专利名称：内皮细胞化动脉瘤支架及其制备方法
技术领域：
本发明属生物医疗材料领域，涉及一种新型动脉瘤支架，具体涉及一种内皮细胞化动脉瘤支架及其制备方法。
背景技术：
颅内动脉瘤是导致急性自发性蛛网膜下腔出血的最主要原因，也是人类猝死的重要原因之一。血管内介入治疗目前已成为颅内动脉瘤治疗的重要手段之一。特别是一些难治性动脉瘤，如梭形或层间动脉瘤、宽颈动脉瘤、椎基底动脉瘤等，直接外科手术治疗难度大、效果差，且常伴严重并发症，而血管内治疗则呈现安全、微创的优越性。过去的十年间，应用电解可脱性弹簧圈(GDC)治疗颅内动脉瘤已经被本领域普遍接受。然而，由于弹簧圈治疗动脉瘤的历史有限，尽管短期疗效得到临床肯定，长期疗效仍有待进一步观察。Hayakawa等在455个动脉瘤GDC栓塞后复查发现178(39％)个动脉瘤未完全填塞，有瘤颈残留。其中大型(11-25mm)或巨大型(＞25mm)动脉瘤和宽颈(＞4mm)小型(4-10mm)动脉瘤出现复发的概率远高于窄颈小型动脉瘤。Bavinzski(Bavinzski G，et al.JNeurosurg.1999；91(2)284-93)等在颅内动脉瘤GDC栓塞后的尸检中也发现瘤颈较大的动脉瘤颈口的新生内膜覆盖较少。因而Geremia等将支架置于动脉瘤瘤颈附近载瘤动脉中，通过支架的网状结构干扰正常的血流促使瘤内血栓形成，组织纤维化，进而闭塞瘤腔。支架技术的应用为颅内难治性动脉瘤的治疗开辟了新的局面。然而，支架技术在动脉瘤中的应用还存在缺陷。首先，支架作为金属异物可以诱发载瘤动脉的血栓形成；其次，金属支架的刺激性作用可引起血管内膜增生，导致载瘤动脉的狭窄或闭塞(Levy EI，et al.Neurosurgery.2002；51(5)1280-5)。这些问题，已限制了支架在临床中的广泛应用。本领域研究认为，对于颅内巨大型及宽颈动脉瘤，如何在支架建立后加快瘤颈口新生内皮的产生和覆盖，是减少动脉瘤复发和避免载瘤动脉狭窄的关键问题。
研究认为，支架内皮细胞化的目的在于使动脉瘤瘤颈处被内皮细胞封闭，重建血管壁。对于栓塞不全者，可以使瘤腔与循环血液隔绝；对于完全栓塞的动脉瘤，可以减轻血流对弹簧圈或瘤内血栓的冲击，降低再通的发生率。支架上的内皮细胞，有利于减轻和修复治疗中损伤的血管内皮，可以避免金属支架与血流直接接触，减少对血流的干扰；同时内皮细胞还可以分泌一氧化氮(NO)、前列环素(PGI2)等活性物质，降低血管痉挛和狭窄的发生率。因此在支架表面实现内皮细胞化，可以减少支架的金属裸露面积从而能够减轻植入后引起的异物炎症反应，同时内皮细胞分泌的活性物质，有助于支架形成具有抗凝特性的光滑表面。支架内皮细胞化的前景十分诱人，但仍然有许多实际的问题有待解决。如支架内皮细胞化的效果取决于种植的内皮细胞数目、粘附细胞的抗血流冲刷能力等，其中首先要解决的是内皮细胞来源问题。异体内皮细胞因涉及免疫排斥反应而不宜应用于临床；转基因永生化内皮细胞系具有潜在的致瘤危险。目前进行的人血管内皮细胞的体外培养中，以脐静脉和幼童包皮的血管内皮细胞培养方法较为成熟，显然这两种方法都不大可能应用于支架的内皮细胞化。尽管血管细胞生物学已取得很大的进步，但内皮细胞的获得仍不够便利。因而，寻找新的内皮细胞获得途径是建立可供临床应用的内皮化支架的关键问题之一。
选择合适的表面涂层材料，形成适合内皮细胞生长的支架表面是建立内皮化支架的又一关键问题。内皮化支架进入血管内后，其附着的内皮细胞必须具备抗血流冲刷能力，同时部分裸露的涂层材料不能引起血小板聚集而发生血栓。以往采用的纤维连接蛋白(Fibronectin)和多聚赖氨酸(poly-L-lysine)粘附力有限，同时存在促进血栓形成的隐患。
发明内容
