专利名称：一种可诱生细胞免疫应答的共表达载体和真核表达载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体地说关于一种可诱生细胞免疫应答的pGL3/CD80-P1A共表达载体和pcDNA3.1/B2M-IL15真核表达载体。
背景技术：
DNA疫苗(DNA vaccine)又称核酸疫苗、基因疫苗(gene vaccine)，是指将编码某种目的抗原蛋白的外源基因插入真核细胞表达质粒，直接导入动物体细胞内，并通过宿主细胞的表达系统合成抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答，从而达到预防和治疗疾病的目的。核酸疫苗不仅能刺激机体产生特异性的体液免疫，还能诱导产生特异性的具有细胞毒杀伤性功能的CTL效应(细胞免疫)，并可直接清除带有目的抗原的靶细胞，因此对病毒、细胞内寄生的细菌和寄生虫所引起的传染病具有广阔的治疗前景。表位疫苗(epitope vaccine)是用抗原表位制备的疫苗，包括合成肽疫苗(synthetic peptide vaccine)、重组表位疫苗(recombinantepitope-based vaccine)及表位DNA疫苗(epitope DNA vaccine，minigenes/epigenes)，是目前研制感染性疾病和恶性肿瘤疫苗的方向。表位(epitope)是抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团，又称抗原决定簇(antigenic determinant)，它是T细胞抗原受体(T cell receptor，TCR)和B细胞抗原受体(B cell receptor，BCR)及抗体特异结合的基本单位。在免疫应答中，TCR和BCR所识别的抗原表位不同，分别称为T细胞表位和B细胞表位。主要组织相容性复合体(major histocompatibilitycomplex，MHC)是高度多态性的细胞表面分子，它将多肽片段递呈给T细胞。与MHC I类分子结合的抗原肽为8-12个氨基酸，是来自内源性抗原经蛋白酶降解后的产物。蛋白酶水解片段通过抗原加工相关转运体(transporterassociated with antigen processing，TAP)转运至内质网与新合成的MHCI类分子相结合，MHC肽复合体转移至细胞表面被CD8+细胞毒T淋巴细胞的TCR识别。MHC II类分子结合肽长度变化较大，为9-25个氨基酸，主要由外源蛋白通过溶酶体中的蛋白酶降解而来。在内体溶酶体中与MHC II类分子结合后，MHC肽复合体也转运至细胞表面被CIM T细胞TCR识别。据此可设计出两大类T细胞疫苗，即与相应的MHC I及MHC II类分子相关的CD8 T细胞疫苗和CIM T细胞疫苗。CIM辅助性T细胞(helper T cell，Th)又分为分泌不同细胞因子却又交叉调节的两群，即Th1和Th2。
DNA疫苗作为第三代疫苗，与血源疫苗和基因工程疫苗相比，具有以下优点在宿主体内合成所编码的蛋白质，具有与天然抗原相似的构象；能诱导机体产生全面的免疫应答；免疫应答持久；易于制备，化学结构稳定，便于保存和运输；可将编码不同抗原的基因构建在同一质粒中或将不同抗原基因的多种重组质粒联合应用，制备多价核酸疫苗；给药途径多样化等，为预防和治疗各种疾病提供了一种重要的思路。但是，由于机体组织对导入质粒有一定程度的破坏，外源基因的转染率较低，导入基因在体内不能也不应自我复制，都限制了核酸疫苗的使用效果。在免疫效果方面，总体而言动物尤其是小动物的试验效果优于人体试验，国内外研究者正谋求以多种方式提高免疫效果，如使用佐剂、改进导入方式、优化表达序列、多抗原表位结合等，使用的剂量也倾向加大。因此，如何增强核酸疫苗的免疫原性成了当前研究的重点。已有的增强DNA疫苗免疫效率的策略主要包括①优化外源基因编码序列核酸疫苗不含病原体的蛋白合成系统，完全依赖于宿主细胞凋控，将外源基因优化为宿主细胞偏好的密码子，可改善目的抗原的合成，进而促进免疫效果。研究表明，选用人体细胞偏好的密码可提高翻译效率，促进蛋白表达，显著提高细胞和体液免疫反应。②细胞因子的免疫佐剂效应细胞因子是体内免疫细胞或非免疫细胞产生的一组具有广泛生物学活性的异质类肽性调节因子，在体内能激活和调节免疫活性细胞，对免疫应答的产生和调节具有重要作用。业已发现多种细胞因子具有免疫佐剂作用，可调节免疫应答的强度和方向。