专利名称：紫菜多糖在制备预防和治疗神经系统疾病药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及神经保护药物，具体地说是紫菜多糖在制备预防和治疗神 经系统疾病药物方面的应用。
技术背景紫菜属于红藻门，红毛菜目，红毛菜科紫菜属植物。已知紫菜含有丰 富的蛋白质、碳水化合物、各种维生素和矿物质，在日本素有"长寿菜" 的美誉。紫菜在中医中已有上千年的应用历史。《本草纲目》中记载"紫菜 主治热气烦塞咽喉，煮汁饮之，病瘿瘤脚气者，宜食之。凡癭结积块之 疾，宜常食紫菜，乃能软坚散结，利水消肿，补肾养心之功效"。紫菜多糖是紫菜的主要成分之一，是从紫菜中提取的一种部分硫酸化 的天然线形多糖，主要由半乳糖、3，6—内醚半乳糖和硫酸基等组成，其基 本结构单元主要是由1， 3连接的IB —D—半乳糖与1， 4连接的a —L一 t. 乳糖一6—硫酸基组成的二糖单位以及1， 3连接的P—D—半乳糖与1， 4 连接的a—L一3， 6—内醚半乳糖组成的二糖单位。此外部分紫菜多糖D — 半乳糖的C6位和L一半乳糖的C2外发生部分甲基化。根据报道，紫菜多糖具有多种活性，包括增强细胞免疫和体液免疫、 抗氧化、抗辐射、抗癌等活性。张全斌等进行了紫菜多糖对老年大鼠的抗 氧化试验，证明其具有抗氧化作用。到目前为止的研究，紫菜多糖还仅局限于对泛指的增强免疫力、抗氧 化、抗肿瘤、抗衰老等方面的研发，其对预防和治疗神经系统疾病方面的 机理等研究尚未见报道。目前国内外有关治疗神经系统疾病的药物研究无 明显进展，从天然植物中获得提取物和有效成分成为该领域中研究的热点 和共识。随着人类平均寿命的逐年增加，世界正步入全球老龄化时代。与年龄 有关的神经退化性疾病也随之增加，在中枢神经系统方面，主要表现为兴 奋与抑制过程减弱，大脑功能降低，记忆力减退和丧失，随后出现识别功 能的进行性减退和情绪紊乱的加重等。老年性痴呆已成为心脑血管疾病和 肿瘤之后的第四位疾病。目前，全世界65岁以上人群中老年性痴呆患病率 约为5%。而老年性痴呆因其复杂的发病机理，近期在防治上不可能取得突 破性进展，故西方有专家预言，老年性痴呆将是21世纪人类第一杀手。帕金森病又称震颤麻痹，是中老年人常见的中枢神经系统变性疾病， 帕金森病的主要病理特征是是因位于中脑部位"黑质"中的细胞发生病理性 改变后，多巴胺的合成减少，抑制乙酰胆碱的功能降低，则乙酰胆碱的兴
奋作用相对增强。两者失衡的结果便出现了 "震颤麻痹"。最新资料表明， 中国有l 7 0万帕金森病患者，其中5 5岁以上的人群中每1 0 0人就有1个帕金森病人，估计每年新增帕金森病人约1 0万人。老年性痴呆和帕金森病对患者、家庭和社会都带来巨大的压力，使得全世界对其给予众多的关注，老年痴呆和帕金森病等神经退行性疾病的治疗药物研究成为老年医学领域中的-个重要课题。 发明内容本发明的目的在于提供紫菜多糖在制备预防和治疗神经系统疾病药物 方面的应用。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为本发明在紫菜多糖的抗衰老作用及机理方面进行了深入而全面的研 究，最后发现紫菜多糖具有对神经细胞损害的保护作用；即紫菜多糖可在制 备预防和治疗神经系统疾病药物中的应用。所述神经系统疾病包括帕金森病或老年性痴呆。所述的紫菜多糖是从红藻门红毛菜目红毛菜科紫菜属的海洋藻类中提 取的硫酸多糖；是指含有D —半乳糖和L一半乳糖一6 —硫酸基，或者同时 还含有3， 6—内醚一L一半乳糖的多糖。本发明所提到的紫菜多糖应该是通 过任何可行方法获得的一类多糖类物质。该紫菜多糖可以是一种水提取物 或其他形式的提取物；也包括将紫菜多糖提取物经任何方法降解制得的不 同分子量的产物。