专利名称：大黄素、芦荟大黄素提取方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于中药技术领域，特别涉及一种从大黄中提取大黄素和芦荟大黄素的方法及大黄素和芦荟大黄素在抗脑缺血损伤方面的应用。
背景技术：
蓼科植物大黄或其他变种的植物根茎中含有大黄素、芦荟大黄素。大黄素异名朱砂莲甲素(Frangula emodin，Rheum emodin，Archin，Frangulic acid)，化学名9，10-Anthracenedione，1，3，8-thihydroxy-6-methyl，结构式为 分子式为C15H10O5，分子量270.33；为橙色针状结晶(乙醇或12毫米以下减压升华)，熔点256-257℃，几乎不溶于水，溶于乙醇及碱溶液。其植物来源为廖科植物掌叶大黄根茎、齿果酸模、齿果酸模根和叶、皱叶酸模的根、羊蹄根、杠板归根和根茎、豆科植物决明新鲜种子、望江南根。芦荟大黄素异名芦荟泻素(Rhabarberone)，化学名9，10-Anthracenedione，1，8-dihydroxy-3-(hydroxymethyl)，结构式为 分子式为C15H10O5，分子量270.23；为橙色针状结晶(甲苯)，熔点223-224℃，易溶于热乙醇，在乙醚及苯中呈黄色、氨水及硫酸中呈绯红色。其植物来源为廖科植物掌叶大黄根茎、药物大黄根茎、巴天酸模根、齿果酸模叶、决明种子、望江南种子、豆科植物山扁豆根、鼠李科植物鼠李的果实。
药理研究表明，大黄素(1)体外可抑制金黄色葡萄球菌、白喉杆菌、枯草杆菌、大肠杆菌等各种细菌、还可抑制胃幽门螺杆菌。(2)可抑制不同有丝分裂原(Con A，LPS)刺激的小鼠脾细胞增殖反应；抑制Con A诱导脾细胞IL2的产生，其抑制作用与大黄素的浓度成正比。(3)30mg/kg于家兔灌胃有利尿作用。(4)体外对艾氏腹水癌细胞的50％的抑制浓度为20mg/kg。(5)42mg/kg连续7天于小鼠腹腔注射，使肝微粒体细胞色素瘤的抑制率为75％[15]；10ug/kg的浓度对肺癌A-549细胞的分裂和DNA的生物合成有抑制作用；42mg/kg连续7天小鼠腹腔注射，使肝微粒体细胞色素P-450含量较对照组下降41.7％；使戊巴比妥钠诱导的小鼠睡眠时间比对照组延长18.7％。(6)对淋巴细胞外钙内流有明显的促进作用，对淋巴细胞免疫功能有抑制作用；也可促进细胞内钙释放。(7)100mg/kg给大鼠腹腔注射，可使肠梗阻所致肠粘膜降低了的组胺水平恢复到正常。(8)体外18.5umol/L可使NE和高钾诱导的主动脉条收缩的量效曲线左移，可能与钙激动作用有关，92.5umol/L可抑制主动脉条的收缩作用是量效曲线右移，可能与大黄素络合钙离子作用有关。(9)可抑制正常动脉硬化的动脉及球囊损伤动脉壁血管平滑肌细胞增殖，主要机制为抑制细胞从G0期向G5期转化，并呈剂量相关性。(10)在5×10-7-5×10-5mol/L浓度范围内，可抑制大鼠腹腔巨嗜细胞白三烯的生物合成，量效关系明显。(11)将大黄素纯品直接加入细胞培养液可抑制细胞增殖，25mg/L可抑制肾小管原癌基因mRNA的表达；还可抑制平滑肌细胞增殖。芦荟大黄素(1)体外可抑制金黄色葡萄球菌、链球菌、白喉杆菌、枯草杆菌、大肠杆菌等各种细菌、对胃幽门螺杆菌有抑制生长作用。(2)70mg/kg连续7天腹腔注射于小鼠，对免疫系统有不同程度的抑制作用。(3)为一种强的平滑肌细胞抑制剂，对平滑肌细胞有抑制作用，呈剂量依赖关系。
发明内容
本发明目的在于提供一种从大黄中提取大黄素、芦荟大黄素的方法及大黄素、芦荟大黄素在制备抗脑缺血损伤药物方面的应用。