Th1细胞主要产生IL-2、IFN-γ，在促进细胞免疫、清除细胞内病原体方面具有优势，Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10，以促进抗体产生为主，而IL-10又对Th1细胞因子产生明显的抑制作用，从而形成免疫调控网络。以细胞因子作为佐剂，可望提高核酸疫苗的免疫效果。在使用方式上，除可直接使用细胞因子外，还可以细胞因子基因与疫苗质粒共免疫，或构建二者的共表达质粒。③共刺激分子的佐剂效应共刺激分子如B7、ICAM-1、VCAM-1、LFA-3等T细胞激活的第二信号，目前研究较多的是B7-1和B7-2分子。T细胞受体与抗原结合产生T细胞活化的第一信号，而T细胞表面的CD28与抗原递呈细胞表达的B7分子结合产生第二信号，T细胞只有同时受到这两种信号的刺激，才能被充分活化。缺乏B7等共刺激分子提供的第二信号，则可能导致T细胞的凋亡或产生免疫耐受。④增加CpG免疫刺激序列(ISS)近年来发现一些非甲基化脱氧核苷酸片断(CpG DNA)能增加核酸疫苗的免疫效果，以细胞免疫反应尤为明显，因此称之为免疫刺激序列(ISS)。免疫刺激序列的基本骨架为5’-嘌呤-嘌呤-CpG-嘧啶-嘧啶-3’，主要来源于细菌DNA，合成的相同序列具有相似的免疫增强作用，但是甲基化修饰或改变序列，则免疫刺激作用完全消失。CpG免疫刺激序列增强免疫反应的机理可能是直接诱导B细胞增殖活化并分泌IL-2、IL-6，保护B细胞免受细胞凋亡作用，刺激单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞活化分泌TNF-α、IL-6、IL-12，刺激T细胞、NK细胞分泌IFN-γ。总之，CpG诱导Th1类细胞因子产生，增加特异性IgG2a抗体的产生，增强CTL反应。
核酸疫苗可通过多种途径及方式接种到机体内，肌肉、皮下、皮内、静脉、腹腔、粘膜都可以是核酸疫苗的接种部位，合适的接种途径和方式有利于提高蛋白表达水平和减少个体差异对免疫应答效果的影响。肌纤维是已永久地有丝分裂后的细胞，转入的DNA不会因为细胞分裂而较快地稀释或丢失，可长期稳定表达。所以，肌肉注射成为最常用的DNA疫苗注射方式。不过，肌纤维对DNA的摄取效率低是重要的限制因素，可将局部肌肉组织经物理或化学因素处理(如局部冷敷、注射麻醉剂或蛇毒、心肌毒素等)，产生炎症反应，损伤的肌细胞在增生过程中，可增加质粒摄入，使目的抗原表达量增多。电脉冲技术的作用机制是使细胞膜双层磷脂结构在电场的作用下发生改变，形成瞬间可逆的微孔，于是DNA或其他物质分子得以进入细胞。在体电脉冲(in vivo electroporation，又称电穿孔技术)正是用上述这种基本原理，使得DNA能够注入到活细胞内以提高其治疗效果。同时，由于电脉冲造成组织的轻微损伤产生了局部组织的炎症反应，可增强抗原递呈细胞(APC)功能，从而进一步提高了DNA疫苗的免疫原性，诱导机体产生更强的免疫应答。另外，在体电脉冲技术增强DNA疫苗的免疫效果较常用的基因枪方法更为简单实用，具有一次导入的质粒DNA量大、成本低、易于推广等优点，有可能成为非病毒载体基因治疗接种方法中的一项主导性技术。
发明内容
本发明的目的在于(1)提供一种可诱生细胞免疫应答的pGL3/CD80-P1A共表达载体；(2)提供一种可诱生细胞免疫应答的pGL3/CD80-P1A共表达载体构建方法；(3)提供一种可增强细胞免疫应答的pcDNA3.1/B2M-IL15真核表达载体；(4)提供一种可增强细胞免疫应答的pcDNA3.1/B2M-IL15真核表达载体构建方法；(5)提供一种可诱生细胞免疫应答的表位DNA疫苗。
本发明的目的是通过以下技术方法来实现的本发明采用质粒pGL3/CMV-epitope-linker-β 2m-TA-SV40-CD80-TA，其中pitope-linker-β 2m融合基因以CMV为启动子，BGH PA为转录终止信号；CD80基因以SV40为启动子，SV40 PA为转录终止信号。本发明采用质粒pcDNA3.1/B2M-IL15，带有β2微球蛋白基因启动子(B2M)，含有BGH PA转录终止信号及氨苄青霉素抗性基因。质粒DNA用Qiagen Plasmid MaxiKit大量制备、纯化，溶于生理盐水，调整浓度为1μg/μl。
