专利名称：活性醇溶蛋白多孔支架的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种生物工程技术领域的方法，具体的说，涉及的是一种活性醇溶蛋白多孔支架的制备方法。
背景技术：
组织工程支架材料是生物医学领域组织工程研究的重点之一；生物材料是种子细胞形成组织之前赖以生存和依附的三维支架，它能将细胞固定于一定位置，为其生长、繁殖、新陈代谢及细胞外基质分泌等生理活动提供场所，并引导再生组织基本形状。作为组织工程的支架材料应具备如下特点①良好生物相容性利于细胞粘附与增殖，无细胞毒性，无免疫原性，不引起炎症反应；②生物可降解性可完全降解，降解速率与组织形成速率基本一致；③具有可塑性及一定机械强度，可引导组织再生，在组织再生过程中能维持特定的大小和形状；④一定的孔隙率，适当大小的孔径及贯通性，细胞能均匀分布在材料表面及内部，可得到足够的营养，为血管长入提供支持；⑤材料及其降解产物无毒、对机体无不良反应，性质稳定，易贮存、易消毒等。
生物材料的力学性能是组织工程，特别是硬组织工程中的重要因素之一。目前，天然生物材料已受到广泛的研究，包括甲壳素、纤维蛋白、胶原蛋白、壳聚糖等。这些材料共同特点就是可降解，生物相容性好，但制备的三维支架力学强度不足，从而限制了它们的发展。玉米醇溶蛋白是玉米的主要储藏蛋白，占玉米总蛋白的45％-50％。玉米醇溶蛋白可以加工成树脂，具有良好的热塑性、坚韧性、疏水性、降解性和抗菌性等。玉米醇溶蛋白已被研究用于医用粘合剂，生物可降解塑料，口香糖，可食用抗湿食品包装，酸敏感药物释放体系，微囊化杀虫剂，口服药物掩味剂，生物学实验条带和创伤敷料等许多方面。研究表明玉米醇溶蛋白具有良好的生物可降解性和生物相容性，是一种可应用于组织工程的新型天然聚合物。
经对现有技术的文献检索发现，中国专利公开号为CN1555892A等专利，都是将植物源性醇溶蛋白与食盐等致孔剂混合，在一定温度和湿度的条件下自然成型，或经模压成型、水煮除去致孔剂后冷冻干燥而制得。尽管上述方法可以获得具有一定力学强度和孔隙特性的支架，并能够通过浸泡等方法使支架承载活性因子；但因为受到加工条件的限制，无法根据需要有效的控制支架中活性因子的含量、释放周期和保持较高的活性。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的上述不足和缺陷，提供一种活性醇溶蛋白多孔支架的制备方法，使得制备出的支架中生物活性因子含量可控，分布均匀；由于支架是在低温温和条件下制备而成，活性成分保持较高生物活性，并可以缓慢释放。作为支架材料应用于组织工程领域时，能够在体内长期发挥作用。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明将醇溶蛋白和活性因子与冰颗粒混合，或者将载有活性因子的醇溶蛋白微球与冰颗粒混合后成型，其孔径大小可通过调控冰颗粒大小来实现，孔隙率可以通过控制蛋白和冰颗粒的比例来调节。
本发明具体步骤如下①在-40℃-0℃，将包载有活性因子的醇溶蛋白微球，或者直接将活性因子和醇溶蛋白按1∶10-560的重量比混合后，密封预冷，与冰颗粒按1∶0.1-5的重量比混合，在-40℃-0℃利用压模法成型。
②将①成型的冰颗粒-包载有活性因子的醇溶蛋白微球多孔支架(即由冰颗粒和包载有活性因子的醇溶蛋白微球混合所组成的支架)或者冰颗粒-包载有活性因子的醇溶蛋白多孔支架(即由冰颗粒、活性因子和醇溶蛋白混合所组成的支架)利用冷冻干燥法除去支架中的冰颗粒。
