专利名称：一种重组人红细胞生成素溶液制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种红细胞生成素(EPO)，特别是涉及一种重组人红细胞生成素(rhEPO)的溶液制剂。
背景技术：
红细胞生成素是一种调节红细胞生成的多肽类激素，90％由肾脏产生。重组人红细胞生成素与天然的红细胞生成素的结构及生理作用均相同，在临床上已经广泛应用于肾性贫血、外科围手术期的红细胞动员以及肿瘤化疗引起的贫血等。
人血白蛋白是一种血液制品，由健康人的血浆经低温蛋白分离等方法提取，并经灭活病毒后制成的制剂。人血白蛋白因为自身的特点，如刚架结构、稳定性好、生物兼容性好、强的结合能力、能够对其他药物起到缓释作用，常被用作药物，尤其是重组蛋白药物的辅料，可以防止蛋白药物的聚集、修饰和降解，并可显著减少其它稳定剂的用量。目前市场上的重组人红细胞生成素制剂产品普遍采用的是以人血白蛋白为辅料的制剂配方。例如，美国安进公司(Amgen)的重组人红细胞生成素注射液(商品名Epogen)、华北制药金坦生物技术股份有限公司的重组人红细胞生成素注射液(商品名济脉欣)均采用血源白蛋白作为稳定剂。
由于血源白蛋白原料来源于人血，虽然世界卫生组织(WHO)、美国食品和药物管理局(FDA)、人用药物注册技术要求国际协调会议(ICH)以及中国国家食品药品监督管理局(SFDA)等对血液制品及其生产原料、过程均有严格规定，但是作为血液制品，不可避免地存在着潜在的病毒污染问题(如肝炎病毒、爱滋病毒等)。另外，血源白蛋白还存在周期性货源短缺的问题。因此，研究人员一直在寻找能代替人血白蛋白的稳定剂。
发明内容
与血源白蛋白(pHSA)相比，重组人血白蛋白(rHSA)的化学均一程度更高。从血浆纯化制备的白蛋白在糖基化、脂肪含量以及结合的小分子配基方面批间差异很大(Day，et al.，″Nonenzymatically Glucosylated Albumin″，The Journalof Biological Chemistry，vol.254，No.3,pp.595-597，Feb.10，1979.)，而rHSA则不存在这些问题。同时，rHSA中二聚体及寡聚体含量远低于pHSA中的聚体含量。所以，重组人血白蛋白是化学成分更为均一、成分更为明确的蛋白质，在保持蛋白药物的生理活性方面，具有血源白蛋白不可比拟的优势。
本发明利用重组人血白蛋白作为重组人红细胞生成素的稳定剂，解决了血源白蛋白可能带来的病原体污染以及周期性货源短缺的问题。本发明以血源白蛋白及重组人血白蛋白为辅料制备重组人红细胞生成素溶液制剂。在不同的环境温度下(37℃、25℃、2-8℃)放置3-24个月，与pHSA相比，以rHSA为稳定剂制备的rhEPO在体内外均表现出了更高的活性，而且rHSA在rhEPO溶液制剂中保持了比pHSA更高的纯度和稳定性。
图1rhEPO在37℃环境下放置3个月的体外活性检测结果；图2rhEPO在37℃环境下放置3个月的体内活性检测结果；
图3rhEPO在25℃环境下放置15个月的体外活性检测结果；图4rhEPO在25℃环境下放置15个月的体内活性检测结果；图5rhEPO在2-8℃环境下放置24个月的体外活性检测结果；图6rhEP0在2-8℃环境下放置24个月的体内活性检测结果；图1-图6中， 2.5mg/ml rHSA 4.0mg/ml rHSA 2.5mg/ml pHSA。
具体实施例方式
实施例rhEPO原液由华北制药金坦生物技术股份有限公司提供rHSA由华北制药集团新药研究开发有限责任公司提供pHSA购自上海莱士血制品有限公司酶联免疫测定仪microplate reader(Molecular Device，USA)(型号VERSAmax)高压液相Waters HPLC高压液相系统(996光电二极管阵列检测器)实施例1含rHSA的3000IU/ml rhEPO的配制配方成分浓度 用量rhEP0 3000IU/ml 165mlrHSA2.5mg/ml 137.5ml柠檬酸钠、氯化 柠檬酸钠20mmol/L、氯化钠10697．5ml钠缓冲液100mmol/L(调pH至6.9)
10000支量取rhEPO原液(2.0×105IU/ml)165ml，加入rHSA(200mg/ml)137.5ml，加柠檬酸钠、氯化钠缓冲液10697.5ml。充分混匀后，无菌过滤到灭菌的容器中，即为rhEPO的半成品。
然后将半成品溶液灌装至3ml西林瓶，每瓶加入1.1ml。最后加塞、轧盖、贴签，制成3000IU/支的rhEPO注射液。
