专利名称：调整菌群预防或治疗细菌性阴道病的益生菌制剂及工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及调整菌群预防或治疗细菌性阴道病的益生菌制剂，用于改善阴道微生态平衡、增强免疫力，并涉及制备这种制剂的工艺。
背景技术：
细菌性阴道炎(BV)、非特异性阴道炎(NSV)或菌群失调性阴道炎(DV)是妇女常见病、多发病，临床上常以抗生素治疗，但效果不理想。抗生素的应用本身亦可引起菌群失调，致使此病迁延不愈，给患者带来巨大痛苦。其他妇科感染性疾病如各种性病、滴虫性阴道炎、霉菌性阴道炎在使用大量抗生素治疗后，也可导致阴道菌群失调，引发菌群失调性阴道炎，再使用抗生素进行治疗多数无效。已有的益生菌的研究也只限于对单个菌种的研究，没有针对益生菌群相互促进、共生，协调促进调整菌群预防或治疗细菌性阴道病的益生菌，也没有协调促进调整菌群预防或治疗细菌性阴道病的益生菌制剂及工艺。
发明内容
从微生态学的角度出发，通过生态制剂调整疗法，扶正和保护阴道内的正常菌群的组成和比例，恢复其自然的抵抗外来菌侵扰的能力，促进其本身的自净作用是治疗此类疾病的一种必然趋势。本发明一种利用有益菌群并促进其它有益菌生长和发挥效能的阴道保健或预防和治疗细菌性阴道病的益生菌制剂。菌种德氏乳杆菌乳酸亚种(Lactobacillus debrueckii subsp.lactis)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)。功能具有调节阴道菌群失调作用，抑制外袭菌和过盛繁殖的阴道菌群中的少数种群。预防或治疗细菌性阴道病。本发明的阴道保健或预防和治疗细菌性阴道病的益生菌制剂，含有按重量配比的德氏乳杆菌5-15份，嗜酸乳杆菌5-15份，乳糖500-700份，水苏糖100-300份，充分混合后含有益生菌活菌数5-15亿/g，分装胶囊、压制片剂。
本发明涉及对两株菌株的微生物学实验、微生态学实验及生产工艺研究实验。微生物实验包括菌种分离、鉴定、生物特性、代谢产物、耐药性、代谢物、H2O2产生及质粒检测等。生态效应试验包括正常值调查、粘附、定植、生物拮抗、模型试验、安全试验、稳定试验和刺激试验等。生产工艺研究包括种子、发酵冻干和制剂产品稳定性及工艺稳定性等方面的研究。基础研究还包括作用机制的研究。
该项研究对健康阴道的微群落及微生态系进行了比较全面和系统的研究。研究结果证明，乳杆菌是阴道优势微种群，其他微种群如肠杆菌、葡萄球菌、链球菌、酵母菌及支原体均为劣势种群。在妊娠的早期、中期及晚期，阴道内的乳杆菌逐渐增加。细菌性阴道炎(BV)、非特异性阴道炎(NSV)或菌群失调性阴道炎(DV)都出现一定的阴道菌群失调现象，其主要表现是乳杆菌减少或消失，其它种增多或比例失调。阴道乳杆菌是妊娠过程中重要生理指标之一，并且是防御感染一个手段。
本发明涉及到的两株菌既嗜酸乳杆菌和德氏乳杆菌经研究表明两菌株都可通过粘附占位、粘附抑制、产生乳酸、H2O2发挥其作用机制。通过药代动力学、药效学、安全性及生产工艺研究研究表明，两菌株都是无毒、无害、安全、有效的，将两者制成微生态制剂可以应用于细菌性阴道病的治疗。
经临床研究证明，嗜酸乳杆菌和德氏乳杆菌制剂对细菌性阴道炎、滴虫性阴道炎的疗效优于或不亚于灭滴灵(对照组)，而且复发率低，无抗生素耐药性、引起菌群失调及毒性反应等副作用。其中对细菌性阴道炎的总有效率达92.0％；而灭滴灵为83.7％，该制剂对滴虫性阴道炎的总有效率达96.7％本发明的益生菌制造工艺。德氏乳杆菌5-15份，嗜酸乳杆菌5-15份，乳糖500-700份，水苏糖100-300份，充分混合后含有益生菌活菌数5-15亿/g，分装胶囊、压制片剂。单一菌粉制备工艺如下(1)德氏乳杆菌菌粉的制备将德氏乳杆菌菌株种子液按重量1-5％接种量接入已经灭菌后的含有重量1％-3％葡萄糖、0.5-1.5％蛋白胨、0.5-1％酵母浸膏、0.2-0.5％乙酸钠、0.2-0.5％柠檬酸铵培养基中，经36℃-39℃厌氧发酵后，离心分离出菌体，将占保护液重量25-40％的菌体加入含有重量3-5％的谷氨酸钠和5-15％多脂奶粉冻干保护液中混合冷冻干燥后即可得到德氏乳杆菌菌粉。
(2)嗜酸乳杆菌菌粉的制备将嗜酸乳杆菌菌株种子液按重量1-5％接种量接入含有重量1％-3％葡萄糖、0.5-1.5％蛋白胨、0.5-1％酵母浸膏培养基中经32℃-36℃厌氧发酵后，离心分离出菌体，将占保护液重量30-45％的菌体加入100-200mM海藻糖及酸中和物质和抗氧化物质等的冻干保护液中，混合，放置2-4小时，冷冻干燥后即可得到嗜酸乳杆菌菌粉。
由于不同人群阴道携带的乳杆菌的种类不同，采用单一乳杆菌，在阴道中的定植几率较小，本发明采用两种已经证明有调节阴道菌群失调作用的乳杆菌作为本制剂的生产菌种，可以使不同患有细菌性阴道病的患者增加乳杆菌的定植几率。大大提高疗效。同时，所添加的乳糖和海藻糖对提高菌种的存活率和在阴道中快速繁殖起到提高和促进作用。
本发明相关研究如下1、健康妇女阴道乳杆菌的定性与定量研究(表1)
表1 各种乳酸杆菌得分离率及平均活菌数(log10n/ml)
注本试验共采集年龄在20-25岁、无阴道疾患的非妊娠育龄妇女标本57份，其中43份分离到乳杆菌，分离率为75.44％.
