-27诱导了SOCS-3。如上所述，已知SOCS-3抑制细胞因子发信号，并且已报道了其是某些试剂抗炎效应的介导物。由于IL-27诱导SOCS-3，数据说明IL-27能用于治疗免疫介导的疾病。
表18 在中性条件下处理的上述细胞在72小时时采集样品并提取RNA。然后利用GENECHIP(Affymetrix，Santa Clara，CA)对RNA分析诱导的表达。下表19以相对于未处理对照的诱导(抑制)倍数显示了所选择基因的GENECHIP数据。
在此，数据再次显示在中性条件下IL-27诱导IL-10。如上所述，IL-10在限制和终止炎症应答中起主要作用。由于IL-27诱导IL-10，数据说明IL-27能用于治疗免疫介导的疾病。
表19 在第3天，在存在IL-2和存在或缺乏IL-27时扩增细胞。具体而言，从24孔板中取出含有那些先前暴露于IL-27的细胞的1ml培养基，然后与含有2×10-4mg/ml IL-27和1×10-5mg/ml IL-2的3ml培养基一起置于6孔板中。取出含有那些先前未暴露于IL-27的细胞的1ml培养基，然后与含有1×10-5mg/ml IL-2的3ml培养基一起置于6孔板中。
在第5天，将含有2×10-4mg/ml IL-27和1×10-5mg/ml IL-2浓度的4ml培养基(IMDM(Invitrogen，Carlsbad，CA)w/10％HyClone血清)添加到那些含有先前暴露于IL-27的细胞的孔中。将含有1×10-5mg/ml IL-2浓度的4ml培养基添加到那些含有先前未暴露于IL-27的细胞的孔中。
在第6天，将细胞离心，然后将沉淀物重悬于培养基(如上相同的培养基)并计数。不同孔的细胞计数示于下表20中，并反映于图19中。
数据显示在Th1或Th2偏爱条件下添加IL-27降低CD4+细胞的增殖，说明IL-27可用于治疗特征为CD4+细胞增殖的疾病，包括自身免疫病诸如多发性硬化和类风湿性关节炎。
表20 实施例9IL-27抑制IL-6诱导的增殖 在存在和缺乏抗IL-2抗体(BD Pharmingen，San Diego，CA)时，检验IL-27对IL-6诱导的野生型(TCCR+/+)和敲除型(TCCR-/-)CD4+细胞增殖的效应。
将来自野生型小鼠的混合脾细胞(4×105)置于96孔板的孔中。将来自敲除型小鼠的混合脾细胞(4×105)置于板上的不同孔中。所有孔都用100μl溶于PBS中的2ug/ml抗CD3包被过夜。依照下表21中所示的实验组处理孔。
表21 在37℃培养细胞。48小时后，添加[3H]-胸苷，又过一夜，通过[3H]-胸苷掺入来测量增殖。每组的平均CPM示于下表22中。没有IL-2中和的增殖示于图20A中。有IL-2中和的增殖示于图20B中。
表22 数据显示不管是否存在抗IL-2抗体，IL-27都抑制抗CD3抗体刺激的及IL-6增强的增殖。当不存在抗IL-2抗体时，IL-27抑制抗CD3抗体刺激的增殖。抗IL-2抗体降低抗CD3抗体刺激的增殖。但是，添加IL-27部分减轻该效应。
实施例10IL-27受体(TCCR)缺陷型小鼠是EAE高度敏感的 IL-27是一种由活化的抗原呈递细胞(APC)产生的配体。IL-27通过由特异性亚基IL-27和gp130(许多其它受体包括IL-6R所共有的)组成的异二聚体受体发信号。如本文中所讨论的，IL-27通过多种STAT和Jak-1活化信号，但主要的信号事件似乎是STAT-1的活化。通过STAT-1的活化和TH-1特异性转录因子T-bet的下游诱导，促进了IL-12RB2链和IFN-γ的表达。IL-27配体和受体图示于图21。
IL-27是IL-12家族的成员，属于细胞因子IL-6簇。见图22。IL-27的两种组分，EBI3和p28，与IL-12亚基享有密切的同源性。IL-27受体(IL-27R)，也称为TCCR，的两个亚基在多种白细胞上协调表达。最高的表达似乎在T细胞和NK细胞上。
