专利名称：用干扰素治疗肺病的方法
技术领域：
本发明涉及用干扰素气雾剂治疗肺病的方法，用于气雾剂输送的一种 或多种干扰素制剂以及确定气雾剂沉积的方法。
背景
根据现行NAEPP/NIH指南，哮喘治疗的主要方式仍然是抗炎剂，其 中皮质类固醇是最有效的。但是，长期施用皮质类固醇会引起全身性的副 作用。而且， 一些哮喘病患者对皮质类固醇有抗性。因此，需要针对过敏 性气道疾病中炎性反应的新药剂。
哮喘的免疫机理包括记忆性CD4+T辅助细胞的极化参与，以及分泌 二型(Th2)细胞因子(白介素(IL) -4， IL-5)的细胞的不平衡性。细胞 因子干扰素-y (IFN-y)是幼稚(naive) CD4+淋巴细胞分化成Thl表型所 必需的。
哮喘中的气道炎症特征为嗜曙红细胞和激活的CD4+ T细胞数目增 多。哮喘涉及记忆性CD4+ T辅助细胞的极化参与和分泌Th2型细胞因子 的细胞相对于那些分泌Thl型细胞因子的细胞的不平衡性。 一些细胞因子 的产生增加以及组织嗜曙红细胞增多和IgE产生增加，所述细胞因子包括 2型细胞因子IL-4和IL-5、肿瘤坏死因子(TNF)-a和粒细胞-巨噬细胞集落 刺激因子(GM-CSF)。大部分气道炎症的细胞因子谱(profile)研究来 自小鼠哮喘模型。动物通常用卵清蛋白的抗原致敏并攻击后，发现产生抗 原特异性IgE、气道嗜曙红细胞增多和针对气雾剂抗原刺激的气道高反应
性。这些变化与Th2细胞因子增多和IFN-y产生减少相关(Brusselle ef a/., 爿m Ce〃編編，1995 Mar; 12(3):254-259)。
Th2细胞因子IL4在气道炎症中扮演重要角色，它可促进由B细胞到 IgE合成的同种型转换并诱导幼稚T细胞分化成Th2淋巴细胞。IL-4敲除 小鼠经气雾剂抗原攻击后在气道中不能产生特异性IgE、气道高反应性、 气道嗜曙红细胞增多或Th2细胞因子(Brusselle "/.,」w Ji ay/^ CW/ Mo/ 所o/, 1995 Mar; 12(3):254-259)。在最初暴露于抗原而非在攻击过程中用抗 IL-4处理的野生型小鼠会抑制IL-5的产生和气道嗜曙红细胞增多，而在抗 原攻击过程中施用抗IL-4则不会抑制嗜曙红细胞增多，这表明IL-4对诱 导局部Th2反应是必需的(Coyle " a/., JAe5pzy Ce〃 JWo/说o/ 1995 Jul; 13(1):54國59)。
IL-10是由Thl和Th2淋巴细胞、单核细胞和巨噬细胞、肥大细胞、 角质形成细胞和嗜曙红细胞产生的细胞因子。IL-10通过下调不同细胞特 别是单核细胞的促炎性细胞因子的合成而作为抗炎性细胞因子发挥作用。 IL-10通过功能性抑制抗原呈递细胞(APC)来下调IL-5的产生(Pretolani et al， Res Immunol 1997 Jan)。 IL-10对嗜曙红细胞功能的直接效果也己被 证实。低浓度的IL-10在降低嗜曙红细胞的CD4表达和加速细胞死亡方面 几乎和皮质类固醇的活性一样。GM-CSF是一种直接参与发炎组织中嗜曙 红细胞和中性粒细胞的归巢和激活的细胞因子。已经注意到在哮喘患者中 与正常对照相比，由PBMC产生的IL-10和肺泡巨噬细胞水平减少(Borish， L W a/,， / w C7/" 7m附,/ 1996 Jun; 97(6): 1288-1296; Koning a/" Cyoh"e 1997 Jun; 9(6):427-436)。在两个过敏性炎症小鼠模型中，滴注IL-10 可保护致敏的小鼠使其不发生气道嗜曙红细胞增多和中性白细胞增多， 可能是通过抑制IL-5和TNF-a实现(Zuany-Amorim W / C7/" /"veW 1996:2644-2651; Zuany-Amorim a/" //附mwwo/ 1996 Jul 1; 157(1):377-84)。
与细胞因子产生的Th2/Thl 二分法一致，在哮喘鼠模型中观察到IL-4 和IL-5占主导的细胞因子谱和低水平的Thl细胞因子IFN-y和IL-12 (Ohkawara "/.，爿w Ji es; /r Ce// Afo/说o/1997 May; 16(5):510-20)。近期有
动物研究着眼于以重组鼠IL-12进行治疗，试图扭转Th2的优势。体外数 据表明，在T淋巴细胞的初次抗原刺激中，IL-12的存在会促进Thl细胞 的发育(Kips a/.， Jm J A&^^ Owe MW 1996 Feb; 153(2):535-9)。 Kips 在体内实验中确认了这一点在免疫时施用IL-12,防止了产生特异性
IgE、气道嗜曙红细胞增多和气道高反应性。虽然在气雾剂攻击已经致敏 的小鼠的过程中施用IL-12可防止气道嗜曙红细胞增多和气道高反应性， 但不能降低特异性IgE的产生，表明IL-12刺激幼稚Th细胞向Thl细胞分 化，并且能够抑制Th2细胞的发育。以IL-12抑制抗原诱导的气道嗜曙红 细胞增多在致敏初期是IFN-Y依赖性的，但在再次攻击时变成IFN-Y非依 赖性的(Brussdle " a/,,」m Ji e^^ Ce〃 Mo/ B/o/ 1997 Dec; 17(6):767-71)。 并且，在用气源性致敏原攻击前，将肺中的IL-12基因用痘苗病毒载体通 过粘膜基因转移到致敏的小鼠中，被证实可导致以IFN-y依赖性方式抑制 IL-4和IL-5、气道高反应性和气道嗜曙红细胞增多(Hogan " a/.， - ￡wr /mmw"o/ 1998 Feb.; 28(2):413画23)。
增加的IFN-Y水平可推动免疫反应转向Thl表型并且可能对哮喘有 益。人类临床相关性聚焦在血清或刺激后的PBMC中的细胞因子水平。大 多数利用受激的PBMC所作的细胞因子的测定是在儿童中进行的。这些研 究证实哮喘症儿童具有IL-4和IL-5产生增多和IFN-y产生减少的倾向。 此外，其它人证实特应性和/或过敏严重程度和IFN-Y释放之间成逆相关 (Imada a/"(1995) /mw 画Zogy 85(3): 373-80; Corrigan " a/"(1990)爿w 及ev及&s/ ^ 141 (4)Pt 1: 970-7; Leonard " a/. ， (1997)力w /及as"/7/r Ce〃 Afo/ 5/o/ 17(3): 368-75; Kang & a/"(1997) J/"fe /eraw Cyo&"e及as 17(8): 481-7)。哮喘病患者BAL液中的细胞因子水平显示出低水平的IFN-y (Kang a/., (1997)J/"fer/eraw Cytoh'we及ay 17(8): 481-7)。
人的rIFN-Y的临床试验非常少。到1999年，IFN-y被指明可用于治疗 慢性肉芽肿性疾病，其中长期治疗(平均持续2.5年)可改善皮肤损伤， 具有最小程度的副反应(发烧，腹泻，流感类似症状)(W五wg/JMW324 (8):509陽16; Bemiller " a/. (1995) B/ood Ce〃s M / Ifc 21(3): 239-47; Weening Wa/., (1995)五^/尸eoT/arr 154(4): 295-8)。 Boguniewicz用渐强剂量的气雾 剂化rlFN，(最大剂量500 mcg，总实验剂量2400 mcg)治疗5个轻度特 应性哮喘患者，用药超过20天(Boguniewicz " a/.， (1995) /力/ergv C7/w //wmmo/95(l)Ptl: 133-5)。所有病人耐受雾状r IFN-y，但是在包含峰流量 的所测终点没有显著变化。
我们向5个具有持续性抗酸杆菌(AFB)涂片及培养阳性多药抗药性 结核病(TB)患者施用雾状rlFN隱y(CondosWa/., (1997)丄a"cef 349(9064): 1513-5)。病人接受气雾剂r IFN个500 mcg， 一周3次，共4周(总试验 剂量6000 mcg)。治疗很好的实现了耐受，副反应极少。4周结束时，5 个病人中的4个呈现痰AFB涂片阴性并且到达阳性培养的时间增加，表 明治疗后机体负荷减少。有趣的是，在这些报道的和其它的病人中，治疗 后1小时后进行的PEFR改善了 6% (n=10)。
特发性间质性肺炎按照组织学被分为七类。这包括普通的间质性肺炎 (UIP)，非特异性间质性肺炎(NSIP)，弥漫性肺泡损伤(DAD)，机化性肺炎 (OP)，脱屑性间质性肺炎(DIP)，呼吸性细支气管炎(RB)，和淋巴细胞间质 性肺炎(LIP)。参见，例如Nicholson,历Wo; a^o/ogv， 2002, 41, 381-391; White, J尸aAo/ 2003, 201， 343-354。
术语"特发性肺纤维变性(IPF)"同义于"隐原性纤维性肺泡炎(CFA)"， 是一个临床术语，指特发性间质性肺炎的一个主要亚组，它描述了一种疾 病，其特征为特发性进行性间质性疾病，呼吸困难出现之后平均存活时间 为3-6年。特发性肺纤维变性的诊断是通过鉴定肺组织活检样本上的普通 间质性肺炎(UIP)进行的。组织学模式的特征为不均匀性，包括斑隙性慢 性发炎(肺泡炎)，进行性损伤(增殖性肌纤维母细胞和成纤维细胞的小 聚集物，术语称为纤维形成病灶)以及纤维化(密集的胶原和蜂窝状改 变)(^i ,伊y》〃，King " a/" 2000，爿w / o/^asp. am/ CV"/ca/ O^e Med" 164, 1025-1032)。对间质性肺炎另一个亚组的治疗不能表明可以成功治愈 特发性间质性纤维化。
皮质类固醇和细胞毒素剂是治疗的主要方式，只有10-30%的患者表 现出初始瞬时反应，表明需要长期治疗(Mapd e"/. (1996) C/zeW 110:1058-1067; Raghu ef a/. (1991)爿w. Z ev. i es;^. 144:291-296)。由于特发性肺
纤维变性的预后很差，需要新的治疗方法。
干扰素是由免疫系统细胞产生的天然蛋白质家族。已经鉴定出3类干 扰素，a、 &和y。每类有不同的效应，虽然他们的活性有重叠。总起来 说，干扰素指导免疫系统攻击病毒、细菌、肿瘤和其它可能入侵身体的外 源物质。 一旦干扰素检测到并攻击外源物质，会通过减速、阻断或者改变 其生长或功能来改变它。
干扰素-Y是多效性细胞因子，具有特异性免疫调节作用，例如激活巨 噬细胞、加强氧自由基的释放、杀死微生物、加强MHCII类分子的表 达、抗病毒作用、诱导可诱导一氧化氮合酶基因及NO的释^[、募集和激 活免疫效应细胞的趋化因子、下调转铁蛋白受体以限制微生物对铁的获取 (细胞内病原存活所需)等。缺乏干扰素-y或其受体的基因工程化小鼠对 分枝杆菌感染极其易感。
重组IFN-Y在1980年代通过肌内和皮下途径施用于正常的志愿者和 癌症患者。有单核细胞的激活的证据，例如氧化剂释放。Jaffe等人报道了 向20个正常的志愿者施用rIFNy (参J ， Jaffe ef a/" / C7/" /"veM 88， 297-302 (1991》。首先，他们通过皮下施用rIFN-Y 250|ng，观察到在4小时出现 血清水平峰值，24小时出现最小值。
几个临床试验受到资助以研究IFN-Y对传染性疾病的作用。MDR-TB 临床试验，题目为"A Phase II/III Study of the Safty and Efficacy of Inhaled Aerosolized Recombinant Interferon-y 1 b in Patients with Pulmonary Multiple Drug Resistant Tuberculosis (MDR-TB) Who have Failed an Appropriate Three Month Treatment",在不同i也区(Cape Town、 Port Elizabeth、 Durban、 Mexico)招募了 80个MDR-TB患者，随机接受气雾剂rIFN-y (500吗 MWF)或安慰剂，在第二线治疗以外至少6个月。这个临床试验提前被结 束了，因为痰涂片、MA培养或胸X光片变化都缺乏有效性。
Ziesche等向9/18个特发性肺纤维变性(IPF)患者皮下给予rlFN-p剂 量为200 mg， 一周三次，同时口服强的松。参见Ziesche " a/., (1999) tv.
