专利名称：一种预防与改善帕金森氏症的组合物及其制法的制作方法
技术领域：
本发明涉及神经退行性疾病领域，尤其涉及帕金森氏症的预防和改善。
背景技术：
帕金森氏症(PD)的病理机制是多方面的。从多巴胺(DA)代谢而言，DA神经元内DA的减少是PD发生的重要环节，其合成代谢的限速酶——酪氨酸羟化酶(TH)需要有四氢喋啶和O2、Fe2+等辅因子的共同参与，并且TH活性和含量都较低；多巴脱羧酶(DDC)则以磷酸吡哆醛为其辅基，另外，自由基的作用是PD产生的另一种机制，多巴胺本身极易发生氧化，在体内单胺氧化酶作用下(Fe3+参与)产生H2O2和O2·+，当机体处于氧化应激状态时，DA就发生代谢失常，成为内源性毒素，同时，Fe2+/Fe3+参与形成神经黑色素，具有自由基清除功能的触酶和谷光甘肽过氧化物酶出现功能缺陷，进一步抑制线粒体NADH电子传递呼吸链，阻断复合物I的活性，导致自由基的积累，另一方面，Fe2+的变化将影响到线粒体内亚铁血红素的合成，导致复合物IV的功能障碍，使线粒体的损伤进一步加剧，不但正常三羧酸循环过程无法进行，而且最终使DA神经元死亡。
不断增加的证据已经显示出不论是由毒物MPTP还是由基因损伤导致的帕金森氏症(PD)，都与氧化损伤有关(Betarbet et al.，2002；Ebadi etal.，1996；Kondo，1996；Schapira et al.，1990)。目前，大多采用抵抗氧化损伤及保护纹状体多巴胺(DA)能神经元的方法治疗PD，例如用Mazindol阻断DA受体；用Dizocilpin马来酸盐封闭NMDA受体；通过给予脑源神经营养因子增强神经元的生存率；提供例如VE、VC等抗氧化物；或用Selegiline抑制单胺氧化酶。然而，所有这些方法因为都有副作用，而不十分有效。
线粒体是氧化剂的来源同时也是其攻击的对象，线粒体抗氧化剂及其代谢物水平的下降有可能会损伤神经细胞抗氧化防御机制的效果，导致老年性痴呆症(AD)、PD等神经退行性疾病。
VB5、VB6、VB11、VB12单独作用时对于PD果蝇运动能力的改善和寿命的延长都有一定的作用，但无法达到对运动能力和寿命都非常有效的效果，甚至会遇到对二者的作用完全相反的现象。
资料显示，对年老大鼠的饮食添加乙酰-L-肉碱(ALCAR)和/或R-硫辛酸(LA)，能够改善随着衰老而增加的线粒体凋亡，降低线粒体所遭受的氧化损伤程度，并增强老年大鼠的意识，及运动活力。而且有报道称，将ALCAR和LA联用，在改善老年大鼠的线粒体凋亡方面比单一使用更有效，联合应用的ALCAR和LA用量大，而且认为用量越大效果越好。
因此，本领域迫切需要提供一种组合物，它所用的剂量小，安全性高，同时能更有效地抑制线粒体的氧化损伤，从而预防、治疗和改善帕金森氏症。
发明内容
本发明旨在提供一种组合物，及其制备方法和用途。
在本发明的第一个方面，提供了一种组合物，它含有二种或多种(如2-12种)线粒体营养素，或者所述的组合物由二种或多种(如2-12种)线粒体营养素构成。
在另一优选例中，所述的线粒体营养素选自下组R-硫辛酸、乙酰肉碱、维生素B5、维生素B6、维生素B11、维生素B12、辅酶Q10、硫胺、核黄素、烟酸、生物素或肌酸。
在另一优选例中，所述的组合物含有(a)维生素B12；(b)一种或多种选自下组的B族维生素维生素B5、维生素B6、维生素B11。
在另一优选例中，上述的组分(b)是维生素B5；或者上述的组分(b)是维生素B5和维生素B6。
在另一优选例中，上述的组分(b)同时包括维生素B5、维生素B6和维生素B11三种B族维生素。
在另一优选例中，上述的组合物还含有(c)一种或多种选自下组的线粒体营养素R-硫辛酸、或乙酰肉碱。
在另一优选例中，所述的组合物含有(i)5-150重量份维生素B5；(ii)2-1000重量份维生素B6；(iii)0.4-40重量份维生素B11；(iv)0.003-1重量份维生素B12；且组份(i)+(ii)+(iii)+(iv)占组合物总重量的10-100％。较佳地组份(i)+(ii)+(iii)+(iv)占组合物总重量的20-90％。
在另一优选例中，所述的组合物含有(i)15-50重量份维生素B5；(ii)50-300重量份维生素B6；(iii)1-10重量份维生素B11；(iv)0.01-0.2重量份维生素B12。
在另一优选例中，所述的组合物还含有(v)100-350重量份R-硫辛酸(vi)100-2000重量份乙酰肉碱；且组份(i)+(ii)+(iii)+(iv)+(v)+(vi)占组合物总重量的15-100％。较佳地组份(i)+(ii)+(iii)+(iv)+(v)+(vi)占组合物总重量的30-90％。
在另一优选例中，所述的组合物还含有(v)150-250重量份R-硫辛酸(vi)180-500重量份乙酰肉碱。
在另一优选例中，所述的组合物含有(1)R-硫辛酸和(2)乙酰肉碱。
在另一优选例中，所述的组合物含有
(1)100-350重量份R-硫辛酸；(2)100-2000重量份乙酰肉碱；且组份(1)+(2)占组合物总重量的10-100％。较佳地组份(1)+(2)占组合物总重量的20-90％。
在另一优选例中，所述的组合物含有(1)150-250重量份R-硫辛酸；(2)180-500重量份乙酰肉碱。
在另一优选例中，所述的组合物还含有(3)5-150重量份维生素B5；(4)2-1000重量份维生素B6；(5)0.4-40重量份维生素B11；(6)0.003-1重量份维生素B12；且组份(1)+(2)+(3)+(4)+(5)+(6)占组合物总重量的15-100％。较佳地组份(1)+(2)+(3)+(4)+(5)+(6)占组合物总重量的30-90％。
在另一优选例中，所述的组合物还含有(3)15-50重量份维生素B5；(4)50-300重量份维生素B6；(5)1-10重量份维生素B11；(6)0.01-0.2重量份维生素B12。
在另一优选例中，所述的组合物还含有药学上可接受的载体。
在本发明的第二个方面，提供了一种组合物的制备方法，它包括步骤①将二种或多种线粒体营养素混合在一起，形成组合物。
在另一优选例中，所述的制备方法中的线粒体营养素选自下组R-硫辛酸、乙酰肉碱、维生素B5、维生素B6、维生素B11、维生素B12、辅酶Q10、硫胺、核黄素、烟酸、生物素或肌酸。
在另一优选例中，它包括步骤在步骤①中，将(a)维生素B12和(b)选自维生素B5、B6或B11中一种或多种B族维生素混合，制得组合物。
在另一优选例中，它包括步骤在步骤①中，再混入(c)一种或多种选自下组的线粒体营养素R-硫辛酸、或乙酰肉碱，制得组合物。
在另一优选例中，它包括步骤在步骤①中，还包括混入一种或多种选自下组的额外的线粒体营养素辅酶Q10、硫胺、核黄素、烟酸、生物素或肌酸。
在另一优选例中，在步骤①中，将(i)5-150重量份维生素B5；(ii)2-1000重量份维生素B6；(iii)0.4-40重量份维生素B11；和(iv)0.003-1重量份维生素B12混合，制得组合物。
在另一优选例中，它包括步骤在步骤①中还包括混入(v)100-350重量份的R-硫辛酸和(vi)100-2000重量份的乙酰肉碱混合，制得组合物。
在另一优选例中，它包括步骤在步骤①中，将(1)R-硫辛酸和(2)乙酰肉碱混合，制得组合物。
在另一优选例中，它包括步骤在步骤①中，还包括混入一种或多种选自下组的额外的线粒体营养素辅酶Q10、硫胺、核黄素、烟酸、生物素或肌酸。
在另一优选例中，它包括步骤在步骤①中，将(1)100-350重量份R-硫辛酸和(2)100-2000重量份乙酰肉碱混合，制得组合物。
在另一优选例中，它包括步骤在步骤①中，还包括混入(3)5-150重量份维生素B5；(4)2-1000重量份维生素B6；(5)0.4-40重量份维生素B11；(6)0.003-1重量份维生素B12混合，从而制得组合物。
在本发明的第三个方面，提供了上述的组合物的用途，将所述的组合物用于制备预防、治疗或改善帕金森氏症的药物，或用于制备预防或改善帕金森氏症的饮食补充剂。
在本发明的第四个方面，提供了一种预防、治疗或改善帕金森氏症的方法，所述的方法是给予需要治疗的对象施用一种或多种(更佳地2种或多种)线粒体营养素。
在另一优选例中，所述的线粒体营养素选自下组R-硫辛酸、乙酰肉碱、维生素B5、维生素B6、维生素B11、维生素B12、辅酶Q10、硫胺、核黄素、烟酸、生物素或肌酸。
在另一优选例中，所述的方法是给予需要治疗的对象施用有效量的(a)维生素B12；(b)一种或多种选自下组的B族维生素维生素B5、维生素B6、维生素B11。
在另一优选例中，所述的治疗方法为还给需要的受试者施加有效量的(c)一种或多种选自下组的线粒体营养素R-硫辛酸、或乙酰肉碱。
在另一优选例中，所述的治疗方法为还给需要的受试者施加有效量的(1)R-硫辛酸和(2)乙酰肉碱。
由此，本发明提供了一种组合物，它剂量小，安全性高，能更有效地抑制线粒体的氧化损伤，达到预防、治疗和改善帕金森氏症的目的。
图1显示了LA、ALCAR及其组合预处理对鱼藤酮所引起的线粒体膜电位下降的抑制效应。
图2显示了LA、ALCAR及其组合预处理对鱼藤酮所引起的线粒体复合物I活性下降的抑制效应。
图3显示了LA、ALCAR及其组合预处理对鱼藤酮所引起的ATP水平下降的抑制效应。
图4显示了LA、ALCAR及其组合预处理对鱼藤酮所引起的细胞色素C释放增加的抑制效应。
图5显示了LA、ALCAR及其组合预处理对鱼藤酮所引起的GSH水平下降的抑制效应。
图6显示了LA、ALCAR及其组合预处理对鱼藤酮所引起的蛋白质氧化损伤增加的抑制效应。
图7显示了LA、ALCAR及其组合预处理对鱼藤酮所引起的氧化的DNA损伤的抑制效应。
图8显示了LA、ALCAR及其组合预处理对鱼藤酮所引起的ROS升高的抑制效应。
