专利名称：抑制肿瘤的反义核苷酸的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术或医学领域；更具体的，本发明涉及可用于调节Bcl-2表达水平的反义核苷酸，及其制备方法和用途。
背景技术：
肿瘤是威胁人类生命的第一大疾病，而传统的治疗肿瘤的方法，包括化疗，放射性疗法及切割手术，都存在着特异性低，副作用大等缺点。许多身体虚弱的肿瘤患者最终并非死于癌症，而是死于化疗，放疗的巨大副作用。手术切除只适用于实体瘤，而且手术会给患者带来巨大痛苦，还有可能促使肿瘤恶化。此外，肿瘤易对化疗药物产生耐药性也是人们在治疗癌症的过程中遇到的一大问题。
基于上述原因，本领域研究人员一直在努力地寻找新的肿瘤治疗靶点，以期开发出特异性高，副作用小的抗癌药物，而Bcl-2蛋白就被认为是具有如此潜力的抗肿瘤靶点。
Bcl-2蛋白是Bcl-2蛋白家族的一员，在细胞凋亡的调控过程中起到关键性作用。它通过BH3疏水结构域将属于同一蛋白家族的凋亡促进因子“锚定”，从而限制后者发挥作用，避免了内源性细胞凋亡的“启动者”细胞色素C等从线粒体内的释放并最终阻止细胞凋亡。目前，一个被普遍接受的假设是“以Bcl-2为代表的凋亡抑制因子和以Bid，Bax为代表的凋亡促进因子在细胞中的比率决定了细胞是否走向凋亡”，足见Bcl-2在细胞凋亡调控中的重要性。
目前，已知的大部分肿瘤细胞，包括肺癌，肝癌，乳腺癌，结肠癌等等，都发现了Bcl-2的高表达。通常认为，这种重要的凋亡抑制因子的高表达使得肿瘤细胞逃脱了既定的凋亡进程，无限增殖。另外，临床上认为，Bcl-2的高表达也同肿瘤耐药性的产生相关。因此，肿瘤细胞内的Bcl-2蛋白表达量的下调，将具有促进肿瘤细胞凋亡并增加其对化疗药物敏感性的效果。
但是，Bcl-2功能的行使主要依靠蛋白之间的相互作用，而非与小分子配体的结合，开发出特异性的影响Bcl-2蛋白结合功能的小分子的难度较大。
因此，本领域迫切需要进一步在基因水平和蛋白水平深入研究Bcl-2，以期找到特异性高，副作用小的Bcl-2抑制药物，从而为Bcl-2相关疾病，特别是肿瘤的预防、改善或治疗提供新的途径。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于预防或治疗Bcl-2相关疾病，特别是肿瘤的反义核苷酸。
在本发明的第一方面，提供一种反义核苷酸，其特征在于，所述的反义核苷酸具有通式(I)所示的结构5’-CTC CCA GCG TGC GCC AT Z-3’(I)其中，Z选自C、或CC。
在本发明的一个优选例中，所述的反义核苷酸的序列中至少2个磷酸键被硫代修饰。
在本发明的另一优选例中，所述的反义核苷酸的序列中所有磷酸键都被硫代修饰。
在本发明的另一优选例中，所述的反义核苷酸用于制备预防或治疗Bcl-2相关疾病的药物。
在本发明的另一优选例中，所述的Bcl-2相关疾病包括肿瘤。
在本发明更优选的优选例中，所述的肿瘤包括(但不限于)肺癌，肝癌，乳腺癌，宫颈癌，结肠癌，造血系统癌，内分泌系统癌，或淋巴结癌，以及各种原发部位不明的癌。
在本发明的第二方面，提供一种药物组合物，所述的药物组合物含有有效量的所述的反义核苷酸，以及药学上可接受的载体。
在本发明的另一优选例中，所述的药物组合物中还可含有紫杉醇、氟达拉滨、阿糖胞苷、柔红霉素、顺铂、5-氟尿嘧啶、多柔比星、依托泊苷、天冬酰胺酶、泼尼松、或甲氨蝶呤。
在本发明的第三方面，提供一种体外抑制肿瘤细胞生长的方法，所述的方法包括将所述的肿瘤细胞与所述的反义核苷酸接触，从而抑制肿瘤细胞的生长。
另一方面，本发明还提供了一种预防或治疗Bcl-2相关疾病的方法，包括给予受试者安全有效量的所述的反义核苷酸。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
图1显示了反义药物以及传统药物的作用机理示意图。
图2显示了在制备反义药物时，将脱氧核苷酸链硫代修饰为硫代脱氧核苷酸链的一种步骤。
图3A显示了磷酸键被硫代后的结构示意图；图3B显示了四种脱氧核苷酸的碱基的结构式。
图4显示了本发明的反义反义核苷酸药物对人肿瘤细胞HT-29的生长抑制作用(3次实验取均值，对不同用药组进行完全随机资料的方差分析，P＜0.05)。
图5显示了集落实验检测肿瘤细胞集落形成抑制率。
图6显示了反义核苷酸KS0604和KS0605具有明显的提高肿瘤细胞HT-29和H446对化疗药物依托泊苷敏感性的作用。