MW.， 341， 1264-1269)。接下来发表了以干扰素y-lb治疗IPF的3 期临床试验的结果。虽然这是第一个具有足够量样本容量的EPF临床试
验，是随机的、预期的、双盲的、安慰剂-对照研究，但没有发现对生理 功能标记物例如最大肺活量有显著作用。但是，安慰剂组发生了较多死 亡，接受干扰素，lb治疗的一个亚组的病人其存活率显著改善，而且最大
肺活量值是正常预测值的55%或更高，对一氧化碳的肺扩散容量值是正常 预测值的35%或更高。那个研究中疾病进展和存活率不相符的原因有待探 讨。 一个可能性是当其使IPF患者的临床过程复杂化时，干扰素Y-lb治疗 改善了宿主对感染的抵御并减少了下呼吸道感染的严重性。这个可能性被 Strieter等的发现所支持，其发现在接受干扰素Y-lb治疗的个体的血浆和 支气管肺泡灌洗(BAL)液中，与接受安慰剂的相比，可被干扰素诱导的 具有抗微生物特性的CXC趋化因子I-TAC/CXCL11被显著上调，而促纤 维化细胞因子大体上并没有被持续6个月治疗期的干扰素y-lb治疗显著改 变(参见Strieter " a/.，」m / A&^z> OzY Care MW. (2004)。 解释这个黯淡 结果的一个可能是以现行剂量策略向肺间质所施用的药物水平不足。
发明简述
在一方面，本发明特点为一种在患肺病个体中治疗肺病的方法，包括 施以治疗有效量的气雾剂干扰素。在很多实施方案中，肺病是阻塞性肺 病。在一些实施方案中，肺病是哮喘或特发性肺纤维变性。在一个实施方 案中，肺病的征状改善可通过预测最大肺活量值(FVC)比治疗前至少高 大约10%，优选至少高大约20%或至少大约25%甚至33%来测量。干扰 素可以是干扰素-a、干扰素-P或干扰素-y。
在另一实施方案中，患肺病例如IPF或哮喘的个体对一种或多种皮质 类固醇、环磷酰胺和硫唑嘌呤治疗无反应。而且，在对免疫抑制治疗具有 最低限度反应的病人中，其肺功能测试有中度但不显著的改善，本发明的 进一步的方面以气雾剂化干扰素合并治疗这些病人，同时保留一或多种其 它治疗方案的治疗，包括但不限于以一或多种免疫抑制剂或抗炎剂治疗。
在更具体的实施方案中，气雾剂化干扰素以大约250 pg至750吗范 围的剂量通过喷雾器施用，每周三次。在另一个实施方案中，通过喷雾器 施用500吗的剂量，优选每周三次。按照喷雾器的效率可施用更低的剂
里。
如果需要以干扰素-Y治疗和其它治疗形式组合治疗IPF患者，气雾剂
化干扰素-Y要被滴定以保证这些患者不会得到非所需的效应。此外，当考 虑组合治疗时，其他药剂可通过被认为是最有效的方式施用。这可能包括
静脉内、肌内、皮下或可与IFN-Y合并以气雾剂施用。
在另一方面，本发明的特点是一种精确地确定一种通过气雾剂施用的 药剂在上呼吸道沉积的方法。在本发明的这个方面的一个实施方案中，通 过气雾剂施用的药剂是干扰素例如干扰素-a、干扰素-卩或干扰素-Y。这项 技术是独特的，可应用于向所有类型的肺病患者施用干扰素例如干扰素-a、干扰素-(3或IFN-Y。
其它目标和优点会通过阅读接下来的详细描述并结合以下示例性附图 而变得明朗。
图1描述了一种典型的潮式呼吸模式。
图2描述了慢速深吸气方法与潮式呼吸相比特点为吸气流降低和吸气 时间大幅延长。
图3代表用慢速深度呼吸模式吸入4.5 pm的气雾剂的人类个体的沉 积模式。图像表明气雾剂的上气道最小限度(小于10%)的沉积，以胃中 少量的活性阐明。沉积图像代表了以慢速深度模式(吸气时间大约8秒) 呼吸3次后，放射性标记的气雾剂沉积在人类个体的肺外周。
图4是同一个体以潮式呼吸20次吸入1.5 nm颗粒(现行标准吸入模 式)的说明性扫描。图像分析表明包含使用大颗粒、慢吸气和延长的吸气 时间的慢速深呼吸方法每次呼吸在肺中沉积气雾剂颗粒效率高51倍。
图5描述了一个患IPF的病人的沉积扫描，其已通过喷雾器接受每周
3次共12周的500吗IFN-Y治疗。治疗后进行成像。感兴趣区域以轮廓标 出。sU/L是肺上部沉积的放射活性相对于肺下部沉积的分布，以氙作标准 化。图中水平线代表肺上象限和下象限的分界线。sC/P指如下所述的特定 的中心相对于外周的比率。a/Xe指气雾剂相对于氙的比率。
图6代表气雾剂治疗前后从BAL中所测的TGF-卩水平。
图7表明在一个为5个患IPF的病人进行的气雾剂rIFN-Y的研究中， 5个病人接受治疗后其增加的百分率预测总肺活量。所有的病人均报告其 呼吸短促有主观性改善。在3个月治疗末期，这个研究中的病人其总肺活 量有统计学上显著的增加。5个研究病人中的2个其最大肺活量有超过 200 cc，s的改善(分别为200和500 cc)。
图8表明在一个为5个患IPF的病人进行的气雾剂rIFN-Y的研究中5 个病人中的3个接受治疗后其增加的百分率预测总肺活量。这些生理变化 伴随着从这些病人的支气管肺泡灌洗(BAL)液(从肺内皮层洗出的液体)中 回收的活性TGF-卩水平的降低。
图9A和9B表明接受气雾剂rIFN-Y治疗IPF的5个病人中TGF-卩在 其总蛋白中所占比例减少。TGF-P是肺纤维化中主要调控物之一。它的激 活导致胶原产生。其水平降低应该引起较少的胶原沉积和较少的肺纤维 化。
图IO表明干扰素-Y气雾剂治疗前后，在肺结核和特发性肺纤维变性病
人肺部所测的干扰素-Y的量。
图11代表哮喘病人接受气雾剂IFN-y治疗后其峰流量值的百分率变 化。所有接受气雾剂IFN-Y治疗的病人都用肺量测定法评估可逆性气道疾 病。在每个气雾剂治疗中，病人在治疗前后进行峰流量的监控。
图12提供了图2中所指的所测峰流量的百分比变化的总结。在气雾 剂干扰素Y治疗后平均峰流量增加，在一些病人中有显著增加。特别注意 至IJ，在所有的干扰素Y治疗后峰流量测量值降低的病人中，没有发现咳嗽 或其它抱怨。这些数据表明气雾剂干扰素Y在气道疾病患者中是安全并是 良好耐受的。
发明详述
在描述本发明的方法和治疗方法学之前，应该理解本发明不限于描述 的特定方法和实验条件，因为这些方法和条件可变。也应理解所用术语只 是为了描述特定实施方案，并不是为了限定本发明的范围，因为本发明的
范围由所附权利要求书限定。
如本说明书和权利要求书中所用，单数形式"一"和"所述"包括复数形 式，除非上下文另有明确说明。因此例如，"所述方法"包括一或多种方法 和/或这里描述的和/或通过阅读本文内容本领域技术人员显而易见的步骤 等等。
除非另有说明，本文所用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域 的技术人员通常理解的意义。虽然相似或等价于这里描述的任何方法和材 料均可应用于实践或测试本发明，这里描述了优选地方法和材料。所有提 到的文献引入以作参考，来批露和描述所引文献中的方法和减材料。
定义
术语"改善的征状"在特定实施方案中，评定为预测的FVC值比治疗 前至少改善10%。
短语"对一或多种皮质类固醇、环磷酰胺和硫唑嘌呤治疗无反应"指对 常规现有技术治疗无反应的患者群体。
肺活量(VC)指可以进出肺的空气总量。 Fevl指一秒钟用力呼气量。
Fevl/FVC率指一秒钟用力呼气量与最大肺活量的比值。 术语"肺病，，指任何影响至少部分肺或呼吸系统的病理学。这个术语包 括阻塞性和非阻塞性病症，例如哮喘、肺气肿、慢性阻塞性肺病、肺炎、 肺结核和任何形式的纤维化，包括但不限于特发性肺纤维变性。
术语"阻塞性肺病"指任何可导致进出呼吸系统空气流减少的肺病。气 流相对正常的减少可以总的或一段有限时间内例如FVC或FEV1进行测
里o
术语"特发性肺纤维变性(IPF)"同义于"隐原性纤维化肺泡炎 (CFA)"，是一个临床术语，指特发性间质性肺炎的一个主要亚组，它 描述了一种疾病，特征为特发性进行性间质性疾病，呼吸困难出现之后平 均存活时间为3-6年。特发性肺纤维变性的诊断通过鉴定肺组织活检样本 上的普通间质性肺炎(UIP)进行。组织学模式的特征为不均匀性，包括 斑隙性慢性炎症(肺泡炎)、进行性损伤(增殖性肌纤维母细胞和成纤维 细胞的小聚集物，术语称为纤维形成病灶)以及纤维化(密集的胶原和蜂 窝状改变)。
术语"哮喘"指一种包含炎症(细胞损伤)和导向肺的气道縮窄的普遍 疾病。哮喘在儿童和成年人中发生。儿童哮喘可继续到青春期和成年期， 但是一些患哮喘的成人在其年轻时没有哮喘。世界范围内数以百万的人受 哮喘影响，这些年更为普遍。
"慢速深呼吸"指任何呼吸模式，其中吸气时间比呼气时间长。这种模
式的特点为工作比(duty cycle)(吸气时间/总呼吸时间)大于0.5。正常潮 式呼吸中工作比总是小于或接近0.5。即是，吸气时间总是小于呼气时 间。在疾病状态下，阻塞性疾病中的工作比降低，在限制性疾病中它可能 仍然小于0.5。"慢速深"呼吸其特点为I/E比率即吸气时间除以呼气时间大 于l，在一些情况下，这个比率接近8或9，因此工作比为0.8或0.9。
干扰素-y的作用机理
最近在培养细胞中进行的细胞信号转导通路研究描绘了一种暂时的针 对IFN-y应答的调节路径(Vilcek ef a/., (1994) /"f爿rc/ j〃ergv /附mw"o/ 104(4): 311-6; Young " a/v (1995) J丄ei^oc所o/ 58(4): 373-81)。当添加IFN-y与其受体的细胞外结构域结合时发生第一个事件，然后导致在受体细胞 内结构域预先存在的信号转导及转录激活蛋白l(STAT-l)的酪氨酸磷酸 化。只有酪氨酸磷酸化的STAT-1被激活，然后形成同型二聚体(或异二 聚体)并与特异性DNA序列结合。
经过转位到细胞核并结合至其很多基因的启动子中的同族(cognate) 调控元件后，STAT-1激活转录。STAT-1可与其它预先存在的组成型活性 的转录因子一起作用，因此一些基因的转录被最大化诱导，而不需要新蛋 白合成。其它基因由STAT-1和应答IFN-Y而新合成的转录因子调节。 IRF-1基因，也编码一个转录因子，也由应答IFN-y的STAT-1调节(Pine， R. (1992) ■/ Fira/ 66(7): 4470-8; Pine " a/., (1994)五附6。
/13(1): 158-67; Pine &a/.， (1990)^Wo/ Ce/Z所o/ 10(6): 2448-57)。应当注意，IRF-1基因的启动子
也含有核因子KB(NF-kB)的结合位点，该因子介导肿瘤坏死因子-a (TNF-a)激活的IRF-1基因的转录(Harada a/.， (1994) Mo/ Ce〃 Ao/ 14(2):1500-9; R. Pine，未发表)。
一旦IRF-1蛋白被合成，它即激活一组临时下游基因的转录。IRF-1 被示出可调节IFN-Y诱导的涉及抗原加工和呈递的重要基因的表达，所述 基因包括TAP-l、 LMP-2和HLA-A及HLA-B I类主要组织相容性抗原 (Johnson a/.， (1994)編Ce〃扁14(2): 1322-32; White " a/., (1996) 7w附wwXy 5(4): 365-76)。