图9显示了LA、ALCAR及其组合预处理对鱼藤酮所引起的突触素I(α-synuclein)及其mRNA表达变化的影响。
图10显示了LA、ALCAR及其组合预处理对鱼藤酮所引起的突触素I和泛素(ubiquitin)水平升高的影响。
图11显示了VB5对PD雄性果蝇攀爬能力的影响。
图12显示了VB5对PD雄性果蝇寿命的影响。
图13显示了VB5对PD雌性果蝇攀爬能力的影响。
图14显示了VB5对PD雌性果蝇寿命的影响。
图15显示了VB12对PD雄性果蝇攀爬能力的影响。
图16显示了VB12对PD雄性果蝇寿命的影响。
图17显示了VB12对PD雌性果蝇攀爬能力的影响。
图18显示了VB12对PD雌性果蝇寿命的影响。
图19显示了VB6对PD雄性果蝇攀爬能力的影响。
图20显示了VB6对PD雄性果蝇寿命的影响。
图21显示了VB6对PD雌性果蝇攀爬能力的影响。
图22显示了VB6对PD雌性果蝇寿命的影响。
图23显示了VB11对PD雄性果蝇攀爬能力的影响。
图24显示了VB11对PD雄性果蝇寿命的影响。
图25显示了VB11对PD雌性果蝇攀爬能力的影响。
图26显示了VB11对PD雌性果蝇寿命的影响。
图27显示了VB5+VB12对PD雄性果蝇攀爬能力的影响。
图28显示了VB5+VB12对PD雄性果蝇寿命的影响。
图29显示了VB5+VB12对PD雌性果蝇攀爬能力的影响。
图30显示了VB5+VB12对PD雌性果蝇寿命的影响。
图31显示了VB6+VB11+VB12对PD雄性果蝇攀爬能力的影响。
图32显示了VB6+VB11+VB12对PD雄性果蝇寿命的影响。
图33显示了VB6+VB11+VB12对PD雌性果蝇攀爬能力的影响。
图34显示了VB6+VB11+VB12对PD雌性果蝇寿命的影响。
图35显示了VB5+VB6+VB11+VB12对PD雄性果蝇攀爬能力的影响。
图36显示了VB5+VB6+VB11+VB12对PD雄性果蝇寿命的影响。
图37显示了VB5+VB6+VB11+VB12对PD雌性果蝇攀爬能力的影响。
图38显示了VB5+VB6+VB11+VB12对PD雌性果蝇寿命的影响。
图39显示了LA+ALCAR、VB5+VB6+VB11+VB12以及LA+ALCAR十VB5+VB6+VB11+VB12预处理对MPP所引起的线粒体损伤，进一步导致细胞死亡现象的抑制效应。
图40显示了LA对PD雄性果蝇攀爬能力的影响。
图41显示了LA对PD雄性果蝇寿命的影响。
图42显示了LA对PD雌性果蝇攀爬能力的影响。
图43显示了LA对PD雌性果蝇寿命的影响。
图44显示了ALCAR对PD雄性果蝇攀爬能力的影响。
图45显示了ALCAR对PD雌性果蝇攀爬能力的影响。
图46显示了ALCAR对PD果蝇寿命的影响。
图47显示了LA+ALCAR对PD果蝇攀爬能力的影响。
图48显示了LA+ALCAR对PD果蝇寿命的影响。
图49显示了PD果蝇模型体内酪氨酸羟化酶和突触素I的表达情况。
1.雌性PD果蝇，2.雄性PD果蝇，3.雌性非PD果蝇，4.雄性非PD果蝇图50显示了LA对雄性PD果蝇突触素I表达的作用。
1.非PD果蝇对照，2.PD果蝇对照，3.LA10图51显示了LA对雌性PD果蝇突触素I表达的作用。
1.非PD果蝇对照，2.PD果蝇对照，3.LA10图52显示了LA对雄性PD果蝇突触素ImRNA表达的作用。
图53显示了LA、VB6对PD果蝇神经系统多巴胺神经元的影响。
1.Uas-DDC-gal4果蝇(PD果蝇的父本果蝇)1天，2.PD果蝇对照1天，3.uas-DDC-gal4果蝇20天，4.PD果蝇对照20天，5.PD果蝇施用VB620天，6.PD果蝇施用LA20天图54显示了VB5、VB6、VB11、VB12、LA对雄性PD果蝇突触素I表达的作用。
1.非PD果蝇对照，2.PD果蝇对照，3.VB5，4.VB6，5.VB11，6.VB12，7.LA图55显示了VB5+VB6+VB11+VB12(即VBS)对雄性PD果蝇突触素ImRNA表达的作用。
具体实施例方式
本发明人经过广泛和深入地研究，意外地发现小剂量的乙酰肉碱(ALCAR)和R-硫辛酸(LA)联用，可以有效地抑制神经细胞的老年性退行性病变。
本发明人还意外地发现，将维生素(Vit)B5与维生素B6、B11、B12中的一种或多种B族维生素联用(尤其是是将维生素(Vit)B5、B6、B11和B12四种维生素联用)，可产生协同效应，从而更有效地改善帕金森氏症。
在另一优选例中，发明人更进一步地发现，将小剂量的ALCAR和LA，以及维生素(Vit)B5、B6、B11和B12联用，改善帕金森氏症的效果更佳。
定义如本文所用，术语“含有”或“包括”包括了“包含”、“基本上由……构成”、和“由……构成”。
如本文所用，术语“基本上由……构成”指在组合物中，除了含有必要成分或必要组份之外，还可含有少量的且不影响有效成分的次要成分和/或杂质。例如，可以含有甜味剂以改善口味、抗氧化剂以防止氧化，以及其他本领域常用的添加剂。
如本文所用，术语“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
如本文所用，术语“ALCAR”、“乙酰肉碱”和“乙酰-L-肉碱”可互换使用，都是指L-肉毒碱的乙酰基衍生物。
如本文所用，术语“药学上或食品学上可接受的载体”指用于治疗剂给药或保健品食用的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些载体它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。来自于LA、ALCAR、VitB5、VitB6、VitB11和VitB12等线粒体营养素之外的非必要成分，以及其他非必要成分(例如其他辅助性药材或食材)，也包括在药学上或食品学上可接受的载体的定义中。
如本文所用，术语“必要成分”指作为活性成分的必要的化学物质，即LA、ALCAR、VitB5、VitB6、VitB11和VitB12等线粒体营养素。各成分也可以以“生理学可接受的盐”或“生理学可接受的酸或碱衍生的盐”形式使用。所述的盐包括(但不限于)与如下无机酸形成的盐如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、以及与有机酸形成的盐，而有机酸则指乙酸、草酸、丁二酸、酒石酸、甲磺酸和马来酸。其他盐包括与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐，以酯、氨基甲酸酯或其他常规的“前体药物”的形式(当以这种形式给药时，在体内可转化成活性部分)。
如本文所用，术语“本发明的组合物”包括药物组合物、食物组合物和/或膳食添加剂，只要它们含有或基本上由选自下组的两种或多种线粒体营养素组成R-硫辛酸、乙酰肉碱、维生素B5、维生素B6、维生素B11、维生素B12、辅酶Q10、硫胺(VB1)、核黄素(VB2)、烟酸(VB3)、生物素(VB7)或肌酸。
如本文所用，“线粒体营养素”是指能够保护线粒体免受氧化损伤和能够提高线粒体功能的营养素，包括那些能够①保护线粒体免遭氧化应激，如抗氧化剂和金属螯合物；②修复线粒体膜；③功能性修复和防止线粒体氧化损害，如线粒体酶的底物或辅酶；和④诱导2期抗氧化酶的表达。
如本文所用，术语“单元剂型”是指为了服用方便，将本发明的组合物制备成单次服用所需的剂型，包括但不限于各种固体剂(如片剂)、液体剂、胶囊剂、缓释剂。所述的单元剂型中含有对于预防、治疗、或改善帕金森氏症有效的本发明的组合物。
如本文所用，“重量份”或“重量份数”可互换使用，所述的重量份可以是任何一个固定的以毫克、克数或千克数表示重量(如1mg、1g、2g、5g、或1kg等)。例如，一个由1重量份组分a和9重量份组分b构成的组合物，可以是1克组分a+9克组分b，也可以是10克组分a+90克组分b等构成的组合物。在所述组合物，某一组分的百分比含量＝(该组分的重量份数/所有组分的重量份数之和)×100％。因此，由1重量份组分a和9重量份组分b构成的组合物中，组分a的含量为10％，组分b为90％。
本发明的组合物可直接用于预防、缓解或治疗帕金森氏症，或可与其它药物或膳食添加剂共同给药。
线粒体营养素本发明的组合物中可含有选自下组的一种或多种线粒体营养素R-硫辛酸、乙酰肉碱、维生素B5、维生素B6、维生素B11或维生素B12。本发明的线粒体营养素组合物含有或基本上由①VitB12+VitB5、VitB6、VitB11中的一种或多种构成、或含有或基本上由②R-硫辛酸+乙酰肉碱构成、或含有或基本上由③R-硫辛酸+乙酰肉碱+VitB5+VitB6+VitB11+VitB12构成。通常，①VitB12+VitB5、VitB6、VitB11中的一种或多种、或②R-硫辛酸+乙酰肉碱、或③R-硫辛酸+乙酰肉碱+VitB5+VitB6+VitB11+VitB12的重量占组合物总重量的15-99％，较佳地30-90％，更佳地50-90％。余量的物质是药学上或食品学上可接受的载体。在优选例中，本发明组合物通常不含有目前在治疗帕金森氏症中所含的其他药物，例如L-DOPA，selegiline等。
适用于本发明的代表性的其他线粒体营养素包括(但并不限于)辅酶Q10、硫胺、核黄素、烟酸、生物素和肌酸。
