专利名称：灵芝液体发酵物、含该发酵物的组合物及制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种真菌与中药液体发酵物，具体地说，是灵芝液体发酵物。
背景技术：
疲劳是机体在一定的环境条件下，由于长时间劳动或过于繁重、紧张的劳动(体力或脑力)而引起作业效率明显的暂时降低的一种生理心理现象。疲劳是机体给予的生理警告信息，避免持续劳动造成过度疲劳，但体力疲劳不超过一定限度时，对人体有益。从疲劳发生的部位可分为个别器官的疲劳；二是全身性疲劳；三是智力疲劳。从疲劳发展的阶段可分为急性疲劳；慢性疲劳；过度疲劳。典型的症状疲惫乏力、工效显著减低、失眠、消化功能紊乱、心理压力明显。
慢性疲劳征病因未明，西医目前无特别治疗方法，该病经常复发，许多患者不能工作，而药物治疗该病是有争议的，且该病治疗困难。常用对症治疗，但根据引起慢性疲劳综合症不同病因假说，目前常试用以下几种治疗方法1抗病毒疗法无环鸟苷等抗病毒药疗效不一致，但对个别患者有效；2神经源性低血压补充水和盐，药物有氟氢可的松以及周围肾上腺能拮抗剂，盐酸米多君对神经源性低血压引起的慢性疲劳综合症有效。防治疲劳综合症发生的最佳方案就是进行早期预防，而早期预防则应以保健为主。
灵芝在中国已有几千年的历史，始载于《神农本草经》，现已记载有灵芝科真菌4属103种，其中灵芝属77种，分布于我国北纬25°～45°范围内的29个省市。在中国已知的103种灵芝中，已有14种被人们利用。《中国药典》(2000年版)首次承认灵芝的药用价值，将赤芝(Ganoderma Luciducm)和紫芝(Ganoderma Sinensis)纳入药典。灵芝子实体含有丰富的营养成分和药用成分，主要有水分12.49％～13.02％，粗蛋白11.98％～13.87％，粗脂肪0.81％～1.96％，总糖7.34％～8.10％，其多糖含量为1.06％～1.33％，钙1550μg/g、镁483μg/g、铁180μg/g、锌44.7μg/g及磷37.5μg/g等人体必需的常量或微量元素，还含有18种常见氨基酸，总量为6.07％～6.38％，其中必需氨基酸含量丰富(E/T＝0.528～0.545)；另有少量萜类物质。主要灵芝产品有灵芝保健饮料(如灵芝茶、灵芝酒)，灵芝药品(如灵芝冲剂、灵芝丸、灵芝胶囊)，灵芝美容品等；这些产品，其主要原料均以赤芝为主，产品成分单一，无具体特定功能，不对机体特定器官起作用，主要是通过提高机体免疫功能达到保健作用。
黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao的根，性味性温，味甘。功能主治补气固表，托毒排脓，利尿，生肌。用于气虚乏力、久泻脱肛、自汗、水肿、子官脱垂、慢性肾炎蛋白尿、糖尿病、疮口久不愈合。未有关于抗疲劳的报道。
液体深层发酵属于现代生物技术之一。最初这种新型发酵技术源自日本，Numata Kenji等人将大豆蛋白预先用纤维素酶和蛋白酶处理，经灵芝发酵后，处理做成新型保健食品，用以治疗糖尿病、血压过低等疾病；日本小议等人将印第安绣球花茶加水处理得提取液，在此提取液中加入灵芝进行发酵，利用灵芝发酵菌丝体处理制成营养保健饮料。我国具有丰富的中药资源，中药在发酵过程中起到抑制或促进真菌生长，或是影响代谢的作用，而真菌又能通过微生物转化的作用将中药中的某些成分进行合成或修饰对中药起到减毒增效的作用，因此这种添加中药为真菌发酵底物的发酵技术称之为新型双向型发酵技术。