专利名称：一种远端关节弯曲致病基因及其检测方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及TNNI2基因，具体地说是一种远端关节弯曲致病基因及其检测方法和应用。
背景技术：
TNNI2基因编码蛋白的功能人类的肌丝主要由原肌凝蛋白(Tropomysin，TMP)、肌钙蛋白(Troponin，TNN)和肌动蛋白(Actin)组成，TPM-TNN-Actin复合物与肌凝蛋白(Myosin)协调作用控制肌肉的收缩与舒张。(文献1.Sung SS，Brassington AME，Grannatt K，Rutherford A，WhitbyFG.，Krakowiak PA，Jorde LB，Carey JC，Bamshad M.Mutations in genesencoding fast-twitch contractile proteins cause distal arthrogryposis syndromes.Am.J.Hum.Genet，2003，72681-690.)，人体的肌钙蛋白(Troponin，TNN)呈球形，由TNNI、TNNT、TNNC三个亚单位组成，TNNC有一些带双负电荷的结合位点，因而对肌浆中出现的Ca2+有很大的亲和力，TNNT的作用是把整个肌钙蛋白分子结合于TPM，TNNI将TNNC结合Ca2+的信息传递给TPM，引起TPM的构象变化，解除它对肌纤蛋白和横桥相互结合的阻碍作用，使肌肉收缩。TNN的复合物是骨骼肌中Ca2+的传感器和调节器，TNNI是通过阻止肌动肌凝蛋白ATP酶激活来阻止肌肉收缩，因此至少氨基酸残基的羧基部分决定了对Ca2+的敏感度。当组成TNNI2的氨基酸缺失、替换时改变了对Ca2+的敏感度，影响肌肉的收缩。(文献2.Stefancsik R，Randall JD，Mao C，Sarkar S.Structure and sequence of the human fast skeletaltroponin T(TNNT3)geneinsight into the evolution of the gene and the origin ofthe developmentally regulated isoforms.Comp.Funct.Genomics，2003，4(6)609-625.)TNNI2基因跨越4KB，由8个外显子组成，外显子长度从4～222bp不等，mRNA长701bp，编码182个氨基酸.
8个外显子，422-425，1067-1096，1241-1247，1795-1836，1920-2048，2211-2300，2423-2599，2845-3066；7个内含子，426-1065，1070-1240，1248-1794，1837-1919，2049-2210，2301-2422，2560-2844。
远端关节弯曲家系致病突变基因的TNNI2结构(下划线部分为外显子)GCTGACCTCGGGTGAGATGGGCTGAGGCGAGGTGTGGATACTCGCAGCTACCCCTCAGCTGACCCGAGCTGTGTGCCCGGCTGAGGCCACAGGCAAAGCCAGGCACACTGTCCTCAGGCTCCTTACGAGAACGACAGAGGCATCTCCAGCGCGTCACCGAGCCCTAAATAGAGTAGCCCAGCCACGGCACCCCCCACCAAGACTTCTTGGACTGGGCGGCAGCACGCGGCCAGGCCAGGCGGCCGGACAGGTGGGGAGGTCTCTGTGGCTCTCCACGCCCCCATTGGTCTGAGGAGGACTCTATGCCCTTTCTGAGCAGGGGCCCAGCCTGGGGGAGGCCATTTATACCCCTCCCCCTGGGCCCACCAGCCCAACTCGCCGCTGCCGGCCTGACCTCGCTCCCAGCCCTGCTGCCCAGATTCTAGGTGAGGCCCAGCCCGGCCCGCCGAG