1.辅酶Q10(CoQ)位于线粒体内膜里的一个电子载体，它可以稳定呼吸链组分并能够作为一种线粒体抗氧化剂起作用(Ebadi等人，2001；Ernster，1994；Frei等人，1990)。在多种线粒体病症中，包括PD，亨廷顿氏症和氏共济失调，CoQ对于临床治疗和生化指标的改变都有积极的影响(Beal等人，1998；Ebadi等人，2001；Shults等人，2002)。在用MPTP处理的小鼠中，CoQ能减轻MPTP导致的神经中毒性，提高纹状体的多巴胺水平，增加纹状体的线粒体数量和ATP合成量，并增强纹状体中线粒体复合体的活性(Beal，2003；Ebadi et al.，2001；Ebadi et al.，1996)，减弱由MPTP引起的氧化剂增加以及纹状体中由MPTP导致的多巴胺损耗(Beal et al.，1998；Ebadi etal.，2001)。临床研究显示PD病人应用高剂量CoQ能减缓致残疾症状进程，剂量最高可达1200mg/d。因此CoQ能够安全地减缓PD症状的恶化(Shults et al.，2002)。
体内CoQ(Ernster，1994)，LA，和肉毒碱(Liu et al.，2002)的水平将随年龄退化，补充LA、ALCAR或CoQ可改进在认知功能和神经退化中与年龄有关的衰退现象(Beal，2003年；Liu et al.，2002.a)。
2.硫胺(VB1)硫胺(VB1)是焦磷酸硫胺素辅酶的前体，VB1磷酰化形成焦磷酸硫胺素，它是包括线粒体酶在内的多种酶的辅因子；VB1对于乙酰胆碱的代谢及其从突触前神经元的释放有着重要作用。已有报道指出在神经退化性疾病和其它形式的痴呆症中，例如AD患者的脑和外周组织中VB1依赖的酶活性都降低(Higdon，2003)，其中包括线粒体中的丙酮酸脱氢酶和α-酮戊二酸脱氢酶(Butterworth和Besnard，1990；Gibson等人，1988；Rao等人，1993)，这引起线粒体的凋亡，导致线粒体中蛋白质的氧化，再进一步影响焦磷酸硫胺素的Km值，形成恶性循环，导致脑部功能的失调，并且这种功能缺陷能够被高剂量的VB1逆转(Harman，1988；Heroux et al.，1996)。因此，正常的和病理性的衰老所特有的脑机能失调，可能会被高剂量的VB1所缓解。由此看出，服用VB1有可能是防治PD的有效候选药物。
3.核黄素(VB2)核黄素(VB2)是线粒体复合物I和II的辅酶FMN和FAD的前体。因为VB2衍生物FAD是谷胱甘肽还原酶(催化产生还原型谷胱甘肽)，黄嘌呤氧化酶(催化产生尿酸)以及次甲基四氢叶酸还原酶(可催化高胱氨酸生成甲硫氨酸)的辅酶，所以VB2缺乏有可能通过影响电子传递链，抗氧化酶以及高胱氨酸的代谢从而对脑机能产生间接影响。同时高胱氨酸水平升高(Duan et al.，2002；Kruman et al.，2002；Seshadriet al.，2002)以及还原型谷胱甘肽(Shukitt-Hale et al.，1998)和尿酸(Ames et al.，1981)的水平降低均与衰老和认知机能障碍相关。以FMN和FAD为辅助因子的线粒体复合物I在PD病人中存在缺陷。最近生理学实验和病理学实验将主要起作用的产氧位点限制在线粒体复合物I的FMN基团上，而不像以前的观点普遍认为产氧位点在线粒体复合物III的泛醌上，这个发现进一步证明了改善PD线粒体复合物I缺陷的重要性(Liu，Y.，Fiskum，G.，and Schubert，D.2002d)。已有临床研究表明服用高剂量VB2(口服，每8小时30mg)同时除去食物中的红肉，可提高一些PD病人的运动能力(Coimbra andJunqueira，2003)，这提示可以通过此疗法改善PD患者的VB2敏感机制，如谷胱甘肽消耗，累积性线粒体DNA突变，无序线粒体蛋白复合物及铁代谢异常等等。VB2可能刺激线粒体酶使之活性上升，并能改变FMN/FAD的Km值。但是VB2又是线粒体外膜上的单胺氧化酶(MAO)的重要辅酶，它的增加有可能会使多巴胺系统内的多巴胺分解增多，不利于PD的症状的改善。因此VB2的应用必须与其他线粒体营养素精心搭配，防止副作用的产生。
4.烟酸(VB3)尼克酸和尼克酰胺统称烟酸，是NAD和NADP的前体。在线粒体和细胞质中，高剂量的尼克酸能提高NAD/NADP的水平(Ames等人，2002)，增加线粒体复合物I对底物的亲和机会，进一步提高酶活性。NADH和NADPH不但是线粒体复合物I的底物和辅酶，同时也是一种内源性抗氧化剂。VB3在MPTP处理的小鼠和聚ADP-核糖多聚酶敲除小鼠中应用可以抵御神经毒性，并能减少神经性损伤及局灶性脑缺血、丙二酸和MPTP引起的ATP消耗(Beal，2003)。NADH还可以刺激内源性多巴胺合成，减轻PD患者的肌肉运动损伤和识别功能失调(Birkmayer and Birkmayer，1989；Kuhn andMuller，1997)。也有报道证明VB3与VB2共用时对线粒体复合物I缺陷疾病有一定疗效，如线粒体脑病、乳酸中毒症及脑休克。而PD患者的VB3摄取量明显降低(Hellenbrand et al.，1996)，需要适当补充。
5.生物素(VB7)以VB7作为辅助因子的线粒体酶包括丙酮酸羧化酶，乙酰辅酶A羧化酶，丙酰辅酶A羧化酶，以及羧化全酶合成酶等，参与体内的糖代谢、脂肪酸合成和多种氨基酸的代谢过程。VB7缺乏在人群中(特别是在孕妇中)是相当普遍的，(Mocket al.，2002.a；Mock et al.，2002b)，并直接导致线粒体的老化和氧化剂的产生(Atamna，Erlitski，& Ames，2005)。VB7对于上述四种酶分子上依赖生物素的羧基是弥补性基团(Mock，1989)，其中前三种是线粒体专一酶，都催化三羧酸循环中的代谢物反馈反应，同时提供亚铁血红素的前体——琥珀酰辅酶A。缺乏VB7将降低这些酶的活性，并且VB7缺乏时线粒体中积累的β-甲基巴豆酰-CoA与氨基乙酸起反应(Mock，1989)，导致线粒体基质中的氨基酸耗尽。因此，缺乏VB7将导致线粒体琥珀酰辅酶A和氨基乙酸的缺乏，进一步引起亚铁血红素的缺乏。
6.肌酸(creatine)肌酸(creatine)是由精氨酸(arginine)、甘氨酸(glycine)及甲硫氨酸(methionine)三种氨基酸所合成的物质。肌酸可以在肝、肾、胰等器官内自行合成；也可摄取自饮食。在细胞质和线粒体之间肌酸/磷酸肌酸转化系统能够利用一种独特的线粒体肌酸激酶(CK)的重组异构体并作为一种空间能量缓冲器起作用细胞内的肌酸、磷酸可与磷酸肌酸(phosphocreatine)根据细胞的代谢水平和ATP浓度互相转换。肌酸能提高肌酸/磷酸肌酸的转化并抑制线粒体通透性转运孔的开启(Beal，2003)。ATP是机体无氧代谢的供能物质，但其分子量大且在体内外稳定性差，而肌酸分子量小化学稳定性好，在体内有广泛的储备意义。一个以45名年轻的素食主义者为对象所进行的双盲实验中，安慰剂对照的交叉试验显示口服肌酸添加剂六周(5g/天)对于脑力工作和需要高效率的工作同样都具有显著作用(Rae等人，2003)。同样，肌酸也已经用于包括PD和亨廷顿病在内的多种神经性疾病的治疗。
在本发明中，可有效用于预防、改善和治疗帕金森氏症的线粒体营养素组合物包括但不限于①VitB12+VitB5、VitB6、VitB11中的一种或多种；②R-硫辛酸+乙酰肉碱；③R-硫辛酸+乙酰肉碱+VitB5+VitB6+VitB11+VitB12。对于患有帕金森氏症的哺乳动物，施用上述线粒体营养素制备成的组合物，能够获得显著增进的效果。所述的组合物为药物组合物；或为食物组合物。
在本发明的一种优选方式中，采用选自以下的组分来配制所述的组合物VitB12、VitB5、VitB6、VitB11，所述的组分可以两种、三种或四种任意组合，一种更优选的组合方式是VitB12+VitB5+VitB6+VitB11。
在本发明的一种优选例中，采用R-硫辛酸+乙酰肉碱联合应用的形式，比单独应用在效果上大大提高，且在剂量上大大降低。
此外，在本发明的一个优选例中，当采用①VitB12+VitB5+VitB6+VitB11的组合时，将R-硫辛酸+乙酰肉碱加入到①中，可达到更优的效果。
因此，本发明的用于预防、改善或治疗帕金森氏症的组合物中，含有维生素B12和维生素B5、B6或B11中任选的一种或多种。当组合物中含有组分维生素B12时，还含有组分维生素B5、维生素B6或维生素B11中的一种或多种，比如，所述组合物包括但不限于维生素B12+维生素B5的组合物、维生素B12+维生素维生素B6的组合物、维生素B12+维生素B11的组合物、维生素B12+维生素B5+维生素B6的组合物、维生素B12+维生素B5+维生素B11的组合物、维生素B12+维生素B6+维生素B11的组合物、或维生素B12+维生素B5+维生素B6+维生素B11的组合物。
在一个优选例中，所述的组合物含有(i)5-150重量份维生素B5，较佳地15-50重量份，更佳地25-35重量；(ii)2-1000重量份维生素B6，较佳地50-300重量份，更佳地80-150重量份；(iii)0.4-40重量份维生素B11，较佳地1-10重量份，更佳地2.5-5.5重量份；(iv)0.003-1重量份维生素B12，较佳地0.01-0.2重量份，更佳地0.07-0.15重量份；且组份(i)+(ii)+(iii)+(iv)占组合物总重量的10-100％；较佳地，组份(i)+(ii)+(iii)+(iv)占组合物总重量的20-90％；更优选地，组份(i)+(ii)+(iii)+(iv)占组合物总重量的40-90％。
本发明的用于预防、改善或治疗帕金森氏症的组合物中，含有R-硫辛酸和乙酰肉碱。
在一个优选例中，所述的组合物含有(1)100-350重量份R-硫辛酸，较佳地150-250重量份，更佳地180-220重量份；
(2)100-2000重量份乙酰肉碱，较佳地180-500重量份，更佳地180-300重量份；且组份(1)+(2)占组合物总重量的10-100％；较佳地，组份(1)+(2)占组合物总重量的20-90％；更佳地，组份(1)+(2)占组合物总重量的40-90％。
在本发明的一种优选方式中，组分(1)与(2)以适当的比例存在，(1)与(2)的重量比为1∶10-10∶1；更优选的，组分(1)与(2)的重量比为1∶5-5∶1；最优选的，组分(1)与(2)的重量比为1∶1-3∶1。