③将②冷冻干燥后的包载有活性因子的醇溶蛋白微球多孔支架或者包载有活性因子的醇溶蛋白多孔支架放置在10℃-75℃，60％-100％湿度下1小时-10天成型，再利用冷冻干燥除去支架中水分，得到活性醇溶蛋白多孔支架。
所述的醇溶蛋白是小麦、大麦、裸麦、燕麦或玉米等的植物源性醇溶蛋白。
所述的醇是C1-4的脂肪醇；所述的脂肪醇进一步限定为乙醇。
所述的包载有活性因子的醇溶蛋白微球，其制备方法为在20℃-37℃下，将醇溶蛋白用含60％-95％醇的水溶液和活性因子共溶后，调节醇浓度为10％-50％，制备成包含有活性因子的醇溶蛋白微球。由该方法得到的包载有活性因子的醇溶蛋白微球的药物包封率为0.2％-40％。
所述的活性醇溶蛋白多孔支架，孔隙率为30％-85％，孔径大小为50μm-1000μm；主要是用于组织工程领域。
所述的活性因子是活性容易受温度和有机溶剂破坏的生长因子。
本发明采用冰颗粒作为制孔剂，得到的包载有活性因子的醇溶蛋白多孔支架基本上是在0℃以下完成，10℃-75℃所停留时间短暂；另外，整个制备过程除了使用乙醇外，并不涉及其他有机溶剂，而且不需水煮等处理，这样既排除了有机溶剂的残留毒性问题，又排除了温度和有机溶剂对活性因子的破坏，从而使活性因子的活性得以最大程度保留。由于本发明制备开始阶段，采用了将活性因子和蛋白直接按比例混合，或者直接使用活性因子含量确定的包载有活性因子的醇溶蛋白微球，因此，很好的控制了活性醇溶蛋白多孔支架中活性因子的含量。材料在组织工程领域内使用时，借此控制局部活性因子的浓度，防止浓度过高产生毒性，过低无法发挥效用的不足。其次，支架中活性因子和醇溶蛋白分布均匀，避免了常规先制备支架，再采用浸泡吸附等方法载药时，活性因子无法深入支架内部，及由此造成释放周期相对较短的弊病；同时，包载有活性因子的醇溶蛋白多孔支架可以随着蛋白的降解，而使支架内部的活性因子逐渐释放，发挥长效作用。
图1相分离法制备的包载有地塞米松磷酸钠的醇溶蛋白微球，a原料(标尺＝74μm)，b包载有活性因子的醇溶蛋白微球(标尺＝1.18μm)。
图2冰颗粒作为制孔剂制备的活性醇溶蛋白多孔支架，A包载有地塞米松磷酸钠的醇溶蛋白微球多孔支架(标尺＝141μm)；B包载有地塞米松磷酸钠的醇溶蛋白多孔支架(标尺＝139μm)。
图3冰颗粒作为制孔剂制备的包载有地塞米松磷酸钠的醇溶蛋白微球多孔支架和包载有地塞米松磷酸钠的醇溶蛋白多孔支架中地塞米松磷酸钠的体外释放动力学。
具体实施例方式
结合附图以及本发明技术方案提供以下实施例实施例1孔隙率为44％的包载有地塞米松磷酸钠的醇溶蛋白微球多孔支架和包载有地塞米松磷酸钠的醇溶蛋白多孔支架的制备①将包载有地塞米松磷酸钠的醇溶蛋白微球，或者直接将地塞米松磷酸钠和醇溶蛋白按1∶10的重量比混合后，在-40℃密封预冷，与冰颗粒按1∶4.22的重量比混合后，在-40℃利用预冷的不锈钢磨具压模制成5×5×5mm3的柱形体。
②将成型的冰颗粒-包载有地塞米松磷酸钠的醇溶蛋白微球多孔支架或者冰颗粒-包载有地塞米松磷酸钠的醇溶蛋白多孔支架，利用冷冻干燥法除去支架中的冰颗粒。
③将冷冻干燥后的包载有地塞米松磷酸钠的醇溶蛋白微球多孔支架或者包载有地塞米松磷酸钠的醇溶蛋白多孔支架放置在75℃，100％湿度下1小时后成型，冷冻干燥除去水分，如图2。
上述实施例中包载有地塞米松磷酸钠的醇溶蛋白微球制备是通过以下方法实现的将醇溶蛋白和地塞米松磷酸钠分别溶解在60％的乙醇水溶液中，混合均匀后，迅速调整乙醇浓度到40％，得到包载有地塞米松磷酸钠的醇溶蛋白微球混悬液，冷冻干燥得包载有地塞米松磷酸钠的醇溶蛋白微球粗制粉末。喷金处理后，扫描电子显微镜观察微球形态及粒径大小分布，结果如图1所示，所制备的蛋白微球直径控制在40nm-100nm之间。根据这种方法，通过控制微球中活性因子含量，来调控支架中活性因子含量，并进一步控制其在支架中的微细分布和释放。很好的避免了常规活性支架制备过程中，活性成分仅仅粘附在支架或者孔的表面，大大延长了活性因子释放时间和调节了释放量。