目前国内有许多关于灵芝与中药发酵的相关报道，如魏赛金，涂国全发现茵陈、垂盆草、火巷、桔梗、黄苓、板蓝根、连翘7味中药能抑制灵芝胞外多糖的分泌，茯苓可明显地促进灵芝的生长，增强胞外多糖的分泌；王林，章克昌，王玉红发现麻黄、莱菔子、金银花和连翘4味中药对灵芝生物量有明显促进作用，黄岑对灵芝生长有抑制作用。但是目前未见在培养基中加入中药的灵芝发酵产物的药理作用的报道，也未见灵芝发酵物具有抗疲劳功能的报道。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题，是提供一种具有抗疲劳的灵芝液体发酵物，其特征在于培养基中加入黄芪，其中加入的黄芪可以是黄芪原生药材或黄芪粉，也可以是黄芪提取液，优选黄芪水提取液(按常规方法制备而得)。
进一步地，培养基中加入重量百分比为1.0～1.2％黄芪，其中所述黄芪为黄芪水提取液中所含黄芪的生药量。
更进一步地，培养基中加入黄芪重量百分比为1.2％黄芪； 本发明灵芝来源为赤芝属或紫芝属中的一种或多种。根据《中国药典》(2000年版)规定灵芝包括赤芝(Ganoderma Luciducm)和紫芝(Ganoderma Sinensis)两个属的灵芝，其它属的虽也有使用但其药理作用有所差异。《中国药典》(2005版灵芝)中灵芝的质量标准制定方法用水提醇沉法提取灵芝菌丝体粗多糖，采用酚-硫法测定，以葡萄糖作为对照。本发明灵芝液体发酵物质量指标以发酵物灵芝菌丝体多糖为质量控制标准。
优选灵芝来源为赤芝属。因选用赤芝属灵芝作为发酵菌株，主要有两点优势其一，发酵过程简单，产量高；其二，发酵物药效较紫芝好。
本发明灵芝液体发酵物(以下简称本发明发酵物)，其灵芝菌丝体多糖含量为6.0％～9.0％，较培养基中未添加黄芪制备而得的发酵物灵芝菌丝体多糖含量高。
进一步优选，本发明发酵物灵芝菌丝体多糖含量为7.5％～9.0％。
本发明发酵物可经过浓缩、过滤后，取滤液得液体提取物，保存备用；或者将本发明发酵物浓缩、烘干、粉碎后得粉末状固体提取物，保存备用。
本发明所要解决的第二个技术问题是提供制备本发明发酵物的方法，它包括如下步骤 a、制备培养基；取灵芝菌种斜面培养，得灵芝种子菌； b、将步骤a所得灵芝种子菌接种于步骤a所得培养基中，发酵培养即得发酵物； 其中，步骤a中的培养基含有下述重量百分比的原料麦麸1.0～2.0％，蔗糖1.5～2.5％，蛋白胨1.8～2.2％，酵母膏0.5～1％，磷酸氢二钾1.0～1.5％，硫酸镁0.5～0.8％，黄芪1.0～1.2％；步骤b所述发酵培养条件为温度为25℃～29℃、pH值为5.5～6.0；培养时间5～7d。
具体地，本发明制备方法步骤a中的培养基含有下述重量配比的原料 麦麸1％，蔗糖2％、蛋白胨0.2％，酵母膏0.1％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁0.05％、黄芪1.2％。
本发明所要解决的第三个技术问题是提供本发明发酵物在制备具有抗疲劳功能的药物、保健食品中的用途。经试验证明，本发明发酵物抗疲劳作用明显，可治疗各种原因所致的疲劳综合症，如因体力、脑力和心理因素导致的疲劳综合症均具有显著的功效；可提高机体活力，增强免疫功能，促进新成代谢，提高睡眠质量，有利于缓解肌肉酸痛及促进脑疲劳的恢复等方面的辅助性治疗、调节和康复。
本发明所要解决的第四个技术问题是提供一种具有抗疲劳的组合物，它是以本发明灵芝液体发酵物或其提取物为活性成分，加入药学上或食品上可接受的原料、辅料或辅助性成分制备而成的药品或保健食品。