IRF-1被磷酸化，对其磷酸化程度的操作影响其DNA结合活性(Pine W a/., (1990) Mo/ Ce〃 10(6): 2448-57; Nunokawa & a/.， (1994」 历o/ /7" ito Commzm 200(2): 802_7)。但是，没有清楚证据表明IRF-1的磷 酸化是体内调节的。STAT-1活性依赖于酪氨酸磷酸化，并受丝氨酸磷酸 化程度的影响。但是，潜在的STAT-1的丰度也被调节。用IFN-y过夜处 理的细胞STAT-1蛋白水平增加，虽然酪氨酸磷酸化和DNA结合活性只比 未刺激的细胞稍强(Pine"a/.， (1994)/13(1): 158-67)。
基因表达和调节的研究能提供总体免疫状态的其它方面的信息。特别 的，细胞因子改变的功能性作用可通过测定特异性DNA结合活性来证 实。例如，在T细胞中IL-12导致STAT-4的激活，然而IL-4导致STAT-6的激活，Thl和Th2反应的发生或由一个向另一个的转换可由在一个特 定时间检测的STAT DNA结合活性谱中反映出来(Darnell (1996)仏ce"/
//onw及as 51:391-403; Ivashkiv,L. B. (1995)/ www"^ 3(1): 1-4)。
气雾剂化干扰素1治疗IPF
最近，一个小随机试验IPF患者皮下干扰素-Y(IFN-力治疗(Ziesche " a/. (1999) TV. / Med 341:1264-1269)。 IFN-y治疗前和治疗中6个月所获 得的经支气管活组织检査样品分析表明治疗前不正常的促纤维化细胞因子 转化生长因子-P(TGF-P)和结缔组织生长因子(CTGF)的增长经IFN-Y治疗 后显著降低(Ziesche " a/. (1999) J:动。经强的松单独治疗的病人其TGF-P和CTGF水平无变化。
干扰素的输送 气雾剂的输送
在本发明一个广泛的方面，提供了治疗患肺病的个体的肺病的方法，
所述肺病包括哮喘和特发性肺纤维变性(IPF)，所述方法包括施用治疗
上有效量的气雾剂化干扰素例如干扰素-Y，其中所述肺病的症状得到改善 或转佳。改善的症状可以是相对于治疗前预测的FVC值至少增加10%。 在一个优选的实施方案中，气雾剂化IFN-Y可用来治疗患哮喘或IPF的个 体，其中所述个体对一或多种皮质类固醇、环磷酰胺和硫唑嘌呤治疗无反 应。此外，气雾剂化干扰素例如IFN-y的施用在患肺纤维化的患者中经过 计算并优化。这样的施用可使患者在肺功能测试中得到改善。
干扰素例如IFN-Y可通过几个不同的途径施用，包括静脉内、肌内、 皮下、鼻内或通过气雾剂。但是，当单独治疗一个肺部过程时，直接将药 物输送到肺可避免其暴露于其它器官系统。通过气雾剂有效施用500吗 IFN-y，每周三次，共两周，经支气管肺泡灌洗(BAL)分析证实，施药后可 在正常病人中引起IFN-Y水平增高。同样地，大约500微克的干扰素-卩， 每周三次以及大约0.25毫克的干扰素-a，每周三次，被认为是有效的。
本发明的目标是通过肺部施药途径输送干扰素例如干扰素1。干扰素 例如IFN-Y在吸气时被输送到哺乳动物的肺部，然后横越肺上皮层进入血 流(关于这点的其它报告包括Adjei " a/., PHARMACEUTICAL RESEARCH, VOL. 7， No. 6, pp. 565-569 (1990); Adjei " a/" /她m加owa/ Jbwma/ o/尸/K3TmaceM"cs, 63:135-144 (1990); Braquet a/.， J"owr"a/ o/ CaWovascw/ar i^arwaco/ogy， Vol. 13， suppl. 5, s. 143-146 (1989); Hubbard & a/.， ^麵/j 她血z恥，Vol. III， No. 3， pp. 206-212(1989); Smith " a/"
/ C7z'", /wveW" Vol, 84, pp. 1145-1146 (1989); Oswein " a/" " Jenwo/feariow o/ /Vofe/" '， Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II， Keystone, Colorado, March, 1990; and Platz " 美国专禾U号5,284,656)。 考虑到用于实践本发明的是一大类用于肺部输送治疗性产品的器械设备， 包括但不限于喷雾器、定量吸入器和干粉吸入器，所有这些都为本领域技
术人员所熟悉。
一些商售的适合实践本发明的设备的具体例子有Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Missouri生产的Ultravent喷雾器；由Marquest Medical Products, Englewood， Colorado生产的Acorn II喷雾器；由Glaxo Inc., Research Triangle Park, North Carolina生产的Ventolin定量吸入器；及由Fisons Corp., Bedford, Massachusetts生产的Spinhaler干教、吸入器；由Allegiance, McGraw Park, IL生产的MistyNeb; 由Trudell Medical International, Canada 生产的AeroEclipse。
所有这些设备需要使用适合蛋白分散的制剂。通常，每种制剂特异适 用于所用的设备类型，可能除了治疗中所用的常规稀释剂、佐剂和/或载 体外还使用合适的推进剂材料。并且也考虑脂质体、微囊或微球包括复合 体或其它类型的载体。化学修饰的蛋白也可制备在不同制剂中，这依赖于 化学修饰的类型或所用设备的类型。
不管是喷嘴式还是超声波式，适合喷雾器使用的制剂典型地包含溶解 在水中的蛋白，其浓度为以大约每毫升溶液中有0.1至25 mg的生物活性 蛋白。所述制剂还可包括缓冲剂或简单的糖(例如，为了蛋白质稳定和调 节渗透压)。喷雾器制剂还可含有表面活性剂，以减少或防止形成气雾剂 时溶液的原子化引起的蛋白质表面诱发聚合。
适合定量吸入器使用的制剂通常可以包含良好分散开的粉末，其含有 在表面活性剂帮助下悬浮在推进剂中悬浮的蛋白。推进剂可以是任何用于 此目的常规材料，例如氯氟烃、氢氯氟烃、氢氟烃或烃，包括三氯氟甲 垸、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇及1，1,1,2-四氟乙烷或其组合。合适的 表面活性剂包括三油酸山梨坦和大豆卵磷脂。油酸也可用做表面活性剂。
适合从干粉吸入器中分散的制剂可包含良好分散开的干燥粉末，其含 有蛋白并可能包括膨胀剂，例如乳糖、山梨醇、蔗糖或甘露醇，含量为可 以促进粉末从所述设备中分散，例如重量占制剂的50%-90%。蛋白最好 是以颗粒形式制备，平均颗粒大小小于10 p (微米)，最优选0.5至5 ^m，以最有效的输送到远侧的肺。
气雾剂输送的目标是显著增加治疗性药剂例如干扰素包括IFN-Y向人
深肺的输送。
一个特别优选的慢呼吸和深吸气的方法与标准(潮式呼吸)
相比可以增加肺外周的沉积效率，直至大约50倍。
与潮式呼吸(图1)相比，使用慢速深吸气方法的特定呼吸模式显示 出吸气流降低，吸气时间大幅延长。这种模式示于图2。慢吸气允许气雾 剂颗粒绕过上气道从而使他们可在肺部沉积。延长的吸气时间可使气雾剂 在肺外周合适的沉淀下来。延长的吸气时间和更好的沉淀在剩余颗粒被呼 出之前促进"吸气沉积"。在这种情形下，可能有接近100%的吸入颗粒在 呼出前沉积下来。这个过程可通过使用相对较大的颗粒(例如大约4.5 pm)而进一步加强，所述大颗粒通常会在口咽处沉积。慢速深呼吸的延 长的吸气特别适合输送药物到病人的肺部他们的外周气道病理学导致常 规的小气雾剂沉积减少以及避免口咽沉积。可通过这种方法治疗的肺外周 疾病包括例如特发性肺纤维变性和肺气肿。这两种实体均导致气室增大， 从而导致潮式呼吸中最小限度的沉积。
这种吸气和沉积的技术可以加强药物的外周输送，目的是通过肺毛细 血管促进全身性吸收进入全身循环。图3代表了一个人类个体中的沉积模 式，其以慢速深呼吸模式吸入4.5 pm的气雾剂。图像表明气雾剂在上气 道的最小限度(小于10%)的沉积，以胃中少量的活性阐明。沉积图像代 表了放射性标记的气雾剂沉积在以慢速深模式(吸气时间大约8秒)呼吸 3次后的人类个体肺外周。图4是同一个体以潮式呼吸20次吸入1.5 pm 颗粒(现行标准吸入模式)的说明性扫描。图像分析表明包含使用大颗 粒、慢吸气和延长吸气时间的慢速深呼吸方法的每次呼吸在肺中气雾剂颗 粒的沉积效率高51倍。
生产可以实现慢速深度操作的设备是复杂的，但可以实现这一功能的 设备原型正在研制并已经应用(Profile Therapeutics Inc., 28 State Street, Ste. 1100， Boston, MA 02109，为总部在英国的Profile Therapeutics的子公司)。
肺薄壁组织疾病导致肺外周的几何变化，会使吸入颗粒物的沉积最小 化。与全身性输送相同药物相比，直接将治疗剂输送到病变位置(肺外 周)更加有效。慢速深度吸入干扰素例如IFN-Y气雾剂的方法特别适用于 治疗肺纤维化患者肺泡中的疾病。
人类沉积研究表明，慢速深度吸气方法大约比气雾剂输送的常规系统
效率高50倍。这种呼吸模式允许临床试验设计为测试气雾剂治疗肺病的 效力，所述肺病例如是阻塞性肺病，包括例如特发性肺纤维变性或哮喘， 所述治疗通过使用一种药剂例如干扰素包括例如IFN-y的已有制剂以宽范 围的剂量将这种药剂运用至肺外周。肺部沉积的数量可通过呼吸模式控 制，因为事实上没有气雾剂被呼出。
鼻部输送
鼻部输送蛋白同时亦是一个考虑。鼻部输送可在鼻部施以治疗产品后 使蛋白直接进入血流，没有必要使产品在肺部沉积。适合鼻部输送的制剂 包括那些带有葡聚糖或环状糊精的制剂。
剂量
应该了解，随着进一步研究的展开，关于治疗各种患者中各种病变的 合适的剂量水平的信息将会出现，本领域技术人员考虑受体的治疗情况、 年龄和一般健康状况之后，可以决定合适的剂量。大体上，注射或者输注 的干扰素-Y剂量为250吗生物活性蛋白(只计算蛋白本身质量，不算化学 修饰)至750叱(同上计算)，每周三次。更优选地，剂量可以是500 pg，每周三次。大体上，注射或者输注干扰素-a剂量是250-750微克，每 周施用1至5次，优选地大约500微克每周施用三次。对于干扰素-P，剂 量大体上是0.10至1 mg，每周1至3次，优选地是大约0.25 mg，每周三 次。剂量可变，依赖于蛋白的循环半衰期，以及所用的制剂。
同其它化合物一起施用
在本发明的另一个方面，可将干扰素和一或多种用于治疗肺病的药物 组合物联合施用。并且，抗炎剂或免疫抑制剂可共同施用，例如环磷酰 胺、硫唑嘌呤或皮质类固醇。施药可同时或连续进行。
有研究表明，皮下施用250吗IFN-Y三天后，并没有IFN-y的BAL水 平增高或者肺泡巨噬细胞的改变，然而外周血单核细胞出现上调(Jaffe "
a/. (1991) ■/ C//". /we成88:297-302)。 而且，气雾剂IFN-y已经被用作肺 结核患者的辅助治疗。
在以下描述的研究中，对常规免疫抑制治疗无反应的IPF患者用气雾 剂化IFN-Y治疗。
本发明可通过参考以下实施例更好的理解，实施例的目的是作为本发 明的示例而不是限制本发明。
