专利名称：一种治疗早老性痴呆的药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及药用化合物，特别涉及抗早老性痴呆药物。
背景技术：
早老性痴呆(AlzheimerDisease, AD)是一种常见的神经退行性疾病，其主要症状表现 为记忆力减退，认知能力低下和思维迟钝，且进行性加重，最后生活不能自理而死亡，病程 一般8 10年。随着社会老龄化进程的加快，AD的患病人数急剧上升，已成为威胁老龄特 别是高龄人口身心健康的严重疾病，并带来了严重的社会、经济和家庭问题。
AD病人主要脑病理改变是形成大量神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles, NFTs)和 大量老年斑、其分子标志物分别是异常磷酸化的tau蛋白和beta-淀粉样蛋白(A-beta)。 NFTs 的数量与AD临床痴呆程度正相关。因此，干预NFTs对AD的防治尤为重要。自从发现 NFTs的主要成分是异常、过度磷酸化的tau蛋白聚集形成的双螺旋丝以来，国内外学者普 遍公认，骨架蛋白tau的异常、过度磷酸化是NFTs形成的关键步骤。过度磷酸化tau蛋白 的聚集不仅以缠结的形式存在，它也是神经毡纤丝和老年斑中的营养不良突起的主要成分。 因此，利用异常过度磷酸化的tau蛋白、A-beta聚积形成的老年斑和记忆障碍作为药效评价 指标，对开发AD新药有重要意义。
到目前为止，国外唯一得到FDA批准的抗早老性痴呆的药物是他克林及其改良产品。 该类药物价格昂贵，且他克林的肝脏毒性强，因此，很难在临床推广应用。此外，由于他 克林类药物是针对改善胆碱能神经功能而设计的，而胆碱能神经功能损伤不是早老性痴呆 患者的特征性病理改变或机制。因此，本发明人利用同时体现早老性痴呆样tau蛋白和beta-淀粉样蛋白异常和学习记忆障碍的大鼠模型，开展了对中药有效成分的筛选和研究工作。 发现脱氫吴茱萸碱在早老性痴呆模型中可有效预防和逆转tau蛋白异常磷酸化、beta-淀粉样 蛋白异常沉积以及学习记忆障碍。
本发明的目的旨在针对早老性痴呆患者特异性脑病理改变(即A-beta沉积形成老年斑 和tau蛋白异常磷酸化聚积)以及行为学改变(即学习记忆障碍)，提供一种或多种来源于 中药的生物碱，该生物碱对早老性痴呆样tau蛋白、A-beta和学习记忆异常有针对性预防 和逆转作用。
他克林类药物是针对改善胆碱能神经功能而设计的，而胆碱能神经功能损伤不是早老性
痴呆患者的特征性病理改变或机制。
发明内容
本发明的任务是提供一种治疗早老性痴呆的药物，使其具有能够对抗早老性痴呆患者特 征性病理改变，能够明显减少早老性痴呆的老年斑数量，使磷酸化的tau蛋白水平明显降低， 使学习记忆障碍得到明显改善等特点，能够用于早老性痴呆的预防和治疗。
本发明提供的这种治疗早老性痴呆的药物是脱氢吴茱萸碱。
脱氢吴茱萸碱是如式(I)所示的化合物
上式中，X —表示阴离子，该阴离子可以是
(1) 卤素离子，如氟离子、氯离子、溴离子、碘离子等；或
(2) 源于无机酸的阴离子，如硝酸根离子、硫酸根离子、磷酸根离子、碳酸根离子等；
或
(3) 源于有机酸的阴离子，如甲酸离子、醋酸离子、乳酸离子、谷氨酸离子等源于羧 酸的阴离子。