为达上述目的，本发明采用如下技术方案从大黄中提取大黄素、芦荟大黄素的方法，依次包括如下步骤(1)取大黄药材粉碎，加乙醇水溶液浸泡、加热回流提取，提取液滤过、回收乙醇得浸膏；(2)浸膏用无机酸水溶液水解，酸水液滤过去渣；(3)去渣酸水液通过聚酰胺层析柱，用乙醇水溶液洗脱除去杂质，继用乙醇与丙酮混合液梯度洗脱，分段收集洗脱液，回收溶剂，浓缩至干，分别得到芦荟大黄素、大黄素；或者，去渣酸水液用三氯甲烷提取，提取液回收三氯甲烷至近干，通过硅胶层析柱，用乙酸乙酯与丙酮混合液梯度洗脱，分段收集洗脱液，减压回收溶剂至干，分别得到芦荟大黄素、大黄素。
步骤(1)中粉碎后的大黄药材加药材重量6-16倍的重量百分比浓度40％-80％的乙醇水溶液常温浸泡0.5-4小时，加热回流提取3-6次，每次0.5-3小时，滤过，减压回收乙醇得浸膏。
步骤(2)中浸膏用其重量5-20倍的重量百分比浓度5％-20％的无机酸水溶液水浴加热水解0.5-1.5小时，酸水液滤过去渣。
步骤(3)中去渣酸水液通过聚酰胺层析柱，用4-12倍层析柱体积的重量百分比浓度10％-50％乙醇水溶液洗脱除去杂质，继用重量百分比浓度60％-95％乙醇水溶液与丙酮混合液梯度洗脱，乙醇水溶液与丙酮体积比为1∶30～30∶1，分段收集洗脱液，减压回收溶剂，浓缩至干，分别得到芦荟大黄素、大黄素；或者，去渣酸水液用三氯甲烷提取3-6次，减压回收三氯甲烷至近干，通过硅胶层析柱，用乙酸乙酯与丙酮混合液梯度洗脱，乙酸乙酯与丙酮体积比为1∶20～20∶1，分段收集洗脱液，减压回收溶剂至干，分别得到芦荟大黄素、大黄素。
大黄素、芦荟大黄素在制备抗脑缺血损伤药物方面的应用，以大黄素或者芦荟大黄素为有效成分。
本发明以在国内广泛种植的大黄药材为原料，原料价廉易得；以乙醇水溶液作为提取溶剂进行提取，原料成本低，提取效果好，且生产过程中无三废产生，环保效益好；提取并经无机酸(盐酸或者硫酸)水解后采用层析纯化，所得提取物中大黄素、芦荟大黄素含量高，可达80-98％。
下面通过大黄素、芦荟大黄素抗脑缺血损伤的动物实验研究证明大黄素、芦荟大黄素的抗脑缺血损伤作用[材料与方法]
(1)实验材料SD大鼠，3～4月龄，90只，雌雄各半，体重300±50g，由河南省实验动物中心提供(编号2003LA-130，合格证号0001012号)。大黄素、芦荟大黄素注射剂(均由河南中医学院药物分析学学科提供)，川芎嗪注射液(山东潍坊制药有限公司；规格2ml，40mg；批号030314)。
(2)分组与处理大鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组、川芎嗪组、大黄素组，芦荟大黄素组，其中后2组又各分为低、中、高3个剂量组。每组10只大鼠。各组大鼠均于造模前3天腹腔注射用药川芎嗪注射液(7.2mg·kg-1·d-1)、大黄素(1.40mg·kg-1·d-1、2.80mg·kg-1·d-1、5.60mg·kg-1·d-1)，芦荟大黄素(0.04mg·kg-1·d-1、0.08mg·kg-1·d-1、0.16mg·kg-1·d-1)，每日用药一次，造模前2h加用药一次。注射液体积为1ml/100g，假手术组和模型组分别腹腔注射同等体积的生理盐水。所有实验大鼠均于术前12h禁食不禁水。造模后6h依神经症状八级评分标准进行评分。
(3)模型制备采用改良的Longa法制备局灶性脑缺血模型(MCAO)，假手术组不插入栓线。实验过程中保持大鼠肛温(37.0±0.5)℃、室温(26±1)℃。
(4)取材与样品制备术后6小时冰盘上取出全脑，用冷生理盐水(4℃)冲洗3遍，除去积血，用滤纸吸去表面水份，去除嗅球、小脑和脑干。于冰盘上迅速分离大脑半球，取左侧半球，从额极向后4mm处冠状切取脑组织3mm，待侧脑组织含水量；再向后冠状切取脑组织2mm，放入2％四氮唑，进行TTC染色，待测脑梗塞面积。
(5)观察指标①神经症状评分。造模后6h观察大鼠神经症状体征，参照评分标准进行评分，记录分值；②脑组织含水量测定。切取的用于测定含水量的脑组织迅速用电子天平称取湿重(精确度为0.1mg)后放入干燥箱中干燥(100℃±2℃)，24h后称取干重。计算公式脑组织含水量＝(脑湿重-脑干重)/脑湿重×100；③脑梗塞面积测定。切取脑组织2mm，放入2％四氮唑，37℃水浴锅温孵30min后放入10％甲醛溶液，15min后取出脑组织，数码相机分别对脑片额侧和枕侧进行拍照，应用计算机软件测定脑组织梗塞面积与相应侧总面积，计算面积比值。计算公式面积比值＝梗塞面积/总面积。