实施例
以下列出的实施例是为本领域技术人员提供如何制备和使用本发明的 治疗方法、化合物和药物组合物的完整揭示和描述，不是为了限制发明人 所认为的发明范围。所用数字(例如数量、温度等)己经尽力确保是精确 的，但需要考虑一些实验错误和偏差。除非另有指出，份数是重量份数， 分子量是平均分子量，温度是摄氏度，压力是等于或接近大气压。
实施例l 病人群体
研究主体是患特发性肺纤维变性(IPF)的病人，根据American Thoracic Society标准A或B (如下)诊断。病人群体对用皮质类固醇、环 磷酰胺和/或硫唑嘌呤进行的常规治疗无反应或者不是这些常规治疗的候 选。病人群体用气雾剂化IFN-Y治疗12周。
确定手术活组织检查表现UIP，这三个条件必须满足
1. 其它导致间质性肺病的已知原因被排除，例如某些药物毒性、环境 暴露和结缔组织疾病。
2. 肺功能测试异常，包括限制性(肺活量降低，经常伴随Fevl/FVC 比率升高)和/或受损的气体交换(02的肺泡-动脉梯度升高或CO的弥散 量降低)。
3. 双侧基部网状异常伴随最小限度的HRCT扫描磨玻璃混浊。 在没有肺手术活组织检查的情况下，在免疫活性成人中，可以假设诊
断为IPF，如果
I. 以上三个标准都满足。
II. 经支气管肺活检(TBBx)或支气管肺泡灌洗(BAL)表明无其它特征支 持另外的诊断。
III. 以下4个次要标准的其中3个
1. 年龄>50
2. 无法解释的运动性呼吸困难的起病隐袭
3. 患病持续时间〉三个月
4. 双侧基部吸气性捻发音。
改善定义为(1)与类固醇治疗前获得的FVC相比，FVC预测值比基 准值增加10%。 (2)尽管接受治疗，病人的FVC比基准值增加多于10% 然后回复至基准值。
适合本研究的病人如下定义
(1) 按照可接受标准(参上)筛选三年内确诊为IPF的病人；
(2) 年龄20-70;
(3) 强的松试验(有或无环磷酰胺/硫唑嘌呤)失败或禁忌接受类固醇 或细胞毒素剂治疗的病人；
(4) 开始研究前接受0-15mg强的松或等价物28天而且愿意保持同样剂
量皮质类固醇的病人；
(5) 筛选时FVC大于或等于50%并小于或等于90%的预测基准值；
(6) 在室内休息状态Pa02 > 60 mm Hg ;
(7) 病人能够理解并同意签署书面授权同意书并同意遵守所有研究中 包含的步骤的要求；
(8) 病人符合科研性支气管镜检要求并愿意接受相关程序；
(9) 病人能够每周三次至ljBdlevue医院的GCRC部接受药物治疗。 不适合接受本研究的病人定义如下(1)病人不愿意或不能够接受
科研性支气管镜检；(2)已知患有哮喘或严重COPD的病人；(3)需要 接受氧气治疗以维持足够的动脉充氧的病人；(4)对研究药物治疗或其 它组成的药物治疗高反应性的病人；(5)己知患严重心脏病、严重外周 血管病或癫痫病，可能因接受研究药物治疗(按照包装说明书禁忌接受药
物治疗)而加剧的病人；(6)怀孕或哺乳期妇女。育龄妇女需要妊娠试 验呈阴性并需要采取可接受的避孕方式(研究持续期间节欲是最优选的方 法)；(7)有证据表明治疗前一周内受到活性感染；(8)除IPF以外的 任何可导致病人进入研究后1年内死亡的病症；(9)异常血清实验值， 包括(a)肝功能超过特定限制筛选时，总胆红素大于正常上限1.5 倍；丙氨酸转氨酶大于正常上限3倍；碱性磷酸酶大于正常上限3倍；白 蛋白小于3.0: (b) CBC在特定限制以外WBC小于2500/mm、血细胞 比容小于30或大于59;血小板小于100000/mm3; (c)筛选时肌酸肝大于 正常上限1.5倍；(10)过去六周内接受肺纤维化药物治疗，不包括皮质 类固醇、环磷酰胺和/或硫唑嘌呤；(11)以往任何种类的干扰素药物治 疗；(12)过去28天内用于任何指征的调查性治疗。
实施例2
最初，从IPF登记处招入10个病人进入气雾剂化干扰素i的标签公 开的初步研究中。这10个病人满足适合和排除标准。收集的数据包括过 去病历，包括身高、体重和生命指征；个人过往的所有药物史及完整的职 业和吸烟历史，体检，EKG， CBC，电解质检验，肝酶和凝血谱，CXR， 胸CT， PFT， ABG及孕期妇女妊娠测试。
毎个病人在研究开始时完成一份肺纤维化调査问巻，详细询问病人一 生对烟草、环境的暴露及药物使用情况。每个病人还会完成一份症状调查 问巻以确定对IFN-y的耐受性及可能的副作用。
病人会接受基准支气管肺泡灌洗(BAL)的支气管镜检来评估某些促 纤维化和炎症细胞因子的水平。步骤如下
每个病人按照Bdlevue Hospital Protocol接受支气管镜检。每个检查 包括Hgb、血小板、BUN/CR、凝血检验、ABG (P02大于等于75 mm Hg) 、 EKG、 CXR。支气管镜检禁忌包括病人不合作、近期心肌梗塞、 恶性心律失常、不可矫正的低氧血症、不稳定的支气管哮喘、肺性高血 压、部分气管阻塞或声带麻痹、出血素质及尿毒症。病人在支气管镜检前 至少8小时必须NPO。设立静脉线，实施补充供氧和持续的脉搏血氧测定
及血压监测。
病人IM前驱用药60mg的可待因，粘性利多卡因会被应用到鼻部， 使用利多卡因漱口及喷雾器(局部麻醉支气管镜检)。在步骤进行中，会 施用咪达唑仑和/或吗啡以使镇静及减少咳嗽反射。这些药物是支气管镜 检中常规应用的。支气管镜检经过鼻部和声带，并进行支气管内检测。然 后施用50ml分装的无菌生理盐水进行BAL，共300ml,缓吸以实现最大 回流。
从病人获得BAL液后，以处理所有BAL标准化步骤在GCRC中心实 验室处理。BAL液经无菌纱布过滤。用血细胞计数器进行分类总细胞计 数。以台盼蓝方法确定细胞存活。每叶BAL液制备20个细胞离心载玻 片，贮存于-70。C。 24小时以106细胞/1111的浓度收集上清液，进行细胞因 子ELISA检测。上皮细胞衬液的体积通过蛋白质方法测定。离心后， BAL液上清使用AMICON过滤方法浓縮10-50倍。细胞因子测试用商售 试剂盒(R&D Systems, Minneapolis, MN)进行。所有样品重复三次，细胞 因子的量在测试最后由微量滴定板读数器定量。按照前述方法(Raghu a a/. (1989) Z ev. / e平D/s. 140:95-100)处理经支气管活组织样品以分离成 纤维细胞，然后通过将3H脯氨酸掺入胶原蛋白来分析胶原产生。在 GCRC中的程序结束后由临床护士观测4小时每个病人可能的支气管镜检 副作用，包括但不限于发烧、呼吸短促、咯血、气胸。记录合并用药情况 于病人的病历中。
每个病人保持他们稳定的皮质类固醇或免疫抑制剂的剂量。当病人还 在进行本研究时不允许进行调查性治疗。临床前大鼠研究已经表明，胃肠 外IFN-y降低了肝微粒体细胞色素P450的浓度。这可能导致已知利用这 个降解途径的药物的代谢降低。如果一个病人正在接受任何已知的由这个 途径代谢的药物，则需要实行合适的监控程序。
IFN-Y通过手持喷雾器施用，每周3次持续12周。在每种剂量施用 前，会由施药的医生进行检査。进行峰流量测量，三次中的最好结果记录 为治疗前值。以常规方式准备Aeroeclipse或AerotechII喷雾器，在喷雾器 中放入500pg的药物。治疗通过压縮空气(墙式或可移动式)进行，同时
病人坐于固定位置，戴鼻夹，正常呼吸。治疗最后，再次由进行研究的医 生对病人进行检查并在病房观察1个小时。施药l个小时后，测量并记录
峰流量读数。第一次气雾剂治疗后，每个病人需要在病房多停留4小时， 再次进行肺检查和峰流量测量。在施用IFN-y的过程中对每个病人进行副 作用监测，包括但不限于发烧、疲劳、GI异常、头痛、咳嗽、呼吸短 促、气喘和化验异常。
毒性以"普通毒性标准(The Common Toxicity Criteria)"定级。剂量 调整相应进行。对于I级毒性，病人可根据医生的判断继续治疗。对于II 级毒性(根据立即重复的异常实验参数证实)，停止病人剂量直至回复小
于或等于i级毒性，这时可恢复治疗。如果n级或更严重毒性出现，病人 将撤出研究。对于m级或iv级毒性，病人撤出研究。异常实验参数需要 确认。
实施例3 临床功效
一个38岁具有慢性过敏史的海地妇女表现为1年半的进行性渐强的 呼吸短促和运动性呼吸困难。这个病人的PFT表现为低弥散量为主导性的 限制模式，疑似间质性肺病。她进行了胸部CT扫描，证实了她的PFT结 果，显示为胸膜下纤维化和蜂窝变化，主要在肺基部。开肺活检表明与 UIP/IPF—致的模式。
病人开始接受气雾剂化IFN-Y。她报告呼吸困难减轻并能够恢复工 作。她已经保持三年临床稳定(参见表1)。客观发现列于表2。运动表 现方面有改善，表现为最大耗氧量增加、每分钟通气量减少及氧气去饱和 度降低。她的呼吸困难分值降低(UCSD SOBQ)。她的肺功能测试在气 雾剂治疗期间保持稳定。沉积图像如图5所示，代表54pg的IFN-y在肺 薄壁组织沉积。图6显示气雾剂治疗前后，从BAL测量的TGF-卩水平。 TGF-p的活性有显著降低，与IFN-y气雾剂的效果一致。
表1治疗前后PFT结果
曰期历史%预测值 TLC FEV1FVCDLCO/VA
4月-02 第一次PFT53495951
7月誦02 开肺Bx+之后；强的松和硫51575564
唑嘌呤Txt开始
8月-02 由于fLFT的硫唑嘌呤D/C;60545254
强的松渐少至10 mg/天;参考
研究研究；Txt前PFT
12月-02 INF-y Tx卞后61666065
6月-03 持续气雾剂治疗54676161
恢复工作
12月-03 持续气雾剂治疗57615371
7月-04 持续气雾剂治疗53585168
fBx-活组织检査；1Tx =治疗
表2运动测定、呼吸困难评分和肌肉力量的结果
变量_Tx卞前_Tx卞后(3个月)
VE,最大L/min
V02最大值，L/min 0.655 (42%) 0.746 (46%)
最小02饱和度(％) 35 54
UCSD SOBQ* 63 44
* University of California at San Diego， Shortness Of Breath Questionnaire 卞Tx-治疗
实施例4
BAL液用于测定蛋白及IFN-Y检测，用病毒抑制测试来确定输送的药 物的量。用ELISA (R&D， Minneapolis)来测定浓縮的BAL液和24小时 细胞培养上清中的细胞因子化-1|3、 IL-4、 IL-6、 IL-8和TNF-a。无细胞的 BAL上清以ELISA和萤光素酶报告测定来测定TGF-卩活性。经支气管活 检(TBBX)样品以半定量RT-PCR来测定TGF-P基因转录。从TBBX样品 获取成纤维细胞，以RT-PCT测定胶原I、 III和纤连蛋白RNA的量。从
TBBX或TBBX的细胞培养物获取RNA(10pg)，进行Northern印迹分析。 用BAL液，BAL上清和TBBX样品以分光光度法测定羟脯氨酸蛋白含 量。计算每个病人的治疗前样本和治疗后样本BAL液细胞数。取得每个 病人的血液样本储存。
实施例5