脱氢吴茱萸碱可按照例如J.Org.Chem.， ia ， 1246-1255(1985)中记载的化学合成方法，或 按照American Journal of Chinese Medicine W， 75-85 (1982)中记载的方法从芸香科吴茱萸 属植物(吴茱萸、楝叶吴茱萸等)等含脱氢吴茱萸碱的植物中提取。
本发明实验资料
分为3个不同剂量组进行实验，所选用的脱氢吴茱萸碱的注射剂量分别为3.125 mg/kg/day, 6. 25 mg/kg/day, 12. 5 mg/kg/day ，注射体积是2 ml，注射时间是分别为7天和 14天。具体操作步骤如下
1.尾静脉或腹腔注射给药
(1)尾静脉或腹腔给药选择雄性Wistar大鼠，固定后在清醒情况下向尾静脉或腹腔 注入脱氢吴茱萸碱药液(2 ml) 7天或14天，浓度分别为3.125 mg/kg/day, 6.25
mg/kg/day， 12. 5 mg/kg/day。然后再从侧脑室注射wortmannin和GFX复制早老性痴呆样TAU 蛋白异常过度磷酸化，A-beta过量产生和沉积以及学习记忆障碍。观察脱氢吴茱萸碱对这些 异常改变的预防作用。
(2)脑片培养给药将大鼠海马切成300pm的脑片，在含95°/。02和5%(:02的条件下培 养不同时间(30min 8h)。用CalyculinA (—种蛋白磷酸酯酶的抑制剂)复制早老性痴呆样 TAU蛋白异常过度磷酸化，用脱氢吴茱萸碱进行干预，分为3个不同剂量组进行实验，各组 所加入脱氢吴茱萸碱药液浓度分别为10pM, 100pM和20(VM。
2. Morris水迷宫训练及测试
目的通过训练及测试来判断用脱氢吴茱萸碱后模型大鼠学习记忆能力的变化。
实验所采用Morris水迷宫测试系统主要包括大鼠行为学测试系统、图象采集系统及微机
数据处理分析系统。测试用圆形水池直径120cm，高60 cm;圆柱形有机玻璃平台直径10cm，
高40 cm。大鼠在训练前2 h移入水迷宫室，并用染发剂将头颈部涂黑，涂染面积不小于3
X3cm2,以与背景形成反差。水池中水面高约45cm，室温及水温均保持在26±2°C，水以
奶粉搅浑；平台用双层白色纱布覆盖扎紧后任意放置于某一象限的中心位置，并没于水面下
约2cm。整个背景均为乳白色，以避免老鼠用视觉搜寻平台。用于指导大鼠游泳找到平台的
红色或兰色标记物分别置于平台所在象限边缘1m左右。
训练时将大鼠从任一象限1/2弧度处头面向池壁轻放于水中，其游泳图像经水面上方1.5
m处的摄像机拍摄并连接于路径追踪系统采集，最后通过微机分析，可提供潜伏期(即大鼠
从入水点起到找到平台所用的时间)、路径、搜索策略等指标，本实验选用潜伏期作为衡量
大鼠学习记忆和测试成绩的指标。每只大鼠每天在4个象限共训练4次,每次游泳时限为60s,
即在60s内未找到平台者系统自动停止记录，潜伏期记为60s，由测试者引导其上台，休息
30s后进行下一次训练。
3. 分子病理学检测
目的通过免疫印迹和免疫组化来反映造模前后以及与对照组比大鼠脑组织tau蛋白的 分子病理学变化。
(1) 免疫印迹法
颈椎脱臼断头处死大鼠，迅速取出大脑脑组织置于0-4。C 0.05MTris缓冲盐溶液(TB， pH7.0)内，快速分离双侧海马，制成10%的蛋白匀浆，在1000rmp离心5分钟，取上清， 测定蛋白含量后备用。
(2) 免疫组化法
用4%多聚甲醛磷酸缓冲盐溶液(PB〉进行心脏灌注固定脑组织，待取出脑组织后再在