取6-8周龄DBA/2雌性小鼠(购自中科院上海实验动物中心)，分组后腹腔给药麻醉小鼠，然后用无菌微量注射器将10-100ug质粒pGL3/CMV-epitope-linker-β2m-TA-SV40-CD80-TA注射入小鼠后腿股四头肌。质粒注射后5分钟内，将电极放置于注射部位两侧，进行电脉冲刺激。用该质粒DNA每隔两周1次共3次免疫，方法同前。第3次免疫后的0-14天用10-100ug质粒pcDNA3.1/B2M-IL15注射入小鼠对侧后腿股四头肌，质粒注射后5分钟内，将电极放置于注射部位两侧，进行电脉冲刺激。第3次DNA免疫和加强免疫后的第18天采血，分离其单个核细胞或CD8+T细胞，用于四聚体分析和IFN-γ ELISPOT分析。
检测免疫后细胞免疫功能，采用四聚体分析检测抗原表位特异性CD8+T细胞的数量和比例。IFN-γ ELISPOT分析检测抗原肽特异性、分泌IFN-γ的功能性T细胞。
一种可诱生细胞免疫应答的pGL3/CD80-P1A共表达载体，它的核苷酸序列如SEQ ID NO2所述。
一种可诱生细胞免疫应答的pGL3/CD80-P1A共表达载体，它的构建如下(1)构建pcDNA3.1/P1A载体；(2)构建pGL3/CD80载体；(3)将pcDNA3.1载体上的epitope-linker-β2m融合基因表达框架亚克隆到pGL3/CD80载体中，形成pGL3/CD80-P1A共表达载体。
一种可增强细胞免疫应答的pcDNA3.1/B2M-IL15真核表达载体，它的核苷酸序列如SEQ ID NO3所述。
一种可增强细胞免疫应答的pcDNA3.1/B2M-IL15真核表达载体，它的构建如下(1)克隆人β2微球蛋白基因启动子；(2)克隆人白细胞介素15基因片断；(3)构建pcDNA3.1/B2M-IL15真核表达载体。
一种可诱生细胞免疫应答的表位DNA疫苗，该疫苗包括pGL3/CD80-P1A共表达载体和pcDNA3.1/B2M-IL15真核表达载体。首先将pGL3/CD80-P1A共表达载体注射免疫，诱生抗原表位特异性细胞免疫应答；然后在0到14天注射权利要求3所述的pcDNA3.1/B2M-IL15真核表达载体增强其诱发的抗原表位特异性细胞免疫应答。
本发明所公开一种可诱生细胞免疫应答的共表达载体和真核表达载体，其优点表现在本发明有利于克服常规表位DNA疫苗免疫原性低的缺陷，可用于肿瘤及病毒持续性感染等的预防和治疗。
图1本发明实施例所用P1A35-43表位DNA疫苗pGL3/CMV-P1A-linker-β2m-TA-SV40-CD80-TA(即pGL3/CD80-P1A)质粒载体示意图；图2本发明所用含人β2微球蛋白基因启动子(B2M)的白细胞介素15(IL-15)真核表达载体pcDNA3.1/B2M-IL15质粒载体示意图；
图3A表位DNA疫苗免疫接种后P1A35-43表位特异性细胞免疫反应，质粒DNA注射免疫诱发表位特异性CD8+-T细胞反应的流式分析结果(单个核细胞)。
图3B表位DNA疫苗免疫接种后P1A35-43表位特异性细胞免疫反应，质粒DNA注射免疫诱发表位特异性CD8+-T细胞反应的流式分析结果(CD8+-T细胞)。
图3C表位DNA疫苗免疫接种后P1A35-43表位特异性细胞免疫反应，脾脏单个核细胞IFN-γ ELISPOT分析结果。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。
实施例11材料和方法1.1材料试剂各种限制性内切酶、T4 DNA连接酶购自Boehringer Mannheim公司；PCR试剂购自TaKaRa公司；细胞总RNA抽提试剂TRIZOL、逆转录反应试剂购自InVitrogen公司；DNA凝胶回收试剂盒及质粒DNA分离纯化试剂盒购自QIAGEN公司；琼脂糖购于Promega公司；酵母提取物，胰蛋白胨购于OXOID公司；Lamda DNA Hind III marker(华美公司)，100bpDNA Marker(天为时代公司)；单个核细胞分离液LymphoprepTM(Axis-Shield polAS)；MTT(华美公司)；ConA(购于晶美公司)；重组人IL-2购自PeproTech EC Ltd公司；R-PE labeled Pro5 MHC PentamerH-2Ld/LPYLGWLVF，FITC标记大鼠抗小鼠CD8分子单克隆抗体(克隆号KT15)和P1A九肽(LPYLGWLVF)均购自PROIMMUNE公司；Mouse IFN-γELISPOT kit(U-CyTech)。其他试剂均为国产分析纯。