具体实施例方式
本发明人经过广泛而深入的研究，意外地找到一种可预防或治疗Bcl-2相关疾病的反义核苷酸。所述反义核苷酸与现有的治疗Bcl-2相关疾病的各种药物相比，具有明显更优的预防或治疗效果。基于此完成了本发明。
如本文所用，“Bcl-2”相关疾病是指与Bcl-2的基因或蛋白的表达相关的疾病，包括但不限于细胞增生性疾病(如肿瘤)。
反义核苷酸药物如本文所用，“反义核苷酸”又称为“反义寡核苷酸(AS-ONs，antisense-oligonucleotides)”或“反义药物”，是指长度约为15-22个碱基的DNA分子及其类似物，可与mRNA互补。根据核苷酸杂交原理，所述的反义核苷酸能与特定的基因发生杂交，激活内源核酸酶(通常为RNase H)降解mRNA或者阻断翻译过程，从而导致细胞相关蛋白质水平下调。反义药物作用原理的示意图见图1，其不同于传统的药物。
在本发明中，所述的“反义核苷酸”还包括采用如基于核酸链骨架修饰技术等手段获得的经修饰的反义核苷酸，所述的修饰基本不改变反义核苷酸的活性，更佳地，所述修饰可提高反义核苷酸的活性或治疗效果。例如，所述的修饰为硫代修饰，或在核糖的2’位置进行烷基修饰。
迄今为止，本领域人员就已经尝试了包括N-myc，Raf，survivin，MDM-2等等作为反义药物的靶点。但是，由于第一代反义药物是单纯的脱氧核苷酸链，溶解性，细胞摄取能力等都不够理想，而且易被内源性核酸酶降解，因此，不能达到良好的治疗效果。基于核酸链骨架的修饰技术发展出的第二代反义药物在可溶性，抗核酸酶降解等方面大有改善，且易于大量合成，能满足临床所需。寡核苷酸的骨架修饰方法有多种，包括硫代法，将脱氧核苷酸链硫代修饰为硫代脱氧核苷酸链的一种步骤见图2。该方法是将DNA骨架上的磷酸键的氧原子用硫原子替代，使得药物具有良好的水溶性，并可抵抗核酸酶降解。临床试验中，采用皮下、肌肉和静脉注射等方法给药，可分布于除脑组织外的各器官和组织中，可与血浆蛋白结合，主要从尿中排出。从理论上来讲，根据反义技术获得的反义分子可用于治疗任何由基因表达或者基因缺失引起的疾病，比如病毒感染、癌症和炎症。尽管反义技术在理论上相当完美，但是在实际应用中还面临着挑战，并非所有的反义分子都能起到良好的作用。
本发明人以Bcl-2的mRNA作为模板，设计出了可特异性与该mRNA结合的反义核苷酸；具体地，本发明涉及的反义核苷酸序列通式如下(其中，A，G，C，T分别代表腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶，胸腺嘧啶四种碱基，这些碱基的结构式参见图3B所示)5’-X CTC CCA GCG TGC GCC AT Y-3’其中，X选自空白、T、TT、或GTT；Y选自C、CC、或CCT。
此外，可对本发明提供的反义核苷酸进行适当的修饰，从而达到改善其Bcl-2抑制效果、提高活性、增加稳定性、降低毒性、延长半衰期等目的。应理解，任何能够保持所述反义核苷酸的大部分或全部活性的修饰都包含在本发明中。
在本发明的一种优选方式中，所述的反义核苷酸的序列中至少2个磷酸键被硫代修饰。磷酸键被硫代的结构示意图见图3。
在本发明的一种更优选的方式中，所述的反义核苷酸的序列中所有磷酸键都被硫代修饰。
在本发明的一种优选方式中，本发明中涉及到具有相同序列骨架5’-CTCCCA GCG TGC GCC AT-3’的12种反义核苷酸序列的组合，详见表1。
表1
在本发明的更优选的方式中，所述的反义核苷酸序列通式如下5’-CTC CCA GCG TGC GCC AT Z-3’(I)其中，Z选自C、或CC。
也即，所述的反义核苷酸具有SEQ ID NO3或SEQ ID NO4所示的序列；更优选的，所述的反义核苷酸中所有磷酸键都被硫代修饰。这两种硫代形式的反义核苷酸的对Bcl-2的抑制效果是非常理想的，远远优于与之具有一个或多个碱基差异的其它种类的反义核苷酸。
反义核苷酸药物的用途本发明人的研究发现，使用上述反义核苷酸(优选的为硫代反义核苷酸)，可抑制Bcl-2的表达，从而可达到预防或治疗Bcl-2相关疾病的目的。在本发明的优选方式中，所述的反义核苷酸通过调节肿瘤细胞内的Bcl-2蛋白的表达，抑制肿瘤细胞增殖。
本发明的反义核苷酸还可增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。由于肿瘤抗药性的产生同Bcl-2蛋白密切相关，本发明涉及的反义药物可以降低细胞内Bcl-2的水平，增强其对化疗药物的敏感性，从而减少化疗药物的使用量，将化疗对患者造成的伤害大大降低，这是传统药物无法实现的。