GCCGGGGGACAGGGCGTGGCTCGAGCTGGTTTGAGGGAGGACTTCCTGGGGCGGGGGTCTGGGGGCCTGGGGGATGCCACCAGCAGCCCCCTTTGGGGCCTGCACGGGTCCGGGAGTGAGAAGGAGAGGGTTTGGGGAGGCAGGTGTAGCGAGAGGCAGGTATTAGACACTCCCTGACCACCAGGCTTCACCTCTGGGGACCCTGGAAGGAGAGTTTAGGGGTCAAGAAGCCCCAGAACCTGAGCCCCCAGGCCAAACTGAGGAGGGATTTCTTCCATGCACTTAGGCCCAAAGCCAAAGAGAGAGGGTTAAAAATAACAGCGTCACTCAGGCGGCCACCTGCGCTGGCCCATCCCACCCTCCCTCGGGGACAGCTGCAGCTCCTCAGGCTATGCCTGGGACATTTTGGGAACACTTTCTCCTCTTACTTCTCACCCTGGGGAATTCCAAGACATTGTCCTTGAAGGAGGTGAGAGTAGGGGGAGGAGGTGAGAGTAGGGGGTGGGCGGGAGGGGGCTGTCATCAGGAGCCCTGAACCCCTCACCACCTACCTGATGGGCACAGGCATCACGGTGGCAAGGGCCTGGCCAACACCTCTGTCTTCCTCTCCCCACAGGCTCCAAGCTCAGGACCTCAGGATGGGAGAGTAAGTGGTACCCCTGTACCCCCATACAGTGACCCTGCCCACCTCCTGCCCTGTCCACCCCATCACACACTCCGACCCCGCCAGCCATGGCCCTAACCTCTGTCTTCTCTCCCCGTCCTGCCTGCGTCCTCCCTCCCTGGACAGTGAGGAGGTAAGTAGTTGCTGGGGGCTCAAAACATGACGAGGAGGGGGCTCCCCCAACTCAGCATAGGTCATAGGTCACAGCCTCAAGGCCCTAAGGCCCAGAGAAGATGGCCTGGCCCTCCCCGCTGGCAAAAGTGCCCCACCCAACCACCAAGACGCTGCTGAAAGAGAGGAAGTGGCTGCCCCAAGCCTTCTGGGGCAGGGGAAGTGTGGCTGTGGCCTGGTCACAGGGGAATCACTTCTTCTTTCTGATTCCTGCACTTCCCGCCCCCACCTCACCGGCCGACCTGCCCCCAACTGGCCCTCCTCTCCCCCAGCCTCTGGCCTCCCAGCACCATGTGCCACCTGGCAAAGTGTCACACACCACACAGCACCATGTCCCAGTGCAAGGTCTGGGGCCAGGGAGGCCCAGCCTGCCCATCATGGCCTCAGGAGCCCCCAGGCTCTGCTGGTCCCGGAGCCGGAGCCCCTGACCTGGCCAGGGAGCGTGGAAGGGGGTGGGGGTGCTCCAGGCCTGGAGGCCCTGACTCGACCCCCTGTCCCCTGCCCTGCAGAAGCGGAACAGGGCCATCACGGCCCGCAGGCAGCACCTGAAGGTAGGTGTGGGCTCCCGGGGGGGTGGCCCAGGTGGGTCTGCAGGGGAGCTGGCTGCAGCCCCTCACCGCCTGCCCCACCGCAGAGCGTGATGCTGCAGATAGCGGCCACGGAGCTGGAGAAGGAGGAGAGCCGCCGTGAGGCAGAGAAGCAGAACTACCTGGCGGAGCACTGCCCGCCGCTGCATATCCCGGGCTCCATGTCTGAAGTGCAGGTACCAGCCCCTCCCCGGCCACCCCGCCTCCCCAGCAGCAGGCCTGCCTGCTAACTCAGTTTCCCCACTTGTCAAGAGGGCCAGTGGGGTGGTCAGGGCAGGGGCAGGTGACCGTGGCTGCCAAGTGTCAGGACGGCCGCCCGCCCCCACACCCACCCCTAGGAGCTCTGCAAACAGCTGCACGCCAAGATCGATGCGGCTGAAGAGGAGAAGTACGACATGGAGGTGAGGGTGCAGAAGACCAGCAAGGAGGTGAGTGGTGGCGGCGGGCCGGCGGCAGGTGGGTAGGCGGTGGCCCAGCGGGCAGGCGGGGCGGGCCGGGGAGGCCGAGACCACCGGGACCTCGGGCTCCCACCCGGCTCCCCTGCCCACAGCTGGAGGACATGAACCAGAAGCTATTTGATCTGCGGGGCAAGTTCAAGCGGCCCCCACTGCGGAGGGTGCGCATGTCGGCCGATGCCATGCTCAAGGCCCTGCTGGGCTCGAAGCACAAGGTGTGCATGGACCTGAGGGCCAACCTGAAGCAGGTCAAGAAGGAGGACACAGAGAAGGTGCGTGCCACGGGGGGAGCACCACCACACCTACCCTGCCGGGGAAGCACCTCCCACACCTGCCCCGCCTGGGACCACCTCCCACACCTGCCTGCCGGGGCCCTGTACCACTGCCCCTCCAGGGTGCCATGCAGGGGACACTCCACTGCCCAATGCAGAGGGTAAACTGAGGCTGAAGGTGGTGTGGACCAGGGTGCGTGCATAAGTGGGTGAGCCTGAGCTCTCTCCTGCCCTCTCCTCCACAGGAGCGGGACCTGCGAGACGTGGGTGACTGGAGGAAGAACATCGAGGAGAAGTCTGGCATGGAGGGCCGGAAGAAGATGTTTGAGTCCGAGTCCTAGGCCACTCGCTGCCCCTACGCCTGCCCCGGTGCCCGGCTCCCAGCAGAACATACTAGGGAGATGCACCCAGAGCCTGCCAGGGAGGGCTGGCCTCACCACCACCGTCAATAAAGGATTTGAATCCCCATGGCTGGTCTGGTCTGGCTCTCCCCAGCCTCTTGGGCCATGCTCTGGGCCCCCGCATCGGTGGCCTGCAGTGTGGTCAGTGGCCAGCGGGGAAAGCCTGGGAGGAGGCCACACGGGGCCTGGGATTTCAGGTTGGGAGGGAAGCTGCTTCCAGCAAGGAGGTGAGCCTGGGAAGGCCCCTACAGGGGAATCCACCCCAGGCTGCACGGGGCTGTTTGGTGAGGGCCCTGATAGTGCCCCAGGCGTTCCTGGGGCTCGGCCTGGGCACATCCAACATGCAGGGCTGGGGATGGAGGCTGTGGGACCGAGCCAGGTCTGGGTGGGAGTTCCTGAGATAAGTGGGTCTCACATTTGCACAGCCACGCAAAGGGCCTCCCGGGGCTCCAGAGAGATCCACACATGTGACACACGTGTGGCCCCCGCAGTGCTGGGGGCAGCCCCCTATGCCTCCCAAGCTGCCCCTCCTCAGGGAGCTCATCTGAGGCAGGAAGCCAAGGGCCACATTAGACCCCAGGCTGCTGTCCACGCGTGCCCACCCCCAGATCCTCCTGCTCATCCCCCTCCCACATCACTTTGGGACAGACCCCCAGCCCCGGGGCCTCCCTGCTTTTCCTATCTGCCCCCTGCCCTGAGCACTGAGGCTGGGCACGGGGAGCGTGGAGGGGCGAGCCTGCACGGTGGGCC
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为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种远端关节弯曲致病基因，具有序列表SEQ ID No1中氨基酸序列。
所述远端关节弯曲致病基因的检测方法，应用巢式PCR方法检测1)提取受检者血液模板DNA；2)引物设计及反应条件第一轮PCR正向引物TNNI2-1F5’-GGTGACCGTGGCTGCCAAGTGTC-3’反向引物TNNI2-1R5’-AGCTCAGGCTCACCCACTTATGCA-3’；反应体系共20ul，受检者模板DNA 1ng，10×buffer(缓冲液)2ul/管，Taqase(耐热聚合酶)1U/管，2.5mMdNTP2ul/管，无菌水14ul/管；将上述液体混匀，瞬间离心，在PCR扩增仪上扩增，扩增条件为95℃，4min；94℃ 40sec，61℃ 1min，72℃ 45sec，35cycles，72℃ 8min；在电泳仪上用PAGE凝胶电泳分离目的带，目的带为885bp或883bp，正常人为885bp片段长，异常为883bp片段长；第二轮PCR引物序列5’-TGGGTGACTGGAGGAAGAACAT-3’5’-AGCTCAGGCTCACCCACTTATGCA-3’反应体系共20ul，受检者第一轮PCR产物做模板DNA 10ng，10×buffer2ul/管，Taqase1U/管，2.5mMdNTP2ul/管，无菌水14ul/管；将上述液体混匀，瞬间离心，在PCR扩增仪上扩增，扩增条件为95℃，4min；94℃ 40sec，60℃ 40sec，72℃ 45sec，35cycles，72℃ 8min；在电泳仪上用PAGE凝胶电泳分离目的带，目的带片段正常人为一条143bp带，患者为两条带140/143bp。
