专利名称：积雪酸在制备预防或治疗肝脏纤维化的药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及积雪酸在制药中的应用，尤其涉及积雪酸在制备预防或治疗肝脏纤维化的药物中的应用。
背景技术：
积雪草是一种植物药，积雪苷是从积雪草中提取的物质，也称为积雪甙(Asiaticoside)，结构见式II。
式II研究发现积雪苷在外用抗皮肤粘膜损伤后，其具有纤维疤痕过增生作用。该物质作为相关用途的化妆品和药品均有上市，在这些产品中积雪苷是其主要活性成份。积雪酸是积雪苷脱糖后即形成的苷元，其结构见式I所示 式I
发明内容
在研究积雪苷抗肝脏纤维化的过程中，发明人发现积雪苷在体外实验时对培养的纤维母细胞的纤维蛋白的形成影响很小，而在积雪苷的体内药代动力学研究中，发现口服积雪苷后，积雪酸(Asiatic acid)在体内浓度较高。当在培养基中加入积雪酸后，发现积雪酸对培养的纤维母细胞的纤维蛋白的形成有一定影响。因此，积雪苷进入人体后可能是以积雪酸的形式发生作用，因而如果积雪酸具有抗肝脏纤维化作用，则可以直接应用积雪酸作为活性成份制成药物，在临床应用时，积雪酸药物能直接发挥药效，起到抗肝脏纤维化作用。
本发明所要解决的技术问题在于通过设计动物实验方法，研究积雪酸抗肝脏纤维化的作用。
本发明的目的是提供积雪酸在制备预防或治疗肝脏纤维化的药物中的应用。
本发明应用大鼠作为实验动物，应用市售的积雪酸为样品进行实验。
本发明通过下列具体实验研究积雪酸的抗肝脏纤维化作用。
本发明应用四氯化碳(CCl4)诱导大鼠肝纤维化作为实验动物模型，是按文献(Rockey DC Gene therapy for hepatic fibrosis-brining treatment into thenew millennium.Hepatology，1999；30816-818、Uleki T.Kaneda Y.TsutsuiH，Nakanishi K，Sawa Y，Morishita R，Matsumoto K.nakamura T，TakahashiH，Okamoto E，Fujimoto J.Hepatocyte growth factor gene therapy of livercirrhosis in rats.Nat Med，1999；5226-230)方法进行的。该方法是研究CCl4导致肝脏纤维化的一个很可靠的模型。
本发明的积极进步效果在于积雪酸具有抗肝脏纤维化作用，因此，积雪酸作为活性成份可用于制备抗肝脏纤维化的药物或其组合物。由于积雪酸单体可以从积雪草中直接提取，而且提取率较高，价格不贵，所以积雪酸的应用有很好的开发前景。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作详细叙述。
实施例1材料与方法1.动物及材料 SD大鼠，雄性，由上海高血压研究所提供2.样品名称积雪酸 广西昌州天然产物开发有限公司或上海医药工业研究院制造，溶于蒸馏水中地塞米松 上海信谊药厂生产，溶于生理盐水3.剂量 积雪酸3mg/kg、9mg/kg和27mg/kg三个剂量组实验方法(1)动物模型制备将60只雄性大鼠随机分成6组正常组、模型组、地塞米松组、积雪酸治疗组(低剂量组、中剂量组、高剂量组)，每组各10只。除正常组给予正常饮食外，其余各组用皮下注射40％CCl4花生油溶液0.3ml/100g(首次每100g体重用纯CCl40.5ml)，每周2次，共12周；同时喂予高脂低蛋白饲料(79.5％玉米粉、20％猪油、0.5％胆固醇)，间日以30％乙醇为饮料。积雪酸治疗组大鼠每天给予积雪酸灌胃1次；正常组及自然恢复组模型组给以等渗盐水灌胃，持续12周；地塞米松组大鼠，给予0.6mg/kg地塞米松。实验结束后股动脉放血处死大鼠，留取血液及全部肝脏，血液经1500r/min离心10min，分离血清，置于-80℃低温冰箱保存，每只大鼠取相同部位肝脏用10％甲醛固定，其余部分肝脏-80℃低温冰箱保存。