幼稚的、未分化的T细胞(Th-0)应答诱导幼稚Th-0细胞分化为成熟T辅助细胞的不同信号。一般而言，已知两种类型的T辅助细胞，Th-1和Th-2细胞。如图23所示，IL-4对Th-0细胞的刺激引起Th-2细胞发育，产生IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13。Th-2细胞和细胞因子产物影响体液免疫和抗蠕虫应答。IL-27和/或IFN-γ对Th-0细胞的刺激诱导T细胞中IL-12应答性的状态，使得它们在IL-12控制下能分化为成熟的TH-1细胞，并产生IFN-γ、IL-2和淋巴毒素(LT)。Th-1细胞及其细胞因子产物与细胞介导的免疫和巨噬细胞活化有关。
为使我们进一步理解IL-27在Th-0细胞分化为Th-1和Th-2辅助细胞中的作用，如上文实施例所述产生IL-27R缺陷型小鼠(TCCR敲除型)。利用实验性自身免疫性脑炎(EAE)，一种多发性硬化的小鼠模型，检验IL-27在自身免疫病过程中的潜在作用。由于仅转移来自具有EAE的小鼠的CD4+T细胞能在首次用于实验的(naive)受体小鼠中引起EAE，因此EAE是T细胞介导的。
为诱导实验性EAE，用在完全弗氏佐剂中的髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)35-55肽免疫小鼠。用MOG免疫野生型(WT)和IL-27受体(TCCR)敲除型小鼠，并如上文实施例所述检查EAE的证据。在治疗后过25天评估临床EAE得分。
图24所示数据证明不是所假定的由于除去IL-27刺激所引起的EAE疾病减轻，IL-27R缺陷型小鼠中EAE加重了。小鼠似乎是EAE高度敏感的且发展成严重的EAE疾病。取自表现出EAE表型的受体缺陷型小鼠的脊髓组织的组织学分析示于图25，证实了具有EAE的IL-27受体敲除型小鼠中炎症和脱髓鞘增强。
进一步发现，用多种病原体刺激IL-27受体缺陷型小鼠，以及诱导的哮喘和肝炎模型，导致Th-1和Th-2介导的应答都加重。这些数据表明IL-27具有重要的免疫抑制功能。
为进一步研究IL-27及其在T细胞分化中可能的作用，根据图27图示的流程，通过MACS纯化幼稚CD4+细胞并用抗CD3+抗体处理，添加或不添加IL-27。在促进T细胞极化为Th-0、Th-1或Th-2的条件下，用IL-27刺激T细胞。
简而言之，用5μg/ml抗CD3(BD Pharmingen)包被24孔平皿过夜。在存在IL-2(10ng/ml)和抗CD28(1μg/ml)时，在每个孔中接种1.8×106CD4+T细胞。为了分化，添加以下细胞因子和抗体TH-0(抗IL-12、抗IFN-γ、抗IL-4，每种为5μg/ml)，TH-1(IL-12为3.5ng/ml，抗IL-4为5μg/ml)，TH-2(IL-4为3.5ng/ml，抗IFNγ和抗IL-12为5μg/ml)。将IL-27以200ng/ml的浓度添加到有些培养物中。72小时后，分离上清液以及RNA，并通过芯片、RT-PCT和/或ELISA分析法分析特定细胞因子的产生。所得数据示于图28，证明IL-27对T细胞发育具有深刻作用。
IL-27对大多数所检验的细胞因子具有深刻作用，该作用通常不依赖细胞分化的条件。在诱导Th-2的条件下，IL-27诱导TNFα和IL-10以及IL-4。同时，IL-27深深抑制IL-2、IL-5、IL-6、GM-CSF和IL-17的产生。
为确定任何这些作用是否是众所周知且有力的免疫抑制细胞因子IL-10的诱导所继发的(secondary)，还在IL-10缺陷型T细胞中检验IL-27的作用。如图29所示，IL-27诱导的对细胞因子产生的调控不依赖IL-10，因为比较野生型和IL-10缺陷型T细胞，在IL-2或GM-CSF的产生中看到的差异很小。