作为本发明的一种特别优选的组合物，其含有组分如下(a)5-150重量份维生素B5，较佳地15-50重量份，更佳地25-35重量；(b)2-1000重量份维生素B6，较佳地50-300重量份，更佳地80-150重量份；(c)0.4-40重量份维生素B11，较佳地1-10重量份，更佳地2.5-5.5重量份；(d)0.003-1重量份维生素B12，较佳地0.01-0.2重量份，更佳地0.07-0.15重量份；(e)100-350重量份R-硫辛酸，较佳地150-250重量份，更佳地180-220重量份；和(f)100-2000重量份乙酰肉碱，较佳地180-500重量份，更佳地180-300重量份；且组份(a)+(b)+(c)+(d)+(e)+(f)占组合物总重量的15-100％；较佳地，组份(i)+(ii)+(iii)+(iv)占组合物总重量的30-90％；更优选地，组份(i)+(ii)+(iii)+(iv)占组合物总重量的50-90％。
本发明的组合物中还可以含有一种或多种代表性的其他线粒体营养素8-1200mg重量份辅酶Q10、4-200mg重量份硫胺、2-240mg重量份核黄素、20-800mg重量份烟酸、1-20mg重量份生物素和0.5-12mg重量份肌酸。
在另一优选例中，所述的组合物含有(i)VB5 15mg(ii)VB6 50mg(iii)VB11 2mg(iv)VB12 0.05mg。
在另一优选例中，所述的组合物含有(1)R-硫辛酸 100mg，(2)乙酰肉碱 100mg。
在另一优选例中，所述的组合物含有(a)R-硫辛酸 100mg，(b)乙酰肉碱 100mg(c)VB5 15mg(d)VB6 50mg(e)VB11 2mg(f)VB12 0.05mg。
作为本发明的一种特别优选的组合物，所述的组合物中还含有药学上或食品学上可接受的载体或赋形剂50-1000重量份。
本发明的药物组合物或饮食补充剂，可以通过常规方法制成任何常规的制剂形式，优选缓释剂型，可以使必要成分缓慢而稳定、持续地释放。
所述的缓释剂型可以通过常规的方法制得，一种优选的方法是用赋形剂作为包覆材料，将必要成分包覆于其中，形成包衣缓/控释制剂，或将必要成分载入缓释骨架中，形成骨架型缓/控释制剂。另一优选方法是将必要成分制成各自的盐，利用不同盐的溶解度差异使各必要成分逐步释放，产生长效。
本发明提供的组合物可以根据所需制备的剂型以及给药途径来决定，本领域技术人员在参考了本发明所提供的组合物以及配比后，采用常规的药物组合物或食物组合物的制备方法即可制备出本发明的组合物。一种优选的方法是先将脂溶性的必要成分先用助溶剂助溶后再加入水溶解制成溶液，而水溶性必要成分直接用水溶解制成溶液，然后将脂溶性必要成分的溶液和水溶性必要成分的溶液混合，从而制得本发明提供的组合物。
本发明提供的组合物用于预防和改善帕金森氏症的用法用量为每日100-350mgLA和100-2000mgALCAR；或每日4-150mgVitB5、2-1000mgVitB6、0.4-40mgVitB11和0.003-1mgVitB12；或每日100-350mgLA、100-2000mgALCAR、4-150mgVitB5、2-1000mgVitB6、0.4-40mgVitB11和0.003-1mgVitB12。
本发明提供的用于预防和改善帕金森氏症的组合物中还可包括但并不限于下述一种或多种代表性的其他线粒体营养素辅酶Q10、硫胺、核黄素、烟酸、生物素和肌酸，其用法用量为口服辅酶Q108-1200mg/天、口服硫胺4-200mg/天、口服核黄素2-240mg/天、口服烟酸20-800mg/天、口服生物素1-20mg/天、口服肌酸0.5-12mg/天。
一种优选的方法是在服用时补充能量，如同时服用碳水化合物、果汁饮料，从而提供辅助的用于预防和改善帕金森氏症的能量，促进线粒体ATP的合成。所需补充的能量大概在50-150卡路里。
当用于制备药物组合物或食物组合物时，所用的线粒体营养素组合物的有效剂量可随施用的模式和待治疗的疾病的严重程度而变化。
对于本发明所述的组合物的剂型没有特别的限制，可以是任何适用于哺乳动物服用的剂型；优选的，所述的剂型可选自颗粒剂、胶囊、片剂、粉末剂、口服液、混悬液、或乳剂。
在本发明的另一优选方式中，所述的组合物作为一种膳食添加剂，添加到水、非-橙汁饮品等饮料、固体食品、烹饪菜肴中，比如可添加到葡萄汁或苹果汁中。优选添加到可以提供至少50-150卡路里热量的膳食中。
在本发明的另一优选方式中，所述的食品上学可接受的载体或赋形剂选自填充剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、泡腾剂、矫味剂、包覆材料、膳食制品、或缓/控释剂。
在本发明的另一优选方式中，所述的组合物为单元剂型，每剂含有100-350mgLA和100-2000mgALCAR；或含有4-150mgVitB5、2-1000mgVitB6、0.4-40mgVitB11和0.003-1mgVitB12；或含有100-350mgLA、100-2000mgALCAR、4-150mgVitB5、2-1000mgVitB6、0.4-40mgVitB11和0.003-1mgVitB12。每剂中还可以含有一种或多种代表性的其他线粒体营养素8-1200mg辅酶Q10、4-200mg硫胺、2-240mg核黄素、20-800mg烟酸、1-20mg生物素和0.5-12mg肌酸。
当将组合物制备成单元剂型时，每天服用所述单元剂型的组合物1-3剂；更优选的，每天服用所述单元剂型的组合物1-2剂。
本发明提供的组合物可通过口服等途径给予。固态载体包括淀粉、乳糖、磷酸二钙、微晶纤维素、蔗糖和白陶土，而液态载体包括培养基、聚乙二醇、非离子型表面活性剂和食用油(如玉米油、花生油和芝麻油)。在制备药物组合物中通常使用的佐剂也可有利地被包括，例如调味剂、色素、防腐剂和抗氧化剂如维生素C、BHT和BHA。
从易于制备和给药的立场看，优选的药物组合物是固态组合物，尤其是片剂和固体填充或液体填充的胶囊。口服给药是优选的。
更优选的剂型是那些可以保证营养素缓慢而稳定地24小时补充给线粒体，一种方式是用合适的载体承载将线粒体营养素组合物，使得线粒体营养素组合物缓慢释放。比如以赋形剂(如羟丙甲基纤维素)作为包覆材料，将线粒体营养素包在其中，形成球状颗粒(包衣缓/控释制剂)；或将线粒体营养素载入骨架缓释片(如羟乙基纤维素)中(骨架型缓/控释制剂)。
应理解，本发明的线粒体营养素组合物中还可含有其它人体所必需的或对人体有益但不影响或不产生直接的药效的成分。此外，根据医师的指导，本发明的组合物也可与其它常规的治疗或预防帕金森氏症的药物共同施用。
本发明的组合物可用于制备预防、改善或治疗细胞线粒体代谢紊乱的药物；或者，本发明所述的组合物可用于制备预防、改善或治疗帕金森氏症的药物。
本发明人利用转入突触素I基因的果蝇帕金森氏症模型(由突触素I转基因型果蝇与uas-DDC果蝇杂交所得)，帕金森果蝇模型表达突触素I，并在成年后发生多巴胺神经元的丢失，神经元内出现细丝状含有突触素I的内含物，运动功能出现障碍。由于这种果蝇模型具备人体帕金森症的基本特征，因此可以利用这一遗传学方法来进行帕金森氏症的研究。
发明人发现，将VB5、VB6、VB11和VB12联合作用于PD果蝇模型上，PD果蝇的运动能力和寿命有明显的改善。
单独作用时50X剂量组的LA对PD果蝇的运动能力和寿命均有效，而ALCAR只延长了PD果蝇的寿命，对运动能力没有影响。二者联合作用时，10X剂量组对PD果蝇运动能力的作用强于10X剂量LA的单独作用。
VB5、VB6、VB11、VB12、LA和ALCAR彼此间的联合作用强于单药的作用，并且联合作用条件下疗效更稳定和安全。在MPP处理细胞引起的线粒体损伤的实验中，发明人发现LA+ALCAR+VB5+VB6+VB11+VB12预处理后的细胞存活率，比LA+ALCAR预处理或VB5+VB6+VB11+VB12预处理的细胞存活率高。
本发明人利用SK-NM-C的慢性鱼藤酮模型(5nM，4周)作为一个体外PD模型再现了鱼藤酮对线粒体功能的毒性影响，对PD病理特征、线粒体功能和氧化与抗氧化损伤生物标记等几个方面进行考察，用LA(0.1，1，10，100uM)，ALCAR(0.1，1，10，100uM)和他们不同组分的组合进行4周预处理。PD的分子病理表现是线粒体功能缺陷。在这个细胞模型里，鱼藤酮处理后的线粒体内膜上的复合体1活性降低、ATP损耗量增加以及细胞色素酶C的释放增加。合适剂量的LA和ALCAR两种线粒体营养素对用鱼藤酮处理后的线粒体有治疗作用。最有效的剂量是10uM的LA和100uM的ALCAR，并且当两者混合使用后，有效剂量出现在0.1和1uM，这种最佳配比比任何一种单用有效得多。LA和ALCAR这样的线粒体营养素可以有效的抑制鱼藤酮引起的细胞氧自由基的产生及氧化损伤。
本发明证明线粒体营养素VB5、VB6、VB11、VB12、LA和ALCAR及其不同组合在PD果蝇模型上会有不同的疗效，并且VB5、VB6、VB11和VB12联合应用，或LA和ALCAR联合应用的效果强于药物的单独作用。LA和ALCAR对抑制PD细胞模型线粒体的功能紊乱、氧化损伤和阻止突触素I及泛素的积累有一定的作用。并且，LA和ALCAR两种药在低浓度时(0.1-1uM)的混合物表现出一种正协同效应，这比单独用10倍浓度的任何一种药来对鱼藤酮处理引发的线粒体功能紊乱和氧化损伤都有效。另外，LA+ALCAR+VB5+VB6+VB11+VB12对细胞的保护作用强于LA+ALCAR或VB5+VB6+VB11+VB12的组合。