其中，所述药品为口服制剂。具体地，药品口服制剂为片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液或丸剂；保健食品为口服液或饼干等。
应用本发明组合物应用本发明发酵物为原料制备而得的药品与保健食品具有抗疲劳，提高机体活力，增强免疫功能，促进新成代谢，提高睡眠质量的作用，而且具有服用方便，使用者顺从性良好的优点，为公众克服疲劳引起的不适提供了新的选择。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式
，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施例方式 实施例1 本发明发酵物的制备 原料麦麸10g、玉米粉10、蔗糖5g、蛋白胨2g、酵母膏1g、硫酸镁0.5g、磷酸氢二钾1g、黄芪水提取液相当于黄芪药材1g、水1000g。
发酵参数温度27℃±2℃；pH值6.0；转速180r/min；培养时间6d。
发酵过程培养基经高压灭菌1MPa，30分钟，待冷却后接种液体灵芝液体种，按接种量的10％接种，按照上述参数进行发酵。
实施例2 本发明发酵物的制备 原料麦麸10g、玉米粉10、蔗糖5g、豆粕10g、硫酸镁0.5g、磷酸氢二钾1g、黄芪水提取液相当于黄芪药材1g、水1000g。
发酵参数温度27℃±2℃；pH值6.0；转速150r/min；培养时间7d。
发酵过程培养基经高压灭菌1MPa，30分钟，待冷却后接种液体灵芝液体种，按接种量的10％接种，按照上述参数进行发酵。
实施例3 本发明发酵物的制备 原料麦麸15g、蔗糖20g、豆粕10g、硫酸镁0.5g、磷酸氢二钾1g、黄芪水提取液相当于黄芪药材12g、水1000g。
发酵参数温度27℃±2℃；pH值6.0；转速180r/min；培养时间6d。
发酵过程培养基经高压灭菌1MPa，30分钟，待冷却后接种液体灵芝液体种，按接种量的10％接种，按照上述参数进行发酵。
实施例4 本发明发酵物的精制 1、本发明发酵物原液的制备分别取实施例1～3所得的发酵物经搅拌的匀浆2.5L，95℃加热浓缩至1L，过滤，取滤液。
2、本发明发酵物粉的制备分别取实施例1～3所得的发酵物经搅拌的匀浆30L，95℃加热浓缩至，烘干，粉碎成粉末状，得本发明发酵物粉100g。
实施例5 本发明保健食品的制备 原料本发明发酵物原液1L(由实施例1制备所得发酵物而得)； 制备方法将本发明发酵物原液与常规辅料(蜂蜜、单糖浆、山梨酸、苯甲酸等)混合均匀后，分装灭菌，制成本发明发酵物原液的口服液剂型保健品。
实施例6 本发明发酵物颗粒保健品的制备 原料本发明发酵物粉1kg(由实施例2制备所得发酵物而得)； 制备方法将本发明发酵物粉与常规辅料(水溶性赋形剂、乙醇等)通过制粒、干燥、整粒、包装等过程，制成本发明发酵物颗粒剂保健品。
实施例7 本发明发酵物片剂保健品的制备 原料本发明发酵物粉100g(由实施例3制备所得发酵物而得)，淀粉60g，乳糖30g，硬酯酸镁10g。
制备方法将本发明发酵物粉、淀粉、乳糖混匀，按常规方法制粒后，加入硬酯酸镁整粒，压片，共制成1000片，得到每片含本发明发酵物粉100mg的片剂保健品。
实施例8 本发明发酵物软胶囊保健品的制备 原料本发明发酵物粉10Kg(由实施例2制备所得发酵物而得)； 制备方法将本发明发酵物粉与常规辅料(PEG400、甘油、吐温等)混合均匀后，用灌装机灌装在明胶胶囊的包装中，得到本发明发酵物软胶囊制剂保健品。