所述远端关节弯曲致病基因用于制备诊断远端关节弯曲2B型、DAS、手足弯曲畸形、马蹄内翻足或马蹄外翻足疾病的试剂或试剂盒。
1.申请人首次在中国一个7代遗传的2B型远端关节弯曲大家系中发现了致病的基因突变，肌钙蛋白亚单位I2(TNNI2)第8外显子175位编码赖氨酸密码子AAG缺失，该突变为世界首次发现。
2.申请人针对该类疾病研制出诊断试剂盒，该试剂盒方法简便、快捷、价位低廉、高效，应用广泛，适于在科研及医疗单位推广。可方便、准确地诊断手足畸形疾病。
3.手足畸形在人群中发病率高，至今许多病因没有明确的诊断。申请人在中国首次发现的远端关节弯曲疾病，势将掀开手足畸形疾病的秘密，为该病的研究提供方法学的帮助。
具体实施例方式
实施例1正常的第8外显子序列GAGCGGGACCTGCGAGACGTGGGTGACTGGAGGAAGAACATCGAGGAGAAGTCTGGCATGGAGGGCCGGAAGAAGATGTTTGAGTCCGAGTCCTAG，其中带下划线部分为缺失位点；一种远端关节弯曲致病基因，具有序列表SEQ ID No1中氨基酸序列。
本发明突变了的第8外显子SEQ ID No1序列为GAGCGGGACCTGCGAGACGTGGGTGACTGGAGGAAGAACATCGAGGAGAAGTCTGGCATGGAGGGCCGGAAGATGTTTGAGTCCGAGTCCTAG(1)SEQ ID No1的信息(参见序列表)(A)序列特征*长度93碱基对*类型核酸*链型双链*拓扑结构线性(b)分子类型DNA(C)假设否(d)反义否(e)最初来源肌钙蛋白亚单位I2(TNNI2)第8外显子(f)与核苷酸序列相关的特征关键词为“mutation”(2)基因的制备正向引物5’-CTACAAGGAAAGCTGGGTC-3’，反向引物5’-AAGGGCTGGAAGAGGTGG-3’反应体系共20ul，受检者模板DNA 1ng，10×buffer 2ul/管，Taqase1U/管，2.5mMdNTP2ul/管，无菌水14ul/管；扩增条件95℃，4min；94℃ 40sec，61℃ 1min，72℃ 45sec，35cycles，72℃ 8min；
实施例2本发明突变了的第8外显子检测方法应用巢式PCR方法检测，(1)DNA提取采5毫升静脉血，枸橼酸钠抗凝，用常规的酚氯仿提取DNA，分光光度计测DNA含量，10钠克/微升；(2)引物设计及反应条件第一轮PCR引物序列正向引物TNNI2-1F5’-GGTGACCGTGGCTGCCAAGTGTC-3’反向引物TNNI2-1R5’-AGCTCAGGCTCACCCACTTATGCA-3’反应体系共20ul①受检者模板DNA 10ng(1ul)②10×buffer 2ul/管③Taqase1U/管(1ul)④2.5mMdNTP2ul/管⑤无菌水14ul/管将上述液体混匀，瞬间离心，在PCR扩增仪上扩增，扩增条件为95℃，4min；94℃ 40sec，61℃ 1min，72℃ 45sec，35cycles，72℃ 8min.
在电泳仪上用PAGE凝胶电泳分离目的带，目的带为885bp或883bp，正常人为885bp片段长，异常为883bp片段长。
第二轮PCR引物序列5’-TGGGTGACTGGAGGAAGAACAT-3’5’-AGCTCAGGCTCACCCACTTATGCA-3’反应体系共20ul①受检者第一轮PCR产物做模板DNA 1ul②10×buffer 2ul/管③Taqase1U/管④2.5mMdNTP2ul/管⑤无菌水14ul/管将上述液体混匀，瞬间离心，在PCR扩增仪上扩增，扩增条件为95℃，4min；94℃ 40sec，60℃ 40sec，72℃ 45sec，35cycles，72℃ 8min.
