专利名称：β－淀粉样肽抑制剂及其筛选方法
技术领域：
本发明属于分子药理学范畴，构建β-淀粉样肽诱导神经细胞退行性变的模型，筛选β-淀粉样肽抑制剂。
背景技术：
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，简写为AD)是一种慢性中枢神经系统退行性疾病，伴有认知及行为障碍，多发生在65岁以上的老年人群。随着人们生活质量提高，人均寿命延长，AD的发病率不断升高，给社会和患者家庭带来沉重负担。AD的主要病理学改变是沉积于神经元外的老年斑(SP)、位于神经元内的神经纤维缠结(NFT)和以海马、皮层区域为主的神经元的大量丢失[1]。构成老年斑的主要成分是一种由36-43个氨基酸组成的β-淀粉样肽(β-amyloid peptide，简写为Aβ)。其中Aβ1-42占Aβ总数的10％左右，Aβ1-40大约占90％，但Aβ1-42更易聚集，毒性强，最终导致神经元功能障碍和死亡，是构成老年斑的基本成分。β-淀粉样肽是β-淀粉样前体蛋白(β-amyloid precursor protein，APP)的代谢产物，经过β-和γ-分泌酶(β-and γ-Secretase)的共同剪切作用形成。大量研究结果表明，APP基因的变异是导致早老性AD的主要原因之一[2]。
由于AD病因尚未阐明.研究AD也缺少理想模型，因此制约了AD研究进展，有关AD动物模型和细胞模型的研究一直是国内外学者探索的热点。AD细胞模型是在体外进行诱导和建立，与AD动物模型相比较，具有可避免各种干扰因素，实验条件容易控制等优点。细胞模型是通过模拟AD脑中主要病变而建立的，在药理学研究中主要应用于寻找防治AD药物的作用靶位点，建立药物筛选模型，在细胞、亚细胞及分子水平上观察药物对病变的防治作用。海马与学习记忆有关，也是发生衰老变化最早部位。AD病理改变最严重的脑区之一是海马[3]。因此选用原代培养的海马神经元作为研究AD的细胞较为理想。但原代培养神经细胞相对难度大，周期长，所以我们同时采用具有神经细胞特性，又可稳定传代的人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y用于构建β-淀粉样肽诱导退行性变的模型，快速筛选β-淀粉样肽抑制剂。
在AD中一个最重要的现象，不管是在遗传性或自发性的病人脑中几乎都有老年斑(senile plaque)沉积，在很多AD患者的脑切片中发现，老年斑的主要成分是Aβ，大量的研究表明Aβ是造成AD的主要的原因[4]。
APP产生Aβ的过程概述[5]APP在正常情形下是经由α-分泌酶切割，之后的产物不具有神经毒性。在某些情形下，β-分泌酶会切割APP，这时产物再经由γ-分泌酶切割，就成为有神经毒性的Aβ了，而Aβ又因为切割的不同有几种不同的产物，其中最重要的是Aβ1-42，老年斑就是以它为中心，Aβ1-40附于其上，最终形成纠结物而毒杀细胞。作用在APP上的三种分泌酶的酶切位点分别在APP的不同处，而β-分泌酶和γ-分泌酶更是所有药厂竟相克隆的基因，在2000年时被克隆出来后就纷纷推出其抑制剂。但在人体试验时发现很严重副作用甚至会有致命性影响。β-分泌酶的基因剔除小鼠做出来后，也发现似乎没有预期的作用，所以此方面的研究还在持续进行[6]。
在AD治疗研究中最大进展是Aβ疫苗的发展，APP转基因小鼠腹膜内注射Aβ免疫小鼠发现脑内老年斑大量减少，也可预防老年斑块的生成。但进入人体试验后，这个疗法造成很严重的炎症反应，故此一研究就喊停[7]。
铜锌离子络合剂可以穿透血脑屏障，在转基因小鼠中可以很快清除在AD脑中沉积的Aβ[8]，但在用药过程中维生素B12的摄取会有问题，此外视力受损。另外如果可溶性的Aβ才是AD关键的话，那么这个方法就不能解决AD了。
由于AD形成的机制不明，所得知的相关讯息与治疗方法都是由结果往前推，由老年斑沉积反推回Aβ，再继续反推到各种可能的原因。在临床上使用或试验的药品还有胆固醇抑制剂，抗炎药及胆碱酯酶抑制剂等，各自针对不同的机制来治疗，但最多只能使病情不再恶化，还没有可以完全治疗的药物和方法[9]。