以下通过试验证明本发明发酵物的有益效果。
一、通过下述试验对灵芝发酵菌种进行筛选(由于《中国药典》与《真菌类保健食品申报与评审规定》中只承认灵芝中两个种属即赤芝(Ganoderma Luciducm)和紫芝(Ganoderma Sinensis)可作为真菌类保健食品，因此只对两个属的灵芝进行筛选)。
(一)本发明发酵物质量指标对比试验 1、本发明发酵物选择赤芝和紫芝为原料，按照相同的条件制备本发明发酵物，分别称为紫芝组和赤芝组。
2、多糖提取水提醇沉法5000r/min，10min离心取发酵液菌丝体，60℃烘干备用。取10g菌丝体干粉，250mL蒸馏水95℃提取3次，每次1小时合并三次提取液，减压浓缩至100mL，80％乙醇4℃沉淀12小时，离心取沉淀，蒸馏水溶解。
3、多糖测定 标准曲线制作准确称取，105℃下干燥至恒重的葡萄糖100mg，加水溶解并定容至100mL，即得储备液；准确吸取葡萄糖储备液2，4，6，8，10，12，14mL，分别置于100mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀；吸取上述溶液各0.4mI，置于20mL试管中，加入5％重蒸苯酚溶液0.8mL，混匀后迅速加入浓硫酸4mL再于沸水浴中加热15min后，冷却到室温，在490nm处测定吸光度(对照为0.4mL双蒸水+0.8mL苯酚+4mL浓硫酸)，建立回归方程。
本发明发酵物灵芝多糖的测定取本发明发酵物灵芝多糖提取液0.4mL，酚-硫法测定(具体方法同标准曲线的制作)。
试验结果回归方程，以糖浓度mg/ml为横坐标x，吸光度为纵坐标Y，经计算得回归方程Y＝4.928X-0.0133r＝0.9963。
测定见表1 表1 赤芝组和紫芝组菌丝体多糖含量
(二)赤芝组和紫芝组发酵物的抗涝疗效对比试验(负重游泳试验) 试验动物KM种小鼠50只，体重20±2g。
试验方法本发明赤芝黄芪发酵物制备方法培养基经高压灭菌1MPa，30分钟，待冷却后接种液体赤芝液体种，按接种量的10％接种，27℃±2℃；pH值6.0，转速180r/min，培养6d。按照本发明发酵物原液提取方法制备。
本发明紫芝黄芪发酵物制备方法培养基经高压灭菌1MPa，30分钟，待冷却后接种液体赤芝液体种，按接种量的10％接种，27℃±2℃；pH值6.0，转速180r/min，培养6d。按照本发明发酵物原液提取方法制备。
将小鼠分为赤芝组(剂量0.4ml/10g)、紫芝组(剂量0.4ml/10g)与模型组，每组各10只，雌雄各半，每日灌胃给药，模型组每日给予等量自来水灌胃，连续30d。末次给药后30min，将小鼠尾根部负重5％体重的铅皮，置于水深35cm，水温25±0.5℃的游泳箱中游泳。记录小鼠自游泳开始至死亡的时间，作为小鼠游泳时间。
试验结果经单因素方差分析表明，各剂量组小鼠体重与对照组之间差异均无显著意义，未见本发明发酵液对小鼠体重有影响。各组负重游泳时间均值的差异有显著意义(P＜0.05)。经过T检验，赤芝组与对照组相比差异有显著性(P＜0.05)。紫芝组与对照组相比无显著性差异(P＞0.05)。说明赤芝组对延长小鼠负重游泳时间的作用比紫芝组效果好。结果见表2。
表2 赤芝组和紫芝组对小鼠负重游泳时间的影响
注与正常对照组相比**P＜0.01，*P＜0.05。
二、以下通过试验对发酵培养基进行筛选 试验方法以菌丝体干重和菌丝体多糖作为指标。
