专利名称：一种带内支撑的组织工程化软骨及其制备方法
技术领域：
本发明涉及医学组织工程技术领域，是临床上用作永久性假体的一种带有内支撑的组织工程化软骨及其制备方法。
背景技术：
临床上因先天畸形、创伤、肿瘤等原因致阴茎或睾丸残缺的患者往往需要植入医用假体。因软骨具有良好的弹性、内部无血管生长，加之自体细胞无免疫源性的特点，构建具有特定形状与体积的组织工程化软骨，以替代目前临床的医用假体已成为组织工程一个重要的研究方向。目前，已有关于组织工程化阴茎及睾丸软骨假体的研究报告。Yoo等(Yoo JJ，Park HJ，Atala A.Tissue engineeringapplications for phallic reconstruction[J].World J Urol，2000，1862-66.)通过软骨细胞与聚羟基乙酸(PGA)复合先后于裸鼠体内及兔阴茎原位内，形成了组织学优良、形态特定的软骨棒，其最大体积为直径1.2cm，长6.0cm。此软骨棒与3 Jonas银线棒假体和3 AMS 700可膨胀阴茎假体比较，各项力学性能相差不大。Baez等(Kim BS，Yoo JJ，Atale A.Engineering of human cartilagerodspotential application for penile prostheses[J].J Urol，2002，1681792-1797.)通过牛软骨细胞与PGA复合后植入到裸鼠的阴囊内，一个月后形成了具有一定的弹性及良好的组织相容性的睾丸假体。
但这种组织工程化软骨的厚度一般为1～5mm，厚度增加便很可能出现“空心”现象，软骨出现塌陷，不能维持良好的形态及强度，因而难以用于临床。这种“空心”现象的主要原因在于(1)软骨是缺乏血管的组织，细胞代谢依赖基质的渗透，随着外层细胞外基质不断的合成与成熟，超过一定厚度的内层细胞会因传质效率的降低而发生代谢障碍；(2)软骨组织工程常用的支架材料PGA的降解产物呈酸性，支架内部的降解产物因不能及时渗透至外部而不断蓄积，致使局部PH不断降低，从而影响了软骨细胞的活性。
为克服“空心”现象，以不可降解的生物材料为内支撑是一种较切实可行的途径。医用多孔高密度聚乙烯(商品名为MEDPOR)无抗原性，无致敏性，不可降解，高稳定性，该材料的多孔性使得血管及软组织可长入而不致移位。体外实验表明，MEDPOR的三维颗粒特点可促进表面接种的分化软骨细胞表型的维持及细胞外基质的形成。Arevalo-Silva等(Arevalo-Silva CA，Eavey RD，Cao Y，et al.Internal support of tissue-engineered cartilage.Arch Otolaryngol Head Neck Surg，2000，1261448-52.)以MEDPOR为内支撑，外涂含自体软骨细胞的聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物(Pluronic)悬液，将其移植于兔皮下6周后形成带有内支撑的弹性软骨。并发现，这种含永久性内支撑的组织工程化软骨成功限制了MEDPOR的炎症反应。但，由于Pluronic是一种具有热敏感性的凝胶状高分子生物材料，凝胶层在体内构建软骨难以形成预制形状的假体。
发明内容
本发明提供一种具有一定体积与形状的带有内支撑的组织工程化软骨及其制备方法。
本发明选用生物力学良好、可被机体降解吸收的PGA替代Pluronic，将PGA无纺网包裹于制成特定形状和大小的内支撑MEDPOR外，再于PGA无纺网内接种自体软骨细胞，经一定时间体外培养后植入体内。由PGA无纺网包裹的支架能保持一定的形状大小，PGA在体内逐渐被降解吸收并不断被新生的自体软骨基质替代，假体就能长期留在体内且不发生排斥。
本发明带有内支撑的组织工程化软骨的制备方法如下1、制备自体软骨细胞悬液按常规在无菌条件下切取软骨消化并培养，收集第三代以内的任一代细胞，配成细胞悬液备用。