本发明的主要优点在于1、通过将必要成分有机地组合在一起，多靶点、多方位地发挥协同作用；2、成分天然，无毒副作用，适于长期服用；3、成本低廉，实用有效；4、功效明显。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分比和份数按重量计。
实施例1-3制备组合物No.1-3
将LA和ALCAR按上述配方混合，制得组合物No.1-3。
实施例4-6制备组合物No.4-6
将VitB5、VitB6、VitB11和VitB12按上述配方混合，制得组合物No.4-6。
实施例7-9制备组合物No.7-9
将LA、ALCAR、VitB5、VitB6、VitB11和VitB12按上述配方混合，制得组合物No.7-9。
实施例10LA和ALCAR的协同作用(细胞学实验)材料ALCAR(购自德国Sigma-Tau公司)和LA(R-a-lipoic acid tris盐，购自德国Viatris公司)；ADP和鱼藤酮(购自sigma公司)；DCF-DA，JC-1，Hoechst 33258和TRITC偶联鼠源IgG抗体(购自Molecular Probes公司)；蛋白氧化损伤检测试剂盒(购自Chemicon International Inc.Temecula公司)；抗8羟基鸟苷抗体(购自TrevigenGaithersburg MD公司)；BCA蛋白定量试剂盒(购自PIERCE公司)；抗a-synuclein单克隆抗体(购自Calbiochem公司)；抗泛素修饰抗体(购自DAKO公司)；IQTM SYBER绿(购自Bio-Rad公司)；FITC和TRITC偶联羊抗兔抗体(购自Sino-American Biotech公司)；免疫印迹分析试剂(购自Santa Cruz生物技术公司)；小牛血清(购自Hyclone公司)；双抗(购自Invitrogen公司)；GSH分析试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)。
细胞培养和处理SK-N-MC神经成纤维细胞，培养在Earle’s缓冲液的MEM培养基中，培养基中加入15％小牛血清，5mM葡萄糖，2mM谷氨酸，1mM丙酮酸钠，非必需氨基酸，50U/ml的青霉素和链霉素。培养基中加入LA和ALCAR以及这两种药物的组合培养四周。LA和ALCAR的浓度分别是0.1，1.0，10，100uM以及不同浓度的组合0.1uM LA+ALCAR0.1uM，1uM+1uM，10uM+10uM，0.1uM+1uM，0.1uM+10uM.用MEM洗涤3次以后换5nM或者没有5nM鱼藤酮的培养基培养4周(Sherer et al.，2002)。LA和ALCAR储备液溶解在无菌的PBS缓冲液中。鱼藤酮溶解在乙醇中。对照细胞加入乙醇和PBS。常规的细胞培养在24孔板中，每周换培养基三次，每周等细胞长满之后传代培养。
线粒体膜电位分析(MMP)用JC-1测定线粒体膜电位(Tirosh et al，2000)，JC-1是一种双发射光，电势敏感的分子探针，当线粒体电位很低的时候或者低浓度单体存在的时候发射绿光(529nm)，高浓度则自己聚合发射红光(590nm)。两种成分对电势都非常敏感，并且红光和绿光的比例能够提供线粒体电势的分析。5×104细胞培养在特意的96孔板中(blk/clrbtm，Costar)检测荧光。细胞用10uM/ml的JC-1，37摄氏度孵育15分钟。孵育之后用PBS洗涤两次，用双波长/双光酶标仪检测(Flex Station_384，购自Molecular Devices，USA)线粒体复合物I活性分析SK-N-MC细胞用差速离心的方法分离线粒体(Humphries and Szweda，1998).3×107细胞用预冷的PBS洗涤两次，用提取缓冲液重悬细胞(0.25M蔗糖，5mM Tris-HCl缓冲液，pH7.5，和1mM EDTA pH8.0)和用玻璃研磨器研磨，没有破的细胞用600g离心15分钟，悬液10000g离心25分钟，线粒体沉淀用提取介质洗涤一次，线粒体复合物I的活性动力学，通过测定DCPIP在600nm的吸收光值减少测定(Smith 1967)。
ATP水平检测ATP水平的测量使用了可浸透洋地黄皂苷的细胞和可定量蛋白质浓度的生物发光试剂盒。
细胞在96孔板中长满后。吸走缓冲液，在每个空中加入0.25M蔗糖100ul，20mMMOPS，0.05mg/ml洋地黄皂苷，调PH到7.4，置于室温3分钟。再换成含0.25M蔗糖的洋地黄皂苷缓冲液，20mM MOPS，20mM EDTA，调PH到7.4放置5分钟，干燥并用含0.25M蔗糖的缓冲液100ul，20mM MOPS，20mM EDTA，5mM无机磷酸盐，1mM ADP的缓冲液，调PH值到7.4按如下安排加入一些只加缓冲液；一些加入5mM丙酮酸和1mM L-苹果酸；一些加入5mM谷氨酸和1mM L-苹果；一些加入1.0uM鱼藤酮和10mM琥珀酸；最后加入2mM抗霉素A，2mM抗坏血酸和0.1mM TMPD。37摄氏度孵育1小时，再加入1.6M高氯酸20ul和15ul6N碳酸钾3000g离心10分钟来沉淀细胞碎片。用生物荧光分析系统分析ATP水平，用BCA蛋白定量试剂盒测蛋白质浓度。
细胞色素C释放检测细胞是在MEM培养基中在盖玻片上长满。移去缓冲液加入预热37摄氏度的包MTGFM(1∶100，1uM)。37摄氏度孵育1小时后，用新鲜的预热过的生长缓冲液洗涤细胞。小心的移去清洗缓冲液，加入预先准备好的含3.7％甲醛的生长缓冲液，然后37摄氏度孵育15分钟。固定后用PBS冲洗涤几次细胞。固定了的细胞再用100％的甲醇在零下20摄氏度渗透5分钟。渗透后用PBS洗3次每次10分钟。用5％的BSA室温处理1小时，然后用细胞色素C抗体(鼠1∶1000)稀释至1％BSA室温孵育1小时。用PBS冲洗细胞3次每次5分钟，用FITC偶联鼠抗体(1∶500)稀释的BBS室温孵育1小时。用PBS洗3次每次10分钟，用2ug/ml DAPI孵育1小时。冲洗细胞并用共聚焦显微镜分析。
GSH水平检测细胞在100mm板上生长，用0.4ml 0.9％的NACL溶液使细胞(1×107)破碎，细胞小球颗粒均匀分布。4摄氏度3000g；离心10分钟，收集上清。基于DTNB用GSH分析试剂盒分析GSH，并用分光光度计在412nm下测量。GSH是细胞蛋白质的指标和表达，作为参照细胞的GSH水平百分比。
蛋白质羰基化检测对于蛋白质羰基化测定，细胞在100mm板上生长。按以上所描述的用Western-Blotting方法收集可溶和不可溶的蛋白质片断。蛋白质羰基化用蛋白氧化损伤检测试剂盒测定。
简要步骤5ul(3ug/ul)的蛋白质与等量的12％的SDS及两倍量的1xDNPH混合溶解。参照反应用1x引物替代DNPH参照溶液。室温反应进行15分钟后加入1.5倍的中和溶液停止。15ug蛋白质12％SDS-PAGE电泳后转移到硝化纤维素膜，加1％BSA/PBS-T(PBS包含0.05％两者混合20)室温摇动1小时。膜在1∶150的兔抗二硝基苯基化腙抗体中4摄氏度过夜。PBS-T洗3遍后膜在辣根过氧化酶羊抗兔偶联抗体中室温孵育1小时。放射自显影曝光胶片。
DNA氧化损伤用生产商提供的方案(1∶300)配出的8羟基鸟苷抗体测DNA氧化损伤，细胞生长在12mm盖玻片上，用70％乙醇在零下20摄氏度条件下混合10分钟。TRITC-偶联抗鼠抗体被用作二抗。用激光共聚焦显微镜成像。红色荧光使每个细胞量化。3次独立实验的数据描述平均值+/-标准偏差。检测最少200个细胞。
DNA氧化损伤也用彗星电泳分析。这一常规的方法已经被前人验证过(Olive etal，1990，2005；Tice et al，2000)。用0.25％的胰岛素和稀释的培养液处理使细胞散开。10ul的细胞(1×104)和90ul的0.6％的低熔点琼脂糖在37摄氏度混合，迅速在显微镜载玻片上涂一层1％的正常溶点的琼脂糖。把载玻片浸入100ml混合溶液(2.5MNaCl，100mM EDTA，10mM Tris，pH10)，加10mlTriton X-100和10ml的DMSO。然后置入电泳缓冲液中(300Mm NaOH，1Mm EDTA，PH大于13)4摄氏度20分钟，使DNA在电泳前松散。电泳在4摄氏度0.73V/cm，28mA条件下跑20分钟。载玻片浸入0.4M Tris，pH7.5，用2ug/ml DAPI褪色后盖上盖玻片。细胞用Olympus BX61a 60油镜(光圈值＝1.25)连接Olympus DP70显微镜观察。用DAPI使核褪色用UV激光(380nm)激发。用Image-ProPlus软件分析图像。从每个模型中随机选出50个，并测量彗尾作为这个模型DNA氧化损伤的指标。3次独立实验的数据描述平均值+/-标准偏差。
活性氧检测细胞在24孔板中长满。吸走培养液，在每个孔中加入500ul 0.25M蔗糖，20mMMOPS，0.05mg/ml洋地黄皂苷，调pH至7.4，室温放置3分钟。再用含0.25M蔗糖，20mMMOPS，20mM EDTA的洋地黄皂苷缓冲液，调pH至7.4，室温放置5分钟，后干燥。再加入含0.25M蔗糖，20mM MOPS，20mM EDTA，5mM无机磷酸盐，1mM ADP，5mM谷氨酸，1mM L-苹果酸的呼吸缓冲液，调pH至7.4并加入10uM羧基H2DCFDA在37摄氏度的条件下测量线粒体的ROS 30分钟。替换缓冲液，用PBS洗，将细胞移到Eppendorf管，并进行细胞计数分析。