根据上述实施例最终得到的活性醇溶蛋白多孔支架，其地塞米松磷酸钠含量为9.1％，孔隙率为44.4％±9.0％，孔径大小为150μm-250μm，孔的贯通性良好，如图2。整个过程仅在75℃，100％湿度下停滞1小时，活性因子活性保持良好。
实施例2孔隙率为65％的包载有地塞米松磷酸钠的醇溶蛋白微球多孔支架和包载有地塞米松磷酸钠的醇溶蛋白多孔支架的制备①将包载有地塞米松磷酸钠的醇溶蛋白微球，或者直接将地塞米松磷酸钠和醇溶蛋白按1∶560的重量比混合后，在-20℃密封预冷，与冰颗粒按1∶1.26的重量比混合后，在-20℃利用预冷的不锈钢磨具压模制成5×5×5mm3的柱形体。
②将成型的冰颗粒-包载有地塞米松磷酸钠的醇溶蛋白微球多孔支架或者冰颗粒-包载有地塞米松磷酸钠的醇溶蛋白多孔支架利用冷冻干燥法除去支架中的冰颗粒。
③将冷冻干燥后的包载有地塞米松磷酸钠的醇溶蛋白微球多孔支架或者包载有地塞米松磷酸钠的醇溶蛋白多孔支架放置在10℃，60％湿度下10天后成型，冷冻干燥除去水分，如图2。
上述实施例中包载有地塞米松磷酸钠的醇溶蛋白微球制备是通过以下方法实现的将醇溶蛋白和地塞米松磷酸钠分别溶解在60％的乙醇水溶液中，混合均匀后，迅速调整乙醇浓度到40％，得到包载有地塞米松磷酸钠的醇溶蛋白微球混悬液，冷冻干燥得包载有地塞米松磷酸钠的醇溶蛋白微球粗制粉末。喷金处理后，扫描电子显微镜观察微球形态及粒径大小分布，结果如图1所示，所制备的蛋白微球直径控制在40nm-100nm之间。根据这种方法，通过控制微球中活性因子含量，来调控支架中活性因子含量，并进一步控制其在支架中的微细分布和释放。很好的避免了常规活性支架制备过程中，活性成分仅仅粘附在支架或者孔的表面，大大延长了活性因子释放时间和调节了释放速率。
根据上述实施例最终得到的活性醇溶蛋白多孔支架，其地塞米松磷酸钠含量为0.2％，孔隙率为65.0％±4.0％，孔径大小为150μm-250μm，孔的贯通性良好，如图2。整个过程仅在10℃，60％湿度下停滞10天，活性因子活性保持良好。
实施例3孔隙率为80％的包载有地塞米松磷酸钠的醇溶蛋白微球多孔支架和包载有地塞米松磷酸钠的醇溶蛋白多孔支架的制备①将包载有地塞米松磷酸钠的醇溶蛋白微球，或者直接将地塞米松磷酸钠和醇溶蛋白按1∶56的重量比混合后，在0℃密封预冷，与冰颗粒按1∶0.24的重量比混合后，在0℃利用预冷的不锈钢磨具压模制成5×5×5mm3的柱形体。
②将成型的冰颗粒-包载有地塞米松磷酸钠的醇溶蛋白微球多孔支架或者冰颗粒-包载有地塞米松磷酸钠的醇溶蛋白多孔支架利用冷冻干燥法除去支架中的冰颗粒。
③将冷冻干燥后的包载有地塞米松磷酸钠的醇溶蛋白微球多孔支架或者包载有地塞米松磷酸钠的醇溶蛋白多孔支架放置在37℃，80％湿度下5天后成型，冷冻干燥除去水分，如图2。
上述实施例中包载有地塞米松磷酸钠的醇溶蛋白微球制备是通过以下方法得到的将醇溶蛋白和地塞米松磷酸钠分别溶解在60％的乙醇水溶液中，混合均匀后，迅速调整乙醇浓度到40％，得到包载有地塞米松磷酸钠的醇溶蛋白微球混悬液，冷冻干燥得包载有地塞米松磷酸钠的醇溶蛋白微球粗制粉末。喷金处理后，扫描电子显微镜观察微球形态及粒径大小分布，结果如图1所示，所制备的蛋白微球直径控制在40nm-100nm之间。根据这种方法，通过控制微球中活性因子含量，来调控支架中活性因子含量，并进一步控制其在支架中的微细分布和释放。很好的避免了常规活性支架制备过程中，活性成分仅仅粘附在支架或者孔的表面，大大延长了活性因子释放时间和调节了释放速率。