上述固定液中后固定6 h，即可作振荡切片。免疫组化采用ABC法，二氨基联苯氨 (diaminobezidin， DAB)显色。
4. 统计分析
全部数据均釆用又土SD表示，利用SPSS统计软件进行统计分析。
5. 药物效果的评估
根据上述实验步骤进行操作，结果显示通过尾静脉给药7天后，两种给药剂量(6.25 mg/kg/day, 12.5 mg/kg/day)均可明显改善模型鼠的学习记忆障碍，即水迷宫测试潜伏期 明显縮短(图l);在此基础上，我们选择低药物剂量(3. 125mg/kg/day和6.25 mg/kg/day)， 延长给药时间至14天后检测，发现6.25 mg/kg/day可明显改善模型鼠的学习记忆障碍，而 3. 125mg/kg/day则无效(图2);通过尾静脉给药(6.25 mg/kg/day) 14天可明显减少早老 性痴呆样模型大鼠的老年斑数量(图3);通过尾静脉给药(6.25 mg/kg/day) 14天磷酸化 的tau蛋白显色明显变淡；磷酸化的tau蛋白水平明显降低(图4)。上述结果说明大鼠尾静 脉注射脱氢吴茱萸碱可明显改善模型大鼠的脑病理学改变和学习记忆障碍。
实验证实脱氢吴茱萸碱具有对抗早老性痴呆患者特征性病理改变的作用，能够明显减少 早老性痴呆的老年斑数量，使磷酸化的tau蛋白水平明显降低，使学习记忆障碍得到明显改 善。本发明揭示了脱氢吴茱萸碱是一种预防和治疗早老性痴呆的有效药物。
图1和图2大鼠尾静脉注射脱氢吴茱萸碱可改善模型大鼠空间学习记忆功能 水迷宫研究结果显示与模型组相比较，通过大鼠尾静脉注射脱氢吴茱萸碱(6.25 mg/kg/day， 12.5 mg/kg/day， 2 ml) 7天能明显縮短大鼠找到安全平台的时间(即潜伏期， n=15; *, p<0.05)。说明尾静脉注射两种剂量的脱氢吴茱萸碱可改善大鼠空间记忆障碍。同 时，我们还研究了通过大鼠尾静脉注射脱氢吴茱萸碱(6.25 mg/kg/day, 3. 125 mg/kg/day， 2 ml)14天的影响，发现在6. 25 mg/kg/day剂量组检测到潜伏期明显縮短(rpl5; *, p〈0. 05), 而在3.125 mg/kg/day剂量组则无改善作用。说明延长时间给药并进一步降低给药剂量可能 不能达到改善大鼠空间记忆障碍的效用。
图3大鼠尾静脉注射脱氢吴茱萸碱明显减少模型大鼠的老年斑
用4%多聚甲醛磷酸缓冲盐溶液进行心脏灌注固定脑组织，取出脑组织后再在上述固定
液中后固定6h,作振荡切片及用ABC法作免疫组化用DAB显色。结果显示与模型组相
比较，通过尾静脉给药(6. 25 mg/kg/day) 14天可明显减少早老性痴呆样模型大鼠的老年斑
数量(见箭头标示，n=15)。 A,C，F为对照组；B,D，E,G，H,I为模型组。A，B为海马神经元(X
40); C，D，E为皮质神经元(X400) ;F,朋，I为皮质神经元(XIOOO)。
图4 大鼠尾静脉注射脱氢吴茱萸碱明显减少模型大鼠脑中tau蛋白异常过度磷酸化 操作同图3。结果显示与模型相比较，通过尾静脉给药(6.25 mg/kg/day) 14天组大
鼠的海马区明显的tau蛋白异常过度磷酸化水平明显减低(/7=15;*, /X0. 01)。表现为tau-l (识别非磷酸化位点)抗体着色减弱，PHF-1 (识别磷酸化位点)抗体着色增强(见箭头标示，
n=15)。
具体实施方式
实施例
大鼠尾静脉注射脱氢吴茱萸碱对早老性痴呆的保护作用