培养基与培养方法麦麸1％，蔗糖2％、蛋白胨0.2％，酵母膏0.1％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁0.05％、黄芪1.2％。27℃培养5天。
取菌丝体，烘干，多糖的提取与测定(同试验一中本发明发酵物质量指标对比试验中多糖的提取与测定)。
1、碳源将基础培养基中去除麦麸与蔗糖，而选择常用碳源葡萄糖、蔗糖、麦麸和复合碳源蔗糖+麦麸进行筛选(各碳源浓度为4％，复合碳源中蔗糖与麦麸各2％)，27℃培养5天。结果表明复合碳源蔗糖+麦麸产量最高。
表3 不同碳源对黄芪灵芝发酵菌丝体干重和菌丝体多糖的影响
2、氮源培养条件与培养同前所述，选择常用无机氮源硝酸铵、硝酸钠与有机氮源蛋白胨、酵母膏(各碳源浓度为1％)，结果表明有机氮源最好。
表4 不同氮源对本发明发酵物菌丝体干重和菌丝体多糖的影响
3、碳源、氮源最适浓度试验根据以上试验结果，综合考虑灵芝工业发酵对种子培养基和发酵培养基的经济性要求和速效碳源、氮源对微生物生长速度的影响，选用碳源蔗糖、麦麸，氮源蛋白胨及酵母膏4因子进行试验，以找出最适碳源、氮源的最适浓度及组合。碳源、氮源的因数水平见表5，正交试验结果与方差分析见表6。从试验结果可以看出主次因数为A＞B＞C＞D，因此灵芝生长的最佳碳源、氮源为麦麸1％，蔗糖2％、蛋白胨0.2％，酵母膏0.1％。
表5 因素水平表
表6 碳源、氮源正交试验结果方差分析
三、黄芪添加量对发酵产物药理作用的影响 试验动物KM种小鼠40只，体重20±2g。
试验方法上述优化后培养基，中分别加入0.5％、1.2％、3.0％黄芪，27℃培养7天，浓缩同本发明发酵物原液制备方法，分别为样品1、2、3。
将小鼠分为3组每组各10只，雌雄各半，每日灌胃给药，模型组每日给予等量自来水灌胃，连续30d。末次给药后30min，将小鼠尾根部负重5％体重的铅皮，置于水深35cm，水温25±0.5℃的游泳箱中游泳。记录小鼠自游泳开始至死亡的时间，作为小鼠游泳时间。
试验结果经单因素方差分析表明，各剂量组小鼠体重与对照组之间差异均无显著意义，未见本发明发酵物原液对小鼠体重有影响。各组负重游泳时间均值的差异有显著意义(P＜0.05)。经过T检验，说明本发明发酵物原液具有延长小鼠负重游泳时间的作用，结果见表7。
表7 本发明发酵物原液对小鼠负重游泳时间的影响
注与正常对照组相比**P＜0.01，*P＜0.05。
综上试验结果本发明发酵最适合培养基与最佳配方为麦麸1％，蔗糖2％、蛋白胨0.2％，酵母膏0.1％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁0.05％，黄芪添加量为1.2％。
四、通过以下试验对发酵参数进行优化 1、初始pH值取最佳配方培养基，滴加盐酸，调节初始pH设定至4.5、5.0、6.0，27℃培养7天，取菌丝体，烘干，多糖的提取与测定如前所述。结果表明最佳发酵初始pH值为5.0。
表8 不同初始pH值对本发明发酵物菌丝体干重和菌丝体多糖的影响
2、温度取最佳配方培养基，分别在25℃、27℃、30℃养7天，取菌丝体，烘干，多糖的提取与测定如前所述。结果表明最佳发酵温度为27℃。
表9 不同温度对本发明发酵物菌丝体干重和菌丝体多糖的影响
3、时间取最佳配方培养基，培养5、6、7天，取菌丝体，烘干，多糖的提取与测定如前所述。结果表明最佳发酵时间为7天。
表10 不同温度对本发明发酵物菌丝体干重和菌丝体多糖的影响
综上试验结果本发明发酵物发酵最佳条件为初始pH值5.0，27℃培养7天。
五、以下通过试验证明本发明发酵物及其提取物和本发明组合物的有益效果。