质粒pGL3/promoter(购自Promega公司)；pcDNA3.1(购自Invitrogen公司)。pcDNA3/eb2m本室构建保存。
质粒pcDNA3.1/eb2m构建方法设计含有表位肽序列、linker及人β2m基因5’端的引物(pb2m)，以人DNA为模板，通过PCR方法扩增出融合基因，PCR产物再经酶切与同样酶切的pET-42b(+)质粒(购自Novagen公司)连接后，形成原核表达质粒pET-OVA-linker-β2m。再以质粒pET-OVA-linker-β2m为模板，eb2m(5)与eb2m(3)为引物，通过PCR方法扩增出含有信号肽序列的融合基因sOVA-linker-β2m，将该融合基因的PCR产物经过酶切与同样酶切的pcDNA3.1质粒连接后，获得真核表达载体pcDNA3.1/eb2m。
引物序列如下pb2m(5)5’CAG CAT ATG TCC ATA ATC AAC TTT GAA AAA CTC GGA GGA GGATCC GGA GGT GGC AGC ATC CAG CGT ACT CCA AAG 3’pb2m(3)5’CAA CTC GAG CAT GTC TCG ATC CCA C 3’eb2m(5)5’GAT AAG CTT ATG TCT CGC TCC GTG GCC TTA GCT GTG CTC GCGCTA CTC TCT CTT TCT GGC CTG GAG GCT TCC ATA ATC AAC TTT G 3’eb2m(3)5’CAA CTC GAG CAT GTC TCG ATC CCA C 3’菌株JM109(大肠杆菌)为本室冻存。
动物DBA/2(H-2d)，6-8周龄，雌性。均购于中科院上海实验动物中心，饲养于本校实验动物科学部清洁级动物房。
主要仪器低温台式离心机(Sorvall)，低温高速离心机(HITACHI)，紫外分光光度计(Eppendorf)，PCR仪(Biometra T3 Thermocycler)，流式细胞仪(Becton Dickinson FACS calibui)，酶标仪(MAX250，MolecularDevices公司)，ELISPOT图像自动分析仪Bioreader4000(BIO-SYS GmbH)，电脉冲仪CUY21(NEPA公司)。
1.2方法1.2.1人CD80基因真核表达载体的构建通过RT-PCR方法克隆人CD80基因，将PCR扩增产物双酶切后，克隆到pGL3/promoter载体中，替代该载体中原有的荧光素酶基因，从而获得在SV40启动子作用下的CD80基因真核表达载体pGL3/CD80。
1.2.2 epitope-linker-β2m融合基因真核表达载体的构建1.2.2.1 pcDNA3.1/P1A真核表达载体的构建通过设计含有P1A基因表位序列(P1A35-43LPYLGWLVF)的3’端下游引物5’CGGGATCCTCCTCCGAAGACCAGCCACCCTAGATAAGGCAGAGCCTCCAGGCCAGAAAG 3’；以及5’端上游引物5’CCCAAGCTTATGTCTCGCTCCGTG3’。上、下游引物的5’端分别加上HindIII和Xba I限制性酶切位点。PCR反应条件于94℃预变性5分钟，共进行30个循环，每个循环条件94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1min。
以pcDNA3.1/eb2m载体为模板，按以上条件进行PCR反应。然后利用pcDNA3.1/eb2m载体上的HindIII和BamHI酶切位点，双酶切去除原有的OVA表位后，将含有P1A35-43表位序列的PCR产物引入pcDNA3.1/eb2m载体中，测序鉴定正确后，获得表达P1A35-43-linker-β2m融合基因的真核表达载体pcDNA3.1/P1A。
1.2.2.2 epitope-linker-β2m融合基因(如SEQ ID NO1所述)和CD80基因双表达载体的构建通过Bg1II和SmaI双酶切，将pcDNA3.1载体上的epitope-linker-β2m融合基因表达框架亚克隆到pGL3/CD80载体中，形成epitope-linker-β2m融合基因和CD80基因双表达载体pGL3/CD80-P1A(见图1)。pGL3/CD80-P1A如SEQ ID NO2所述。
