专利名称：一种被乙型肝炎病毒x抗原上调表达的基因及其编码产物与用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医药工程技术领域，尤其涉及一种被乙型肝炎病毒(HBV)X抗原(HBxAg)上调表达的基因，及其编码产物，以及它们在乙型肝炎相关肝癌的早期诊断及治疗中的应用。
背景技术：
原发性肝细胞癌(HCC)是全世界范围的恶性肿瘤之一，每年都有将近40万的人被诊断患上HCC。从被诊断开始通常只有不到6个月的存活期，5年生存率低于3％。如此高的死亡率主要是因为癌组织的过快生长，还有就是初期通常无明显症状。因此，尽管早期肝癌可以通过手术治疗，实际上发现时大部分都已是晚期。乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染是导致HCC发生的重要原因之一。HBV基因组编码的蛋白包括DNA聚合酶、核心蛋白、S蛋白、前S1蛋白和前S2蛋白以及X蛋白(HBx)。乙型肝炎病毒X抗原(HbxAg)是一种反式激活蛋白，其序列高度保守，为病毒基因组转录所必需，并与慢性HBV感染者发展为HCC有重要关系，具有转录调节活性，对于细胞增殖、信号转导、DNA修复及凋亡等均有影响，可能参与HCC形成的多个环节。HBxAg反式激活的基因也可能参与肝细胞的恶性转化，并可能作为肝细胞恶性转化过程中的标志基因，在HBV相关肝癌的早期诊断和治疗中具有应用价值。
发明内容
本发明的目的在于筛选在正常肝组织中不表达或极低水平表达，而在HBV感染的肝细胞中，被HbxAg显著上调表达的基因，并对该基因进行克隆和表达，研究它在HBV相关肝癌的早期诊断和治疗中的应用。
本发明利用消减杂交技术构建HBxAg反式激活的cDNA消减文库，筛选差异表达的基因片段，并进行生物信息学分析，获得一种被乙型肝炎病毒X抗原(HBxAg)上调表达的新的基因，命名为UG。UG基因的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，由745个碱基组成，与人胎肝cDNA文库中的H49417克隆有98.7％的同源性。UG基因编码的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示，由99个氨基酸残基组成，它和多药抗性蛋白(MRP)家族的N端几乎100％同源。
本发明提供了UG基因的筛选、克隆方法，以及对肝细胞中UG的检测和对UG功能的验证1、HBxAg表达质粒的构建和Huh7细胞稳定转染扩增HBxAg基因，插入真核表达质粒pIRESneo，得到重组质粒pIRESneo-HBx。再分别将重组质粒pIRESneo-HBx和对照空载体质粒pIRESneo转染Huh7细胞(人肝癌细胞，以含有5％小牛血清的DMEM培养液培养)，转染24小时后，更换为含有600μg/ml G418的选择性培养基，间隔2-3天换液一次，14天后待阳性克隆形成以后，用裂解液裂解细胞，以Western blotting检测HBxAg蛋白的存在；2、消减杂交用Myltenyi Biotech的mMACS mRNA isolation kit纯化pIRESneo稳定转染的Huh7细胞的mRNA，逆转录成单链的cDNA，再与pIRESneo-HBx稳定转染的Huh7细胞的mRNA进行杂交，洗脱未杂交的mRNA，用随机引物扩增，即可得到差异表达的基因，即载体转染的Huh7细胞不表达，而pIRESneo-HBx转染的Huh7细胞表达的基因。将扩增产物与pMD18T载体连接，测序，序列再与GenBank进行对比分析，获得UG基因；3、Real time PCR检测分别抽提pIRESneo-HBx和pIRESneo稳定转染的Huh7细胞的总RNA，逆转录为cDNA，再进行Real time PCR分析；结果在前者转染的Huh7细胞可检测到强烈的杂交信号，而在后者仅检测到很微弱的信号甚至检测不到信号。