每个病人被要求参加(需单独同意)通过手持式喷雾器施用IFNi的 沉积研究。这个沉积研究如下设计来研究气雾剂化IFN-y。药物以99mTc 标记并通过气雾剂喷雾器施用。利用"衰减技术"，计算输送到肺各个部位 的IFN-y的剂量。最初所用剂量为500吗IFN-y，因为这个剂量在以往表 明是安全的。根据每个病人个体沉积研究调整剂量。在治疗末期，用上述 的步骤进行一次跟踪支气管镜检。通过肺沉积图像引导BAL，以使最大 量药物沉积的区域得到分析并与最低量药物输送区域和前气雾剂IFN-Y样 品比较。通过这种方式，可以计算并确定肺每个区域的总剂量。按照临床 反应及BAL数据，可调整剂量以反映最优化临床和沉积参数。如果可 能，将尝试进行治疗前后相似片段的抽样。每个病人在治疗一个月后接受 跟踪检査。所有程序、实验室检测、放射性研究和肺生理测试的结果均记 录于病人的病历。所有研究测试在NYU医学中心的GCRC进行。
本研究中使用一种商售呼吸驱动式喷雾器AemEclipse，其颗粒的产生 依赖于病人通过喷雾器的呼吸。它只在吸气时产生气雾剂。
IFN-y以^锝二亚乙基三胺五乙酸("mTc-DTPA)放射性标记来进行体 内和体外研究。对于AeroEclipse，使用2管(250mg的IFN-力来达到最终 体积2mL。用Pari Master空气压縮器(PARI Respiratory Equipment, Inc. Monterey, CA)来操作AeroEclipse 。
以临床应用的方式将喷雾器连接到电路。用T连接器(Tconnectoreascade， Hudson Respiratory Care, Temecula， CA)连接一个十级低流量(l.OL/m)级 联冲击器(California measurements, Sierra Madre, CA)。 一个可以阻隔颗粒 物在呼气时进入级联冲击器的吸气过滤器被置于活塞泵和级联冲击器之 间。第二个过滤器(泄漏过滤器)被置于系统中以捕获多余的导入吸气过
滤器而没有导入冲击器的颗粒。为评估病人通气可能引起的效应，用一个
活塞泵(Harvard Apparatus, Millis, MA)模拟病人的呼吸过程。
吸入前在实验台在两个条件下研究气雾剂-驻云(standing cloud);级联冲击器在没有活塞泵(泵与电路断开)产生任何 通气的情况下直接从1 Lpm的管中抽取颗粒样本。为了从AeroEclipse产 生颗粒，在采样持续过程中手动压按呼吸驱动阔。
通气过程中:用Harvard泵在系统中产生正弦流，类似病人的呼吸。使用 潮式体积为750ml;呼吸速率为20/m，工作比为0.5。
测定颗粒的空气动力学分布及在连接到级联(T connectorcde)的管道 上的沉积。气雾剂的弹道特征通过T COnneCtor(;aseade的活性来定量，并以占 级联冲击器上捕获的活性的百分比来表示(％级联)。用这个沉积来预测 肺沉积。
氙成像和衰减研究用AemEclipse喷雾器研究所有个体的IFN-y沉 积。进行氙成像和衰减研究(参下)。
肺容积和轮廓研究(133氙(133Xe)平衡扫描)病人就坐于一个后向放置 的伽马摄像机(Picker Dina camera; Northford, CT)前面。经过用，锝(99m Tc)对房间背景取像后，把相机设置到133Xe。以功能残气量(FRC)进行潮 式呼吸，病人吸入5-10 mCi的133Xe直至计数率稳定到15秒内稳定 ±10%。摄取1分钟伽马图像(^Xe平衡图像)并存储于计算机(Nuclear Mac vl.2/94; Scientific Imaging Inc. Littleton, CO)中分析。这个图像用来定义肺 的外缘。
气雾剂沉积研究^Xe成像后，相机转成"，c。然后，病人从喷雾器 中吸入放射性标记的气雾剂化IFN-Y。为每个装置准备一个呼气过滤器来 捕获呼出的颗粒。喷雾器一直运行直至干涸。最后一次吸气后，病人喝一 杯水以把材料从口咽冲洗到胃。测定胃活性评估上气道沉积。
肺衰减研究(灌注扫描)进行肺灌注扫描以计算肺的衰减系数。沉积成 像后立即通过外周静脉注射5mCi的99mTc白蛋白大团聚体。假定所有大 团聚体穿过心脏右侧而按照区域灌注比例分布于肺部。获取1分钟成像。 灌注计算为测定的活性值减去上个(沉积)图像的活性值。肺衰减系数测
定为相机所测活性量除以注入的活性量。肺衰减系数=所测活性/注入活 性。
胃衰减给病人含有已知量99mTc的面包，并在摄取之后进行胃部伽马 相机照像。胃衰减计算为摄取活性除以伽马相机所测活性。胃衰减系数= 所测活性/摄取活性。
沉积定量利用计算机，将存储的133Xe平衡扫描的感兴趣的区域可视 化圈出，以定义肺轮廓和包含肺容积。肺中心区域被圈出，其描绘了二维 肺区域的内部的三分之一。定义氙区域后，将同样的区域置于沉积图像和 所鉴定的胃活性。然后， 一个描绘胃轮廓的"胃区域"被可视化圈出。如果 胃区域和左肺的氙平衡区域有重叠，重叠区域被定义为"肺上胃(stomach onlimg)"或SOL。为确定整个肺沉积，排除胃和肺上胃区域的放射活 性。
肺沉积以伽马相机通过对肺区域的活性定量并进行适当的衰减校正测 定。口咽沉积通过从沉积图像总活性中减掉肺活性确定。对胃衰减做适当 校正。
特异中心相对于外周的比率(sC/P)特异的中心相对于外周肺活性定 义为气雾剂图像除以氙平衡图像。这个比率代表了沉积的气雾剂的分布， 以区域肺容积做标准化。
气雾剂沉积的sC/P =(气雾剂C/P /氙C/P ) 如果气雾剂作为一种气体完美作用并按照133Xe分布，sC/P比率应该为 1.0。偏向中心气道沉积的颗粒产生2.0或更高的sC/P比率。
沉积研究结果显示出气雾剂在整个肺部的显著性沉积。对肺容积作标 准化后，肺部中央区域有比外周相对较多的微粒(sC/P比率=1.618)。有最 小限度的上气道沉积。
实施例6 气雾剂IFN-y的作用
不利作用我们用气雾剂化IFN卞冶疗了 15个个体(正常的志愿者和 肺结核患者)。气雾剂施用被很好的耐受，很少病人抱怨偶尔咳嗽或肌
痛。最长施药时间为3个月，不利作用没有增加。而且，Jaffe发现给予正 常个体气雾剂化IFN-y是安全的，没有全身性副作用，并能够激活肺泡巨 噬细胞而不是PBMC，这与胃肠外输送rIFN-Y相反，其效果只能在外周血 体现(Jaffe W a/.' (1991) JC7/" /"veW 88(1): 297-302)。
沉积研究我们研究了 IFN-Y的气雾剂沉积特点。展示了一个沉积图 像，揭示出放射性活性(气雾剂)在肺的所有正常区域沉积。病变和腔区 域被省略。灌注扫描也显示腔区域的灌注为最小限度。用质量平衡技术和 氙(如图)进行的沉积测定揭示出10%-20%范围的气雾剂剂量被输送到 肺。我们做出结论，将药物靶向输送到肺部可引起药物在肺正常薄壁组织 的沉积(Condos " (1998)爿m Ji &s;^ CW/ Qire 157(3): A187)。
支气管肺泡灌洗发现我们以前已经证明以IFN-Y治疗一组患严重多药 抗性结核病患者有临床改善。病人在治疗前和治疗后进行放射线摄影相关 区域的BAL的支气管镜检。24小时细胞培养上清及BAL液经ELISA测 试，发现其随时间而降低的TNF-a水平(平均172到117 pg/ml)、 ILl-b水 平(平均25到8pg/ml)以及不可评估的IFN-y水平(平均3.3到2.5 pg/ml)。 我们做出结论，施用IFN-y与疾病部位局部产生的TNF-a降低相关。这可 部分解释IFN-y在晚期MDR-TB中的有益效果(Condos " a/., (1998)爿m J 及e一 O/f Owe 157(3): Al 87)。
实施例7 特发性肺纤维变性的成功治疗
在一个对5个IPF患者的气雾剂rIFN-Y的研究中，我们发现治疗被很 好的耐受。不利作用，包括疲劳、咳嗽和低烧(n=l)。研究期间进行的 常规化验未发现任何异常。所有病人均报告其呼吸短促有主观性改善。在 3个月治疗的末期，研究中的病人其总肺活量具有统计学上显著的提高。 图7表明在接受治疗的5个病人中的3个，其治疗后增加的百分率预测总 肺活量。5个研究病人的2个也有大于200 cc(分别是200和500 cc)的最大 肺活量的改善。图8表明在接受治疗的5个病人中的3个，其治疗后增加 的百分率预测最大肺活量。这些生理变化都伴随从支气管肺泡灌洗
(BAL)液(从肺内皮层洗出的液体)回收的活化TGF-p水平的降低。图 9表明接受治疗的5个病人中，其tgf-j3在总蛋白中所占部分减少。tgf-P是肺纤维化中主要介导物之一。它的激活导致胶原产生。其水平降低应 该引起较少的胶原沉积和较少的肺纤维化。而且，我们测量了气雾剂治疗 前后病人bal液中干枕素-y的水平，发现施用气雾剂药物和其升高相 关。图IO表明了结核病人和特发性肺纤维变性病人在干扰素-Y气雾剂治
疗前后在其肺部所测干扰素-Y的量。
与之前进行的皮下研究相反，我们能够表明以气雾剂输送rIFN-Y，肺 功能有生理性改善。与Intermune皮下试验中病人接受1年治疗相比，这 种改善发生在3个月的治疗期间。这种生理性改善与肺部IFN-y水平升高 相关，引起从接受气雾剂治疗后的病人肺部回收的活化tgf-卩的水平降 低。这个数据证明了输送药理学上重要量的干扰素-y到肺的能力。皮下施 药后未检测到可测肺部干扰素-Y水平(参J , Jaffe " W.， / C7z'" /"ve比88， 297-302 (1991)。在一个进一步确定肺剂量的尝试中，5个病人中的2个进 行了沉积研究。这些研究确定了大约40mcg的rIFN-Y沉积到肺外周。在 皮下rIFN-Y试验中未检测到或报告rIFN-y的肺部剂量或肺部水平的测量。
实施例8 细胞因子基因调节
在本研究中，对转录因子丰度、磷酸化和dna结合活性的研究验证 了一种假设，即气雾剂ifn-Y治疗影响细胞信号转导途径以激活潜在的 STAT-1并诱导IRF-1的重新合成。我们在从IFN-Y治疗前后肺结核病人受 影响和未受影响的肺部区域的BAL细胞上进行了这些实验(Condos W "/.， (1999) J及es/^ CnY Care MW (付梓待刊))。纯化和克隆IRF-1是由 Richard Pine博士与Jamese E Darnell, Jr在洛克菲勒大学分子细胞生物学实 验室进行的首创性工作的主要部分(Pine a a/., (1990) M / Ce//所o/ 10(6): 2448-57)。与本项目目标3所建议的相同或相似的免疫印迹及电泳迁移率 变动分析也在上述工作中得到应用。
肺结核病人的未受影响的肺的细胞因子基因操作的结果是最相关的。
结果显示在BAL细胞的粘附细胞(主要是肺泡巨噬细胞)和非粘附性细 胞(淋巴细胞和多形核细胞)部分，在气雾剂IFN-Y治疗后，均有特异性 IRF-DNA和STAT-1-DNA复合物的量增加。
实施例10 哮喘治疗的效力
我们将招募30名轻度-中度哮喘病人接受IFN-Y气雾剂治疗并对比标 准治疗。本研究为随机、安慰剂对照、交叉、双盲r IFN-Y气雾剂输送研 究，在患有轻度-中度持续性哮喘、需要中等剂量吸入的皮质类固醇作为 症状控制的个体中进行。