1.2.3人IL-15基因真核表达载体的构建通过RT-PCR方法克隆人IL-15基因，然后双酶切PCR扩增产物，将IL-15基因克隆到pBluescript载体，阳性克隆送上海博亚公司测序鉴定。将测序正确的IL-15基因再通过BamHI和NotI双酶切，亚克隆到pcDNA3.1/B2M-EGFP载体，获得以B2M为启动子的IL-15基因真核表达载体pcDNA3.1/B2M-IL15(见图2)。
pcDNA3.1/B2M-IL15如SEQ ID NO3所述。
1.2.4质粒的大量制备和纯化按质粒纯化试剂盒(QIAGEN plasmid midiprep kit)要求进行。简言之，取1ml已鉴定正确的菌液加至100ml LB中，振荡培养至对数生长期，6000rpm，4℃离心15分钟，沉淀中加入P1(含RNaseA)10ml，震荡重悬沉淀后，加入溶液P2 10ml，轻缓倒置离心管数次，最后加入预冷的溶液P3 10ml，轻缓倒置离心管数次，冰浴20分钟，13000rpm，4℃离心30分钟，上清转移到预先用10ml QC缓冲液平衡好的柱子(QIAGEN-Tip500)上，然后用30ml缓冲液QC洗柱2次，用15ml缓冲液QF洗脱质粒DNA，最后经0.7倍体积的异丙醇沉淀，70％乙醇洗涤后，用适量TE溶解，260nm测定OD值，鉴定质粒的量和纯度，用适当的限制性内切酶酶切，电泳鉴定。
1.2.5质粒DNA注射和电脉冲转移条件将质粒DNA溶于生理盐水中，调整浓度到1ug/ul。腹腔给药麻醉小鼠后，用无菌微量注射器将质粒DNA溶液(100ug/0.1ml)注射入小鼠后腿股四头肌就。质粒注射后5分钟内，将电极放置于注射部位两侧，两电极间距约5mm，电极直径0.5cm，进行电脉冲刺激。电击条件为长脉冲方波，电压100V，波宽60ms，频率0.75Hz，脉冲次数10次(正反各5次)。
1.2.6五聚体分析表位特异性CD8+T细胞1.2.6.1质粒DNA肌肉注射诱导表位特异性T细胞免疫将DBA/2小鼠分为4组，每组3只。第1组注射生理盐水；第2组注射质粒pcDNA3.1；第3、4组注射质粒pGL3/CD80-P1A。分组后腹腔给药麻醉小鼠，然后用无菌微量注射器分别将100ul生理盐水或100ug质粒DNA注射入小鼠后腿股四头肌。质粒注射后5分钟内，将电极放置于注射部位两侧，进行电脉冲刺激。分别用生理盐水或质粒DNA每隔两周1次共3次免疫，方法同前。第3次免疫后的第10天用100ug质粒pcDNA3.1/B2M-IL15分别注射入第1、2、3组小鼠对侧后腿股四头肌，第4组注射生理盐水对照，质粒注射后5分钟内，将电极放置于注射部位两侧，进行电脉冲刺激。在第一次免疫后第35天处死小鼠，分离脾脏单个核细胞，用于五聚体分析。
1.2.6.2五聚体分析具体步骤1.2.6.2.1取5×105脾脏单个核细胞，用洗涤缓冲液(含0.1％叠氮钠和0.1％BSA的PBS)洗涤两次，重悬于50ul洗涤液中。
1.2.6.2.2加入10ul PE标记的五聚体(H-2 Ld/LPYLGWLVF)，置于暗处，室温孵育10-15分钟。
1.2.6.2.3用洗涤液洗涤一次，重悬于100ul洗涤液中，加入1ul FITC标记的抗小鼠CD8抗体，置于暗处，冰上孵育20-30分钟。
1.2.6.2.4用洗涤液洗涤2次后，重悬于200ul的固定液(含1％胎牛血清和2.5％甲醛的PBS)中，避光保存或直接用于流式细胞分析。
1.2.7ELISPOT分析制备各种肿瘤细胞悬液，同位素(铯137)细胞辐照仪照射后，1×106细胞皮下注射免疫2次，间隔一周。最后一次免疫后10天取脾脏，分离其脾脏单个核细胞。调整单个核细胞浓度为2×106/ml，按照小鼠IFN-γELISPOT试剂盒方法进行ELISPOT分析，步骤简述如下1.2.7.1将250ul无菌去离子水加入包被抗体瓶中，混合15秒，室温放置5分钟，避免剧烈震荡。取出50ul加入5ml的无菌PBS，混匀。然后加入ELISPOT板，每孔50ul。再每孔加入50ul PBS，盖上板盖，4℃过夜。
1.2.7.2取出ELISPOT板，去掉液体，用无菌PBST(含0.01％Tween-20的PBS)洗涤5-10次。加入200ul/孔无菌PBS-BSA，37℃，1小时。去掉液体(不用洗板)，加入100ul已准备好的细胞。细胞总数为2×105/孔。每个样品分为两组，一组不加肽作为对照组；另一组加8ug/ml的P1A 9肽(LPYLGWLVF)作为刺激组。各设6个复孔。置于37℃，5％CO2孵育24小时。