所述的化疗药物包括(但不限于)紫杉醇、氟达拉滨、阿糖胞苷、柔红霉素、顺铂、5-氟尿嘧啶、多柔比星、依托泊苷、天冬酰胺酶、泼尼松、或甲氨蝶呤。
抑制Bcl-2相关疾病的方法本发明还提供了一种抑制Bcl-2相关疾病的方法，所述的方法包括采用本发明的反义核苷酸，使之与Bcl-2的mRNA发生杂交，从而抑制Bcl-2的表达。
在本发明的一种优选方式中，所述的Bcl-2相关疾病为肿瘤。因此，本发明提供了一种抑制肿瘤的方法，所述方法包括采用本发明的反义核苷酸，抑制肿瘤中Bcl-2的表达，使肿瘤细胞发生凋亡，从而达到抑制肿瘤的目的。
药物组合物本发明还提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有有效量的所述的反义核苷酸，以及药学上可接受的载体。
所述“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。
所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
所述“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。
本发明的反义核苷酸的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于反义核苷酸的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的反义核苷酸每天以约0.001-100mg/kg(优选的为0.01-20mg/kg)动物体重的剂量给予时，能得到令人满意的效果，较佳地每天以2-4次分开的剂量给予，或以缓释形式给药。对大部分大型哺乳动物而言，每天的总剂量约为0.005-100mg，较佳地约为0.008-50mg。可调节此剂量方案以提供最佳治疗应答。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
任何适用的给药途径都是可以的，包括但不限于口服、静脉内注射、皮下注射、肌肉给予、局部给予、植入、缓释给予、肿瘤内给予等；优选的，所述给药方式是非肠道给予的。
在本发明的一种方式中，所述的药物组合物中还可含有其他Bcl-2相关疾病的治疗剂。所述治疗剂比如肿瘤治疗剂。
此外，本发明的药物组合物可与其它的Bcl-2相关疾病的药物联合用药；或者也可结合其它治疗手段使用。
本发明的主要优点在于1.传统药物的靶点通常为蛋白质，而本药物的作用靶点是细胞凋亡抑制因子Bcl-2的mRNA。本发明涉及的药物是反义核苷酸、特别是反义硫代寡核苷酸，经过证明，其比现有的其它Bcl-2抑制药物效果更为理想。
2.药物特异性高且具有广谱性。反义药物利用核酸杂交原理可与靶蛋白的mRNA特定序列高特异性结合。Bcl-2蛋白在多种人肿瘤细胞中高表达，并且同肿瘤细胞的抗凋亡相关，因此本药物具有治疗多种癌症的潜力。
3.药物用量小，副作用小。本发明涉及的药物作用于基因水平，位于细胞生理活动的更上游，因此药物用量更小。反义药物的母体是人体遗传物质DNA，不含较大毒性基团，毒副作用小。
4.可增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。前已述及，肿瘤抗药性的产生同Bcl-2蛋白密切相关，本发明涉及的反义药物可以降低细胞内Bcl-2的水平，增强其对化疗药物的敏感性，从而减少化疗药物的使用量，将化疗对患者造成的伤害大大降低，这是传统药物无法实现的。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室指南(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。
实施例1 反义药物的生产反义药物使用GE Amersham公司的AKTA oligopilot DNA/RNA Synthesizer合成，所用试剂的配制及合成操作均按照仪器操作手册进行，其中合成所用载体为Amersham公司的PS dC 30HL。纯化和脱盐过程同样使用Amersham公司的AKTA离子交换纯化系统完成，操作遵照仪器手册进行。