病人必须为18至65岁，可为任何种族和性别。他们现时必须为非吸 烟者，具有吸烟<10包年史。满足NAEPP关于哮喘诊断指南的病人会被 招入。我们将招募轻度-中度持续性哮喘的病人，其1秒用力呼气量 (FEV1)基准水平大于预测值的70%，并有可逆性证据(支气管扩张药治 疗后FEV1改善大于或等于15%)。这些病人需要间歇性使用吸入式b2-激 动剂和低剂量的吸入式皮质类固醇。低剂量的吸入式皮质类固醇应用包括 168-500 mcg/天的丙酸倍氯米松，200-400 mcg/天的布地奈德DPI, 500-1000 mcg/天的氟尼縮松，或400-1000 mcg/天的曲安奈德。
怀孕的、对纤维光导支气管镜检禁忌的、现时抽烟的、或具有吸烟 >10包年史的病人将被排除。任何具有控制不佳的或严重哮喘史的、最近 全身性使用皮质类固醇历史的、近期加剧或感染历史的病人也将被排除。
我们会引入一个月的"清洗(wash-in)"期以保证所有招入的病人以相 同的基准剂量的吸入式皮质类固醇(丙酸倍氯米松4-12 puffs/天)开始。每 个病人在基准线有
1) 完整的病历及身体检査，和常规化验，
2) 肺功能检测(FEV1, FVC，和PEFR)，
3) 以静脉棒抽取50 ml肝素化血液，
4) 获取血液样本用于总IgE、对确定过敏原特异性的IgE及嗜曙红细 胞计数，
5) BAL的纤维光导支气管镜检，细胞计数/分化分析及用ELISA方法 分析24小吋培养上清的IFN-y、 IL-4、 IL-5、 GM-CSF、 IL-IO、 IL-12和 IL-13的水平。
我们然后将向15个病人施用气雾剂rlFN-Y(500 mcg),每周3次，共 8周。以随机方式向15个病人施用等量的雾化盐水。在8周内我们将进行 1个月的洗出期并将个体交叉至临床试验的第二部分(arm)。病人每次 治疗到访将会进行
1) 简短的对迹象和病症的问巻调査
2) 检查日志卡和监控b-激动剂应用
3) 气雾剂治疗前后峰流量测定
4) 每周进行的简短病历和身体检査
5) 个体将在气雾剂化IFN-Y治疗前、中、后在日志中记录症状特征。 他们会对咳嗽、气喘、呼吸短促症状在刻度表中评级。他们也将记录每日 峰流量测定。
在试验的每一部分完成时(气雾剂化IFN-Y治疗或对照盐水治疗8周) 个体将会有
1) 完整的病历及身体检查，和常规化验，
2) 肺功能检测(FEV1, FVC，和PEFR),
3) 以静脉棒抽取50 ml肝素化血液，
4) 获取血液样本用于总IgE、对确定过敏原特异性的IgE(RAST)及嗜 曙红细胞计数，
5) 在最后一次IFN-y治疗或无治疗后的一天将进行BAL的纤维光导支 气管镜检。我们将分析BAL细胞计数/分化及用ELISA方法对24小时培 养上清的IFN-y、 IL-4、 IL-5、 GM-CSF、 IL-IO、 IL-12和IL-13的水平。
6) 每个月在哮喘诊所对所有的病人进行继续跟进
a) 完整的病历及体检
b) 常规化验
c) 肺活量和峰流量测定 我们选择研究使用低剂量的吸入式皮质类固醇的轻度-中度持续性哮
喘的病人有一些原因。第一，只包括轻度间歇性症状的病人可能不会使我 们在这样一个群体中灵敏地发现生理性、症状性或免疫性改变。第二，我 们不能要求任何需要使用吸入式类固醇的病人为了这个试验而中断治疗。
而且，本试验的目的是确定气雾剂化IFN-y能否作为己经确定的治疗方案 的辅助。我们明白使用吸入式类固醇可能扰乱我们的研究，因为皮质类固 醇会影响细胞因子水平。我们引入"清洗"期以使所有个体在同一基准开 始。
实施例11
对哮喘患者肺功能的作用
为测定气雾剂r IFN-Y对肺功能测试的作用，我们获得了每个病人气雾 剂治疗前的1秒内用力呼气量(FEV1)的肺活量值、最大肺活量(FVC)值、 呼气速率峰值和肺容积包括肺总气量(TLC)值和功能残气量(FRC)值。这些 会在Bellevue Hospital Pulmonary Function Laboratory进行。
我们预期在施用气雾剂化r IFN-Y后会立即发现峰流量测量值的轻微改 善，如我们在治疗没有哮喘的肺结核病人中所观察到的一样。如今，仍然 不清楚为什么IFN-Y会有支气管扩张剂作用。我们也预期在8个星期气雾 剂IFN-Y治疗后FEV1和FVC改善，反映气道炎症减少。
我们特别选取跟踪FEV1因为其对个体病人来说是可再现的。这些值 对大气道阻塞是特异的。如果我们在本研究的开始部分发现小气道疾病的 其它变量受到影响，我们会使用比气道传导率、气道阻力或用力呼气量值 的25%-50%作为终点。如果需要更灵敏的气道阻力测定，我们可进行频 率依赖性顺应性研究。我们也可以进行乙酰甲胆碱支气管激发研究来研究 气道高反应性。因为个体差异性及个体间差异性，这些额外研究并不十分 可信。实验设计为交叉试验可避免个体间差异性。
实施例12 对BAL样本的效果
从30个哮喘病人获取BAL样本。我们将向这些病人中的15个施用
气雾剂IFN-y 8周以测定IFN-y是否调节细胞因子的产生。从这些病人治疗 前后抽取BAL和血液。
方法纤维光导支气管镜检个体将以病历和身体检查、肺活量测定、 血氧测定、支气管高反应性检测，凝血检验(PT,PTT,血小板)和CBC及化 学筛选进行初筛。在程序进行中病人会有持续的心率和02饱和度监 测、主观症状和用药剂量记录、静脉内导管安置、吸入式b-激动剂的前驱 给药、皮下阿托品(0.4mg)和镇静剂(咪达唑仑，iv)和补充氧气。在轻微的前 驱给药和鼻及上气道局部麻醉后进行纤维光导支气管镜检。支气管镜尖楔 入右中叶或小舌的分段(segmental)或次分段(subsegmental)支气管。 以20 ml等分将100 ml的37。C生理盐水灌注到支气管。加温的盐水可避 免在哮喘个体中热致支气管痉挛。用和缓的间歇性吸收来回收流出物。预 计在轻度哮喘患者中有60%-80%的液体回收。在中度到严重病症的个体 中回收减少至50% [Jarjour, 1998 #62]。脉搏血氧测定和病人状态的临床评 估在程序结束后进行。出院指导将包括一周内的跟踪预约和电话联络。
肺泡巨噬细胞(AM)和BAL细胞以标准技术进行支气管肺泡灌洗 (BAL)收集细胞，并按照如下所述准备培养把液体以一层无菌纱布过滤 以除去粘液凝块。用血球计数器进行总细胞计数，所数共500个细胞用改 良Wright-Giemsa染色剂染色的细胞离心载玻片进行细胞分类。用台盼蓝 排除法确定细胞存活，在所有情况下用于实验的回收细胞其存活大于 90%。从每一叶的BAL制备20个细胞离心载玻片， 一旦以10°/。福尔马林 固定即存贮于-70'C。洗涤BAL细胞并以106细胞/毫升的浓度在补充了 10。/。的热灭活胎牛血清(FCS)、 100u/mL青霉素、100mcg/ml链霉素的 RPMI(GIBCO)中培养24小时(37'C)。
外周血在IFN-y治疗前和结束后，在每天的固定时间以静脉棒采血。 从肝素化静脉血中以Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离PBMC。肝素化 静脉血于Ficoll-Hypaque中分层并以2500rpm离心20分钟。PBMC的低密 度层将被吸出并以磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤，以106细胞/毫升的浓度重悬 于补充了 10%的热灭活FCS、 100u/mL青霉素及100mcg/ml链霉素的 RPMI(GIBCO)中。然后细胞培养物在37'C和5% 0)2中保温24小时。收
集细胞上清并以ELISA测定细胞因子。
收集血清样本以测定对过敏原特异的IgE(RAST)，所述过敏原(屋尘 螨(D. pteronyssinus )、美洲尘螨(D. farinea )、 德国蜚蠊(B. germanica -German cockroach ) 禾口美洲裴赚 (P. americana -American cockroach))与城市哮喘相关。
对从特应性哮喘患者和正常对照所获得的PBMC进行额外的研究。这 需要在相同的补充RPMI培养基中分离PBM细胞培养物，如上所述。然 后这些培养的细胞将会用非特异性刺激物(LPS)或已知过敏原刺激。然后 培养上清通过ELISA分析细胞因子。这些水平将会与静止细胞细胞因子 水平对比。可通过这个评估筛选一个大的城市哮喘群体，用于招募基准 IFN-Y反应差的病人进入气雾剂化IFN-Y治疗试验。
细胞因子评估我们用ELISA(Endogen)测定24小时后收集的BAL细 胞上清(106细胞/毫升)中的IFN-y、 IL-4、 IL-5、 IL-IO、 el-12、 IL-13和 GM-CSF。我们收集了 5管106细胞/毫升，所以我们可以对每个细胞因子 以一式三份测量样品。因为我们每个肺段平均30-40xl(^个BAL细胞，我 们预计可以评估每个病人的BAL细胞上清。我们将不会测量BAL液中的 细胞因子，因为我们会在BAL之后的样品中回收IFN-Y，而且我们旨在研 究从BAL细胞中自发释放出来的细胞因子。
实施例13 IFN-Y治疗影响基因调控的机理
临床治疗程序将对调节应答IFN-y的基因表达的转录因子的丰度和活 性有清晰的作用，并且这些数据与细胞因子谱的关联将扩展用来评估哮喘 中免疫应答的标准。而且，所获得的这些数据将可对来自细胞因子产生和 细胞因子及其它基因表达的分析的结果进行作用机理阐释。
本项目的设计加入了几个对照以帮助确定气雾剂IFN-Y治疗的效果， 区分于其它任何变量。这包括在治疗过程前后获取BAL和血液样本，以 及收集受影响和未受影响的叶的BAL样品。为此所有实验将会用从BAL 或PBM细胞制备的蛋白提取物进行。胞质和核蛋白将会分别获取和分
析。为取得更多确定性的结果，BAL细胞将被分成粘附性和非粘附性群。 前者将主要包括肺泡巨噬细胞。后者将主要包含淋巴细胞和粒细胞。 PBMC将被提取而不作进一步分离。
本项目对转录因子丰度和DNA结合活性的研究将验证一个假设，即 气雾剂IFN-Y治疗的临床程序将影响细胞信号转导路径以激活潜在的 STAT-1并诱导IRF-1和CIITA的重新合成。获得的数据将把调节基因表 达的分子机制联系到初步的临床发现。用气雾剂IFN-Y进行体内治疗的有 限治疗过程的结果当与证明对治疗有分子应答的数据结合进行解释时，可 对用于将来试验的设计产生更大的预测性效果。
决定转录因子STAT-1 、 IRF-1和CIITA的丰度
对治疗程序前后这些转录因子的总量进行定量是有价值的，主要原因 有两个。这些数据对全面解释针对IFN-Y治疗的受调控应答是关键性的。 它将得出关于可利用的蛋白被磷酸化的程度和具有DNA结合活性的总蛋 白比例的结论。而且，蛋白的丰度是编码这些因子的基因受调控表达的最 终测量，因此为将来进一步整合激发的免疫应答的功能性和调节性方面的 研究提供了基础。
免疫印迹检测将会是首选的技术。最高5 x 106个细胞的胞质和核提取 物被用来作每个分析。按照以上所述获取的细胞将为每个病人产生10个 样品。 一个病人的所有PBMC和BAL细胞提取物将会包括在一个单独实 验中，以有利于一组样品内的相对定量。每个实验中也会包括从培养的细 胞系制备的胞质和核提取物对照。基于以前的研究，这些样品已知含有靶 蛋白，因此可提供免疫印迹检测的阳性对照。而且，他们可被用来证实取 得的数据是定量的或者揭示定量检测的局限性。