突触素I和泛素水平检测荧光免疫标记法和Western blotting检测突触素I和泛素的分布状态与水平。用荧光免疫标记法检测，细胞生长在12mm的盖玻片上，突触素I和泛素已经有人做过(Arima et al 1999，Zhang et al，2004)经过一些修改简要步骤如下细胞在零下20摄氏度与甲醇混合10分钟，用PBS洗后用5％的BSA在室温处理1小时。洗三次后混合后的细胞溶液中加入突触素I鼠抗体(1∶200)和泛素(1∶500)兔抗体，室温孵育半小时，接下来用PBS洗3次。之后加入FITC偶联羊抗鼠抗体(1∶100)和TRITC偶联羊抗兔抗体(1∶100)在37摄氏度条件下孵育半小时后再洗三次。之后加入5ug/mlHoechst33342室温孵育10分钟，用PBS洗3次后，将细胞置于甘油/PBS(9∶1)混合物中，然后使用LSM510META_德国_Zeiss激光共聚焦显微用63x/1.4HCxPlanAPO的油镜观察。突触素I用氩激光(488nm)激发，泛素用氦激光(543nm)激发，DNA用UV激光(364nm)激发。
用Western blotting检测，细胞被收集，蛋白质被萃取，在前人做Westernblotting检测的经验基础上修改，简要步骤如下细胞被溶解缓冲液(50mMTris-HCl，250mM NaCl，5mM EDTA，50mM NaF，1％NP40，2ug/ml aprotinin，2ug/mlleupeptin，1mM phenylmethylsulfonyl fluoride，700U/ml DNase I，1％beta-mercaptoethanol以上试剂均购自Sigma公司)。用BCA蛋白定量试剂盒定量可溶蛋白质，考马斯亮蓝调平检测不溶蛋白质。等量蛋白质加15％SDS-PAGE电泳后转膜到硝化纤维素膜，用5％BSA加入TBS-T(20mM Tris，500mM NaCl，0.1％两者混合20)室温摇动固定2小时。膜浸时在突触素I鼠抗体(1∶2000)或泛素(1∶500)兔抗体中，在4摄氏度孵育过夜。之后用TBS-T洗涤六次，每次5分钟。加入与二抗(突触素I1∶4000羊抗鼠抗体，泛素1∶1000羊抗兔抗体)相偶联的辣根过氧化酶，室温1-2小时。荧光放射自显影使胶片感光。
反转录引物设定及反转录PCR的定量cDNA链是由1ug总RNA和少量dNTP用反转录酶XL(购自Takara，Shiga，Japan公司)合成的。引物参考Sherer et al.，2002β-actin的正引物，序列为tcaccatggatgatgatatcgcc；β-actin的反引物序列为ccacacgcagctcattgtagaagg；突触素I正引物为aggactttcaaaggccaagg；突触素I反引物为tcctccaacatttgtcacttgc。这两对引物都可以使瘤状突起的边界交叉。用RT-PCR仪的多次循环来扩增以达到定量的目的(Bio-Rad，Hercules，CA)。这两种PCR产物的量通过IQTM SYBER的荧光接收器在每一个循环最后退火这一步进行跟踪定量。反应在含有200nmol正反因物的25ul体系中完成。每个模板基因的表达水平用2-CT方法来计算。在的靶序列扩增到一定的大小的时候再开始采集数据。2-CT描述在处理后的细胞里基因表达的曲线变化。以actin的表达量以及没有处理的细胞(control)来做一个标准_CT＝_CT，Rotenone-_CT，Control＝(CT，synuclein-CT，actin)Rotenone-(CT，synuclein-CT，actin)Control.mRNA水平的结果用处理后的细胞与Control细胞的比来表示。
结果MMP的效果如图1A(在激光共聚焦显微镜下JC-1的分布状态)和图1B(荧光读数分析JC-1的数量)，对比参照系，鱼藤酮处理导致线粒体膜的激发荧光由红变绿，红光强度/绿光强度的比值降低，说明鱼藤酮诱导线粒体去极化。而LA，ALCAR及其组合的预处理能够有效的抑制这一效应，其中LA+ALCAR(0.1μM或1μM)最为有效。LA 10μM或ALCAR100μM一样有效。经过鱼藤酮处理后的细胞用LA或ALCAR预处理与Shere等(2002)做过的那样在200μM H2O2中处理2小时有同样的效果(如图1C)。由于鱼藤酮处理后加与不加H2O2同样的效果，所以我们以下所有的分析都不加H2O2.。
结果表明，低剂量LA+ALCAR(0.1μM或1μM)能最有效地抑制线粒体去极化。
复合物I活性的分析结果用不同浓度DCPIP测定线粒体复合物I的活性动力。如图2所示，发现鱼藤酮处理使复合物I的活力比参照系下降了30％，而LA(10，100μM)，ALCAR(100μM)，LA+ALCAR(0.1，1μM)的预处理能够防止这一下降。而LA+ALCAR(0.1，1μM)比LA，ALCAR任何单一浓度都更有效。
结果表明，低剂量LA+ALCAR(0.1μM或1μM)能最有效地防止复合物I的活力下降。
ATP分析结果鱼藤酮能有效的降低细胞产生ATP的能力(图3)。LA(10μM)和ALCAR(100μM)都能有效的抑制ATP水平降低。LA+ALCAR(0.1，1μM)也明显抑制ATP水平降低，但较高浓度的混合(都是10μM)就失去抑制的效果，高浓度的LA(100μM)也同样失去抑制效果。
结果表明，高浓度LA+ALCAR对细胞产生ATP的能力的下降没有抑制作用，而低剂量LA+ALCAR(0.1μM或1μM)能有效抑制该能力的下降。
细胞色素C释放分析的结果细胞色素C的释放可由图象判断(图4)1)参照细胞显示线粒体被很好的保护，细胞色素C在线粒体上。图象上复合的橙色显示线粒体富含细胞色素C。鱼藤酮处理过的细胞比起参照细胞橙色较少；2)鱼藤酮处理的细胞显示细胞色素C从线粒体上释放到细胞溶胶中，使着色点变少而且分散。
结果表明，LA(10μM)和ALCAR(100μM)都有抑制细胞色素C的释放的作用，低剂量LA+ALCAR(都是1μM)能有效抑制细胞色素C的释放。
抗氧化GSH水平结果鱼藤酮处理导致GSH明显损失。用LA(0.1-100μM除了1μM)，ALCAR(1-100μM除了10μM)可保护鱼藤酮引起的GSH损失(图5)。LA(10μM)和ALCAR(100μM)是两种单独作用最有效浓度。
结果表明，低剂量LA+ALCAR(都是1μM)能最有效地保护鱼藤酮引起的GSH损失。
蛋白质羰基化的效果蛋白质羰基化是蛋白质氧化损伤的一个重要指标，我们用Western blotting分析后用DNPH反应测不溶蛋白质片段。如图6所示，与参照系(a)相比鱼藤酮处理过的细胞蛋白质羰基化升高(b)。用LA处理对蛋白质羰基化无影响。ALCAR100μM处理蛋白质羰基化明显受到抑制。
结果表明，低剂量LA+ALCAR(0.1μM或1μM)处理有明显的抑制蛋白质羰基化的效果，而较高浓度的联合使用(10μM+10μM)没有抑制效果。
DNA氧化损伤的效果8羟基鸟苷抗体使细胞褪色，DNA氧化损伤的maker(红色)。相同的细胞用Hoechst33342标记细胞核形态。如图7A和7B所示，鱼藤酮处理的细胞8羟基鸟苷免疫反应性升高。许多DNA氧化损伤的细胞显示破碎的细胞核形态是apoptosis的特性。LA(10μM)和ALCAR(100μM)降低8羟基鸟苷免疫反应性。
结果表明，低剂量LA+ALCAR(0.1μM或1μM)能抑制鱼藤酮引起的8羟基鸟苷免疫反应性的升高。
ROS检测的效果因为线粒体是ROS的来源和标靶，用DCF检测鱼藤酮处理过的线粒体功能损伤和氧化损伤的同时是否伴随着ROS增加。如图8所示。
结果表明，鱼藤酮处理过的样品ROS显著增加，而LA(10uM)和ALCAR(100uM)对此有显著保护作用。另外，两者低浓度联合使用(0.1+0.1μM和1+1μM)也有对ROS增加的保护功能。
突触素I和泛素的表达和分布状态的分析结果PD症状表现在细胞质中突触素I和泛素的堆积，我们称其为路易氏小体.突触素I和泛素的表达水平可以用Western blotting分析检验.Western blotting的图象和定量结果如图9A和9B所示.与Control进行比较(a).鱼藤酮处理后的模型显示出突触素I的可溶性水平，用0.1-100uM的LA或者0.1-100uM的ALCAR进行预处理可以对由于鱼藤酮引起的突触素I表达的增加有抑制作用。两者在0.1+0.1uM和1+1uM的浓度混合时也有明显的作用.
突触素I的mRNA水平用RT-PCR方法检测，如图9C所示在鱼藤酮处理过的细胞中突触素I的mRNA的量与参照相比有明显的减少，在10uM的LA和100uM的ALCAR，两者在浓度0.1+0.1uM和1+1uM恢复突触素I的mRNA水平达参照系水平。
用萤光免疫检验法分析突触素I和泛素的状态分布鱼藤酮引起细胞质中突触素I和泛素水平升高(图10)。用10uM的LA和100uM的ALCAR和两者在浓度0.1+0.1uM和1+1uM的混合物可抑制细胞质中突触素I和泛素水平升高。
结果表明低剂量LA+ALCAR(0.1μM或1μM)能明显抑制突触素I表达的增加；低剂量LA+ALCAR(0.1μM或1μM)能使突触素I的mRNA水平恢复达参照系水平；低剂量LA+ALCAR(0.1μM或1μM)能抑制细胞质中突触素I和泛素水平升高。
实施例11LA和ALCAR的协同作用(PD果蝇行为学实验)材料和方法转入突触素I基因的果蝇帕金森氏症模型(由突触素I转基因型果蝇与Uas-DDC-gal4果蝇杂交所得)(购自美国)，帕金森果蝇模型表达突触素I，并在成年后发生多巴胺神经元的丢失，神经元内出现细丝状含有突触素I的内含物，运动功能出现障碍(见图49)。这种果蝇模型具备人体帕金森症的基本特征(Feny，2000)。
自果蝇羽化开始，雌雄分开实验，将果蝇随机分为0X，0.2X，1X，5X，10X，20X，50X等多个实验组，每组包括雌雄各170-300只左右果蝇，PD果蝇的母本(即α-syn果蝇)本身不表达突触素I，在羽化后3天时其运动能力测试值与PD果蝇是相同的，可作为非PD对照(non-PD)。
所有果蝇均在25℃、50-60％湿度，12小时光照条件下以培养管培养.