3、不同pH条件下细菌对阴道上皮细胞的黏附作用将阴道分离出的几种常见正常菌群与乳杆菌在不同pH条件下考察它们对阴道上皮细胞的黏附能力，结果见表2，在pH3.5时，乳杆菌对阴道上皮细胞的黏附能力最强，葡萄球菌、肠杆菌、念珠菌在pH7.2时黏附阴道上皮细胞能力最强。
表2 不同细菌对阴道上皮的黏附能力(x±s)
*与pH7.2相比，P＜0.05。
随pH值的增加，乳杆菌对上皮细胞的黏附能力减弱，葡萄球菌、肠杆菌、念珠菌对上皮细胞的黏附能力增强。
3、乳杆菌制剂对非特异性阴道炎的治疗机制的研究采用本制剂治疗非特异性阴道炎结果表明，阴道炎治疗前pH、清洁度明显高于对照组及治疗组，治疗后阴道pH明显低于对照组，见表3。
表2 阴道pH、清洁度、G+杆菌百分率比较
注正常对照组32例，年龄24-38岁，排出妇科疾病，近期无抗生素应用史；治疗组32例，年龄28-41岁，临床确诊为非特异性阴道炎的患者。
4、采用本制剂治疗前后各组阴道微生物阳性检出的平均对数值的比较治疗后阴道乳杆菌明显高于对照组，葡萄球菌明显低于对照组。见表4表4 各菌阳性平均对数值比较(X±SD)
5、使用本制剂对非特异性阴道炎的治疗效果.表5结果说明接种本制剂后接种后病人症状得到改善表4 使用本制剂对非特异性阴道炎的治疗效果
6、适用本制剂治疗细菌性阴道病治疗前后阴道指标变化情况见表6、表7、表8、表9。结果表明用药前后阴道pH值明显低于用药前，有显著性差异。阴道滴虫、分泌物、白带多、瘙痒症状用药前后有显著性差异，用药后明显好于用药前。
表6 阴道pH值变化比较
*P值有显著性差异表7 阴道滴虫变化比较
***P值有极显著差异表8 阴道痒变化比较
***P值有极显著差异表9 阴道分泌物白带变化比较
***P值有极显著差异
具体实施例方式实施例1德氏乳杆菌5g，嗜酸乳杆菌10g，乳糖700g，水苏糖100g，充分混合后含有益生菌活菌数5-15亿/g，分装胶囊，包装。阴道外用，每日一次，每次一粒。德氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌菌粉制备工艺如下(1)德氏乳杆菌菌粉的制备将德氏乳杆菌菌株种子液按重量1％接种量接入已经灭菌后的含有重量2％葡萄糖、1.5％蛋白胨、1％酵母浸膏、0.5％乙酸钠、0.5％柠檬酸铵培养基中，经36℃-39℃厌氧发酵后，离心分离出菌体，将占保护液重量40％的菌体加入含有重量4％的谷氨酸钠和5％多脂奶粉冻干保护液中混合冷冻干燥后即可得到德氏乳杆菌菌粉。
(2)嗜酸乳杆菌菌粉的制备将嗜酸乳杆菌菌株种子液按重量1％接种量接入含有重量2％葡萄糖、1.5％蛋白胨、1％酵母浸膏培养基中经32℃-36℃厌氧发酵后，离心分离出菌体，将占保护液重量45％的菌体加入150mM海藻糖及酸中和物质和抗氧化物质等的冻干保护液中，混合，放置2小时，冷冻干燥后即可得到嗜酸乳杆菌菌粉。
实施例2德氏乳杆菌10g，嗜酸乳杆菌15g，乳糖500g，海藻糖300g，充分混合后含有益生菌活菌数5-15亿/g，分装胶囊，包装。口服，每日3次，每次2-4粒。德氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌菌粉制备工艺如下(1)德氏乳杆菌菌粉的制备将德氏乳杆菌菌株种子液按重量3％接种量接入已经灭菌后的含有重量3％葡萄糖、0.5％蛋白胨、0.8％酵母浸膏、0.35％乙酸钠、0.35％柠檬酸铵培养基中，经36℃-39℃厌氧发酵后，离心分离出菌体，将占保护液重量32％的菌体加入含有重量3％的谷氨酸钠和10％多脂奶粉冻干保护液中混合冷冻干燥后即可得到德氏乳杆菌菌粉。