(6)统计学处理数据用SPSS 11.0统计分析软件处理。计量资料以(x)±标准差(s)表示，进行单因素方差分析。
(1)神经症状评分脑缺血大鼠的神经症状评分增高(5.75±0.57)；大黄素高(4.50±0.52)、中(3.90±0.99)、低(2.70±0.48)剂量组大鼠的神经症状评分降低；芦荟大黄素高(3.10±0.73)、中(4.30±0.48)、低(5.20±0.91)剂量组的神经症状评分降低；其中大黄素低剂量组(1.40mg·kg-1·d-1)和芦荟大黄素高剂量组(0.16mg·kg-1·d-1)降低尤为显著。
(2)脑组织含水量脑缺血大鼠脑组织含水量明显增高(83.42±1.50)；大黄素高(80.98±4.31)、中(79.11±1.22)、低(76.55±1.08)剂量组大鼠的脑组织含水量明显降低；芦荟大黄素高(76.86±1.43)、中(81.75±1.22)、低(83.02±1.39)剂量组的脑组织含水量降低；其中大黄素低剂量组(1.40mg·kg-1·d-1和芦荟大黄素高剂量组(0.16mg·kg-1·d-1)降低尤为显著。
(3)脑梗塞面积脑缺血大鼠脑梗塞面积明显增高(34.87±1.33)；大黄素高(32.90±2.92)、中(32.75±1.24)、低(27.70±1.28)剂量组大鼠的脑梗塞面积明显降低；芦荟大黄素高(29.00±1.59)、中(30.95±1.10)、低(33.33±1.67)剂量组的脑梗塞面积降低；其中大黄素低剂量组(1.40mg·kg-1·d-1)和芦荟大黄素高剂量组(0.16mg·kg-1·d-1)脑梗塞面积降低尤为显著。
通过研究，我们发现从大黄中提取的大黄素、芦荟大黄素可以改善脑缺血后的神经症状，减轻脑组织水肿，减小脑梗塞面积，对缺血性脑损伤具有明显的保护作用，其中以大黄素低剂量(1.40mg·kg-1·d-1)和芦荟大黄素高剂量(0.16mg·kg-1·d-1)对脑缺血损伤的保护作用尤为明显。
从大黄中提取的大黄素、芦荟大黄素可以改善脑缺血后的神经症状，减轻脑组织水肿，减小脑梗塞面积，对缺血性脑损伤具有明显的保护作用，其中以大黄素低剂量(1.40mg·kg-1·d-1)和芦荟大黄素高剂量(0.16mg·kg-1·d-1)对脑缺血损伤的保护作用尤为明显。结合目前脑缺血的治疗研究进展和大黄素、芦荟大黄素的研究现状，本发明关于大黄素及芦荟大黄素的提取方法以及所提取的大黄素及芦荟大黄素在抗缺血性脑损伤方面的研究结果，为临床治疗脑缺血及其他缺血性脑血管疾病的防治提供了直接依据。
具体实施例方式
实施例1、从大黄中提取大黄素、芦荟大黄素的方法，取大黄药材，粉碎为粗粉，加药材重量10倍的重量百分比浓度60％的乙醇水溶液常温浸泡2小时，加热回流提取4次，每次1小时，滤过，减压回收乙醇得浸膏；(2)浸膏用其重量10倍的重量百分比浓度15％的盐酸水溶液水浴加热水解1小时，酸水液滤过去渣；(3)去渣酸水液用等量三氯甲烷提取4次，减压回收三氯甲烷至近干，通过硅胶层析柱，用乙酸乙酯与丙酮混合液(体积比1∶20～1∶1)洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂至干，得到芦荟大黄素；用乙酸乙酯与丙酮混合液(体积比1∶1～20∶1)洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂至干，得到大黄素、芦荟大黄素。