按卫生部发布的《保健品检验与评价技术规范》中《保健食品功能学评价程序和检验方法规范》，缓解体力疲劳作用的检测方法中负重游泳试验、血清尿素测定(二乙一肟法)、肝糖原测定(蒽酮法)和乳酸测定的规定方法执行。
1、本发明发酵物对小鼠负重游泳时间的影响 试验动物KM种小鼠50只，体重20±2g。
试验方法将小鼠分为本发明发酵物原液(实施例3所得发酵物按照实施例4方法制备)大剂量(0.4ml/10g)、中剂量0.2ml/10g、小剂量(0.1ml/10g)、模型组，人参0.4ml/10g(水煎液含生药量g/ml)每组各10只，雌雄各半，每日灌胃给药，模型组每日给予等量自来水灌胃，连续30d。末次给药后30min，将小鼠尾根部负重5％体重的铅皮，置于水深35cm，水温25±0.5℃的游泳箱中游泳。记录小鼠自游泳开始至死亡的时间，作为小鼠游泳时间。
试验结果经单因素方差分析表明，各剂量组小鼠体重与对照组之间差异均无显著意义，未见本发明发酵物原液对小鼠体重有影响。各组负重游泳时间均值的差异有显著意义(P＜0.05)。经过T检验，本发明发酵物原液低剂量组游泳时间延长但与模型组相比无显著性差异，本发明发酵物原液高、中剂量组、人参与对照组相比差异有显著性(P＜0.05)。说明本发明发酵物原液高级剂量与中剂量具有延长小鼠负重游泳时间的作用。结果见表11。
表11 本发明发酵物原液对小鼠负重游泳时间的影响
注与正常对照组相比**P＜0.01，*P＜0.05。
2、本发明发酵物原液对运动后小鼠血清尿素的影响 试验动物KM种小鼠50只，体重20±2g。
试验方法将小鼠分为本发明发酵物原液(实施例3所得发酵物按照实施例4方法制备)大剂量(0.4ml/10g)、中剂量0.2ml/10g)、小剂量(0.1ml/10g)、人参0.4ml/10g(水煎液含生药量g/ml)和模型组，每组各10只，雌雄各半，每日灌胃给药，模型组每日给予等量自来水灌胃，连续30d。末次给药后30min后，在温度为30±0.5℃的水中不负重游泳90min，休息60min后，摘眼球采血0.8ml(不加抗凝剂)。待血液凝固后离心取血清，用血清尿素试剂盒进行测定。
试验结果经单因素方差分析表明，各剂量组小鼠体重与对照组之间差异均无显著意义，未见本发明发酵物原液对小鼠体重有影响。各组血清尿素均值的差异有极显著意义(P＜0.01)。经过T检验，本发明发酵物原液高剂量组、人参组与对照组相比差异有显著性(P＜0.05)。说明本发明发酵物原液高剂量具有降低运动后小鼠血清尿素的作用。结果见表12。
表12 本发明发酵物原液对运动后小鼠血清尿素的影响
注与正常对照组相比**P＜0.01，*P＜0.05。
3、本发明发酵物原液对小鼠肝糖原的影响 试验动物KM种小鼠50只，体重20±2g。
试验方法将小鼠分为本发明发酵物原液(实施例3所得发酵物按照实施例4方法制备)大剂量(0.4ml/10g)、中剂量0.2ml/10g)、小剂量(0.1ml/10g)、人参0.4ml/10g(水煎液含生药量g/ml)和模型组，每组各10只，雌雄各半，每日灌胃给药，模型组每日给予等量自来水灌胃，连续30d。末次给药后30min后，取肝脏，按肝糖原测定试剂盒的说明书，进行肝糖原测定。
试验结果经单因素方差分析表明，各剂量组小鼠体重与对照组之间差异均无显著意义，未见本发明发酵物原液对小鼠体重有影响。各组肝糖原的均值的差异有极显著意义(P＜0.01)。经过T检验，本发明发酵物原液高剂量组与对照组相比差异有显著性(P＜0.05)。说明本发明发酵物原液高剂量具有增加小鼠肝糖原的作用。结果见表13。