a)实验动物及分组
雄性Wistar大鼠(华中科技大学同济医学院实验动物实验中心提供)，SPF级，体重250 320克，90只，常规环境饲养。分6组，每组15只①正常组；②假手术组；③Hcy组1 (100 (aM);④Hcy组2 (350 pM); Hey组l+叶酸/VitB12;⑥Hcy组2+叶酸/VitB12。
给大鼠注射同型半胱氨酸(homocystin， Hcy)构建复合型早老性痴呆动物模型，可选 择尾静脉注射、腹腔注射或侧脑室注射。大鼠尾静脉注射方法是将大鼠在清醒状态下固定， 从尾静脉缓慢注入(注射速度为lml/约10秒)Hcy;腹腔注射方法是将大鼠在清醒状态 下固定，从腹腔缓慢注入(注射速度为lml/约5秒)Hcy;大鼠侧脑室注射方法是将大鼠 麻醉后固定在脑立体定位仪上，清晰暴露前后囟，于前囟后1.0 1.2 mm，中线旁侧1.5 1.8mm垂直进针至硬膜下约3.5 3.8 mm，用牙科水泥固定留针，缓慢注入(注射速度为 20 4/约lmin) Hcy。同型半胱氨酸homocystin的注射剂量为尾静脉注射每次注射浓度 为100pM的同型半胱氨酸lml，每天1次，持续14天，或每周1次，持续半年；腹腔注射 每次注射浓度为100jaM的同型半胱氨酸lml，每天l次，持续14天，或每周l次，持续半 年；侧脑室注射每次注射浓度为100 nM的同型半胱氨酸20 pl，每天1次，持续14天。 通过尾静脉或腹腔或侧脑室持续注射同型半胱氨酸(homocystin， Hcy)，能在大鼠复制出同 时具有老年斑(A-beta沉积)、tau蛋白异常磷酸化和学习记忆障碍的复合型早老性痴呆大 鼠模型。尾静脉注射和腹腔注射等外周注射法具有操作简单，重现性好，模型维持时间长， 所需费用低等特点。本方法构建的动物模型可用于筛选AD新药、评价临床治疗效果和用以
研究发病机制等。 (2)主要试剂
丙烯酰胺(Arc), N, N-亚甲基双丙烯酰(bis),四甲基乙二胺(TEMED)，十二烷基磺酸 钠(SDS)，甘氨酸(Glycine),牛血清白蛋白(BSA)，三羟甲基氨基甲烷(Tris)，矾酸钠 (Na3 V04)， beta-磷酸甘油(beta-PG),氟化钠(NaF)， Calyculin A， wortmannin, GFX 为Sigma产品；过硫酸铵(AP)及考马斯亮蓝蛋白显色液从Pierce (美国)公司购买；预染的高分子量蛋白标准从Gibco公司购买。
(3) 主要仪器
WDT-V型脑立体定位仪(西安西北光电仪器厂) STT-III型三维手动推进器(西安西北光电仪器厂) 垂直型电泳槽和湿式电转膜槽(Hoefer, USA) 电泳仪(DF-C型，东方特力科贸中心) 转膜仪(BI0-RAD，北京市六一仪器厂) 台式高速离心机(Sigma，德国) 酶标仪(DG-3022型)
图象分析系统(Image pro-plus kodak, USA) 衡温杂交孵育箱(Biometra) 脑立体定位注射仪(日本)
(4) 尾静脉注射给药
将大鼠在清醒状态下固定，从尾静脉缓慢注入2ml脱氢吴茱萸碱(6.25mg/kg/day, 3.125 mg/kg/day)。
(5) Morris水迷宫训练及测试
实验所采用Morris水迷宫测试系统主要包括大鼠行为学测试系统、图象采集系统及微机
数据处理分析系统。测试用圆形水池直径120cm，高60cm;圆柱形有机玻璃平台直径10cm,