中国传统药学具有悠久的历史，其丰富的药物种类为AD治疗药物筛选提供了一个庞大的资源库。但由于AD至今还没有完全的动物模型，转基因鼠最多只能造成脑中斑块的产生，不能完全模拟功能和其他的病理现象，因此我们构建了β-淀粉样肽诱导神经细胞退行性变的模型，在细胞水平模拟AD的病理和生化改变，用于快速筛选β-淀粉样肽抑制剂，并提供进一步在分子水平研究Aβ毒性机制的平台。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是建立Aβ诱导的大鼠原代培养海马神经元及人神经母细胞瘤株SH-SY5Y退行性变模型的方法，以Aβ诱导的神经母细胞瘤株SH-SY5Y退行性变模型从大量天然药物提取物中快速筛选β-淀粉样肽抑制剂，快速筛选得到的初筛物以两种模型继续研究。
本发明所采用的技术方案为(一)Aβ诱导的大鼠原代培养海马神经元及人神经母细胞瘤株SH-SY5Y退行性变，确定Aβ诱导两种细胞退行性变的EC50。
(二)以Aβ诱导的神经母细胞瘤株SH-SY5Y退行性变模型从大量天然提取物中快速筛选，初步筛选出对Aβ有抑制作用的提取物。
(三)分离所选取的天然提取物中各有效成分化合物，以Aβ诱导的大鼠原代培养海马神经元及人神经母细胞瘤株SH-SY5Y两种模型继续筛选，得到活性强的β-淀粉样肽抑制剂。
本发明应用分子药理学技术，构建β-淀粉样肽诱导神经细胞退行性变的药物筛选细胞模型，筛选β-淀粉样肽抑制剂。这一细胞筛选模型的建立，将会有助于筛选出AD的治疗药物，同时筛选出的化合物也可应用于Aβ毒性机制的进一步研究。本发明所建立的细胞筛选模型操作简单易行，具有很好的特异性和敏感性，能够高效、快速、准确地发现β-淀粉样肽抑制剂。我们应用这一模型已经筛选出具有较强作用的β-淀粉样肽抑制剂-丹参酮IIA。
图1 Aβ诱导SH-SY5Y细胞和海马神经元退行性变，MTT法测定细胞活性(A)为Aβ诱导SH-SY5Y细胞退行性变的半数退变量。
(B)为Aβ诱导原代培养的海马神经元退行性变的半数退变量。
图2为Aβ1-42诱导海马神经元退行性变(400×)。将培养在COVERSLIP上的海马神经元经多聚甲醛固定后以Hoechst荧光染料染色细胞核，比较同一区域相差及荧光镜头下细胞及核的形态，A1、B1和C1为相差镜头下观察结果；A2、B2和C2为荧光镜头下观察结果。
图3为荧光显微镜观察SH-SY5Y神经细胞退行性变细胞核的变化(油镜1000×)。
图4 Agilent 2100生化分析仪检测大鼠原代培养的皮层神经元退行性变化。其中图4-(1)为空白对照组。
图4-(2)为Aβ1-42处理组。
图4-(3)为丹参酮IIA组。
图5为丹参酮IIA对Aβ诱导的SH-SY5Y细胞退行性变的作用。
图6为丹参酮IIA对Aβ诱导原代培养的海马神经元退行性变具有保护作用。
具体实施例方式实施例1 大鼠原代海马神经元的培养取孕18天SD大鼠的胎鼠，分离海马组织，0.25％胰蛋白酶消化20分钟后去除胰蛋白酶，加入含10％胎牛血清的DMEM培养基(GIBECO/BRL，U.S.A)调细胞密度为1×106细胞数/毫升，Coverslips、培养板或培养瓶(Costar，U.S.A)预先以100μg/ml多聚D型赖氨酸包被。培养约四小时细胞贴壁，更换含2％B27的神经培养基Neurobasal Medium(GIBECO/BRL，U.S.A)培养24小时。加入5μM阿糖胞苷抑制非神经元生长，抑制24小时后更换神经培养基。3-4天培养后半量换液。培养7天后以4％多聚甲醛固定，神经特异性兔抗大鼠抗体β-tubulin III染色细胞骨架，FITC标记的羊抗兔二抗结合；Hoechst33342荧光染料染色细胞核。Gel/mountTM封片后在荧光显微镜下观察神经元形态并计数神经元得率。结果显示神经元得率大于90％，海马神经元大多为典型的锥形细胞，突起很长，密集联系，培养的神经元生长稳定，适合用于实验研究。
实施例2Aβ诱导的大鼠原代培养海马神经元及人神经母细胞瘤株SH-SY5Y退行性变模型的建立。