结果1.各组大鼠肝脏指数、尿羟脯氨酸排出量及血清学指标变化见表1。各期积雪酸治疗组大鼠肝组织及血清透明质酸(hyaluronic acid，HA)含量、血清谷丙转氨酶活性(ALT)均低于模型对照组(p＜0.01＝。3wk时积雪酸治疗组大鼠肝脏细胞变性、坏死及炎细胞浸润程度均显著低于模型对照组.12wk时模型组成纤维细胞增生达2.8级，HE及VG染色均示假小叶形成；而积雪酸治疗组虽有成纤维细胞及胶原增生，但肝小叶形态完整。这表明积雪酸能显著改善肝功能，减轻肝脏病理损害程度，抑制肝脏细胞外基质形成。
表1各组大鼠肝脏指数、尿羟脯氨酸排出量及血清学指标变化(x-±s)
*与模型组比照，P＜0.012.各组大鼠肝脏纤维化程度正常组大鼠肝组织结构正常，肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列，无胶原纤维增生；模型组大鼠肝小叶结构破坏，肝索排列紊乱，汇管区纤维结缔组织增生明显，胶原纤维粗大，形成纤维间隔及假小叶，纤维化程度较正常组显著增加；地塞米松组纤维化程度较肝纤维化组稍有减轻，纤维间隔稍薄，但延伸仍明显，严重者假小叶仍存在，纤维化程度也较正常大鼠显著增加(χ2＝37.2，P＜0.01)；积雪酸治疗组大鼠肝组织结构改善恢复明显，汇管区结缔组织显著减少，纤维间隔显著变薄、减少，与肝纤维化组比较差异有统计学意义分别为χ2＝48.8，P＜0.05，χ2＝21.7，P＜0.01。
3.积雪酸抗肝纤维化的分子生物学研究体外培养的3T6细胞中，以cDNA为探针进行核酸分子杂交。结果显示积雪酸能显著降低3T6细胞i，iii，iv型前胶原mRNA水平，p＜0.05～0.01。在CCl4大鼠肝纤维化模型中，早期积雪酸治疗组显著降低了i，iii，iv型前胶原mRNA水平p＜0.05～0.01，表明积雪酸对i，iii，iv型胶原基因的表达具有抑制作用是在转录水平上。积雪酸亦可降低肝纤维化时PDGF、PDGF受体PDGFr-β及转化生长因子TGF-β1的mRNA表达水平，提示积雪酸可能通过抑制TGFβ-1、PDGF等肝纤维化相关生长因子的表达而间接抑制胶原合成。
积雪酸对ITO细胞生长增殖的影响ITO细胞位于肝窦周围间隙内，其功能是储存脂肪和维生素A，此外还可产生结缔组织和基质。现在认为ITO细胞是肝小叶内一种相对不活动的成纤维细胞，在一定的条件下可转化为成纤维细胞，在肝硬变的发生发展中具有重要作用。它是正常及肝纤维化时产生胶原的主要细胞。在CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型中，积雪酸能明显抑制肝组织中ITO细胞的增殖及转化，体外培养的ITO细胞中加入积雪酸后，其DNA及胶原合成显著受抑，抑制程度与积雪酸浓度及作用时间成正相关。积雪酸还可阻断血小板衍生生长因子PDGF的促ITO细胞增殖及胶原合成作用。结果显示积雪酸除直接作用外，还通过抑制PDGF的作用而起到间接的抗肝纤维化作用。
结论根据以上实验表明积雪酸作为积雪酸在体内的活性成分，具有抗肝脏纤维化的作用。而本实验利用积雪酸直接给CCL4诱发肝脏纤维化的大鼠模型实验，证明积雪酸确有抗肝脏纤维化的效果。
权利要求
1.积雪酸在制备预防或治疗肝脏纤维化的药物中的应用，其中该积雪酸的化学结构如式I所示 式I。
全文摘要
本发明公开了积雪酸在制备预防或治疗肝脏纤维化的药物中的应用。本发明通过用积雪酸对大鼠肝脏纤维化的影响，证实了积雪酸具有抗肝脏纤维化的作用。因而，积雪酸可作为活性成份用于制备抗肝脏纤维化的药物。
文档编号A61P1/16GK101032493SQ20061002440
公开日2007年9月12日 申请日期2006年3月6日 优先权日2006年3月6日
发明者刘 英, 刘全海, 陈秀华, 王小晨, 肖璘 申请人:上海医药工业研究院