本发明的目的是改进已有的金属材质动脉瘤支架的性能，克服已有技术的缺陷，提供一种内皮细胞化动脉瘤支架。本发明将自体血管内皮细胞对支架金属表面修饰，能在支架建立后加快瘤颈口新生内皮的产生和覆盖，减少动脉瘤复发和避免载瘤动脉的狭窄，提高动脉瘤特别是颅内动脉瘤的治愈率，减少动脉内血栓形成的机会。
本发明的另一目的是提供所述内皮细胞化动脉瘤支架的制备方法。
本发明首先解决了内皮细胞的来源，采用从自体静脉内皮层采集扩增的血管内皮细胞，并将该细胞粘附于经生物相容性的，生物可降解的，无毒的高分子生物材料涂层处理的不锈钢动脉瘤支架表面，制成自体内皮细胞化动脉瘤支架，用于动脉瘤的血管内治疗，特别是颅内动脉瘤的介入治疗。
本发明所述的高分子生物材料选自肝素键合的聚(乳酸-氨基酸)共聚物(专利申请号01132179.2；国际申请号PCT/CN01/01622)，其生物相容性好，可降解且无毒。
本发明通过下述方法制备，包括以下步骤1、培养自体血管内皮细胞取实验用犬颈静脉，血管段，放入1％胶原酶(Sigma)，0.125％胰酶(Sigma)中消化，吸出细胞悬液，离心，倒去上清夜，用80％DMEM20％胎牛血清，20ng/mlVEGF培养液重悬细胞，将1×106细胞密度的细胞悬液种植于涂有多聚赖氨酸的培养皿CO2培养箱中培养，传代。
2、制备涂层材料及不锈钢支架表面涂层将交酯或内酯与含多官能团氨基酸的吗啉二酮衍生物(derivative ofmorpholine-dione)，其中两者的投料摩尔比例控制在99∶1～1∶99，以辛酸亚锡为催化剂，进行聚合；所得聚合物用Pd/C为催化剂催化氢化或采用HBr/HAc为催化剂脱去保护基团后，得具有可反应性侧基的生物降解型聚酯，再将脱保护后的聚合物与肝素溶解在混和溶剂THF/H2O中，以二环己基碳二亚氨为催化剂进行反应，得到可完全生物降解的药物高分子材料。
将制备的生物可降解高分子材料溶解在氯仿中，得到浓度从10％wt～0.01％wt的溶液，喷涂到支架表面，剂量从10～1000ug，抽干，消毒后待用。
所述的交酯或内酯包括L-丙交酯，DL-丙交酯，乙交酯或己内酯等类似的单体。
(3)内皮化不锈钢支架集成采用1×107-5×107的高滴度细胞悬液滴在血管支架上，使均匀贴附在支架上后浸入培养液，CO2培养箱中培养24小时备用。
本发明提供了决定支架内皮细胞化效果的种植的内皮细胞数目，保证了粘附细胞的抗血流冲刷能力。
本发明自体内皮化不锈钢支架制备的每个步骤中均进行了相应的理化性能和生物学特征的检测，结果表明符合设计要求。表1是涂层材料的理化及生物特征。表2是内皮化支架的生物学特征。
表1
表2
将上述集成的内皮化不锈钢支架置于体外血流冲刷仪中，采用70dyne/cm2切应力冲刷24小时，观察结果显示支架表面内皮细胞形态无明显变化，并计每1mm长度支架表面的粘附细胞数量无明显减少，0、12、24小时细胞数分别为305.3±22.54；294.7±20.45；288.6±30.97。
本发明所用实验试剂，仪器及实验动物均为市购。
本发明采用自体血管内皮细胞修饰不锈钢动脉瘤支架表面，克服了不锈钢裸支架的诸多缺陷，具有以下主要优点。
1、抗载瘤动脉血栓形成。
内皮化的支架表面避免了金属与血液直接接触，减少炎症反应后产生血栓形成作用，降低载瘤动脉狭窄的发生率；涂层材料中键合的肝素在支架到达治疗位置后缓慢释放，阻止了治疗早期载瘤动脉内的血栓形成。
2、促进治疗后动脉瘤瘤颈部位内皮细胞层的形成。
通过支架带入的自体内皮细胞在瘤颈部位沿支架的网格排列，这种排列结构大大减少了内皮细胞所要爬行的距离，可在瘤颈部位疏松的血栓表面形成内皮细胞层，从而真正达到治愈动脉瘤的目的。
3、自体内皮细胞容易采集、无免疫源性、不存在伦理问题。