(1)确定Aβ诱导两种细胞退行性变的EC50Aβ1-42以DMSO(Sigma，U.S.A)充分溶解，2mM保存液置-20℃保存。临用前37℃孵育3-5天，以神经培养基(含2％B27的Neurobasal Medium)稀释成0，1，2，4，6，8，10，12μM浓度，加入培养在96孔培养板的大鼠原代培养海马神经元中。作用24小时后，以MTT比色法测定细胞活力。简述之，每孔100μl培养基中加入5mg/ml MTT(Sigma，U.S.A)15μl，继续培养3-4小时。吸去培养基，加入DMSO 200μl，过夜使被还原蓝色的结晶颗粒充分溶解。Bio-Rad 3350 microplate reader测定样品孔570nm处的吸光值。数据用softMax Pro4.3.1 DD软件进行统计分析，EC50值以四参数模拟分析的标准曲线法计算。结果显示，Aβ的细胞毒性呈浓度依赖性，在8μM时细胞存活率即下降至60％(P＜0.05)，到16μM下降更为明显，达26.36％左右(P＜0.01)。Aβ诱导SH-SY5Y细胞退变的EC50值为9.798μM。如附图1的(A)所示。
Aβ诱导人神经母细胞瘤株SH-SY5Y退行性变的EC50测定步骤基本同上。不同的是含10％胎牛血清的DMEM培养基培养的SH-SY5Y细胞转移至96孔培养板(初始密度1×105cells/ml)换以OptiumTM培养基培养12小时。加入以OptiumTM稀释成0，1，2，4，8，12，16，24μM的Aβ1-42，作用24小时后同上测定。EC50值采用四参数法测定。结果显示，Aβ的细胞毒性呈浓度依赖性，Aβ诱导海马神经元退行性变的EC50值为4.021μM。结果见附图1的(B)。
可见，Aβ1-42的细胞毒性在一定剂量范围内呈量效关系。原代培养的海马神经元对Aβ1-42的毒性比SH-SY5Y细胞系更敏感。两者的EC50值分别为4.021μM和9.798μM。在下面的实验中5μM和10μMAβ1-42被用于诱导大鼠原代培养海马神经元及人神经母细胞瘤株SH-SY5Y退行性变模型，筛选Aβ1-42的抑制剂。
(2)以荧光染料Hoechest 33342染色观察Aβ1-42诱导的神经细胞核凋亡体外分离的海马神经元在培养7-9天后，形成广泛的突触联系和各种受体表达，NMDA、AMPA以及kainate受体的表达，使细胞较容易受到兴奋性毒性和代谢性伤害。将培养在COVERSLIP上的海马神经元经多聚甲醛固定后以Hoechst荧光染料染色细胞核，比较同一区域相差及荧光镜头下细胞及核的形态，见图2。结果显示正常的海马神经元胞核呈圆形或椭圆形，如图2的(A1)和(A2)所示；Aβ1-42作用24小时使部分神经元发生凋亡，相差观察显示细胞皱缩，形成凋亡小体，荧光显微镜观察对应的细胞核，显示核浓染，裂解。如图2的(B1)和(B2)所示。
Hoechst荧光染料染色细胞核能显示完整的和碎裂的细胞核，初步判断细胞的凋亡状况。以10μM Aβ1-42作用于SH-SY5Y细胞24小时，Hoechst荧光染色细胞核显示空白对照组细胞核饱满，完整，密度较大(图3-A)，而Aβ1-42组有部分细胞核染色质浓缩，附着于核膜，显现新月形或马蹄状凋亡特征(图3-B)。
(3)Agilent 2100生化分析仪检测原代海马神经元培养在6孔板中，处理后的细胞经胰酶消化收集，无血清的培养基重悬，密度1×106cells/mi。取500μl细胞悬液加入1μl，200μg/ml annexin V-biotin，混匀染色凋亡及死亡细胞，室温放置10分钟。400×g离心5分钟，以含1μg/ml Fluorolink-Cy5streptavidin(Amersham Biosciences U.K.Ltd.，Buckinghamshire，U.K.)and 1μM Calcein-AM(Molecular Probes Inc.，Eugene，OR)1×binding buffer重悬染色活细胞。室温放置10分钟后离心，250μl细胞缓冲液(Cell Fluorescence LabChip kit)重悬，取10μl上样于芯片，Agilent2100 bioanalyzer测定并分析，每个样品取500-1000个细胞进行计数。