2、支架的制备将MEDPOR制成预定的体积与形状作为内支撑，外裹预定厚度的PGA无纺网，制成PGA-MEDPOR复合支架。
3、细胞-支架复合及培养将复合支架消毒清洗后置入含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养液预培养24h，吸干后，将自体软骨细胞悬液均匀滴加于复合支架表面，37℃培养4h后移入含10％FBS的DMEM的培养液内按常规继续培养，隔日换液一次，2周后即可行体内移植。
本发明带内支撑组织工程化软骨由于利用生物力学性能较好的PGA无纺网包裹于具有特定形状大小且不会被降解的MEDPOR外，使构建的带有内支撑的组织工程化软骨的形状具有可控性。
具体实施例方式
现结合实施例对本发明作详细描述。
实施例1构建用作睾丸假体的带内支撑组织工程化软骨1、制备自体软骨细胞悬液无菌条件下切取新生幼猪四肢大关节表面软骨，呈大小相对一致的颗粒(2mm×2mm)。0.25％氯霉素浸泡20min。PBS冲洗后，加入临时用DMEM培养液配制的0.3％II型胶原酶，于37℃恒温摇床内消化1h后吸弃液体，换用0.075％II型胶原酶继续消化12h，收集细胞。经200目筛网过滤，混合均匀后计数(并行台盼蓝染色检查软骨细胞活力，活力大于85％，则用于实验)。离心(1500r/min、5min)后弃上清，漩涡振荡器内混匀，加入含10％FBS的DMEM培养液，配成细胞密度为5×107/ml的软骨细胞悬液备用。
2、支架的制备与预处理将MEDPOR制备成长短径分别为8、12mm的椭球体，外裹2mm厚PGA无纺网，制成PGA-MEDPOR复合支架。支架在细胞接种前75％酒精浸泡消毒30min，PBS冲洗两遍，加入含10％FBS的DMEM培养液预培养24h，吸干后备用。
3、细胞-支架复合及培养将上述软骨细胞悬液均匀滴加于支架表面，37℃、5％CO2、饱和湿度CO2孵箱内培养4h后移入50ml含有10％FBS的DMEM培养液内继续培养，隔日换液一次。2周后植于裸鼠背部皮下，继续培养6周后取出，即成为睾丸假体。
实施例2构建用作阴茎假体的带内支撑组织工程化软骨细胞获取、支架预处理及细胞-支架复合培养方法同实施例1，内支撑的MEDPOR改为直径6mm，长30mm。
按照上述方法，可制备多种假体，如眼球、鼻、颅骨、颌面骨等假体。
权利要求
1.一种带内支撑的组织工程化软骨的制备方法，步骤如下(1)制备软骨细胞悬液按常规在无菌条件下切取软骨消化并培养，收集第三代以内的任一代细胞，制成细胞悬液备用；(2)支架的制备以医用多孔高密度聚乙烯MEDPOR为材料制成预定形状和大小的内支撑，外裹预定厚度的聚羟基乙酸PGA无纺网，制成包裹成PGA-MEDPOR复合支架；(3)细胞-支架复合及培养将复合支架消毒清洗后置含10％胎牛血清的DMEM培养液中预培养24小时，取出吸干培养液，再将上述(1)制备的软骨细胞悬液均匀滴于复合支架表面，37℃孵育4小时后移入含10％胎牛血清的DMEM培养液内，按常规培养，隔日换液一次，2周后即可行体内移植。
2.权利要求1所述方法制备的带内支撑的组织工程化软骨。
全文摘要
本发明涉及医学组织工程技术领域，是临床上用作永久性假体的一种带有内支撑的组织工程化软骨及其制备方法。本发明以无抗原性，无致敏性，不可降解且具有高稳定性的医用多孔高密度聚乙烯MEDPOR为材料制成预定形状和大小的内支撑支架，再用生物相容性好可被机体降解吸收的无纺聚羟基乙酸PGA包裹内支撑支架形成PGA－MEDPOR复合支架，然后将制备的自体软骨细胞悬液均匀滴于复合支架表面的无纺PGA内，经一定时间体外培养后植入体内。包裹于内支撑外的无纺PGA逐渐被降解吸收并不断被新生的自体软骨基质替代，其不仅可保持原形，而且组织相容性极好，所以可以作为永久性假体置于体内。
文档编号A61L27/40GK1872353SQ20061002803
公开日2006年12月6日 申请日期2006年6月22日 优先权日2006年6月22日
发明者吴玉家, 江华, 朱鴷 申请人:中国人民解放军第二军医大学