实施例2含rHSA的1500IU/ml rhEPO的配制配方成分 含量 用量rhEPO 1500IU/ml 82.5mlrHSA 2.5mg/ml 137.5ml柠檬酸钠、氯化 柠檬酸钠20mmol/L、氯化钠10780ml钠缓冲液100mmol/L(调pH至6.9)
10000支量制备方法同实施例1实施例3含rHSA的6000IU/ml rhEPO的配制配方成分 含量用量rhEPO 6000IU/ml 330mlrHSA 4.0mg/ml220ml柠檬酸钠、氯化 柠檬酸钠20mmol/L、氯化钠10450ml钠缓冲液100mmol/L(调pH至6.9)
10000支量制备方法同实施例1实施例4 含pHSA的3000IU/ml rhEPO的配制配方成分含量 用量rhEPO 3000IU/ml165mlpHSA2.5mg/ml 137.5ml柠檬酸钠、氯化 柠檬酸钠20mmol/L、氯化钠10697.5ml钠缓冲液100mmol(调pH至6.9)
10000支量取rhEPO原液(2.0×105IU/ml)165ml，加入pHSA(200mg/ml)137.5ml，加柠檬酸钠、氯化钠缓冲液10697.5ml。充分混匀后，无菌过滤到灭菌的容器中，即为rhEPO的半成品。
然后将半成品溶液灌装至3ml西林瓶，每瓶加入1.1ml。最后加塞、轧盖、贴签，制成3000IU/支的rhEPO注射液。
实验例实验例1rhEPO活性检测为了确证在储存期内生物制品的质量稳定，应将至少三批试制品存放于不同条件下进行稳定性考察，一般存放条件包括2～8℃、室温、37℃(《生物技术药物研究开发和质量控制》，王军志主编，科学出版社，2002年，第173页)。将样品在37℃、25℃、2-8℃的环境条件下分别放置3个月、15个月和24个月。检测各批次rhEPO的体内、体外活性(《中国生物制品规程》2000年版，重组人红细胞生成素制造及检定规程，第399-408页)，考察rHSA对rhEPO生物学活性的影响。
根据实施例1的溶液制剂，以及rHSA含量4.0mg/ml、pHSA含量2.5mg/ml的3000IU/ml规格的rhEPO(参照实施例1制备)，将三个批次的体内外活性检测结果取平均值做图(见说明书附图1-6)。结果显示，rHSA与rhEPO配伍良好。在相同保存温度和保存时间的条件下，与2.5mg/ml的pHSA相比，以2.5mg/ml和4.0mg/ml的rHSA作辅料，都可以更有效地保持rhEPO的体内外活性，尤其是rHSA2.5mg/ml的作用明显优于pHSA2.5mg/ml。
实验例2rHSA稳定性检测实施例1和实施例4制备的3000IU/ml规格的rhEPO，分别放置于37℃、25℃、2-8℃的环境中，定期用分子筛高压液相层析(SEC-HPLC，Superdex200 HR10/30)检测rhEPO溶液制剂中的rHSA和pHSA纯度，考察制剂中rHSA和pHSA的稳定性。结果表明，rHSA在rhEPO溶液制剂中可保持比pHSA更高的纯度，具有良好的稳定性。检测结果见表1。
稳定性检测方法仪器Waters HPLC系统(996光电二极管阵列检测器)色谱柱Superdex200 HR10/30(Amersham Biosciences，Sweden)流动相100mmol/L PB，pH7.0流速0.5ml/min上样量50μl检测波长280nm
表1 rhEPO溶液制剂中的HSA纯度(％)
发明人对实施例2和实施例3制备的1500IU/ml、6000IU/ml的rhEPO溶液制剂也按实验例1和实验例2进行了同样的实验。实验结果一致，重组人血白蛋白在rhEPO溶液制剂中保持比血源白蛋白(参照实施例4同样可以制备1500IU/ml、6000IU/ml的含血源白蛋白的rhEPO)更高的纯度，稳定性也更好。
权利要求
1.一种重组人红细胞生成素溶液制剂，含有重组人红细胞生成素和重组人血白蛋白。
2.权利要求1的溶液制剂，其中重组人血白蛋白含量为2.5-4.0mg/ml。
3.权利要求2的溶液制剂，其中重组人血白蛋白含量为2.5mg/ml。
4.权利要求2的溶液制剂，其中重组人血白蛋白含量为4.0mg/ml。
5.权利要求1的溶液制剂，还含有柠檬酸钠、氯化钠缓冲液。
6.权利要求1至5任一所述的溶液制剂，为注射剂。
全文摘要
本发明涉及一种重组人红细胞生成素的溶液制剂。该制剂由重组人红细胞生成素、重组人血白蛋白以及柠檬酸钠、氯化钠缓冲液组成，可用于肾性贫血、外科围手术期的红细胞动员以及肿瘤化疗引起的贫血等。
文档编号A61K9/08GK101015684SQ20061001239
公开日2007年8月15日 申请日期2006年2月10日 优先权日2006年2月10日
发明者魏敬双, 李梅彦, 贾茜, 姜扬, 贺建功, 任乐民, 程立均, 周兴军 申请人:华北制药集团新药研究开发有限责任公司