对临床标本进行的检测显示，UG mRNA在HBV感染的肝脏细胞和HCC早期的肝细胞中过量表达，在未感染HBV的肝细胞中则很弱甚至未检测到表达；4、UG表达对肝脏肿瘤细胞生长的影响分析UG基因的编码序列，合成引物，PCR扩增cDNA片段，产物插入真核表达质粒载体pIRESneo，获得重组质粒pIRESneo-UG测序；HBxAg能促进肝细胞的生长意味着其反式激活的基因也可能介导类似的功能。为了验证UG是否也具有这种功能，将表达质粒pIRESneo-UG、pIRESneo-HBx以及pIRESneo转染Huh7细胞，用含有10％胎牛血清的培养液培养。5天后隔天用台盼兰染色计数，同时用流式细胞术分析细胞的生长和DNA的含量。与转入空载体的细胞相比，UG明显刺激了Huh7细胞的生长，但未及HBxAg对Huh7生长的影响程度。这说明上调UG的表达是HBxAg刺激细胞生长的机制之一。
原位杂交和免疫印迹显示UG和HBxAg共表达于HBV感染者的肝组织中，HBxAg和UG在HCC早期都过量表达，体外实验证实UG的过量表达会刺激人肝癌细胞(HepG2)的生长。简言之，在HBV感染早期，HBxAg反式激活UG基因的表达，而UG则刺激细胞增殖UG和促进细胞恶性转化。因此，UG可以作为乙型肝炎所致的HCC的早期诊断指标，并可能作为基因或药物治疗的靶点，本发明也为进一步探讨HBV致病及致癌机制提供新的研究方向。
图1pIRESneo-HBx质粒的结构图2HBx基因对Huh7细胞细胞内UG基因的上调作用图3HBV感染的肝组织和肝癌组织中UG基因的表达图4pIRESneo-UG质粒的结构图5UG的促肿瘤细胞增殖作用
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述。
实施例11.HBxAg表达质粒的构建根据HBxAg核苷酸序列设计引物，上、下游引物中分别引入EcoRI、BamH I酶切位点，以含有HBV全基因组的质粒pBR322-HBV(本实验室构建)为模板，PCR扩增HBxAg编码基因，PCR扩增试剂为TaKaRa产品。
引物15′-cccgaattcatggctgctcgggtgtgctg-3′引物25′-cccggatccttaggcagaggtgaaaaagttgc-3′在0.5毫升离心管建立以下反应体系质粒pBR322-HBV10ng10×Taqase缓冲液 5μl引物1(5mM)2μl引物2(5mM)2μldNTP(10mM)2μlMgCl2(25mM) 2μlTaqase(2U/μl)0.5μl补充双蒸去离子水至总反应体积50μl，在PE2400型PCR仪进行热循环反应先94℃变性2分钟，再94℃变性40秒，60℃退火40秒，72℃延伸50秒，共进行30个循环，然后72℃延伸5分钟，温度降至4℃结束反应。PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，将目的条带回收，以EcoRI、BamH I酶切，酶切产物插入经过EcoRI、BamHI酶切线性化的真核表达质粒载体pIRESneo。
在0.5毫升离心管建立以下反应体系EcoRI、BamH I酶切的HBxAg基因片段6μl5×T4DNA连接酶缓冲液2μlEcoRI、BamH I酶切的质粒载体pIRESneo 2μlT4DNA连接酶(2U/μl) 1μl混匀，置于16℃水浴16小时，取5μl转化感受态大肠杆菌DH5α，得到的氨苄青霉素抗性菌落接种于含有氨苄青霉素100μg/ml的LB液体培养基，再提取重组质粒进行酶切鉴定，命名为pIRESneo-HBx，其结构如图1所示，PCMV为巨细胞病毒启动子，IVS为内含子，IRES为内部核糖体进入位点，Neo为新霉素磷酸转移酶基因，即G418抗性基因，polyA为牛生长激素转录终止序列。
2.Huh7细胞稳定转染(1)用QIAprep SpinMiniprep Kit(Qiagen)试剂从大肠杆菌中提取重组质粒pIRESneo-HBx以及对照质粒pIRESneo，并用紫外分光光度法测定质粒DNA的含量和纯度。