在电泳仪上用PAGE凝胶电泳分离目的带，目的带片段正常人为一条143bp带，患者为两条带140/143bp。
实施例3试剂盒组成
(1)引物管
第一轮扩增试剂组成管1(18ul体系)2.5mMdNTP、10×buffer、10mM第一轮引物；管2液体石蜡与Taqase混合液4ul；(Taqase1U/管)第一轮扩增方法将管1与管2混合，加1ul受检者模板DNA，混匀，瞬间离心，在PCR扩增仪上扩增。扩增条件为95℃，4min；94℃ 40sec，61℃ 1min，72℃ 45sec，35cycles，72℃ 8min.
扩增的产物可以直接用于DNA测序，也可以用于第二轮PCR模板。测序可以检测该片段的任何突变。
第二轮扩增试剂组成管3(18ul体系)2.5mMdNTP、10×buffer、10mM第二轮引物；管4液体石蜡与Taqase混合液4ul；(Taqase1U/管)第二轮扩增方法将管3与管4混合，加1ul第一轮PCR扩增产物，混匀，瞬间离心，在PCR扩增仪上扩增。扩增条件为95℃，4min；94℃ 40sec，60℃ 40sec，72℃ 45sec，35cycles，72℃ 8min。
在垂直板电泳仪进行变性凝胶电泳。8％凝胶，7mol尿素，40％去离子甲酰胺，电泳40瓦4～5小时。正常人为143bp一条带，患者为为140/143bp两条带。
试剂盒应用的范围对诊断为远端关节弯曲2B型的患者；对诊断为DAS的患者；对手足弯曲畸形的患者；对马蹄内翻足或马蹄外翻足的患者。
关节弯曲SEQUENCE LISTING<110>辽宁省计划生育科学研究院<120>一种远端关节弯曲致病基因及其检测方法和应用<130>
<160>9<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>93<212>DNA<213>TNNI2第8外显子<220>
<221>mutation<222>(1)..(93)<223>
<400>1gagcgggacc tgcgagacgt gggtgactgg aggaagaaca tcgaggagaa gtctggcatg60gagggccgga agatgtttga gtccgagtcc tag 93<210>2<211>4163<212>DNA<213>TNNI2<220>
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关节弯曲<223>
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关节弯曲gac atg aac cag aag cta ttt gat ctg cgg ggc aag ttc aag cgg ccc 2476Asp Met Asn G1n Lys Leu Phe Asp Leu Arg Gly Lys Phe Lys Arg Pro100 105 110 115cca ctg cgg agg gtg cgc atg tcg gcc gat gcc atg ctc aag gcc ctg 2524Pro Leu Arg Arg Val Arg Met Ser Ala Asp Ala Met Leu Lys Ala Leu120 125 130ctg ggc tcg aag cac aag gtg tgc atg gac ctg agg gcc aac ctg aag 2572Leu Gly Ser Lys His Lys Val Cys Met Asp Leu Arg Ala Asn Leu Lys135 140 145cag gtc aag aag gag gac aca gag aag gtgcgtgcca cggggggagc2619Gln Val Lys Lys Glu Asp Thr Glu Lys150 155accaccacac ctaccctgcc ggggaagcac ctcccacacc tgccccgcct gggaccacct2679cccacacctg cctgccgggg ccctgtacca ctgcccctcc agggtgccat gcaggggaca2739ctccactgcc caatgcagag ggtaaactga ggctgaaggt ggtgtggacc agggtgcgtg2799cataagtggg tgagcctgag ctctctcctg ccctctcctc cacag gag cgg gac ctg2856Glu Arg Asp Leu160cga gac gtg ggt gac tgg agg aag aac atc gag gag aag tct ggc atg 2904Arg Asp Val Gly Asp Trp Arg Lys Asn Ile Glu Glu Lys Ser Gly Met165 170 175gag ggc cgg aag aag atg ttt gag tcc gag tcc tag gcc act