结果见附图4。图4-1为空白对照组，散点图上右象限显示程序性死亡的细胞数，同时被annexin-V和calceinAM染色，占活细胞数的16.8％，占总细胞数的14.9％，坏死细胞11.4％，说明原代培养的神经细胞培养7天后也有部分细胞死亡，其中显示的死亡细胞中可能也有部分是通过程序性死亡途径的。图4-2为Aβ1-42处理组。经5μmAβ1-42作用24小时后，皮层神经元存活率下降至47.2％，其中程序性死亡细胞上升至65.2％，也即程序性死亡细胞占总细胞数的30.8％，坏死细胞与程序性死亡细胞的比率为1.7，经Aβ1-42处理后，坏死细胞与程序性死亡细胞比例与对照比较增加了一倍以上，也提示Aβ诱导细胞死亡可能有程序性细胞死亡以外的其他方式。图4-(3)为丹参酮IIA组。2.5μM丹参酮IIA能抑制Aβ1-42的作用，使细胞存活率上升至63.2％，程序性死亡的细胞数降低至36.5％，即占总细胞数的23.1％，坏死细胞与程序性死亡细胞比率为1.6，显示丹参酮IIA对细胞的保护也可能通过多条途径，不仅是抑制程序性细胞死亡。
实施例3以Aβ诱导的神经母细胞瘤株SH-SY5Y退行性变模型快速筛选Aβ抑制剂。
神经母细胞瘤株SH-SY5Y在96孔培养板中培养12小时后，加入待选的天然产物提取物，同时以10μM Aβ1-42诱导细胞退行性变，药物与Aβ同时作用细胞24小时后，以MTT比色法测定细胞活力，T检验统计比较药物对Aβ毒性作用的影响。在筛选了大量天然产物提取物后，发现其中十数种天然药物对Aβ毒性作用有抑制作用，其中丹参酮提取物作用最强。
实施例4以两种模型继续筛选，得到活性强的Aβ抑制剂。
丹参中有效成分的提取采用原形生药煎煮浸出以及乙醇回流法分离得到多种化合物，包括丹参酮IIA，丹参酮I，隐丹参，丹参素等。化合物以神经母细胞瘤株SH-SY5Y退行性变模型继续筛选发现丹参酮IIA对Aβ毒性有较强抑制作用。后续实验的丹参酮IIA从中国药品生物制品检定所购买标准品。丹参酮IIA溶解于DMSO中，浓度20mg/ml饱和溶液，滤膜过滤，分装保存在-20℃备用。
(1)不同浓度丹参酮IIA对Aβ诱导的神经细胞退行性变的影响二倍递减稀释丹参酮IIA使成10，5，2.5，1.25，0.625，0.312，0.156，0.078μM，观察不同浓度药物对Aβ诱导的SH-SY5Y细胞和原代培养的海马神经元这两种神经细胞退行性变的影响，用MTT法检测。结果见附图5及附图6。
MTT法检测不同浓度的丹参酮IIA保护SH-SY5Y细胞抑制10μM Aβ1-42诱导的损害作用。结果显示，10μM Aβ1-42降低SH-SY5Y细胞存活率至65.5％，在0.5-10μM范围内，丹参酮IIA能明显保护细胞抵制Aβ1-42的毒性作用，丹参酮IIA在浓度为2.5μM和10μM时，丹参酮IIA提高Aβ1-42降低的细胞存活率分别为10.9及26.16％。结果见附图5。
丹参酮IIA对Aβ诱导原代培养的海马神经元退行性变具有保护作用。5μM Aβ1-42作用24小时降低原代海马神经元对MTT的反应能力至37.89％，在1.0-10μM浓度范围内，丹参酮IIA能显著性抑制Aβ1-42诱导的原代海马神经元存活率减低，在浓度为0.625μM和2.5μM时，与Aβ1-42阳性组比较，分别提高细胞存活率20％和15.4％。结果见附图6。
(2)丹参酮IIA对Aβ1-42诱导的神经细胞核退行性变的影响以荧光染料染色观察丹参酮IIA和Aβ1-42诱导的神经细胞形态。
2.5μM丹参酮IIA和5μM Aβ1-42共同作用于海马神经元细胞24小时，将培养在COVERSLIP上的海马神经元经多聚甲醛固定后以Hoechst33342荧光染料染色细胞核，比较同一区域相差及荧光镜头下细胞及核的形态，如附图2的(C1)和(C2)所示。与正常组和5μM Aβ1-42诱导组相比，丹参酮IIA 2.5μM降低了凋亡的细胞核数量，减轻了凋亡的程度。
2.5μM丹参酮IIA和10μM Aβ1-42共同作用于SH-SY5Y细胞24小时，将培养在COVERSLIP上的海马神经元经多聚甲醛固定后以Hoechst33342荧光染料染色细胞核，荧光显微镜观察细胞及核的形态，如附图3的(C)所示。与正常组和10μM Aβ1-42诱导组相比，能部分减少浓染和凋亡的细胞核。