尽管在体外看到IL-27对免疫抑制性IL-10的强诱导(图28)，在来自具有EAE的IL-27R-/-小鼠的T细胞中只看到较小的IL-10降低(图30)。但是，该人为的体外观察结果决不能排除如下解释，即IL-27介导的IL-10诱导是EAE过程中的重要生物学过程。相反，它最有可能反映了我们用于研究IL-27诱导的IL-10体内诱导的实验技术的限制。
实施例11EAE是TH-17依赖性的 最近的证据表明新的辅助性T细胞亚型，即所谓的TH-17细胞，是许多促炎过程包括EAE的关键介导物。报道了这些Th-17产生IL-17A、IL-17F、IL-6、TNF和GM-CSF。见图31提供的图解。对TH-17细胞的发育了解很少，但认为依赖IL-23，另一种类似于IL-12的异二聚体细胞因子。IL-23缺陷型动物无法有效发育该T细胞表型，并且对EAE和CIA有抗性。但是，尽管IL-23似乎是必需的，它还不足以使TH-17细胞在体外分化。
如上为所讨论的，与野生型同窝幼仔相比，IL-27R缺陷型小鼠发展出更严重的EAE疾病。分析IL-27信号的下游事件以确定对EAE严重程度的此限制效应中的重要因素。在活化过程中检验多种细胞因子应答IL-27的表达。
IL-27促进IFN-γ产生，已知IFN-γ抑制IL-17。数据表明IL-27比IFN-γ更有效的抑制IL-17和其它Th-17细胞因子IL-6和GM-CSF的产生(见图33和34)。此外，来自具有EAE的TCCR-/-小鼠的淋巴结细胞在体外在再刺激时分泌比野生型更多的Th-17细胞因子(图37)。
IL-27介导的对IL-17产生的抑制不依赖IFN-γ，因为致使其不响应IFN-γ的T细胞在用IL-27刺激时仍然抑制IL-17产生(图35)。在缺乏IFN-γ信号时，基础IL-17产生更高。原因尚不清楚，因为即使在野生型培养物中，通过添加IFN-γ中和性抗体仍阻断IFN-γ信号。因此，在IFN-γR缺陷型小鼠中的IL-17高表达可能反映发育改变(即IFNγR缺陷型T细胞与野生型细胞的不同不只限于IFNγR表达)，或者可能反映胞内IFNγ回路。在共表达配体和受体的细胞中，在晚期分泌途径中能产生信号，这样的信号将是胞内的且不为中和性抗体所阻断。
为确定Th-17细胞在IL-27R缺陷型小鼠中是否调节异常，用CFA中的MOG免疫IL-27R缺陷型小鼠。在第14天取出引流淋巴结，并用MOG离体再刺激。含有IL-27R缺陷型T细胞的淋巴结上清液表达显著升高水平的IL-17(图37和38)。
此外，对脑和脊髓(EAE中炎症的实际部位)的免疫浸润物的分析揭示IL-27R缺陷型小鼠中浸润了更多细胞。此外，在通过胞内染色分析时，更高百分数的这些细胞是IL-17阳性的。总之，这两项观察结果转变为脊髓中IL-17的表达是粗略两倍(见图39)。
IFN-γ和IL-27都活化STAT-1，STAT-1敲除导致IL-17升高。因此，IL-27可通过活化STAT-1而抑制IL-17。该关系通过在获自STAT-1敲除型模型的细胞中分析IL-27介导的IL-17抑制来研究。在缺乏STAT-1时，IL-27不抑制IL-17，表明该抑制是由STAT-1介导的。在缺乏STAT-1时，IL-27成为IL-17的诱导物。这种颠倒的机制基础是未知的，但有可能推测IL-27对STAT-3的活化在该效应中起作用，因为其它诱导IL-17的细胞因子(特别是IL-23)通过STAT-3发信号而不活化STAT-1(见图36)。
总之，IL-27受体(TCCR)缺陷型小鼠是EAE高度敏感的。IL-27在体外有效抑制Th-17细胞因子IL-17、IL-6和GM-CSF。此外，具有EAE的L-27受体缺陷型小鼠比野生型产生更多的Th-17细胞因子。IL-27可通过使免疫应答偏离Th-17来抑制EAE。