cgc tgc 2952Glu Gly Arg Lys Lys Met Phe Glu Ser Glu Ser Ala Thr Arg Cys180 185 190ccc tac gcc tgc ccc ggt gcc cgg ctc cca gca gaa cat act agg gag 3000Pro Tyr Ala Cys Pro Gly Ala Arg Leu Pro Ala Glu His Thr Arg Glu195 200 205atg cac cca gag cct gcc agg gag ggc tgg cct cac cac cac cgt caa 3048Met His Pro Glu Pro Ala Arg Glu Gly Trp Pro His His His Arg Gln210 215 220taa agg att tga atc ccc atggctggtc tggtctggct ctccccagcc 3096Arg Ile Ile Pro225tcttgggcca tgctctgggc ccccgcatcg gtggcctgca gtgtggtcag tggccagcgg3156ggaaagcctg ggaggaggcc acacggggcc tgggatttca ggttgggagg gaagctgctt3216ccagcaagga ggtgagcctg ggaaggcccc tacaggggaa tccaccccag gctgcacggg3276gctgtttggt gagggccctg atagtgcccc aggcgttcct ggggctcggc ctgggcacat3336ccaacatgca gggctgggga tggaggctgt gggaccgagc caggtctggg tgggagttcc3396tgagataagt gggtctcaca tttgcacagc cacgcaaagg gcctcccggg gctccagaga3456gatccacaca tgtgacacac gtgtggcccc cgcagtgctg ggggcagccc cctatgcctc3516ccaagctgcc cctcctcagg gagctcatct gaggcaggaa gccaagggcc acattagacc3576ccaggctgct gtccacgcgt gcccaccccc agatcctcct gctcatcccc ctcccacatc3636actttgggac agacccccag ccccggggcc tccctgcttt tcctatctgc cccctgccct3696gagcactgag gctgggcacg gggagcgtgg aggggcgagc ctgcacggtg ggccatgacc3756aggccaaatt ggcagtctcc gggctgggga ccagcatggt gctgggggtt ggccagcctg3816gtctctggtc cttactgcca ccctgaaagg caggctgtgt cactcctcac catgccaggg3876gaccaagaga cctgtgccca tcaggcaggg gctaggcctg gccctgacct ggctccagtg3936
关节弯曲tggctcccaa gtctcgtttc cactcagccc caagacccag ccccatctgg ccaccaagga3996caaggcagct gacaggttct gacaaggccg gtgacagcaa ggccacgtta tcagccctgc4056tctttgaagg ctgacagagc aggcacgcca aggtccctgt gctcagatct gcgctgggga4116ggctgccagc ctgcgctgtg cccttgcccc cgggaggtcc catcgat 4163<210>3<211>10<212>PRT<213>TNNI2<400>3Ala Pro Ser Ser Gly Pro Gln Asp Gly Arg1 5 10<210>4<211>14<212>PRT<213>TNNI2<400>4Lys Arg Asn Arg Ala Ile Thr Ala Arg Arg Gln His Leu Lys1 5 10<210>5<211>43<212>PRT<213>TNNI2<400>5Ser Val Met Leu Gln Ile Ala Ala Thr Glu Leu Glu Lys Glu Glu Ser1 5 10 15Arg Arg Glu Ala Glu Lys Gln Asn Tyr Le uAla Glu His Cys Pro Pro20 25 30Leu His Ile Pro Gly Ser Met Ser Glu Val Gln35 40<210>6<211>30<212>PRT<213>TNNI2