人类自体内皮细胞可以在大隐静脉的内皮层中采集扩增而得。自体内皮细胞的使用避免了诸如脐静脉内皮细胞、永生化内皮细胞系等需要考虑的排斥反应以及伦理问题等。
4、本发明所涉及的技术方法成熟可行，成本在可接受范围内。
图1犬血管内皮细胞形态(放大倍数200)。
图2A，B均为内皮细胞化支架在扫描电镜下的形态。
具体实施例方式
实施例1(1)培养自体血管内皮细胞取实验用犬一侧颈静脉，无菌下剥离静脉周围的芥蒂组织，用D-hank’s液反复冲洗血管，将血管内的血液冲洗干净，用外科缝线把血管一头扎住，血管内壁外翻，外科缝线扎住血管另一头将血管段放入1％胶原酶(Sigma)，0.125％胰酶(Sigma)中37℃消化20分钟，用血清终止消化吸出细胞悬液，离心1500转/分5分钟，倒去上清夜，用80％DMEM20％胎牛血清，20ng/mlVEGF培养液重悬细胞，将1×106细胞密度的细胞悬液种植于涂有多聚赖氨酸的培养皿中放入37℃5％CO2培养箱中培养，待细胞铺满皿底后进行细胞传代。
(2)涂层材料的制备及不锈钢支架的表面涂层将交酯或内酯与含多官能团氨基酸的吗啉二酮衍生物以辛酸亚锡为催化剂，进行聚合；其中两者的投料摩尔比例控制为99∶1；反应温度为50-200℃，反应时间为0.5-46小时；所得聚合物用Pd/C为催化剂催化氢化24～180小时，得到具有可反应性侧基的生物降解型聚酯，反应温度为10-35℃，反应时间为8-80h；再将上述脱保护后的聚合物与肝素溶解在混和溶剂THF/H2O中，以二环己基碳二亚氨为催化剂进行反应，即得可完全生物降解的药物高分子。
将制备的生物可降解高分子材料溶解在氯仿中，得到浓度从10％wt～0.01％wt的溶液，所得溶液采用计算机控制的喷涂工艺喷涂到支架表面，剂量为10ug，然后抽干，消毒后待用。
所述交酯或内酯可选用L-丙交酯，DL-丙交酯，乙交酯或己内酯等类似的单体。
(3)内皮化不锈钢支架的集成用1×107的高滴度细胞悬液缓慢地滴在血管支架上并旋转支架，在倒置显微镜下可见血管内皮细胞均匀的贴附在支架上后浸入培养液中放入37℃ 5％CO2培养箱中培养24小时后准备进行体内植入支架。
本发明自体内皮化不锈钢支架制备的各步骤中均进行了相应的理化性能和生物学特征的检测，结果表明符合设计要求。表1是涂层材料的理化及生物特征。
表2是内皮化支架的生物学特征。
表1
表2
实施例21、培养自体血管内皮细胞同实施例1。
2、制备涂层材料及不锈钢支架表面涂层将交酯或内酯与含多官能团氨基酸的吗啉二酮衍生物，其中两者的投料摩尔比例为1∶99，以辛酸亚锡为催化剂，进行聚合；反应温度为50～200℃，反应时间为0.5～46小时，得到聚合物的交酯或内酯与含多官能团氨基酸的吗啉二酮衍生物的摩尔比例为1∶99；所得聚合物用HBr/HAc为催化剂脱去保护基团后，得具有可反应性侧基的生物降解型聚酯，反应温度为10-35℃，反应时间为8-80h；再将脱保护后的聚合物与肝素溶解在混和溶剂THF/H2O中，以二环己基碳二亚氨为催化剂进行反应，即得可完全生物降解的药物高分子材料。
将制备的生物可降解高分子材料溶解在氯仿中，得到浓度从10％wt～0.01％wt的溶液，用计算机程序控制的喷涂工艺喷涂到支架表面，剂量为1000ug。抽干，消毒后待用。
所述的交酯或内酯可选用L-丙交酯，DL-丙交酯，乙交酯或己内酯等类似的单体。
(3)内皮化不锈钢支架集成采用5×107的高滴度细胞悬液慢滴在血管支架上，并旋转支架，使均匀贴附在支架上后浸入培养液中放入37℃ 5％CO2培养箱中培养24小时后准备用。进行体内植入支架。
本发明支架进行了相应的理化性能和生物学特征的检测，结果表明符合设计要求。
实施例3内皮化支架介入治疗动脉瘤的实验将上述自体内皮细胞化动脉瘤支架均匀压缩于微导管球囊表面备用。