实施例12IL-6诱导Th-17细胞 如图41所图示的，IL-23是Th-0细胞分化为产生细胞因子IL-17、IL-6、GM-CSF和TNF的Th-17细胞所必需的，但非充分的。IL-23不是充分的一个可能原因是Th-0细胞不表达IL-23受体，因此不响应IL-23。因此，能够在Th-0细胞中诱导IL-23R的因素是TH-17分化途径的强制性组分。
由于TH-1(IFN-γ)和TH-2(IL-4)细胞的效应细胞因子也参与这些细胞的发育，因此提供了稳定化反馈回路，照此类推，我们推论出TH-17效应细胞因子之一必然参与TH-17发育。在TH-17效应细胞因子中，IL-6看上去最有希望，因为其受体在幼稚T细胞上表达，并且因为存在终末分化T细胞以外的其它IL-6来源(最值得注意的是抗原呈递细胞)。此外，IL-6敲除型小鼠对EAE有抗性(见图42)。
对野生型和IL-27受体敲除型小鼠检验对单独的IL-6或与IL-27和IL-23组合的应答。如图43所示，IL-6诱导Th-17轴(axis)。IL-6的单独处理刺激IL-23受体，还刺激IL-17A和IL-17F产生。有趣的是，IL-27的共施用降低或消除IL-6刺激的IL-23受体和IL-17产生的升高(见图43)。IL-23对IL-23受体和IL-17产生的刺激有轻微影响，似乎能与IL-6单独展示的大刺激叠加。在此组合中添加IL-27也降低或消除应答。取自再刺激的淋巴结细胞的mRNA显示出IL-23受体敲除型中与野生型对照相比IL-23受体的诱导(见图43)。
在增殖测定法中进一步比较IL-6的效应，在野生型和TCCR敲除型小鼠中IL-6刺激大大增强纯化的T细胞的增殖。在野生型细胞中，添加IL-27完全中和IL-6诱导的增殖。但是，在TCCR敲除型小鼠中没有看到该降低，证明IL-27拮抗IL-6的有力增殖效应。见图44。因此，IL-27似乎在几个水平上是IL-6拮抗剂，包括IL-6驱动的TH-17分化。
实施例13IL-27的作用 如图46所示，IL-27影响T细胞分化，特别是在多个水平影响Th-17细胞的发育。虽然IL-27刺激IL-10、IL-4的产生及Th-1细胞的发育，它也抑制Th-17细胞的产生、Th-17细胞细胞因子IL-17和GM-CSF的产生。
此说明书中的所有出版物和专利申请表明了本发明所属领域的普通技术水平。所有出版物和专利申请在此收入作为参考，其程度如同明确且单独指示每篇单独的出版物或专利申请作为参考。
本发明已根据多个具体和优选的实施方案和技术得以描述。但是，应当理解可以进行许多变异和修改而仍然在本发明的精神和范围内。
权利要求
1.治疗自身免疫病的方法，包括施用TCCR激动剂。
2.TCCR激动剂在制造治疗自身免疫病的药物中的用途。
3.增加淋巴细胞中IL-10表达的方法，包括给淋巴细胞施用TCCR激动剂。
4.增加淋巴细胞中SOCS3表达的方法，包括给淋巴细胞施用TCCR激动剂。
5.依照权利要求1-4任一项的方法或用途，其中所述TCCR激动剂是抗体。
6.依照权利要求1-4任一项的方法或用途，其中所述TCCR激动剂是单克隆抗体。
7.权利要求6的方法或用途，其中所述单克隆抗体是以美国典型培养物保藏中心入藏登记号ATCC PTA-6447保藏的杂交瘤细胞系所产生的。
8.根据权利要求1-4任一项的方法或用途，其中所述TCCR激动剂是人源化抗体。
9.依照权利要求1-4任一项的方法或用途，其中所述TCCR激动剂是能减弱或抑制Th1应答的TCCR变体。
10.依照权利要求1-4任一项的方法或用途，其中所述TCCR激动剂是抗体片段或单链抗体。
11.依照权利要求1-4任一项的方法或用途，其中所述激动剂是TCCR胞外结构域。
12.依照权利要求1-4任一项的方法或用途，其中所述激动剂包括IL-27或其部分。
13.依照权利要求1-4任一项的方法或用途，其中所述激动剂包括IL-27变体。
14.依照权利要求1-4任一项的方法或用途，其中所述激动剂包括包含p28能够结合TCCR和gp130的那部分的IL-27变体。