(2)用含有5％小牛血清的DMEM培养液传代培养细胞人肝癌细胞Huh7，转染前一天，胰酶消化生长状态良好的Huh7细咆，传代接种24孔板，次日细胞达到90％～95％汇合时，用脂质体LipofectamineTM2000(Invitrogen)转染，在无血清无抗生素的DMEM培养液中进行。分别取pIRESneo-HBx和对照质粒pIRESneo 0.8μg，与50μlDMEM培养液混合；再取LipofectamineTM20002μl与50μl DMEM培养液混合；室温孵育5分钟以后，将质粒DNA溶液与LipofectamineTM2000溶液轻轻混合，室温下放置不超过5分钟，以形成DNA-脂质体复合物。同时，用DMEM培养液洗细胞3次。每孔再加入100μlDMEM培养液。将DNA-脂质体复合物溶液加入孔内，将培养板前后轻轻晃动使分布均匀。37℃孵育4～6h后，吸除转染液移去，加入2ml完全DMEM培养液，37℃，5％CO2培养24小时。
(3)转染24小时后，吸除原培养液，换用含有600μg/ml G418的完全DMEM培养液进行加压筛选，3天换液一次。14天后待阳性克隆生长，并达到70％以上汇合成片时，收集细胞。
(4)分别收集pIRESneo-HBx以及对照质粒pIRESneo稳定转染的Huh7细胞，与4×SDS凝胶加样缓冲液混合。100℃煮沸10分钟，行SDS-PAGE(分离胶浓度12％)。电泳4h后，将SDS-PAGE电泳的蛋白条带电转移到硝酸纤维素膜上，用封闭液(5％的脱脂奶粉溶液，溶于PBS中)室温封闭2小时，再加入按1∶1000稀释的兔抗HBxAg多克隆抗体，37℃反应1小时，TBS溶液洗三遍，加入1∶500稀释的HRP标记的羊抗兔IgG，37℃反应1小时，TBS溶液洗3遍，然后用DAB显色反应。
(5)mRNA提取使用QuickPreP mico mRNA纯化试剂盒从Huh7细胞中提取重组质粒pIRESneo-HBx以及对照质粒pIRESneo稳定转染的细胞的mRNA，以分光光度计分别定量检测。
3.消减杂交分别抽提pIRESneo-HBx以及对照质粒pIRESneo稳定转染的细胞的mRNA，将pIRESneo稳定转染的细胞的mRNA加入耦联有oligo dT的磁珠，将吸附mRNA的磁珠置于磁场中，反复淋洗，以去除mRNA以外的其他成分，再利用磁珠上的oligo dT作为引物直接进行逆转录反应，再用洗脱缓冲液洗去mRNA，使磁珠上只保留单链cDNA，然后加入适量(少量)的pIRESneo-HBx稳定转染的细胞的mRNA，使共同表达的基因所对应的mRNA吸附于磁珠，再进行淋洗，将未吸附的mRNA洗脱，对洗脱的mRNA进行RT-PCR扩增，即可大量富集差异表达的基因，即载体转染的Huh7细胞不表达，而pIRESneo-HBx转染的Huh7细胞表达的基因。将扩增产物与pMD18T载体连接，测序，序列再与GenBank进行对比分析。经过6次试验，得到一种高度富集的差异表达基因，该基因片段长745个碱基，与人胎肝cDNA文库中的H49417克隆有98.7％的同源性，命名该基因为UG。对筛选得到的克隆进行DNA测序，再与GenBank中的序列数据中进行比对分析。结果所得克隆的序列如SEQ NO1所示，其编码氨基酸的序列如SEQ NO2所示。
4.逆转录实时荧光定量PCR(1)RNA提取质粒转染的Huh7细胞直接在培养皿上加Trizol试剂，再用QuickPreP mico mRNA纯化试剂提取、纯化mRNA。临床标本则先进行组织匀浆，再用Trizol和QuickPreP mico mRNA纯化试剂提取、纯化mRNA。以紫外分光测定mRNA浓度。
(2)逆转录实时荧光定量PCR从细胞或组织中提取的mRNA各取1μg，加入下列组分配制实时定量一步RT-PCR反应液(One step SYBRRT-PCRkit，TaKaRa)2×SYBR one step RT-PCR缓冲液12.5μlTaqase(5U/μl) 0.5μlM-MLV RTase(200U/μl)0.25μlRNase抑制剂(40U/μl) 0.5μl引物F(10μM) 0.5μl引物R(10μM) 0.5μlRNase Free dH2O8.25μl总体积 25μl。
引物15′-ctgctgagcctgtgcttcc-3′
引物25′-catggtggtggatgaagag-3′以10倍系列稀释的质粒pMD-UG为标准品，仪器为Roche的Lightcycler。反应条件42℃逆转录15分钟，95℃2分钟灭活逆转录酶，然后进行PCR反应95℃5秒，60℃20秒，45个循环。然后分析融解曲线。