关节弯曲<400>6Glu Leu Cys Lys Gln Leu His Ala Lys Ile Asp Ala Ala Glu Glu Glu1 5 10 15Lys Tyr Asp Met Glu Val Arg Val Gln Lys Thr Ser Lys Glu20 25 30<210>7<211>59<212>PRT<213>TNNI2<400>7Leu Glu Asp Met Asn Gln Lys Leu Phe Asp Leu Arg Gly Lys Phe Lys1 5 10 15Arg Pro Pro Leu Arg Arg Val Arg Met Ser Ala Asp Ala Met Leu Lys20 25 30Ala Leu Leu Gly Ser Lys His Lys Val Cys Met Asp Leu Arg Ala Asn35 40 45Leu Lys Gln Val Lys Lys Glu Asp Thr Glu Lys50 55<210>8<211>31<212>PRT<213>TNNI2<400>8Glu Arg Asp Leu Arg AspVal Gly Asp Trp Arg Lys Asn Ile Glu Glu1 5 10 15Lys Ser Gly Met Glu Gly Arg Lys Lys Met Phe Glu Ser Glu Ser20 25 30<210>9<211>36<212>PRT<213>TNNI2<400>9Ala Thr Arg Cys Pro Tyr Ala Cys Pro Gly Ala Arg Leu Pro Ala Glu1 5 10 15
关节弯曲His Thr Arg Glu Met His Pro Glu Pro Ala Arg Glu Gly Trp Pro His20 25 30His His Arg Gln3权利要求
1.一种远端关节弯曲致病基因，其特征在于具有序列表SEQ ID No1中氨基酸序列。
2.一种权利要求1所述远端关节弯曲致病基因的检测方法，其特征在于应用巢式PCR方法检测1)提取受检者血液模板DNA；2)引物设计及反应条件第一轮PCR正向引物TNNI2-1F5’-GGTGACCGTGGCTGCCAAGTGTC-3’反向引物TNNI2-1R5’-AGCTCAGGCTCACCCACTTATGCA-3’；反应体系共20ul，受检者模板DNA 10ng ul，10×buffer 2ul/管，Taqase1U/管，2.5mMdNTP2ul/管，无菌水14ul/管；将上述液体混匀，瞬间离心，在PCR扩增仪上扩增，扩增条件为95℃，4min；94℃ 40sec，61℃ 1min，72℃ 45sec，35cycles，72℃ 8min；在电泳仪上用PAGE凝胶电泳分离目的带，目的带为885bp或883bp，正常人为885bp片段长，异常为883bp片段长；第二轮PCR引物序列5’-TGGGTGACTGGAGGAAGAACAT-3’5’-AGCTCAGGCTCACCCACTTATGCA-3’反应体系共20ul，受检者第一轮PCR产物做模板DNA 10ng，10×buffer2ul/管，Taqase1U/管，2.5mMdNTP2ul/管，无菌水14ul/管；将上述液体混匀，瞬间离心，在PCR扩增仪上扩增，扩增条件为95℃，4min；94℃ 40sec，60℃ 40sec，72℃ 45sec，35cycles，72℃ 8min；在电泳仪上用PAGE凝胶电泳分离目的带，目的带片段正常人为一条143bp带，患者为两条带140/143bp。
3.一种权利要求1所述远端关节弯曲致病基因的应用，其特征在于所述远端关节弯曲致病基因用于制备诊断远端关节弯曲2B型、DAS、手足弯曲畸形、马蹄内翻足或马蹄外翻足疾病的试剂或试剂盒。
4.按照权利要求3所述远端关节弯曲致病基因的应用，其特征在于所述试剂或试剂盒采用的第一轮引物正向5’-CTACAAGGAAAGCTGGGTC-3’，反向5’-AAGGGCTGGAAGAGGTGG-3’；第二轮引物正向5’-TGGGTGACTGGAGGAAGAACAT-3’，反向5’-GTGCATCTCCCTAGTATGTTCTGC-3’。
全文摘要
本发明涉及TNNI2基因，具体地说是一种远端关节弯曲致病基因及其检测方法和应用，其具有序列表SEQ ID No1中氨基酸序列。申请人首次在中国一个7代遗传的2B型远端关节弯曲大家系中发现了致病的基因突变，肌钙蛋白亚单位I2(TNNI2)第8外显子175位编码赖氨酸密码子AAG缺失，该突变为世界首次发现。同时针对该类疾病研制诊断试剂盒，该试剂盒方法简便、快捷、价位低廉、高效，适于在科研及医疗单位推广。
文档编号A61P19/02GK101054412SQ20061004629
公开日2007年10月17日 申请日期2006年4月12日 优先权日2006年4月12日
发明者姜淼, 韩维田, 边超英, 李学付, 王格, 李蕴青, 易冬旭, 李建新 申请人:辽宁省计划生育科学研究院