(2)嗜酸乳杆菌菌粉的制备将嗜酸乳杆菌菌株种子液按重量3％接种量接入含有重量3％葡萄糖、0.5％蛋白胨、0.5％酵母浸膏培养基中经32℃-36℃厌氧发酵后，离心分离出菌体，将占保护液重量38％的菌体加入200mM海藻糖及酸中和物质和抗氧化物质等的冻干保护液中，混合，放置小3时，冷冻干燥后即可得到嗜酸乳杆菌菌粉。
实施例3德氏乳杆菌15g，嗜酸乳杆菌5g，乳糖600g，海藻糖200g，加入500g的泡腾粉，充分混合后含有益生菌活菌数5-15亿/g，压制片剂，包装。阴道外用，每日一次，每次一片。德氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌菌粉制备工艺如下(1)德氏乳杆菌菌粉的制备将德氏乳杆菌菌株种子液按重量5％接种量接入已经灭菌后的含有重量1％葡萄糖、0.8％蛋白胨、0.5％酵母浸膏、0.2％乙酸钠、0.2％柠檬酸铵培养基中，经36℃-39℃厌氧发酵后，离心分离出菌体，将占保护液重量25％的菌体加入含有重量5％的谷氨酸钠和15％多脂奶粉冻干保护液中混合冷冻干燥后即可得到德氏乳杆菌菌粉。
(2)嗜酸乳杆菌菌粉的制备将嗜酸乳杆菌菌株种子液按重量5％接种量接入含有重量1％葡萄糖、0.8％蛋白胨、0.8％酵母浸膏培养基中经32℃-36℃厌氧发酵后，离心分离出菌体，将占保护液重量30％的菌体加入100mM海藻糖及酸中和物质和抗氧化物质等的冻干保护液中，混合，放置4小时，冷冻干燥后即可得到嗜酸乳杆菌菌粉。
权利要求
1.一种用于调整菌群预防或治疗细菌性阴道病的益生菌制剂，其特征在于有按重量配比的德氏乳杆菌5-15份，嗜酸乳杆菌5-15份，乳糖500-700份，水苏糖100-300份，
2.一种用于调整菌群预防或治疗细菌性阴道病的益生菌制剂制备工艺，其特征在于按重量配比取德氏乳杆菌5-15份，嗜酸乳杆菌5-15份，乳糖500-700份，水苏糖100-300份，混合后含有益生菌活菌数5-15亿/g，分装胶囊或压制片剂，德氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌菌粉制备工艺如下(1)德氏乳杆菌菌粉的制备将德氏乳杆菌菌株种子液按重量1-5％接种量接入已经灭菌后的含有重量1％-3％葡萄糖、0.5-1.5％蛋白胨、0.5-1％酵母浸膏、0.2-0.5％乙酸钠、0.2-0.5％柠檬酸铵培养基中，经36℃-39℃厌氧发酵后，离心分离出菌体，将占保护液重量25-40％的菌体加入含有重量3-5％的谷氨酸钠和5-15％多脂奶粉冻干保护液中混合冷冻干燥后即可得到德氏乳杆菌菌粉。(2)嗜酸乳杆菌菌粉的制备将嗜酸乳杆菌菌株种子液按重量1-5％接种量接入含有重量1％-3％葡萄糖、0.5-1.5％蛋白胨、0.5-1％酵母浸膏培养基中经32℃-36℃厌氧发酵后，离心分离出菌体，将占保护液重量30-45％的菌体加入100-200mM海藻糖及酸中和物质和抗氧化物质等的冻干保护液中，混合，放置2-4小时，冷冻干燥后即可得到嗜酸乳杆菌菌粉。
全文摘要
调整菌群预防或治疗细菌性阴道病的益生菌制剂及工艺，按重量配比取德氏乳杆菌5－15份，嗜酸乳杆菌5－15份，乳糖500－700份，水苏糖100－300份，混合后含有益生菌活菌数5－15亿/g，菌株经30－45℃分别发酵，24hr－36hr，离心分离菌体，50℃下干燥或冷冻干燥获得干燥菌粉，添加到乳糖和水苏糖再制备成阴道外用或口服益生菌胶囊剂及外用泡腾片。具有调节阴道菌群失调作用，有效抑制外袭菌和过盛繁殖的阴道菌群中的少数种群。
文档编号A61P15/00GK101028289SQ20061004595
公开日2007年9月5日 申请日期2006年3月1日 优先权日2006年3月1日
发明者康白, 袁杰利 申请人:大连森佰澳科技有限公司