高40cm。大鼠在训练前2小时移入水迷宫室，并用染发剂将头颈部涂黑，涂染面积不小于3
X3cm2,以与背景形成反差。水池中水面高约45 cm，室温及水温均保持在26±2°C,水以
奶粉搅浑；平台用双层白色纱布覆盖扎紧后任意放置于某一象限的中心位置，并没于水面下
约2cm。整个背景均为乳白色，以避免老鼠用视觉搜寻平台。用于指导大鼠游泳找到平台的
红色或兰色标记物分别置于平台所在象限边缘1m左右。
训练时将大鼠从任一象限1/2弧度处头面向池壁轻放于水中，其游泳图象经水面上方1.5
m处的摄象机拍摄并连接于路径追踪系统采集，最后通过微机分析，可提供潜伏期(即大鼠
从入水点起到找到平台所用的时间)、路径、搜索策略等指标，本实验选用潜伏期作为衡量
大鼠学习记忆和测试成绩的指标。每只大鼠每天在4个象限共训练4次,每次游泳时限为60s，
即在60s内未找到平台者系统自动停止记录，潜伏期记为60s，由测试者引导其上台，休息 30s后进行下一次训练。
(6) 分子病理学检测
目的通过免疫印迹和免疫组化来反映脱氢吴茱萸碱对骨架蛋白TAU和A-beta的影响。
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免疫印迹法
颈椎脱臼断头处死雄性Wistar大鼠，迅速取出大脑脑组织置于0-4°C 0.05M Tris缓冲盐 溶液(TB， PH7.0)内，快速分离双侧海马，制成10%的蛋白匀桨，在1000rmp离心5分钟， 取上清，测定蛋白含量后备用。
免疫组化法
用4%多聚甲醛磷酸缓冲盐溶液(PB)进行心脏灌注固定脑组织，待取出脑组织后再在 上述固定液中后固定6 h，即可作振荡切片。免疫组化采用ABC法，二氨基联苯氨 (diaminobezidin, DAB)显色。
(7) 统计分析
全部数据均采用又土SD表示，利用SPSS统计软件进行统计分析。
(8) 药物效果的评估
根据上述实验步骤进行操作，结果显示通过大鼠尾静注射脉脱氢吴茱萸碱(6.25 mg/kg/day, 12. 5 mg/kg/day) 7天或14天可明显改善模型鼠的学习记忆障碍、明显减少老年 斑数量、明显降低磷酸化的tau蛋白水平。
(9) 结论
上述结果说明通过大鼠尾静脉注射脱氢吴茱萸碱对早老性痴呆的保护作用。证实脱氢吴 茱萸碱能够对抗早老性痴呆患者特征性病理改变，能够明显减少早老性痴呆的老年斑数量， 使磷酸化的tau蛋白水平明显降低，使学习记忆障碍得到明显改善等特点，能够用于早老性 痴呆的预防和治疗。
权利要求
1 . 一种治疗早老性痴呆的药物，它是以脱氢吴茱萸碱作为活性成分。
2 .脱氢吴茱萸碱在制备用于预防和治疗早老性痴呆的药物中的应用。
3 . —种治疗早老性痴呆的药物制剂，其特征在于含有活性成分脱氢吴茱萸碱和药学上 容许的载体或添加剂。
全文摘要
本发明提供了一种治疗早老性痴呆的药物，该药物是以脱氢吴茱萸碱作为活性成分，实验证实脱氢吴茱萸碱具有对抗早老性痴呆患者特征性病理改变的作用，能够明显减少早老性痴呆的老年斑数量，使磷酸化的tau蛋白水平明显降低，使学习记忆障碍得到明显改善，是一种预防和治疗早老性痴呆的有效药物。
文档编号A61P25/28GK101120946SQ200610019948
公开日2008年2月13日 申请日期2006年8月9日 优先权日2006年8月9日
发明者王建枝 申请人:华中科技大学