表13 本发明发酵物原液对小鼠肝糖原的影响
注与正常对照组相比**P＜0.01，*P＜0.05。
4、血乳酸测定 试验动物KM种小鼠40只，体重20±2g。
试验方法将小鼠分为本发明发酵物原液(实施例3所得发酵物按照实施例4方法制备)大剂量(0.4ml/10g)、中剂量(0.2ml/10g)、小剂量(0.1ml/10g)、人参0.4ml/10g(水煎液含生药量g/ml)和模型组，每组各10只，雌雄各半，每日灌胃给药，模型组每日给予等量自来水灌胃，连续30d。末次给药后30min后，用毛细玻璃管眼球内眦静脉采血20μl，用全血乳酸测定试剂盒进行乳酸含量的测定。动物采血后不负重在温度为30±0.5℃的水中游泳10min后停止，立即采血20μl测定血乳酸，休息20min后再各采血20μl，进行血乳酸测定。血乳酸曲线下面积＝5×(游泳前血乳酸值+3×游泳后10min的血乳酸值+2×游泳后休息20min的血乳酸值)。
试验结果经单因素方差分析表明，各剂量组小鼠体重与对照组之间差异均无显著意义，未见本发明发酵物原液对小鼠体重有影响。运动前各剂量组血乳酸值与正常对照组相比无显著性差异(P＞0.05)。游泳10min后各组小鼠血乳酸值与运动前相比都有不同程度升高。各个剂量组的血乳酸水平明显低于正常对照组，有显著性差异(P＜0.05)。休息20min后各组血乳酸值均下降，高、中剂量组与正常对照组相比，差异有显著性(P＜0.05)。低剂量组小鼠血乳酸曲线下面积减小，但是无差异。高、中剂量组与正常对照组相比，小鼠血乳酸曲线下面积均明显减小，有显著性差异(P＜0.05)，结果见表14。
表14 本发明发酵物原液对小鼠运动前后血乳酸的影响
注与正常对照组相比**P＜0.01，*P＜0.05。
5、毒性观察 (1)给小鼠灌食最大给药浓度和剂量都不致死，不能测出本发明发酵物的半数致死量。
(2)用本发明发酵物进行了大鼠致畸胎试验、Ames试验、小鼠骨髓微核试验和染色体畸变试验，证明该药无致畸和致突作用。
通过以下试验对发酵物，发酵物提取物，组合物中灵芝菌丝体多糖进行测定。
标准曲线制作称取105℃下干燥至恒重的葡萄糖100mg，加水溶解并定容至100mL，即得储备液；准确吸取葡萄糖储备液2，4，6，8，10，12，14mL，分别置于100mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀；吸取上述溶液各0.4mL，置于20mL试管中，加入5％重蒸苯酚溶液0.8mL，混匀后迅速加入浓硫酸4mL于沸水浴中加热15min后，冷却到室温，在490nm处测定吸光度(对照为(0.4mL双蒸水+0.8mL苯酚+4mL浓硫酸)，以X为多糖含量(mg/mL)Y为吸光值建立回归方程。
发酵物菌丝体多糖与测定 多糖提取水提醇沉法5000r/min，10min离心取本发明发酵物菌丝体，60℃烘干备用。取10g菌丝体干粉，250mL蒸馏水95℃提取3次，每次1小时合并三次提取液，减压浓缩至100mL，80％乙醇4℃沉淀12小时，离心取沉淀，蒸馏水定容至250mL，为样品1。
发酵物提取物多糖提取取本发明实施例4中所述发酵物原液200mL浓缩至100mL，80％乙醇4℃沉淀12小时，离心取沉淀，蒸馏水定容至250mL，为样品2。
本发明发酵物口服液保健品多糖提取取本发明发酵物实施例5中所述口服液保健品200mL浓缩至100mL，80％乙醇4℃沉淀12小时，离心取沉淀，蒸馏水定容至250mL，为样品3。