结果如图2所示，未经转染的Huh7细胞、以及空载体pIRESneo转染的Huh7细胞内的UG基因几乎不表达，而pIRESneo-HBx转染的Huh7细胞内的UG基因相对高水平表达，表明HBxAg能显著激活UG基因的表达。如图3所示，UG基因在正常肝组织内不表达，而HBV感染的肝组织以及HCC组织内，UG基因高水平表达。
实施例21、UG cDNA表达质粒的构建合成UG基因的扩增引物，上、下游引物中分别引入EcoRI、BamHI酶切位点，PCR扩增UG基因的cDNA片段。
引物15′-gaattcatggccgcgcctgccctgctg-3′引物25′-cccggatccttaagacttcaccaggttcc-3′在0.5毫升离心管建立以下反应体系质粒pMD18-UG 10ng10×Taqase缓冲液 5μl引物1(5mM)2μl引物2(5mM)2μldNTP(10mM)2μlMgCl2(25mM) 2μlTaqase(2U/μl)0.5μl补充双蒸去离子水至总反应体积50μl，在PE2400型PCR仪进行热循环反应先94℃变性2分钟，再94℃变性40秒，60℃退火40秒，72℃延伸50秒，共进行30个循环，然后72℃延伸5分钟，温度降至4℃结束反应。PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，将目的条带回收，以EcoRI、BamH I酶切，酶切产物插入经过EcoRI、BamHI酶切线性化的真核表达质粒载体pIRESneo。
在0.5毫升离心管建立以下反应体系EcoRI、BamH I酶切的HBxAg基因片段6μl5×T4DNA连接酶缓冲液2μlEcoRI、BamH I酶切的质粒载体pIRESneo 2μlT4DNA连接酶(2U/μl) 1μl混匀，置于16℃水浴16小时，取5μl转化感受态大肠杆菌DH5α，得到的氨苄青霉素抗性菌落接种于含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养液，再提取重组质粒进行酶切鉴定，命名为pIRESneo-UG，其结构如图4所示，PCMV为巨细胞病毒启动子，IVS为内含子，IRES为内部核糖体进入位点，Neo为新霉素磷酸转移酶基因，即G418抗性基因，polyA为牛生长激素转录终止序列。
2、UG表达对肝脏肿瘤细胞生长的影响分别将质粒pIRESneo-HBx、pIRESneo-UG以及对照质粒pIRESneo转染Huh7细胞，转染方法同前所述，转染2天后，以胰蛋白酶消化细胞，悬浮于含有5％胎牛血清的DMEM培养液，计数，调整细胞浓度1.0×104/ml，接种96孔板，每天检测细胞的增殖活性。检测时，首先吸除培养液，每孔加新鲜不含胎牛血清的DMEM培养液，再加MTS/PES溶液20μl(Promega)，然后将96孔板敞开于细胞培养箱中继续孵育4小时，于酶标仪上检测A490-A630，结果如图5所示，表明UG具有类似于HBxAg的促进细胞增殖的功能，然而其作用强度不及HBxAg。
SEQUENCE LISTING<110>中国人民解放军第二军医大学<120>一种被乙型肝炎病毒X抗原上调表达的基因及其编码产物与用途<130>说明书，权利要求书<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>745<212>DNA<213>人工序列<400>1tgagcctgcg cggagacgct gggacccacg acgacagaag gcgccgatgg ccgcgcctgc60tgagccctgc gcggggcagg gggtctggaa ccagacagag cctgaacctg ccgccaccag120cctgctgagc ctgtgcttcc tgagaacagc aggggtctgg gtacccccca tgtacctctg180ggtccttggt cccatctacc tcctcttcat ccaccaccat ggccggggct