实施例2、从大黄中提取大黄素、芦荟大黄素的方法，取大黄药材，粉碎为粗粉，加药材重量12倍的重量百分比浓度70％的乙醇水溶液常温浸泡4小时，加热回流提取3次，每次40分种，滤过，减压回收乙醇得浸膏；(2)浸膏用其重量8倍的重量百分比浓度20％的硫酸水溶液水浴加热水解40分种，酸水液滤过去渣；(3)去渣酸水液通过聚酰胺层析柱，用30％乙醇洗脱除去杂质，继用80％乙醇与丙酮(体积比1∶30～1∶1)混合液洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂，浓缩至干，得到芦荟大黄素，继用80％乙醇与丙酮(体积比1∶1～30∶1)混合液洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂，浓缩至干，得到大黄素、芦荟大黄素。
实施例3、从大黄中提取大黄素、芦荟大黄素的方法，取大黄药材，粉碎为粗粉，加药材重量8倍的重量百分比浓度50％的乙醇水溶液常温浸泡3小时，加热回流提取5次，每次30分种，滤过，减压回收乙醇得浸膏；(2)浸膏用其重量6倍的重量百分比浓度15％的硫酸水溶液水浴加热水解50分种，酸水液滤过去渣；(3)去渣酸水液通过聚酰胺层析柱，用40％乙醇洗脱除去杂质，继用70％乙醇与丙酮(体积比1∶30～1∶1)混合液洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂，浓缩至干，得到芦荟大黄素；继用70％乙醇与丙酮(体积比1∶1～30∶1)混合液洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂，浓缩至干，得到大黄素、芦荟大黄素。
实施例4、从大黄中提取大黄素、芦荟大黄素的方法，取大黄药材，粉碎为粗粉，加药材重量6倍的重量百分比浓度40％的乙醇水溶液常温浸泡3小时，加热回流提取5次，每次30分种，滤过，减压回收乙醇得浸膏；(2)浸膏用其重量6倍的重量百分比浓度15％的硫酸水溶液水浴加热水解50分种，酸水液滤过去渣；(3)去渣酸水液通过聚酰胺层析柱，用40％乙醇洗脱除去杂质，继用70％乙醇与丙酮(体积比1∶30～1∶1)混合液洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂，浓缩至干，得到芦荟大黄素；继用70％乙醇与丙酮(体积比1∶1～30∶1)混合液洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂，浓缩至干，得到大黄素、芦荟大黄素。
实施例5、从大黄中提取大黄素、芦荟大黄素的方法，取大黄药材，粉碎为粗粉，加药材重量16倍的重量百分比浓度80％的乙醇水溶液常温浸泡3小时，加热回流提取5次，每次30分种，滤过，减压回收乙醇得浸膏；(2)浸膏用其重量6倍的重量百分比浓度15％的硫酸水溶液水浴加热水解50分种，酸水液滤过去渣；(3)去渣酸水液通过聚酰胺层析柱，用40％乙醇洗脱除去杂质，继用70％乙醇与丙酮(体积比1∶30～1∶1)混合液洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂，浓缩至干，得到芦荟大黄素；继用70％乙醇与丙酮(体积比1∶1～30∶1)混合液洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂，浓缩至干，得到大黄素、芦荟大黄素。
实施例6、大黄素在制备抗脑缺血损伤药物方面的应用，以其制备大黄素注射剂。制法提取所得大黄素用乙醇溶解，缓缓加入丙三醇液中，搅拌均匀后，加注射用水至近总量时，用重量百分比浓度1％的氢氧化钠水溶液调PH值至3.5～4.5，加入注射用水至总量，混合均匀，0.45μm微孔滤膜滤过，通氮气灌封于2ml安瓿中，100℃灭菌30min，即得。规格2ml；组成大黄素50mg、8％乙醇、20％丙三醇、蒸馏水；用法用量每日一次，每次1支，肌肉注射。
实施例7、大黄素在制备抗脑缺血损伤药物方面的应用，以其制备大黄素片。制法提取所得大黄素粉碎成细粉，加淀粉、硬脂酸镁、滑石粉混合均匀，制成颗粒，压片，包薄膜衣，即得。规格0.25g；组成芦荟大黄素20mg、淀粉0.2g、硬脂酸镁0.02g、滑石粉适量；用法用量口服，一日3次，每次1片。