选用上述的同一实验用犬(15-20Kg)，颈外静脉采集后建立颈总动脉动脉瘤模型(瘤颈8mm；瘤体6×8×10mm3)。模型建立后三周，将颈总动脉动脉瘤犬经静脉全身麻醉后固定于数字减影血管造影(DSA)床，经右侧股动脉插入6F动脉鞘。常规血管造影显示动脉瘤位置及形态后，将6F导引导管置于载瘤颈总动脉的近端。自体内皮细胞化动脉瘤通过微导管输送到动脉瘤瘤颈位置，球囊扩张到位后释放支架。即刻复查DSA显示支架位置满意，动脉瘤内涡流产生，部分血栓形成，瘤体缩小。三月后复查DSA显示动脉瘤不显影。将动脉瘤解剖离体，经免疫组化染色显示瘤颈部位有内皮细胞层形成。对照组采用裸不锈钢支架经相同途径治疗后，三月后DSA显示动脉瘤闭塞不全，免疫组化染色显示瘤颈部位内皮细胞层形成不全。
权利要求
1.一种内皮细胞化动脉瘤支架，其特征是由涂层生物可降解的高分子生物材料的不锈钢动脉瘤支架和自体血管内皮细胞组成，所述的不锈钢动脉瘤支架表面涂层上贴附自体血管内皮细胞。
2.按权利要求1所述的内皮细胞化动脉瘤支架，其特征是所述的自体血管内皮细胞选自自体静脉内皮层。
3.按权利要求1所述的内皮细胞化动脉瘤支架，其特征是所述的支架表面涂层的高分子生物材料为肝素键合的聚乳酸-氨基酸共聚物。
4.按权利要求1的内皮细胞化动脉瘤支架的制备方法，其特征是包括以下步骤，(1)培养自体血管内皮细胞取实验用犬颈静脉血管段，放入1％胶原酶，0.125％胰酶中消化，吸出细胞悬液，离心，倒去上清夜，用80％DMEM20％胎牛血清，20ng/mlVEGF培养液重悬细胞，将1×106细胞密度的细胞悬液种植于涂有多聚赖氨酸的培养皿CO2培养箱中培养，传代；(2)制备涂层材料及不锈钢支架表面涂层将交酯或内酯与含多官能团氨基酸的吗啉二酮衍生物，以辛酸亚锡为催化剂，进行聚合，所得聚合物用Pd/C为催化剂催化氢化或采用HBr/HAc为催化剂脱去保护基团后，得具有可反应性侧基的生物降解型聚酯，再将脱保护后的聚合物与肝素溶解在混和溶剂THF/H2O中，以二环己基碳二亚氨为催化剂进行反应，得到可完全生物降解的药物高分子材料；将制备的生物可降解高分子材料溶解在氯仿中，所得溶液喷涂到支架表面抽干，消毒后待用；(3)内皮化不锈钢支架集成采用1×107-5×107的滴度细胞悬液滴在血管支架上，使均匀贴附在支架上后浸入培养液，CO2培养箱中培养24小时备用。
5.按权利要求4的制备方法，其特征是步骤2所述的交酯或内酯选自L-丙交酯，DL-丙交酯，乙交酯或己内酯等类似的单体。
6.按权利要求4的制备方法，其特征是步骤2的交酯或内酯与含多官能团氨基酸的吗啉二酮衍生物的投料摩尔比例为99∶1～1∶99。
7.按权利要求4的制备方法，其特征是步骤2的溶解在氯仿中的所得溶液浓度为10％wt～0.01％wt，喷涂到支架表面的剂量为10～1000ug。
全文摘要
本发明属生物医疗材料领域，涉及一种内皮细胞化动脉瘤支架及其制备方法。本发明将自体静脉内皮层采集扩增的血管内皮细胞粘附于经生物相容性的，生物可降解的，无毒的高分子生物材料涂层的金属动脉瘤支架表面制成动脉瘤支架，能在支架建立后加快瘤颈口新生内皮的产生和覆盖，减少动脉瘤复发和避免载瘤动脉的狭窄，提高动脉瘤特别是颅内动脉瘤的治愈率，减少动脉内血栓形成。本发明克服了不锈钢裸支架的诸多缺陷，无免疫源性和伦理问题，制备成本不高、技术成熟。有利于提高我国在新型血管内治疗材料和推动颅内动脉瘤介入治疗的学术水平。
文档编号A61L27/40GK101073677SQ20061002665
公开日2007年11月21日 申请日期2006年5月17日 优先权日2006年5月17日
发明者朱巍, 周良辅, 程树军, 汪洋, 毛颖, 宋冬雷, 田彦龙, 朱云梦 申请人:复旦大学附属华山医院