果蝇培养基采用玉米酵母培养基(其中溶解好的酵母粉在温度降到60-70℃之间时加入并搅拌)，并加入丙酸抑制霉菌生长；培养基加热到沸腾后冷却至45℃以下，加入相关药物至所需浓度(0X，0.2X，1X，5X，10X，20X，50X等剂量)。做好的培养基用纱布覆盖，水分蒸发后加瓶塞放入冰箱内保存。保质期6天培养基加药方法(a)最终溶剂量按10ml/100g培养基为准，对照组仅加10ml溶剂；水溶性的药品直接以6ml水溶解(可事先配成浓缩液)；脂溶性的药品先用蔗糖酸脂助溶后再加入6ml的水(因药物不同方法略有差异)，助溶剂可用二甲亚砜、DMSO(＜10％)、蔗糖酸脂(＜0.5％)、吐温20等；(b)根据各种药品的耐热温度、光照反应、溶解度等理化特征在配药时作相应调整，水溶性药物和脂溶性药物混用时不同时加。(c)其中5X、10X、20X、50X、100X剂量组分别表示在100g培养基中所含的药物的mg数。
攀爬能力测试实验自羽化后3天开始，每6天进行一次。以直径27mm，长110mm的玻璃管作为测试管，在距瓶底80mm处作一高度标记，10只果蝇装入管中后，轻轻震动使果蝇落到管底，10秒钟时记录爬到80mm高度及以上的果蝇数量，连续测试10次，并根据这10次记录的80mm高度及以上的果蝇数量计算每只果蝇每次爬到80mm高度处的概率值，以此作为该管果蝇的攀爬指数。
同时，果蝇3天换一次培养基，同时记录每3天的果蝇死亡数，据此利用EXCEL软件作出存活率-羽化年龄曲线，对其寿命进行考察。
果蝇寿命学、攀爬能力的测试数据均利用EXCEL软件处理。。
结果见图40-48。
结果表明，LA的20X、50X剂量组可改善PD果蝇的攀爬能力，在一定程度上延长其寿命；5X、10X、20X剂量组可在mRNA水平和蛋白质水平较好地抑制突触素I的表达，但50X剂量组却在保护多巴胺神经元方面较为突出。ALCAR的5X、10X、20X剂量组均可有效延长PD果蝇的寿命，但对PD果蝇的攀爬能力均无影响。
LA+ALCAR的10X、20X剂量组均可有效延长PD果蝇的寿命，并且作用强于10X剂量组的LA单独作用，而且LA+ALCAR的5X、20X剂量组均可有效改善PD果蝇的攀爬能力。
实施例12VitB5、VitB6、VitB11和VitB12的协同作用实验方法与实施例11中所述的相同。仅VitB5、VitB6、VitB11和VitB12的剂量表示方法略有不同(见表1-7)。
VitB5、VitB6、VitB11和VitB12的剂量表示如下表1-7所示表1
表2
表3
表4
表5
表6
表7
结果1.见图11-14。
结果表明，VB5单独使用可以延长PD雄性果蝇的寿命，但对其攀爬能力无作用。对雌性PD果蝇，VB5除了对攀能力无改善作用外，低剂量(1X，5X)对寿命无明显影响，高剂量有延长寿命的作用(20X，100X)。
2.见图15-18。
结果表明，VB12单独使用可以改善PD雄性果蝇的攀爬能力，但对其寿命无延长作用。对雌性PD果蝇，VB12对攀爬能力的改善作用不如雄性，对其寿命影响较小。
3.见图19-22。
结果表明，VB6单独使用可以延长PD雄性果蝇的寿命，但对其攀爬能力无作用，同时VB6能保护多巴胺神经元。对雌性PD果蝇，VB6可以延长其寿命，但对其攀爬能力无作用。
4.见图23-26。
结果表明，VB11单独作用对雄性PD果蝇的攀爬能力和寿命均无明显影响。对雌性PD果蝇，VB11对其攀爬能力和寿命有微小的改善作用。
5.见图27-30。
结果表明，VB5+VB12联合作用对雄性PD果蝇的攀爬能力和寿命均无明显影响。VB5+VB12联合作用下，对雌性PD果蝇的攀爬能力和寿命的影响均不明确。
6.见图31-34。
结果表明，VB6、VB11、VB12三者联合作用对雄性PD果蝇的攀爬能力和寿命均无明显影响。同样地，VB6、VB11、VB12三者联合作用对雌性PD果蝇的攀爬能力和寿命也均无明显影响。
7.见图35-38。
结果表明，VB5、VB6、VB11、VB12四者联合作用时，1X、20X、100X三个剂量组合对雄性PD果蝇的攀爬能力和寿命均有明显影响。对雌性PD果蝇而言，VB5、VB6、VB11、VB12四者联合作用时，1X、10X、20X、100X四个剂量组合对攀爬能力有明显改善作用，而对寿命作用不大。
综上所述，VB5、VB6、VB11和VB12虽然都对突触素I的表达在不同程度上有抑制效应(见图54)，但是单独作用时对运动能力和寿命的影响较弱，两两、三种成分组合时，有一定的效果，当四种成分联合作用时，对PD果蝇的攀爬能力改善和寿命的延长具有明显作用，其中的机制可能与对突触素I表达的抑制效应有关(见图55)。
实施例13LA、ALCAR、VitB5、VitB6、VitB11和VitB12的协同作用材料和方法SK-N-MC神经成纤维细胞用LA、ALCAR、VB5、VB6、VB11、VB12处理72小时后，加入MTTP(250μm)处理72小时，去除培养基，加5mg/mLMTT在37℃条件下孵育3小时，测定550nm下的光吸收值，以550nm的光吸收值作为细胞活性的指标。
表8各实验组加药剂量表
结果见图39。
结果表明，LA、ALCAR、VitB5、VitB6、VitB11和VitB12联用，其对帕金森氏症细胞模型的保护作用比LA和ALCAR联用增强3％，比VitB5、VitB6、VitB11和VitB12联用时增强8％。
实施例14LA、VitB5、VitB6、VitB11和VitB12及其联合效应对PD果蝇突触素I基因表达的影响和对多巴胺神经元的保护作用材料和方法利用与前述相同的突触素I基因的果蝇帕金森氏症模型作为考察对象，以PD果蝇的母本果蝇(α-syn果蝇)或父本果蝇(uas-DDC-gal4果蝇，即DDC果蝇)作为非PD对照，果蝇饲养与给药、及给药剂量等均采用与前述实施例10-13相同的方法。在果蝇达到相应年龄时，在每个实验组中随机抽取一定数量(约200只)的果蝇4℃条件下将其断头取材，将头部匀浆离心，分离出蛋白质和RNA成分，按照与细胞学实验部分相似的方法进行突触素Iwestern-bloting或mRNA的RT-PCR实验；或者将果蝇头部解剖，取出神经组织进行免疫组化实验，方法参考细胞学部分实验内容。
结果见图50-51。
结果表明，10X剂量的LA对突触素I的表达有抑制效应。
见图52。
结果表明，20X剂量的LA对突触素I基因的表达有抑制效应。
见图53。
结果表明，VitB6和20X剂量的LA能够阻止PD果蝇多巴胺神经元的丢失。
见图54。
结果表明，LA、VitB5、VitB6、VitB11和VitB12分别对突触素I的表达都有抑制效应。
见图55。
结果表明，VitB5+VitB6+VitB11+VitB12对突触素I基因的表达有抑制效应。
讨论本发明针对PD多因素的发病机制，选择针对线粒体损伤修复有一定作用的6种营养素作为主要组成成分，通过不同组合，分别在不同位点联合发挥作用，保障线粒体的正常代谢功能，以达到对PD的防治效果。
具体而言，泛酸(VB5)是辅酶A(CoA)前体，由辅酶A和脂肪酸合酶的磷酸泛酰巯基乙胺部分组成，因而对乙酰CoA的产生很重要。泛酸缺乏使猴子中亚铁血红素合成下降，并引起贫血症(Plesofsky-Vig，1996)。缺乏泛酸的头孢真菌中线粒体复合体IV减少(Brambl and P1esofsky-Vig，1986)，复合体IV的铁含量也减少(Brambl andPlesofsky-Vig，1986)，这导致了线粒体复合体IV的缺失。脂肪酸和泛酸是保证亚铁血红素生物合成前体——琥珀酰辅酶A正常供应的微量原料，任意一个的缺乏将通过与生物素缺乏相似的机制减少亚铁血红素合成。现已发现超过70种酶利用泛酸产生的辅酶A或衍生物作为反应底物。
VB6是吡哚醛5-磷酸(PLP)的前体，PLP是DA合成的所必需的辅酶，也直接参与亚铁血红素的合成(Scholnick et a1.，1972)，在美国大约10％的人摄入维生素B6不到推荐每日摄入量(RDA)的一半(Wakimoto and Block，2001)，因此VB6是代谢的重要限制因素。亚铁血红素缺乏也许是在老化过程中的线粒体和神经细胞衰败的一个因素(Atamna et a1.，2002.a)。亚铁血红素是细胞中铁的一个主要功能形式，它在线粒体由亚铁螯合酶插入亚铁原卟啉IX合成。亚铁血红素缺乏使脑细胞里的线粒体复合体IV减少，激活硝酸氧化物合成酶，改变淀粉样前体蛋白质，并破坏铁和锌内环境恒定。铁和B6的普遍缺乏导致其认知困难，儿童缺铁会迟延CNS的发展(Benton，2001；Tamura et a1.，2002)。因而，亚铁血红素缺乏或调节异常也许是神经衰退过程的一个重要和可防止的部分(Atamna et a1.，2002.a)，但这还是可以通过补充VB6加以预防。
叶酸(VB11)是各种一碳四氢叶酸酯的衍生物的合成原料，在核酸合成与甲基化反应中起着非常重要的作用，这些反应对大脑正常功能至关重要。叶酸缺乏将影响核DNA或mtDNA的合成，减少嘌呤和dTMP的可利用性。与细胞质的四氢叶酸酯合成酶比较，线粒体含有更高水平的叶酸辅酶。大脑中叶酸辅酶的线粒体含有较多谷氨酸盐长链，这与肝中分布有明显差异，叶酸水平降低或高胱氨酸含量升高与认知力损伤、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病以及其他各类痴呆疾病密切相关。(Carl et al.，1996)VB12具有广泛的生理作用，但需转化为甲基钴胺和辅酶B12后才具有活性，在人类的组织中，有两种生化反应需要维生素B12的参与一种是从高半胱氨酸合成甲硫氨酸的反应，其中产生的四氢叶酸参与DNA的合成，间接参与胸腺嘧啶脱氧核苷酸合成；另一种是甲基丙二酸辅酶A转变为琥珀酸辅酶A，参与三羧循环，从而对神经髓鞘中脂蛋白的形成，保护中枢和外周的有髓神经纤维的功能完整性起重要作用。同时参与广泛的蛋白质及脂肪代谢等。VB12对神经亲和力强，有修复神经髓鞘、促进再生作用。