蛋白通过SDS-PAGE分离，然后转移到膜。膜用检测STAT-l、 IRF-1 和CIITA的试剂显影，逐个进行。膜最后被探査以检测b-微管蛋白，其在 胞质和核蛋白提取物中均存在，因此可作为实验内或实验间的胞质或核提 取物的定量比较的内部标准。所需的所有抗体可在实验室获得或者巿面有 售，并且已知对免疫印迹程序有效。为了依次检测不同的蛋白，膜被处理 以破坏抗体结合，但不释放靶蛋白。可通过重复顺序检测每个靶蛋白并比
较第一轮和第二轮获得的信号来证明这种方法有效。每个蛋白的检测特异 性的阴性对照由抗体(相对另外两个)提供。而且，最后膜将进行不包括 一抗的显影。
如果可获得的细胞数目不够，或特定的转录因子的丰度太低，信号则
不会被检测到。对这些蛋白进行ELISA测试可能会获得更大的灵敏度， 但是免疫印迹方法的更高的可靠性和特异性将会失去。但是，这些潜在的 问题都不会是显著的。所需要的细胞数目通常应该只是每个BAL样品的 一小部分。任何靶蛋白的低丰度将会是一个导致有意义结论的生理学相关 结果。但是，应该注意，如果每个细胞中有100-1000拷贝的靶蛋白，即 相当于在所分析等份中有不超过8毫微微摩尔(0.5-1.5ng)，试剂和检测系 统将会产生一个信号。
STAT-1、 IRF-1和CIITA的酪氨酸和丝氨酸磷酸化的特征 转录因子磷酸化的改变经常是所述因子从存在到发挥功能间的联系。 即使DNA结合活性不由磷酸化直接改变，这一点也是正确的(David (1995) 5We"ce 269(5231 ):1721-3; Wen, Z. " (1995) CW/ 82(2): 241-50; Pine ef a/" (1994)五m&o /13(1): 158-67; Cho " a/" (1996) J/m画o/ 157(11): 4781-9; David & a/., (1996) J所o/ C/zew 271(27): 15862-5; Gupta " a/.， (1995) Sde"ce 267(5196):389國93; Hibi " a/" (1993) Dev 7(11): 2135-48;
Parker " a/" (1996) Mo/ Ce〃 5/o/ 16(2): 694-703; Schindler ef a/" (1992) 5Wewce 257(5071): 809-13; Shuai(1992) 5We"ce 258(5089): 1808-12)。 如上所述，STAT-1的酪氨酸和丝氨酸磷酸化均可调控和控制其活性。 IRF-1是一个磷蛋白，但其自然发生的磷酸化的改变从没有被记录， CIITA的磷酸化很少被研究。这里描述的实验将通过检测PBMC和BAL 细胞提取物的磷酸化事件(以前主要在细胞培养系统中记录)来提供关于 STAT-1体内调控的数据。所取得的关于IRF-1和CIITA的数据将超过以 前所确定的。
这个系列实验的最简明的设计是从细胞提取物中通过免疫沉淀定量回 收耙蛋白，通过SDS-PAGE分离回收的蛋白，然后通过免疫印迹分析分离 的蛋白检测磷酸化。商售的抗磷酸酪氨酸抗体已经广被接受为可用作进行
免疫印迹并确定酪氨酸磷酸化的存在和程度，很少依赖或不依赖于特定的 靶蛋白。抗磷酸丝氨酸的抗体也可在市面买到，但不确定他们能够检测意 向靶蛋白中的这种残基。因此，本方法的成功应用有一些不确定性。除了 以上描述的阴性和阳性对照的类型外，在溶液中包括磷酸氨基酸并观察到 没有获得信号可表明特异性检测到磷酸酪氨酸和磷酸丝氨酸。
虽然经SDS-PAGE变性的蛋白很可能会与抗磷酸丝氨酸抗体反应，但 如果免疫印迹检测丝氨酸磷酸化无效，ELISA仍然可能是成功的替代。如 果是那样，将在孔内包被靶蛋白的抗体，蛋白将被结合，检测步骤将会利 用抗磷酸丝氨酸的一抗，所述抗体来自与靶蛋白抗体来源不同的物种。免 疫印迹所用对照基本上也可用于ELISA系统。
还有另外一个替代方式用于STAT-1丝氨酸磷酸化分析。可基于已知 的受调控的磷酸化的丝氨酸位点，Ser277，来制备(参见方法)特异性的 抗磷酸STAT-1 (P-Ser)抗体(Wen, Z. " a/" (1995) Ce〃 82(2): 241-50)。这 很可能成功，因为已经获得了特异于几种蛋白的磷酸化形式的市售抗体 (New England Biolabs)，所述抗体这样获得以合适的磷肽免疫，然后用 蛋白-a、肽及磷肽亲和基质纯化特异性抗体。本项目会应用类似的方法。 以"P-正磷酸盐代谢标记细胞、然后特异性免疫沉淀耙蛋白和磷酸氨基酸 分析不适合本项目，因为靶蛋白在代谢标记必需的培养期间可能被修饰， 以及能获得的材料的量不足以进行这样的方式。虽然对任何靶蛋白进行丝 氨酸磷酸化变化的测定可能不能轻易实现，但受调控的翻译后修饰的可能 的重要性强烈支持作这样的尝试。
这些数据将被用来建立在这个系统内这些因子的丰度和其作用的联 系。STAT-1丝氨酸磷酸化的程度将决定激活的水平而因此设定DNA结合 活性的最大和最小水平。如上所述，丝氨酸磷酸化的改变可能调节DNA 结合活性并对STAT-1功能有其它效应。增加的STAT-1的丰度和磷酸化 基准水平也有可能被检测到。这一结果将意味着，体内反应总体上与长时 间暴露于IFN-Y的培养的细胞的反应类似，而且反映出翻译后修饰(磷酸化 和去磷酸化)的时间进程以及作为针对IFN-Y的分子应答的STAT-1的重新 合成。IRF-1或CIITA磷酸化改变的数据将作为体内针对IFN-y的分子应
答的新标记物，并为将来测定这些改变的功能意义的基础研究提供有力的 理论基础。如果丰度改变而磷酸化不变，则可能是在这个系统中这些因子
的磷酸化不被调控，或者，对于STAT-1可能是在获取样本时没有持续的 净变化。有必要将来在其它系统中研究以区分这些可能性。
测定STAT-1、 STAT-4、 STAT-5、 STAT-6和IRF-1的DNA结合活性 测定DNA结合活性将提供所需的最后数据以评估针对治疗程序的分子应 答的调控。以实验样品的电泳迁移率变动分析检测并定量STAT家族和 IRF-1转录因子将通过已建立的步骤完成。在这些测试中将包括从培养细 胞制备的提取物作为阳性对照。用于特异性的对照和对所研究的因子的鉴 别将通过进行包括竞争性寡核苷酸或抗血清的反应来提供。将同时应用非 特异性和特异性寡核苷酸或抗血清。
与细胞培养系统(其整个群体在同一时刻开始暴露于加入的细胞因子 并持续同样的时间)的同步性相反，从BAL或血液样品获得的细胞将代表 反复气雾剂IFN-y治疗的总效果，所述治疗为叠加于不同步的起始，而个 别细胞的暴露时间是由它们自己在暴露位置处进出所决定。在细胞培养模 型中，IFN-y在几分钟内激活STAT-1 DNA结合活性。在一些细胞系中， 这个活性很快衰减。在其它包括单核细胞系NB4、 U937和THP-1中，其 可持续几小时(R. pine and E. Jackson,未发表)。由于STAT-1调节IRF-1基 因，IFTsky诱导IRF-1 DNA结合活性典型地只在1-2小时后被检测到，然 后则持续至少16小时。因此，STAT-1和IRF-1 DNA结合活性可能同时存 在，但也可能只有一个或另一个被检测到。
从实验样品获得的结果可能揭示出STAT-1和IRF-1 DNA结合活性都 存在，因此表明数天间歇性剂量的体内净结果等价于细胞培养系统中的中 等时间的暴露。这与已经报道的Bcr/abl转化细胞系或白血病患者的 PBMC中的STAT因子的组成型激活不同(Carlesso"a/., (1996) J Exp Med 183(3): 811-20; Gouilleux-Gruart " a/" (1996) 87(5): 1692-7)。而且，
这样的结果有力地表明对IFN-Y的全部应答在获取样本时仍在进行。或 者，只有STAT-1或IRF-1 DNA结合活性可被检测。似乎不会出现只有 STAT-1被检测，因为延长的IRF-1诱导是标准的，而STAT-1的激活典型
地是瞬时的。没有STAT-1 DNA结合活性存在情况下，出现IRF-1 DNA 结合活性将意味着治疗激活了一个反应，此反应与在培养的细胞中经IFN-Y过夜处理所见到的相同。生理学上，这与以下情况相一致IFN-y的存在 持续了足够长时间以致激活了生理活性终点例如由单核细胞向巨噬细胞分 化或ThlT细胞应答的建立。
对STAT-4、 -5和-6的测定将为T细胞针对IL-2的应答以及关键Thl 或Th2细胞因子的出现和功能提供分子标记物。最近很多的报道已经表明 IL陽2激活STAT-5， IL-12激活STAT-4， IL-4激活STAT-6 (Cho & a/.， (1996) //wmw"o/ 157(11): 4781-9; Gilmour & a/.， (1995) 7Voc M3f/ 腦92(23): 10772-6; Schindler "a/" (1992) 5We"ce 257(5071): 809-13)。这 里获得的数据本身不能证明这样的判断，因为几乎每一个STAT家族成员 都由一个以上的细胞因子激活，而且几乎每个细胞因子都能激活一个以上 的STAT。特别地，STAT-4也由IFN-a激活，STAT-5也由IL-7、 IL-15、 促泌素和生长激素激活，STAT-6也由IL-13激活(Ivashkiv， L. B. (1995) /画画' 3(1): l隱4; Darnell (1996)//onw 7 ey 51:391-403; Cho " a/" (1996, //附mzmo/ 157(11): 4781-9)。也应该注意STAT-1可被IL-6和 IL-10以及IFN-y激活。但是，对这个数据的分析将由上述细胞因子基因表 达分析所支持。而且，对STAT-4、 -5和-6DNA结合活性的测定将通过提 供细胞内分子效应的数据显著地延申那些观察，所述细胞内分子效应与确 定的细胞因子谱协同发生。
方法
我们用GITC和超速离心从10x106个BAL细胞中提取mRNA。由于 RT-PCR可对如此小量的细胞进行，总RNA也将被提取，贮存于-7(TC， 分析IRF-1的基因表达。PCR引物将基于己发表的序列，对于细胞因子基 因利用所述的RT-PCR，以b-肌动蛋白或GAPDH作对照比较转录强度。 由于IRF-1有基础性表达，需要一个定量的方法来进行RT-PCR。根据标 准方法，来自BAL细胞的总RNA将用oligo-d(T)和PCR进行逆转录。第 一轮PCR将会以20%的cDNA进行，使用以下寡核苷酸正向引物5'-GTCAGGGACTTGGACAGGAG-3， ， 逆 向 弓l 物 5，國AGCTCGGGGGAAATGTTAGT-3'。 IRF-1的表达将以GAPDH的表达进 行标准化。