多糖的测定取0.4ml多糖溶液，加入0.8ml5％苯酚，再加入4ml浓硫酸，于沸水浴中加热15min后，冷却到室温，在490nm处测定吸光度。
结果标准曲线Y＝4.928X-0.0133r＝0.9963 表15 多糖测定结果
由以上的各项试验结果可以看出，本发明发酵物无明显毒副作用，且原料来源丰富，提取和制备成相应的药物或食品的方法并无特殊要求和限制，在提高机体耐受能力，增强抗疲劳等方面具有理想的综合药理作用，具有很好的应用于药品及保健品的前景，可在治疗各种原因所致的疲劳综合症，可发挥满意的辅助治疗、保健和康复作用，为公众克服疲劳引起的不适提供了新的选择。
权利要求
1.一种灵芝液体发酵物，其特征在于培养基中加入黄芪。
2.根据权利要求1所述的灵芝液体发酵物，其特征在于培养基中加入重量百分比为1.0～1.2％。
3.根据权利2所述的灵芝液体发酵物，其特征在于培养基中加入重量百分比为1.2％黄芪。
4.根据权利要求1～3任一项所述的灵芝液体发酵物，其特征在于灵芝来源为赤芝属或紫芝属中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的灵芝液体发酵物，其特征在于灵芝来源为赤芝属。
6.根据权利要求1～5任一项所述的灵芝液体发酵物，其特征在于其灵芝菌丝体多糖含量为6.0％～9.0％。
7.一种制备权利要求1所述灵芝液体发酵物的方法，它包括如下步骤
a、制备培养基；取灵芝菌种斜面培养，得灵芝种子菌；
b、将步骤a所得灵芝种子菌接种于步骤a所得培养基中，发酵培养即得发酵物；
其中，步骤a所述培养基含有下述重量百分比的原料麦麸1.0～2.0％，蔗糖1.5～2.5％，蛋白胨1.8～2.2％，酵母膏0.5～1％，磷酸氢二钾1.0～1.5％，硫酸镁0.5～0.8％，黄芪1.0～1.2％；步骤b所述发酵培养条件为温度为25℃～29℃、pH值为5.5～6.0；培养时间5～7d。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于步骤a所述培养基含有下述重量百分比的原料
麦麸1％，蔗糖2％、蛋白胨0.2％，酵母膏0.1％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁0.05％、黄芪1.2％。
9.权利要求1～6任一项所述的灵芝液体发酵物在制备具有抗疲劳功能的药物、保健食品中的用途。
10.一种具有抗疲劳的组合物，它是以权利要求1～6任一项所述灵芝液体发酵物或其提取物为活性成分，加入药学上或食品上可接受的原料、辅料或辅助性成分制备而成的药品或保健食品。
全文摘要
本发明涉及一种真菌与中药液体发酵物，具体地说，本发明发酵物其特征在于在培养基中加入重量百分比为1.0～1.2％黄芪。本发明发酵物灵芝菌丝体多糖含量为6.0％～9.0％，本发明还提供了该发酵物的制备方法与用途。应用本发明发酵物及含有该发酵物的组合物制备而得的药品与保健食品具有抗疲劳，提高机体活力，增强免疫功能，促进新成代谢，提高睡眠质量的作用，而且具有服用方便，使用者顺从性良好的优点，为公众克服疲劳引起的不适提供了新的选择。
文档编号A61K36/481GK101172125SQ20061002218
公开日2008年5月7日 申请日期2006年11月3日 优先权日2006年11月3日
发明者霞 罗, 曹定知, 杨士明, 巍 魏, 许晓燕, 瑾 曾, 余梦瑶 申请人:四川省中医药研究院