1.2.7.3取出ELISPOT板，去除培养细胞。加入冰冻去离子水200ul/孔，将板放置在冰上10分钟。PBST洗板10次。加入生物素标记的检测抗体100ul/孔，37℃，1小时。洗板5-10次。加入50ul/孔的酶标记抗体(GABA)，37℃孵育1小时。洗板5-10次(最后一次用PBS，避免Tween-20对显色剂的影响)。
1.2.7.4取出1.5ml显色剂I和1.5ml显色剂II，4℃暗处混合，加入30ul/孔新鲜配制的显色剂I/II，放置暗处，室温孵育20-30分钟(至显微镜下可以观察到斑点为止)。去除显色液，使用去离子水清洗ELISPOT板，室温干燥后，于Bioreader4000读板仪读板记数。
1.2.8统计学处理所有数据均采用未配对资料的t检验进行统计分析。
1.2.9结果第1、2、3、4组四聚体和CD8双阳性细胞占整个脾脏单个核细胞比例分别为0.5％、0.61％、2.7％、1.85％(图3A)。以CD8+T细胞作为整体看，第1、2、3、4组四聚体和CD8双阳性细胞的比例分别是2.94％、3.88％、26.75％、12.92％(图3B)。以第3、4免疫方案诱发的抗原表位特异性CD8+T细胞数量较多，与第1、2组相比具有显著差异(P＜0.01)。其中第3种免疫方案效果显著优于第4种方案(P＜0.01)，即注射质粒pcDNA3.1/B2M-IL15的能增强抗原表位特异性T细胞反应。
IFN-γELISPOT分析按照小鼠IFN-γELISPOT试剂盒(购自英国U-CyTech公司)方法进行。结果表明(见图3C)，第1、2、3、4组小鼠脾脏2×105单个核细胞中平均IFN-γ分泌细胞数分别为10、16、73、60。其中第3、4免疫方案IFN-γ分泌细胞数显著多于第1、2免疫方案(P＜0.01)，并且注射质粒pcDNA3.1/B2M-IL15的第3免疫方案IFN-γ分泌细胞数显著多于未注射质粒pcDNA3.1/B2M-IL15的第4免疫方案(P＜0.05)。
SEQUENCE LISTING<110>上海交通大学医学院<120>一种可诱生细胞免疫应答的共表达载体和真核表达载体<130>/<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>411<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>1atgtctcgct ccgtggcctt agctgtgctc gcgctactct ctctttctgg cctggaggct 60ctgccttatc tagggtggct ggtcttcgga ggaggatccg gaggtggcag catccagcgt120actccaaaga ttcaggttta ctcacgtcat ccagcagaga atggaaagtc aaatttcctg180aattgctatg tgtctgggtt tcatccatcc gacattgaag ttgacttact gaagaatgga240gagagaattg aaaaagtgga gcattcagac ttgtctttca gcaaggactg gtctttctat300ctcttgtact acactgaatt cacccccact gaaaaagatg agtatgcctg ccgtgtgaac360catgtgactt tgtcacagcc caagatagtt aagtgggatc gagacatgta a 411<210>2<211>6584<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>2ggtaccgagc tcttacgcgt gctagcccgg gagctttttg caaaagccta ggcctccaaa 60aaagcctcct cactacttct ggaatagctc agaggcagag gcggcctcgg cctctgcata120aataaaaaaa attagtcagc catggggcgg agaatgggcg gaactgggcg gagttagggg180cgggatgggc ggagttaggg gcgggactat ggttgctgac taattgagat gcatgctttg240catacttctg cctgctgggg agcctgggga ctttccacac ctggttgctg