反义核苷酸的主要生产过程简述如下1，依照GE Amersham公司的AKTA oligopilot DNA/RNA Synthesizer要求将质量合格的乙腈，脱保护试剂，单体溶液，硫代和封闭试剂安装于合成仪的相应部位；2，使用AKTA Oligopilot Unicorn4.0合成控制系统编写程序控制合成仪进行自动合成；3，合成粗产物使用Amesham提供的强阴离子交换柱(柱体Fineline100，填料Source 30Q)纯化，反相色谱柱(柱体Fineline100，填料Soucre 15RPC)脱盐；4，脱盐产物经旋转蒸发浓缩；5，产品稀释为一定浓度，真空冷冻干燥为白色粉末(GLZ-0.4型真空冷冻干燥机)，封装4℃保存。
整个生产过程均在百级洁净区内进行。
合成样品通过HPLC检测，纯度达95％以上，杂质主要包括长度比目的片断更短的寡核苷酸序列(N-x序列)，NaCl等。
实施例2 用于体外药效学检测的硫代反义核苷酸的合成依照反义药物的生产方法合成了四条本发明涉及的序列，同时合成已知的阳性对照药物G3139及K22和作为阴性对照的关键碱基错配序列(TM，two-basemismatch，两个关键碱基的错配即会对药效产生较大的影响)，相关药物序列见表2。
表2 实施例中合成的硫代反义核苷酸序列
实施例3本发明的反义核苷酸对体外培养的肿瘤细胞的增殖的影响本实施例中，选择人结肠癌细胞HT-29(购自上海申能博彩生物科技有限公司)为试验对象。细胞库中冻存的HT-29细胞复苏后细胞培养箱培养传代1周后检测细胞状态良好，开始实验。
在六孔板中构建2ml体积的细胞培养体系，其中每孔包含HT-29细胞500个，以不加药物做空白对照，TM做阴性对照，G3139和K22作为阳性对照。反义药物和阴性，阳性对照药的最终浓度均为5μM。细胞培养箱内培养15天后取出弃培养液，记录每孔细胞集落数。
统计结果见图4。结果显示，本发明的反义药物具有明显的抑制人肿瘤细胞HT-29增殖的活性。四种反义序列的抑制程度存在差异，其中，KS0604，KS0605两序列对细胞集落形成的抑制率可达50％以上，抑制效果好于与之具有一个或多个碱基差异的对照药物G3139和K22，也好于与之具有一个或多个碱基差异的反义核苷酸KS0601和KS0602。
实施例4 本发明的反义核苷酸对人肿瘤细胞Bcl-2蛋白表达的影响使用蛋白免疫印记实验(Western Blot)的方法，检测反义药物对人肺癌细胞H446(购自中国医学院肿瘤医院研究所)，人宫颈癌细胞Hela(购自中科院上海生科院)，人结肠癌细胞HT-29(购自上海申能博彩生物科技有限公司)等人肿瘤细胞Bcl-2表达的抑制作用。
上述细胞复苏后培养1周，检查细胞状态正常时开始实验。
细胞接种于6孔板，每孔15×104个细胞，待长至60-70％满度时加入反义药物及对照药物至终浓度1μM，继续培养48小时后裂解细胞获得总蛋白提取液用于实验。蛋白提取液稀释为1μg/μL，电泳上样20μL。
Western Blot实验操作遵照《分子克隆实验指南》(第二版，科学出版社出版)的固定化蛋白质的免疫学测定部分进行，实验中使用BIO-RAD的电泳和转膜系统，相关的缓冲液也依照《分子克隆实验指南》(第二版，科学出版社出版)说明配制。
显影胶片经图像扫描系统扫描后，以条带灰度作为蛋白表达的量化值，以空白对照为100％计算蛋白表达抑制率。
实验结果见表3。1μM剂量的反义药物即可不同程度降低上述体外培养人肿瘤细胞的Bcl-2的水平，其中KS0604和KS0605对HT-29和H446细胞的Bcl-2表达的抑制率达到60％以上。
表3 硫代反义核苷酸药物对不同肿瘤细胞Bcl-2表达的抑制作用 通过对本反义核苷酸药物的体外药效学检测，得到如下结论本发明涉及的几种硫代反义寡核苷酸药物具有降低多种人肿瘤细胞的Bcl-2表达水平的作用，并且这种蛋白水平的下调抑制了人肿瘤细胞的增殖。
实施例5 集落实验检测肿瘤细胞集落形成抑制率采取的实验步骤如下对数生长期的肿瘤细胞HT-29用胰酶消化，血球计数板计数；稀释细胞并植入新的六孔板中，每孔细胞数400个，终体积1ml，培养过夜；次日分组加入受试药物并将体系补为终体积2ml；4，培养箱内培养7天后取出，低倍显微镜下计集落数；处理数据，计算集落形成抑制率。
结果见图5。从结果可知，KS0604对肿瘤细胞HT-29的集落形成抑制效果显著好于K22和G3139，在10uM剂量时KS0604可以达到45％的抑制率，相同浓度下K22和G3139的抑制率在30％-35％之间。