acctccggat240gtccccactc ttcaaagcca agatggtagc tgccatccct gggagcctgg aaccaggcaa300tgttcggggg aggcagggga caggctggaa cctggtgaag tcttaaagta gactcctcct360atcggggtgt agaagggaat ctgttaatca aacagagcaa tattagaaag gctacagagg420tcaactcagt ggaacacggt tctcccaaac agattttgta attccgaaaa tccacgcatg480cgcaaacata cgcatacact cccatgttcc tggacagttt atagctacca taacctggca540ttttccaaaa cataccatgt agactcttgg atacacaagg taattttaga gccacattag600
gatgaacctt ttaaaaggtt atgcatttat ttttatgttt ccccactagc tgtattatag660gacaattttt atatgtgata tgtatttacc ttagtgtgtt aaataaacac tggcattcca720aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 745<210>2<211>99<212>PRT<213>人工序列<400>2Met Ala Ala Pro Ala Glu Pro Cys Ala Gly Gln Gly Val Trp Asn Gln1 5 10 15Thr Glu Pro Glu Pro Ala Ala Thr Ser Leu Leu Ser Leu Cys Phe Leu20 25 30Arg Thr Ala Gly Val Trp Val Pro Pro Met Tyr Leu Trp Val Leu Gly35 40 45Pro Ile Tyr Leu Leu Phe Ile His His His Gly Arg Gly Tyr Leu Arg50 55 60Met Ser Pro Leu Phe Lys Ala Lys Met Val Ala Ala Ile Pro Gly Ser65 70 75 80Leu Glu Pro Gly Asn Val Arg Gly Arg Gln Gly Thr Gly Trp Asn Leu85 90 95Val Lys Ser
权利要求
1.一种被乙型肝炎病毒X抗原上调表达的基因，其特征在于它编码的多肽具有如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的一种被乙型肝炎病毒X抗原上调表达的基因，其特征在于它具有如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
3.权利要求1或2所述的一种被乙型肝炎病毒X抗原上调表达的基因在乙型肝炎相关肝细胞癌的早期诊断中的应用。
4.权利要求1或2所述的一种被乙型肝炎病毒X抗原上调表达的基因在乙型肝炎相关肝细胞癌的治疗中的应用。
全文摘要
本发明涉及生物医药工程技术领域，原发性肝癌具有很高的死亡率，但初期通常无明显症状，由于乙型肝炎病毒X抗原反式激活的基因可能参与肝细胞的恶性转化，本发明的目的就在于筛选在HBV感染的肝细胞中，被HbxAg显著上调表达的基因，该基因在正常肝组织中不表达或极低水平表达。本发明提供了一种被乙型肝炎病毒X抗原上调表达的基因，它具有如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。本发明的基因及其编码产物可以作为乙型肝炎相关肝细胞癌的早期诊断指标和治疗靶点，本发明为进一步探讨HBV致病及致癌机制提供新的研究方向。
文档编号A61K48/00GK1821403SQ200610024200
公开日2006年8月23日 申请日期2006年2月28日 优先权日2006年2月28日
发明者廖小玲, 任浩, 赵平, 戚中田 申请人:中国人民解放军第二军医大学