actaattgag300atgcatgctt tgcatacttc tgcctgctgg ggagcctggg gactttccac accctaactg360acacacattc cacagaatta attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc attttttaac420caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga gatagggttg480agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc caacgtcaaa540gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc ctaatcaagt600tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag cccccgattt660agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa agcgaaagga720gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac cacacccgcc780gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtgg ggataccccc tagagcccca gctggttctt840tccgcctcag aagccataga gcccaccgca tccccagcat gcctgctatt gtcttcccaa900tcctccccct tgctgtcctg ccccacccca ccccccagaa tagaatgaca cctactcaga960caatgcgatg caatttcctc attttattag gaaaggacag tgggagtggc accttccagg 1020
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1.一种可诱生细胞免疫应答的pGL3/CD80-P1A共表达载体，它的核苷酸序列如SEQ ID NO2所述。
2.根据权利要求1所述的pGL3/CD80-P1A共表达载体，它的构建如下(1)构建pcDNA3.1/P1A载体；(2)构建pGL3/CD80载体；(3)将pcDNA3.1载体上的epitope-linker-β2m融合基因表达框架亚克隆到pGL3/CD80载体中，形成pGL3/CD80-P1A共表达载体。
3.一种可诱生细胞免疫应答的pcDNA3.1/B2M-IL15真核表达载体，它的核苷酸序列如SEQ ID NO3所述。
4.根据权利要求3所述的pcDNA3.1/B2M-IL15真核表达载体，它的构建如下(1)克隆人β2微球蛋白基因启动子；(2)克隆人白细胞介素15基因片断；(3)构建pcDNA3.1/B2M-IL15真核表达载体。
5.一种可诱生细胞免疫应答的表位DNA疫苗，其特征在于该疫苗包括权利要求1所述的pGL3/CD80-P1A共表达载体和权利要求3所述的pcDNA3.1/B2M-IL15真核表达载体。
6.根据权利要求5所述的疫苗，其特征在于首先将权利要求1所述的pGL3/CD80-P1A共表达载体注射免疫，诱生抗原表位特异性细胞免疫应答；然后在0到14天注射权利要求3所述的pcDNA3.1/B2M-IL15真核表达载体增强其诱发的抗原表位特异性细胞免疫应答。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，具体地说关于一种可诱生细胞免疫应答的pGL3/CD80－P1A共表达载体和pcDNA3.1/B2M－IL15真核表达载体。本发明所公开一种可诱生细胞免疫应答的pGL3/CD80－P1A共表达载体和pcDNA3.1/B2M－IL15真核表达载体，其优点表现在本发明有利于克服常规表位DNA疫苗免疫原性低的缺陷，可用于肿瘤及病毒持续性感染等的预防和治疗。
文档编号A61P35/00GK1920045SQ200610030199
公开日2007年2月28日 申请日期2006年8月18日 优先权日2006年8月18日
发明者张兴黔, 钱关祥, 梅文瀚, 方丽娟, 钱丽 申请人:上海交通大学医学院