(3)丹参酮IIA对Aβ1-42诱导的原代海马神经元退行性变率的影响2.5μM丹参酮IIA和5μM Aβ1-42共同作用于海马神经元细胞24小时，流式细胞仪检测丹参酮IIA对Aβ1-42诱导的原代海马神经元退行性变率的影响，实验步骤同实施例2。结果见附图4的(C)及表1。结果显示，2.5μM丹参酮IIA能抑制Aβ1-42的作用，使细胞存活率上升至63.2％，程序性死亡的细胞数降低至36.5％，即占总细胞数的23.1％，坏死细胞与程序性死亡细胞比率为1.6，显示丹参酮IIA对细胞的保护也可能通过多条途径，不仅是抑制程序性细胞死亡。
表1
实施例5丹参酮IIA抑制Aβ毒性的机制研究实验中我们选择了Aβ1-42诱导变化最大的5个基因，包括Gabrp、Optn、plexin A3similar protein、Regucalcin、Tbc1，其中Tbc1是下调倍数最大的一段ESTAA818474的同源序列，AA818474与小鼠Tbc1(也称Bub2)有85％的同源性，因为大鼠的Tbc1序列还没有报道，我们通过大鼠和小鼠的基因组DNA序列比对拉出了全长的Tbc1基因的cDNA序列。以β-actin为参比基因，从原代培养的皮层神经元提取总RNA反转录成cDNA为模板，实时荧光定量PCR检测目的基因与参比基因相对扩增效率系数。
结果见表2，显示在原代培养的皮层神经元，经Aβ1-42处理后，GABAA受体的pi亚基及信号素家族plexin A3相似蛋白的表达显著上升，与空白对照比较分别上升至5.56倍及2.46倍，衰老标志性钙结合蛋白regucalcin与亨廷顿结合蛋白optineurin表达下调。丹参酮IIA能完全抑制GABAA受体的pi亚基及信号素家族plexin A3相似蛋白的表达升高，部分抑制钙结合蛋白regucalcin表达的降低，但丹参酮IIA对亨廷顿结合蛋白optineurin表达下调没有影响。同时我们的结果还显示根据Gene Bank号为AA818474的EST推断出的大鼠Tbc1基因在Aβ处理组和药物组与对照比没有显著差异，Tbc1可能并非Aβ诱导的变化基因。结果提示丹参酮IIA能通过维持钙稳态，调节钙依赖的第二信使通路及GABA受体通路阻断或减轻Aβ毒性。
表2 丹参酮IIA对Aβ1-42诱导原代培养的皮层神经元基因表达变化的影响
权利要求
1.一种β-淀粉样肽抑制剂，为丹参酮IIA。
2.权利要求1所述β-淀粉样肽抑制剂在制备治疗阿尔茨海默病药物中的应用。
3.权利要求1所述β-淀粉样肽抑制剂的筛选方法，包括如下步骤A、建立β-淀粉样肽诱导神经细胞退行性变的模型，确定细胞退行性变的EC50；B、以一种β-淀粉样肽诱导的神经细胞退行性变模型从大量天然提取物中快速筛选，初步筛选出对Aβ有抑制作用的提取物；C、以两种β-淀粉样肽诱导的神经细胞退行性变模型继续筛选，得到活性强的β-淀粉样肽抑制剂。
4.权利要求3的筛选方法，其特征在于，所述β-淀粉样肽诱导神经细胞退行性变的模型采用人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y。
5.权利要求3的筛选方法，其特征在于，所述β-淀粉样肽诱导神经细胞退行性变的模型采用大鼠原代培养海马神经元。
全文摘要
本发明公开了β－淀粉样肽抑制剂及其筛选方法。本发明提供了一种β－淀粉样肽抑制剂的筛选模型，以Aβ诱导的大鼠原代培养神经元及人神经母细胞瘤株SH－SY5Y两种模型筛选，得到活性强的β－淀粉样肽抑制剂。本发明还公开了用这种方式筛选得到的一种β－淀粉样肽抑制剂——丹参酮IIA。本发明所建立的细胞筛选模型操作简单易行，具有很好的特异性和敏感性，能够高效、快速、准确地发现β－淀粉样肽抑制剂。
文档编号A61P25/00GK1907287SQ20061003032
公开日2007年2月7日 申请日期2006年8月23日 优先权日2006年8月23日
发明者胡应和, 孙丽文, 王立 申请人:华东师范大学