因此，KS0604体外抑制肿瘤的效果相对于G3139和K22高10个百分点以上。由于药物的成本极高，相对比较有限的效果的提高将可能实现用药量的大幅度降低，亦即成本的大幅度降低。
实施例6 药物敏感性的检测药物敏感性测试的实验步骤如下1，在对数生长期的肿瘤细胞(HT29或H446，均购自中国医学院肿瘤医院研究所)培养液中添加终浓度为10uM的反义药物，作用48小时，不加反义药物组(溶剂对照；Solvent Control)和阴性药物(2碱基错配；Two-base Mismatch)组作为对照；2，消化细胞并计数，植入无菌96孔板，5000个细胞每孔，并加入一定浓度的依托泊苷，使用培养液将体系补齐为200uL；3，培养72小时后采用MTT法检测细胞活性。
结果见图6。从结果可知，KS0604以及KS0605具有明显的提高肿瘤细胞HT-29和H446对化疗药物依托泊苷敏感性的作用。尤其在针对H446细胞的试验中，依托泊苷10uM和30uM浓度下的药物增敏效果最为明显，反义药物预处理组在依托泊苷10uM浓度下相对细胞活力降至40％左右，而相应的非处理组仍为80％左右。
因此可见，本发明的反义核苷酸除了杀伤肿瘤细胞，其主要功能还在于提高肿瘤对各类化疗药物的敏感性，从而提高治疗效果，减少副作用。
鉴于大剂量传统化疗药物对肿瘤患者产生的巨大伤害，本发明涉及的反义药物的良好的增敏效果将可以为之提供一个可能的解决方案，并产生较为深远的影响。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>福建金山生物制药股份有限公司<120>抑制肿瘤的反义核苷酸<130>063473<160>15<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
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<221>misc_feature<223>反义核苷酸<400>15ctcccagcat gtgccat 1权利要求
1.一种反义核苷酸，其特征在于，所述的反义核苷酸具有通式(I)所示的结构5’-CTC CCA GCG TGC GCC AT Z-3’ (I)其中，Z选自C、或CC。
2.如权利要求1所述的反义核苷酸，其特征在于，所述的反义核苷酸的序列中至少2个磷酸键被硫代修饰。
3.如权利要求2所述的反义核苷酸，其特征在于，所述的反义核苷酸的序列中所有磷酸键都被硫代修饰。
4.权利要求1所述的反义核苷酸的用途，其特征在于，用于制备预防或治疗Bcl-2相关疾病的药物。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的Bcl-2相关疾病包括肿瘤。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤包括肺癌，肝癌，乳腺癌，宫颈癌，结肠癌，造血系统癌，内分泌系统癌，或淋巴结癌。
7.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有有效量的权利要求1所述的反义核苷酸，以及药学上可接受的载体。
8.如权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，其中还可含有紫杉醇、氟达拉滨、阿糖胞苷、柔红霉素、顺铂、5-氟尿嘧啶、多柔比星、依托泊苷、天冬酰胺酶、泼尼松、或甲氨蝶呤。
9.如权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，其中含有依托泊苷。
10.一种体外抑制肿瘤细胞生长的方法，其特征在于，所述的方法包括将所述的肿瘤细胞与权利要求1所述的反义核苷酸接触，从而抑制肿瘤细胞的生长。
全文摘要
本发明属于生物技术或医学领域，公开了一种反义核苷酸，所述的反义核苷酸具有通式5’－CTC CCA GCG TGC GCC AT Z－3’所示的结构；更优选的，所述的反义核苷酸是硫代反义核苷酸。经过证明，本发明反义核苷酸比现有的其它Bcl－2抑制药物效果更为理想，且毒副作用小。
文档编号A61P35/00GK1887896SQ20061002920
公开日2007年1月3日 申请日期2006年7月21日 优先权日2006年7月21日
发明者翟培彬, 陈仁海, 陈希中, 林英略, 王巍, 黄旭华 申请人:福建金山生物制药股份有限公司