实施例8、芦荟大黄素在制备抗脑缺血损伤药物方面的应用，以其制备芦荟大黄素胶囊。制法提取所得芦荟大黄素粉碎成细粉，加淀粉、滑石粉混合均匀，制成颗粒，干燥后装入胶囊壳，即得。规格0.15g；组成芦荟大黄素0.5mg、淀粉0.14g、滑石粉适量；用法用量口服，一日3次，每次1粒。
实施例9、芦荟大黄素在制备抗脑缺血损伤药物方面的应用，以其制备芦荟大黄素注射剂。制备方法提取所得芦荟大黄素用乙醇溶解，缓缓加入丙三醇液中，搅拌均匀后，加注射用水至近总量时，用重量百分比浓度1％的氢氧化钠水溶液调PH值至3.5～4.5，加入注射用水至总量，混合均匀，0.45μm微孔滤膜滤过，通氮气灌封于2ml安瓿中，100℃灭菌30min，即得。规格1ml；组成芦荟大黄素1mg、5％乙醇、10％丙三醇、蒸馏水；用法用量每日一次，每次1支，肌肉注射。
权利要求
1.从大黄中提取大黄素、芦荟大黄素的方法，其特征在于，依次包括如下步骤(1)取大黄药材粉碎，加乙醇水溶液浸泡、加热回流提取，提取液滤过、回收乙醇得浸膏；(2)浸膏用无机酸水溶液水解，酸水液滤过去渣；(3)去渣酸水液通过聚酰胺层析柱，用乙醇水溶液洗脱除去杂质，继用乙醇与丙酮混合液梯度洗脱，分段收集洗脱液，回收溶剂，浓缩至干，分别得到芦荟大黄素、大黄素；或者，去渣酸水液用三氯甲烷提取，提取液回收三氯甲烷至近干，通过硅胶层析柱，用乙酸乙酯与丙酮混合液梯度洗脱，分段收集洗脱液，减压回收溶剂至干，分别得到芦荟大黄素、大黄素。
2.如权利要求1所述的从大黄中提取大黄素、芦荟大黄素的方法，其特征在于，步骤(1)中粉碎后的大黄药材加药材重量6-16倍的重量百分比浓度40％-80％的乙醇水溶液常温浸泡0.5-4小时，加热回流提取3-6次，每次0.5-3小时，滤过，减压回收乙醇得浸膏。
3.如权利要求1或2所述的从大黄中提取大黄素、芦荟大黄素的方法，其特征在于，步骤(2)中浸膏用其重量5-20倍的重量百分比浓度5％-20％的无机酸水溶液水浴加热水解0.5-1.5小时，酸水液滤过去渣。
4.如权利要求3所述的从大黄中提取大黄素、芦荟大黄素的方法，其特征在于，步骤(3)中去渣酸水液通过聚酰胺层析柱，用4-12倍层析柱体积的重量百分比浓度10％-50％乙醇水溶液洗脱除去杂质，继用重量百分比浓度60％-95％乙醇水溶液与丙酮混合液梯度洗脱，乙醇水溶液与丙酮体积比为1∶30～30∶1，分段收集洗脱液，减压回收溶剂，浓缩至干，分别得到芦荟大黄素、大黄素；或者，去渣酸水液用三氯甲烷提取3-6次，减压回收三氯甲烷至近干，通过硅胶层析柱，用乙酸乙酯与丙酮混合液梯度洗脱，乙酸乙酯与丙酮体积比为1∶20～20∶1，分段收集洗脱液，减压回收溶剂至干，分别得到芦荟大黄素、大黄素。
5.大黄素、芦荟大黄素在制备抗脑缺血损伤药物方面的应用，其特征在于，以大黄素或者芦荟大黄素为有效成分。
全文摘要
从大黄中提取大黄素、芦荟大黄素的方法，依次包括如下步骤(1)取大黄药材粉碎，加乙醇水溶液浸泡、加热回流提取，提取液滤过、回收乙醇得浸膏；(2)浸膏用无机酸水溶液水解，酸水液滤过去渣；(3)去渣酸水液通过聚酰胺层析柱，用乙醇水溶液洗脱除去杂质，继用乙醇与丙酮混合液梯度洗脱，分段收集洗脱液，回收溶剂，浓缩至干，分别得到芦荟大黄素、大黄素；或者，去渣酸水液用三氯甲烷提取，提取液回收三氯甲烷至近干，通过硅胶层析柱，用乙酸乙酯与丙酮混合液梯度洗脱，分段收集洗脱液，减压回收溶剂至干，分别得到芦荟大黄素、大黄素。利用本发明得到的大黄素、芦荟大黄素可用于制备抗脑缺血损伤药物。
文档编号A61P9/10GK1887837SQ20061001774
公开日2007年1月3日 申请日期2006年4月30日 优先权日2006年4月30日
发明者李建生, 梁生旺, 郑晓珂, 刘敬霞, 刘轲 申请人:河南中医学院