根据上述实施例最终得到的活性醇溶蛋白多孔支架，其地塞米松磷酸钠含量为1.8％，孔隙率为80.3％±3.7％，孔径大小为150μm-250μm，孔的贯通性良好，如图2。整个过程仅在37℃，80％湿度下停滞5天，活性因子活性保持良好。
表冰颗粒作为制孔剂制备的活性醇溶蛋白多孔支架孔隙率随冰颗粒-蛋白比率变化图(n＝3)
实施例4包载有地塞米松磷酸钠的醇溶蛋白微球多孔支架和包载有地塞米松磷酸钠的醇溶蛋白多孔支架中活性因子的体外释放动力学将制备的包载有地塞米松磷酸钠的醇溶蛋白微球多孔支架和包载有地塞米松磷酸钠的醇溶蛋白多孔支架，分别浸泡在1.2mL磷酸缓冲液(PBS，pH7.2，37℃)中，定期更换新鲜PBS溶液，并利用分光光度法于240nm检测活性因子含量，计算释放速率。结果如图3所示，包载有地塞米松磷酸钠的醇溶蛋白微球多孔支架和包载有地塞米松磷酸钠的醇溶蛋白多孔支架中活性因子在体外模拟体内环境中，活性因子释放时间维持35天，药物释放两分别达到了85％和95％，仍有部分活性因子未释放出来。在体内，随着体内水解酶的作用，蛋白逐渐降解，活性因子将逐渐释放，从而维持药物更长周期的释放。
权利要求
1.一种活性醇溶蛋白多孔支架的制备方法，其特征在于，具体步骤如下①在-40℃-0℃，将包载有活性因子的醇溶蛋白微球，或者直接将醇溶蛋白和活性因子按1∶10-560的重量比混合均匀后，密封预冷，与冰颗粒按1∶0.1-5混合，在-40℃-0℃利用压模法成型；②将成型的冰颗粒-包载有活性因子的醇溶蛋白多孔支架和冰颗粒-包载有活性因子的醇溶蛋白微球多孔支架利用冷冻干燥法除去支架中的冰颗粒；③将包载有活性因子的醇溶蛋白支架放置在10℃-75℃、60％-100％湿度下1小时-10天成型，冷冻干燥除去水分。
2.根据权利要求1所述的活性醇溶蛋白多孔支架的制备方法，其特征是所述的包载有活性因子的醇溶蛋白微球，其制备方法为在20℃-37℃下，将醇溶蛋白用含60％-95％醇的水溶液和活性因子共溶后，调节醇浓度为10％-50％，制备成包含有活性因子的醇溶蛋白微球。
3.根据权利要求1或者2所述的活性醇溶蛋白多孔支架的制备方法，其特征是所述的醇溶蛋白，是小麦、大麦、裸麦、燕麦或玉米的植物源性醇溶蛋白。
4.根据权利要求1所述的活性醇溶蛋白多孔支架的制备方法，其特征是所述的醇是C1-4的脂肪醇。
5.根据权利要求4所述的活性醇溶蛋白多孔支架的制备方法，其特征是所述的脂肪醇，为乙醇。
6.根据权利要求1所述的活性醇溶蛋白多孔支架的制备方法，其特征是其孔隙率为30％-85％，孔径大小为50μm-1000μm。
全文摘要
一种生物工程技术领域的活性醇溶蛋白多孔支架的制备方法。本发明在－40℃－0℃，将包载有活性因子的醇溶蛋白微球，或者直接将醇溶蛋白和活性因子按1∶10－560的重量比混合均匀，再与冰颗粒按1∶0.1－5混合，在－40℃－0℃压模成型，并利用冷冻干燥法除去支架中的冰颗粒；再将包载有活性因子的醇溶蛋白支架在10℃－75℃，60％－100％湿度下1小时－10天成型，利用冷冻干燥除去支架中水分。本发明能得到具有合适孔隙率，孔径大小和活性因子含量可控的活性醇溶蛋白多孔支架，并且活性因子保持良好的生物活性，能够缓慢释放。作为支架材料应用于组织工程领域时，能够在体内长期发挥作用。
文档编号A61L27/34GK1836744SQ20061002608
公开日2006年9月27日 申请日期2006年4月27日 优先权日2006年4月27日
发明者王瑾晔, 王华杰 申请人:上海交通大学