在一帕金森氏综合症动物模型上(Duan et al.，2002)及用L-多巴治疗的患者中发现血浆高半胱氨酸水平增高，并且此高半胱氨酸水平与VB11，VB12和吡哆醛-5-磷酸盐水平有负相关性(Miller et al.，2003)。
α-硫辛酸(LA)及其还原形式二氢硫辛酸，是α-酮戊二酸脱氢酶的辅酶和丙酮酸脱氢酶的辅酶；属多功能的抗氧化物，能清除自由基，再循环产生其它的抗氧化剂(包括谷光甘肽，维生素C，CoQ和硫氧还原蛋白，所有的这些步骤都能再循环产生维生素E)，以及螯合催化金属(例如铁)来预防自由基的产生；诱导产生第二相酶。
乙酰-L肉碱(ALCAR)，是L-肉毒碱的乙酰基衍生物，可以穿过线粒体膜，能够将长链脂肪酸转入线粒体供能，增加双磷脂酰甘油的水平，增加呼吸作用以及被看作二级抗氧化剂。动物(包括人类)组织中的肉碱水平随年龄增长而下降(Costell等，1989；Liu等，2002a；Maccari等，1990)从而降低线粒体膜完整性。对于大小鼠，犬类等动物的研究表明，补充ALCAR可以改善与衰老相关认知力障碍，促进神经再生，保护神经细胞免受线粒体解偶联剂与抑制剂毒害，减轻脑局部贫血和再灌注后的神经损伤，提高脑中谷胱苷肽和GABA水平。
本发明用转入突触素I基因的果蝇帕金森氏症模型(由突触素I转基因型果蝇与uas-DDC果蝇杂交所得)，帕金森果蝇模型表达突触素I，并在成年后发生多巴胺神经元的丢失，神经元内出现细丝状含有突触素I的内含物，运动功能出现障碍。由于这种果蝇模型具备人体帕金森症的基本特征，因此可以利用这一遗传学方法来进行帕金森氏症的研究。
本发明显示，VB5、VB6、VB11、VB12单独作用时对于PD果蝇运动能力的改善和寿命的延长都有一定的作用，但对每一个具体剂量来说都无法达到对运动能力和寿命都非常有效的效果，甚至会遇到对二者的作用完全相反的现象；当VB5与VB12组合时略有联合效应，对运动能力和寿命的影响趋向一致，并在雌性PD果蝇上观察到1X和20X剂量组的效果相对较好，但影响程度较小；当VB6、VB11和VB12三者组合时，PD果蝇上观察到药物对运动能力和寿命均无明显效果；只有在VB5、VB6、VB11和VB12联合作用时，我们观察到PD果蝇的运动能力和寿命有明显的改善，水平接近非PD对照果蝇组。
单独作用时50X剂量组的LA对PD果蝇的运动能力和寿命均有效，而ALCAR只延长了PD果蝇的寿命，对运动能力没有影响。二者联合作用时，10X剂量组对PD果蝇运动能力的作用强于10X剂量LA的单独作用。
由于VB5、VB6、VB11、VB12、LA和ALCAR在体内发挥作用的途径有所不同，因此它们彼此间的联合作用强于单药的作用，并且联合作用条件下疗效更稳定和安全。本发明中LA+ALCAR+VB5+VB6+VB11+VB12预处理后在MTT环境中的细胞存活率，比LA+ALCAR预处理或VB5+VB6+VB11+VB12预处理的细胞存活率高。
本发明在进一步对药物作用机制的研究中，利用SK-NM-C的慢性鱼藤酮模型(5nM，4周)作为一个体外PD模型再现了鱼藤酮对线粒体功能的毒性影响。(复合酶1活性降低，MMP和ATP水平降低，细胞色素C释放增加)氧化压力(谷胱甘肽的丢失，ROS，蛋白质酰基和8-OXO-dG增加)，和PD的病理特征(突触素I和泛素水平的积累增加)。发明人在PD病理特征，线粒体功能和氧化与抗氧化损伤生物标记几个方面，研究用LA(0.1，1，10，100uM)，ALCAR(0.1，1，10，100uM)和他们不同组分的组合进行4周预处理的效果。
PD的分子病理表现是线粒体功能缺陷。在这个细胞模型里，鱼藤酮处理后的线粒体内膜上的复合体1活性降低、ATP损耗量增加以及细胞色素酶C的释放增加。合适剂量的LA和ALCAR两种线粒体营养素对用鱼藤酮处理后的线粒体有治疗作用。最有效的剂量是10uM的LA和100uM的ALCAR，并且当两者混合使用后，有效剂量出现在0.1和1uM，这种最佳配比比任何一种单用有效得多。LA和ALCAR这样的线粒体营养素可以有效的抑制鱼藤酮引起的细胞氧自由基的产生及氧化损伤。
PD症状的最明显表现是突触素I和泛素的堆积。这说明复合体I的调节是突触素I堆积水平的关键，而且高表达量的突触素I诱发氧化损伤。另外，氧化损伤以及细胞色素C的减少也可使突触素I聚集。经鱼藤酮处理后的PD细胞模型的具体变化是细胞质中突触素I和泛素蛋白的显著增加。因此，LA和ALCAR是否可以用于防止PD病症的发生与治疗，取决于他们能否阻止这些蛋白质的表达及分配。
总之，本发明证明线粒体营养素VB5、VB6、VB11、VB12、LA和ALCAR及其不同组合在PD果蝇模型上会有不同的疗效，并且VB5、VB6、VB11和VB12联合应用，或LA和ALCAR联合应用的效果强于药物的单独作用。LA和ALCAR对抑制PD细胞模型线粒体的功能紊乱、氧化损伤和阻止突触素I及泛素的积累有一定的作用。并且，LA和ALCAR两种药在低浓度时(0.1-1uM)的混合物表现出一种正协同效应，这比单独用10倍浓度的任何一种药来对鱼藤酮处理引发的线粒体功能紊乱和氧化损伤都有效。另外，LA+ALCAR+VB5+VB6+VB11+VB12对细胞的保护作用强于LA+ALCAR或VB5+VB6+VB11+VB12的组合。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种组合物，其特征在于，它含有二种或多种(如2-12种)线粒体营养素，或者所述的组合物由二种或多种(如2-12种)线粒体营养素构成。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的线粒体营养素选自下组R-硫辛酸、乙酰肉碱、维生素B5、维生素B6、维生素B11、维生素B12、辅酶Q10、硫胺、核黄素、烟酸、生物素或肌酸。
3.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的组合物含有(a)维生素B12；(b)一种或多种选自下组的B族维生素维生素B5、维生素B6、维生素B11。
4.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的组分(b)是维生素B5；或者所述的组分(b)是维生素B5和维生素B6。
5.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的组分(b)同时包括维生素B5、维生素B6和维生素B11三种B族维生素。
6.如权利要求3-5中任一所述的组合物，其特征在于，所述的组合物还含有(c)一种或多种选自下组的线粒体营养素R-硫辛酸、或乙酰肉碱。
7.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的组合物含有(1)R-硫辛酸和(2)乙酰肉碱。
8.一种如权利要求1所述的组合物的制备方法，其特征在于，它包括步骤①将二种或多种线粒体营养素混合在一起，形成组合物。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的线粒体营养素选自下组R-硫辛酸、乙酰肉碱、维生素B5、维生素B6、维生素B11、维生素B12、辅酶Q10、硫胺、核黄素、烟酸、生物素或肌酸。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，在步骤①中，将(a)维生素B12和(b)选自维生素B5、B6或B11中一种或多种B族维生素混合，制得组合物。
11.如权利要求8所述的方法，其特征在于，在步骤①中，将(1)R-硫辛酸和(2)乙酰肉碱混合，制得组合物。
12.如权利要求10所述的方法，其特征在于，在步骤①中，再混入(c)一种或多种选自下组的线粒体营养素R-硫辛酸、或乙酰肉碱，制得组合物。
13.如权利要求10或11所述的方法，其特征在于，在步骤①中，还包括混入一种或多种选自下组的额外的线粒体营养素辅酶Q10、硫胺、核黄素、烟酸、生物素或肌酸。
14.一种如权利要求1-7中任一所述的组合物的用途，其特征在于，所述的组合物用于制备预防、治疗或改善帕金森氏症的药物，用于制备预防或改善帕金森氏症的饮食补充剂。
15.一种预防、治疗或改善帕金森氏症的方法，其特征在于，给予需要治疗的对象施用一种或多种(更佳地2种或多种)线粒体营养素。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述的线粒体营养素选自下组R-硫辛酸、乙酰肉碱、维生素B5、维生素B6、维生素B11、维生素B12、辅酶Q10、硫胺、核黄素、烟酸、生物素或肌酸。
全文摘要
本发明公开了一种B族维生素的组合，它可以有效改善帕金森氏症；本发明公开的低剂量的LA和ALCAR的组合，可以很有效地抑制鱼藤酮导致的线粒体功能紊乱，突触素I和泛素的表达水平的升高，氧化损伤升高和抗氧化GSH水平的降低。本发明还公开了，低浓度LA和ALCAR与维生素B联合使用可以提供一种更新更直接的线粒体营养素复合物，对于帕金森症的保护和治疗更为有效。
文档编号A61K31/525GK101057857SQ20061002590
公开日2007年10月24日 申请日期2006年4月21日 优先权日2006年4月21日
发明者刘健康, 高鸿翔, 张红宇 申请人:中国科学院上海生命科学研究院