细胞提取物的制备将来自BAL的细胞加入无血清的RPMI培养液， 如上所述，然后计数，然后转移到组织培养板。置于37-C下2小时后，用 培养液取出非粘附细胞，然后再次计数。粘附细胞的数目将以这两次细胞 计数的差值获得。将PBMC加入无血清的RPMI培养液，如上所述，然后 计数。所有剩余的步骤将在0-4'C进行。悬浮的细胞将被离心(200 x g, 10 分钟)，然后吸掉上清，把沉淀重悬于磷酸缓冲液(PBS)。重复这一步骤， 这些细胞将被再次离心，最终的PBS上清被吸掉。加入然后吸掉PBS以 洗涤附着的细胞单层。再次加入PBS，单层将通过刮擦被分离。细胞和 PBS将被转移到离心管进行离心，然后吸掉PBS。洗涤过的细胞沉淀悬于 裂解缓冲液(20 mM Hepes'Na, pH 7.9， 0.1 mM EDTA'Na， 0.1 M NaCl， 0.5% NP-40, 10%甘油，1 mM DTT, 0.4 mM PMSF， 3 pg/ml抑肽酶，2吗/ml亮抑 酶肽，1 ng/ml抑胃酶肽，100 pM Na3V04， 10 mM Na2P207, 5 mM NaF) (3 pi 每105个细胞)并孵育5分钟进行裂解。离心回收核(500 x g, 10分钟)。取 出上清，然后离心以澄清(13,000 x g， 15分钟)。回收所得的上清作为胞质 提取物，冷冻于碎干冰或液氮，然后存贮于-80'C。核沉淀将重悬于洗涤 缓冲液(没有NP-40的裂解缓冲液)，然后通过离心回收。吸掉上清，然后 沉淀悬于提取缓冲液(洗涤缓冲液，只是0.3M NaCl代替0.1M)(3pl每105 个细胞)并混合30分钟。提取的核通过离心沉淀，回收的上清作为核提取 物，按照上述冷冻存贮。测定蛋白浓度以使在一个实验中可使用数量相当 的不同提取物。这通常需要每个提取物使用相同的体积，因为使用提取缓 冲液体积/细胞个数的固定比率通常会在一个提取物组内或从不同制备物 产生一致的核和胞质提取物的蛋白浓度。
免疫化学程序如下进行免疫印迹:提取物和蛋白质大小标准与用于 SDS-PAGE的浓縮Laemmli上样缓冲液混合，将其加到按照标准程序用 8%分离胶和4%的浓縮胶制备的不连续Tris-甘氨酸凝胶系统。这个凝胶百 分比将溶解所有感兴趣的蛋白。以恒定电压进行电泳直至染料标记物到达 凝胶底部。把凝胶用转移缓冲液(Tris-甘氨酸加10%甲醇)平衡，然后用相
同的缓冲液以半干装置(BioRad Transblot， SD)把蛋白转移至硝化纤维膜。 膜以标准程序显影。简单来说，这需要封闭(用于Tris缓冲液加Tween20 去污剂中的脱脂奶粉孵育)、与特异性一抗孵育、以^t闭液洗涤几次、以 酶联二抗孵育、以无封闭剂的缓冲液洗涤、与酶底物孵育。对化学发光底 物来说，信号将通过X射线胶片测定。或者，可利用PHRI的一个 Molecular Dynamics Storm 860装置来检测化学发光底物的信号。按照实验 设计，本项目将使用先前测定为转移STAT-1和IRF-1所必需的最优化条 件，如以前测定那些病人每人的最佳发展条件那样(Pine^"/.， (1994) /13(1): 158-67; Pine " a/" (1990) Mo/ CW/ 5/o/ 10(6): 2448-57; Pine未 发表)。对CIITA来说，最优化检测条件，包括封闭试剂的选择、去污剂 的浓度、每个步骤孵育的时间和检测方法将用从培养的细胞制备的对照提 取物以经验决定。STAT-1和IRF-1的免疫沉淀将如前述进行，有微小修 改。特别的，用金黄色葡萄球菌fl""^)细胞回收与抗IRF-1抗体结 合的IRF-1已经被应用蛋白-a-琼脂糖取代。
如果需要ELISA检测转录因子的丰度或测定磷酸化，基于标准程序 的详细方法将用从培养的细胞制备的对照提取物以经验决定。为增加灵敏 度，优选的方法需要将捕获抗体结合到微培养皿的孔中，然后封闭，然后 以需要的提取物孵育。进一步洗涤后，使用特异性二抗，然后使用针对二 抗的酶联抗体，进行底物孵育。每次抗体孵育后进行洗涤。对于STAT-1，可以用兔多克隆抗血清提供捕获抗体，鼠单克隆抗体用于检测，或反 之亦然，因为对蛋白和磷酸酪氨酸或磷酸丝氨酸，二者均可获得。对IRF-l和CIITA来说，只有针对蛋白的兔多克隆抗体可获得，所以需要用针对 磷酸酪氨酸和磷酸丝氨酸的鼠单克隆抗体。检测这些蛋白需要用提取物包 被微培养皿的孔，然后以特异性一抗和酶联二抗孵育。如果合适，实验样 品测试中针对特异性的对照将包括略去一抗血清和/或加入磷酸氨基酸。
电泳迁移率变动分析已经为所指每个STAT家族成员和IRF-1发展 了 (Pine and Gilmour，前述)最佳分析。反应将包括非特异性和特异性竞争 物，或非特异性和特异性抗体。每个反应将用5Hg的蛋白提取物进行，通 常为2-3^d。对于有竞争物的反应，在放射性标记的探针与提取物混合时
加入那些寡核苷酸。对用抗体的反应，蛋白-DNA结合反应将按常规进 行，然后加入抗血清，继续孵育。当孵育完成时，将反应物加到天然聚丙 烯酰胺凝胶，然后在4'C电泳。凝胶经干燥后，通过放射自显影或以 Molecular Dynamic Phospholmager获取结果。
我们将以Student's paired t检验比较在基线获得的数据和r IFN-y治疗 后的数据，以平均值士SEM表示。基于以往的研究，我们将需要检测 FEV1中0.3L的差异，及3xl()S个细胞/毫升的差异。用30个个体，我们 将有80%的把握度。因此我们将在每组招募15个个体。
个体群体将对400个哮喘个体进行体检。30个轻度-中度持续性过敏 性哮喘病人将随机接受IFN-Y气雾齐U(n-15)或者标准治疗(n-15)。病人必须 接受肺功能和支气管刺激检测。必须没有纤维光导支气管镜检禁忌。本研 究群体的主要部分将从Bellevu Hospital Primary care Asthma Clinic招募。 我们的病人群体的人口统计学特征为90%少数民族(主要是西班牙和非洲 裔美国人)，年龄为18-79岁(中位数为39)，男性女性比例为l: 2。
潜在的风险总体来说，干扰素-y(IFN-力的风险和副作用的严重性与 给药的量相关。在本研究所用的剂量(50 mcg/m"下，最常见的可能的副作 用包括发烧、头痛和不适。高剂量下有报道会出现偶尔的反胃和恶心。气 雾化与不利反应不相关，虽然可能预计有头痛、咳嗽和发烧。如果出现严 重症状，将停止用药。有一个以前未知的IFN-y的副作用的风险，其与哮 喘病无关。个体有可能对IFN-y的蛋白部分产生过敏性反应，这种情况下 将中止。
风险管理方案为最小化任何风险，支气管肺泡灌洗在体检后进行， 排除有心脏病或心绞痛历史的个体。进行了胸X光和包括流血参数的血液 研究。支气管肺泡灌洗将由肺科人员在科室指导下进行。依照程序，研究 对象保持3小时NPO，每30分钟记录生命体征，持续3小时。所有的病 人在程序进行中将进行心脏监测，并于程序进行时和结束后接受鼻部供氧 2小时以防止血氧不足。所有的病人数据将被锁在肺研究办公室。病人如 果出现不利作用，将有一个"救护推车"跟随纤维光导支气管镜检，包括气 管内管、可注射的利多卡因和肾上腺素等，所有的程序在医院进行，住院
医师和CPR小组待命。所有的支气管肺泡灌洗程序将定期审査以发现任 何不良反应发生率的增加并鉴别他们的起因。
实施例14
所有接受气雾剂干扰素-Y的病人进行了肺活量测定以评定可逆气道疾 病。大多数病人具有无可逆性迹象的阻塞性气道疾病。在每次气雾剂治疗 中，病人在每次治疗前后进行峰流量的监测。所有病人的数据示于图 11。峰流量测定的百分比变化的总结性数据示于图12。气雾剂干扰素i后 平均峰流量值增加，在一些病人中有显著增加。这些数据表明气雾剂干扰 素-Y在气道疾病患者中是安全并良好耐受的。
权利要求
1. 一种治疗患肺病的个体中的肺病的方法，包括施以治疗有效量的气雾剂化干扰素。
2. 权利要求1的方法，其中所述肺病是阻塞性肺病。
3. 权利要求1的方法，其中所述肺病是特发性肺纤维变性。
4. 权利要求1的方法，其中所述肺病是哮喘。
5. 权利要求1的方法，其中所述疾病改善至相对于治疗前预测的FVC值 增加至少10%。
6. 权利要求1的方法，其中所述患肺病的个体对一或多种皮质类固醇、 环磷酰胺和硫唑嘌呤治疗无反应。.
7. 权利要求1的方法，其中所述气雾剂化干扰素以大约250至750pg的 剂量施用，每周三次。
8. 权利要求1的方法，其中所述气雾剂化干扰素以大约500pg的剂量施 用，每周三次。
9. 权利要求1的方法，其中所施用的气雾剂化干扰素的量经过计算和优化。
10. 权利要求1的方法，其中所述施用引起干扰素在肺病患者的肺部沉积。
11. 权利要求1的方法，其中所述施用引起肺功能测试的改善。
12. 权利要求1的方法，其中所述干扰素是干扰素a。
13. 权利要求1的方法，其中所述干扰素是干扰素P。
14. 权利要求1的方法，其中所述干扰素是干扰素Y。
15. —种治疗换肺病的病人的方法，包括与治疗有效量的免疫抑制剂或 抗炎剂组合输送治疗有效量的气雾剂化干扰素。
16. 权利要求15的方法，其中所述免疫抑制剂或抗炎剂选自如下一组 皮质类固醇、硫唑嘌呤和环磷酰胺。
17. 权利要求15的方法，其中所述肺病是阻塞性肺病。
18. 权利要求15的方法，其中所述肺病是特发性肺纤维变性。
19. 权利要求15的方法，其中所述肺病是哮喘。
20. 权利要求15的方法，其中所述疾病改善至相对于治疗前预测的FVC 值增加至少10%。
21. 权利要求15的方法，其中所述患肺病的个体对一或多种皮质类固 醇、环磷酰胺和硫唑嘌呤治疗无反应。
22. 权利要求15的方法，其中所述气雾剂化干扰素以大约250至750pg 的剂量施用，每周三次。
23. 权利要求15的方法，其中所述气雾剂化干扰素以大约500Mg的剂量 施用，每周三次。
24. 权利要求15的方法，其中所施用的气雾剂化干扰素的量经过计算和 优化。
25. 权利要求15的方法，其中所述施用引起干扰素在肺病患者的肺部沉积。
26. 权利要求15的方法，其中所述施用引起肺功能测试的改善。
27. 权利要求15的方法，其中所述干扰素是干扰素(x。
28. 权利要求15的方法，其中所述干扰素是干扰素|3。
29. 权利要求15的方法，其中所述干扰素是干扰素Y。
30. —种治疗患肺病的病人的药物组合物，其包含治疗有效量的气雾剂 化干扰素。
31. 权利要求30的药物组合物，进一步包含一种免疫抑制剂或抗炎剂。
32. 权利要求30的药物组合物，其中所述免疫抑制剂或抗炎剂选自如下 一组皮质类固醇、硫唑嘌呤和环磷酰胺。
33. 权利要求30的药物组合物，其中所述肺病是阻塞性肺病。
34. 权利要求30的药物组合物，其中所述肺病是特发性肺纤维变性。
35. 权利要求30的药物组合物，其中所述肺病是哮喘。
36. 权利要求30的药物组合物，其中所述患肺病的个体对一或多种皮质 类固醇、环磷酰胺和硫唑嘌呤治疗无反应。.
37. 权利要求30的药物组合物，其中所述干扰素是干扰素a。
38. 权利要求30的药物组合物，其中所述干扰素是干扰素卩。
39. 权利要求30的药物组合物，其中所述干扰素是干扰素Y。
全文摘要
本发明提供了一种治疗肺病如特发性肺纤维变性(IPF)和哮喘的方法，包括施用治疗有效量的气雾剂化干扰素例如干扰素α、干扰素β或干扰素γ。本发明同时也提供了一种或多种气雾剂化干扰素的药物组合物。
文档编号A61K38/21GK101378774SQ200580052105
公开日2009年3月4日 申请日期2005年9月20日 优先权日2005年9月20日
发明者G·斯马尔多内, R·康多斯 申请人:纽约大学;纽约州立大学研究基金会