15.依照权利要求1-4任一项的方法或用途，其中所述激动剂是包含IL-27能减弱或抑制Th1应答的那部分和异源肽的融合蛋白。
16.依照要求15的方法或用途，其中所述异源肽包括抗体的Fc部分。
17.依照权利要求1-2任一项的方法或用途，其中所述自身免疫病是同种异体移植物排斥。
18.依照权利要求1-2任一项的方法或用途，其中所述自身免疫病是自身免疫性甲状腺病。
19.依照权利要求1-2任一项的方法或用途，其中所述自身免疫病是自身免疫性葡萄膜视网膜炎。
20.依照权利要求1-2任一项的方法或用途，其中所述自身免疫病是巨细胞性动脉炎。
21.依照权利要求1-2任一项的方法或用途，其中所述自身免疫病是炎性肠病。
22.依照权利要求1-2任一项的方法或用途，其中所述自身免疫病是胰岛素依赖型糖尿病。
23.依照权利要求1-2任一项的方法或用途，其中所述自身免疫病是多发性硬化。
24.依照权利要求1-2任一项的方法或用途，其中所述自身免疫病是恶性贫血。
25.依照权利要求1-2任一项的方法或用途，其中所述自身免疫病是银屑病。
26.依照权利要求1-2任一项的方法或用途，其中所述自身免疫病是类风湿性关节炎。
27.依照权利要求1-2任一项的方法或用途，其中所述自身免疫病是结节病。
28.依照权利要求1-2任一项的方法或用途，其中所述自身免疫病是硬皮病。
29.依照权利要求1-2任一项的方法或用途，其中所述自身免疫病是系统性红斑狼疮。
30.依照权利要求1-2任一项的方法或用途，其中所述自身免疫病是至少部分通过Th1应答介导的。
31.依照权利要求1-2任一项的方法或用途，其中所述自身免疫病是至少部分通过CD8+T细胞增殖介导的。
32.筛选TCCR激动剂的方法，包括
(1)使表达TCCR的细胞与候选的TCCR激动剂接触；
(2)分析应答候选的TCCR激动剂的TCCR活化的基因的表达；并
(3)建立TCCR活化的基因的表达的增加与候选的TCCR激动剂的活性的联系。
33.权利要求32的方法，其中所述TCCR活化的基因包括IL-10、SOCS-3或两者。
34.权利要求32的方法，其中所述TCCR活化的基因包括SOCS-3。
35.权利要求32的方法，其中所述细胞是T淋巴细胞。
36.权利要求32的方法，其中所述分析包括定量PCR分析。
37.权利要求32的方法，其中所述分析包括免疫测定分析。
38.以美国典型培养物保藏中心入藏登记号ATCC PTA-6447保藏的杂交瘤细胞系所产生的单克隆抗体。
39.以美国典型培养物保藏中心入藏登记号ATCC PTA-6447保藏的杂交瘤细胞系。
40.治疗或抑制免疫应答的方法，包括施用IL-27或其激动剂。
41.权利要求1的方法，其中所述免疫应答是通过Th-17细胞介导的。
42.权利要求1的方法，其中所述免疫应答是Th-1或Th-2介导的应答。
43.权利要求1的方法，其中所述免疫应答是超炎症应答。
44.权利要求1的方法，其中所述免疫应答是自身免疫应答。
45.权利要求1的方法，其中IL-27抑制IL-17产生。
46.抑制IL-17、IL-6或GM-CSF产生的方法，包括施用IL-27或其激动剂。
47.治疗或抑制免疫应答的方法，包括施用IL-6的拮抗剂或其受体。
48.权利要求47的方法，其中所述拮抗剂是阻断IL-6与其受体活化的抗体、适体或小分子拮抗剂。
全文摘要
本发明涉及治疗自身免疫病的方法。在一个实施方案中，本发明涉及包括施用TCCR激动剂的治疗自身免疫病的方法。在一个实施方案中，自身免疫病是至少部分通过Th1应答介导的。在一个实施方案中，自身免疫病是至少部分通过CD8+T细胞增殖介导的。
文档编号A61K38/20GK101120022SQ200580048153
公开日2008年2月6日 申请日期2005年12月16日 优先权日2004年12月16日
发明者尼科·吉拉迪, 弗雷德里克·德索瓦格 申请人:健泰科生物技术公司