所述紫菜属藻类包括条斑紫菜(户y^oe"w^)、甘紫菜(P^7w)、岡 紫菜(/^wZw^/cw/ato)、铍紫菜(P c/^/ ato)、长紫菜(P&"tota)、坛紫 菜(i^m'to"era&)、边紫菜(尸wwg/w7to)等中的一种或几种。本发明另一方面提供了一种具有神经保护活性的药学制剂，该制剂含 有上述任一种形式的紫菜多糖和药学可接受的载体，如淀粉、氯化钠、 微晶纤维素、山梨酸和/或甘露醇等。所述制剂包括口服给药的剂型、非口 服给药的注射剂型或局部给药制剂。本发明具有以下优点1. 安全性高，可长期限服用。在目前阶段，老年性痴呆和帕金森病通 常是不可逆的神经退行性疾病。为了保持患者病情不继续恶化，病人用药 周期较长。紫菜多糖作为来源于食用海藻的一种天然海洋多糖产物，其高 安全性可以保证病人长期用药的需要。紫菜多糖来源于食用海藻紫菜，经 急性毒性试验证明安全性非常高。2. 使用效果好。实验结果表明紫菜多糖能够保护神经细胞SY5Y对抗 AP^35毒性，具有显著的神经保护作用；紫菜多糖同时具有提高免疫功能 的活性，可以从多角度提高老年病人的健康状况。
图1为紫菜多糖对SY5Y细胞A^51损伤的保护作用。林，p〈0.001， *，p〈0. 05。图2为紫菜多糖对小鼠避暗试验的影响图2A.对错误次数的影响，图 2B.对潜伏期的影响;*， p<0.05。图3为紫菜多糖对小鼠水迷宫试验的影响图3A.对小鼠进入盲端的错 误次数的影响，图3B.对小鼠找到平台潜伏期的影响；*， p<0.05。图4为紫菜多糖对小鼠海马内乙酰胆碱转移酶(ChAT)活性的影响； *， p<0. 05。图5为紫菜多糖对小鼠海马内乙酰胆碱酯酶(AChE)活性的影响；*, p<0. 05。
具体实施方式
以下通过具体实施方式
对本发明进行进一步说明。这里想要指出的是， 下面的具体实施方式
仅用来说明本发明，本领域技术人员在理解本发明精 神的前提下，可以根据本技术领域的现有技术和公知知识对本发明进行相 应变换，这些技术方案均落入本发明的范围之内。实施例1从条斑紫菜制备紫菜多糖将100g干燥条斑紫菜加40倍量的水，12(TC提取3小时。筛绢过滤除 去藻渣，滤液用硅藻土助滤。将所得滤液浓縮，然后将该浓縮物冻干得到 20g的冻干提取物。实施例2从坛紫菜制备紫菜多糖将100g干燥坛紫菜加40倍量的水，12(TC提取3小时。筛绢过滤除去藻渣，滤液用硅藻土助滤。将所得滤液浓縮，经自来水流水透析2天，蒸 馏水透析1天，然后将该透析液用75%乙醇沉淀，用95%乙醇洗涤所得沉 淀两次，烘干该沉淀得到16g烘干提取物。 实施例3低分子量紫菜多糖Pl的制备取提取的紫菜多糖5g配成1. 5%的水溶液，在该溶液中加入5mM抗坏 血酸和5mM过氧化氢，常温反应3小时。将该反应液用截留分子量为3600Da 的透析袋在自来水中透析2天，在蒸馏水中透析2天，之后真空浓縮。冻 干该浓縮物得到3g分子量为35kD的紫菜多糖样品Pl。实施例4低分子量紫菜多糖P2的制备取提取的紫菜多糖5g配成1.5%的水溶液，在该溶液中加入lOmM抗坏 血酸和10mM过氧化氢，常温反应3小时。将该反应液用截留分子量为3600Da 的透析袋在自来水中透析2天，在蒸馏水中透析2天，之后真空浓縮。冻 干该浓縮物得到3g分子量为6kD的紫菜多糖样品P2。实施例5紫菜多糖注射剂的制备取紫菜多糖50g，加入注射用水500ml，甘露醇50g，调PH值至7.0，分装，冷冻干燥。实施例6紫菜多糖对神经母细胞瘤株SH—SY5Y的保护作用 本发明以细胞存活率为指标，研究了紫菜多糖对神经母细胞瘤株SH— SY5Y细胞的日-淀粉样肽(P-amyloid peptide, Ap)损伤模型的保护作用。材料SY5Y细胞株由瑞典卡罗琳斯卡研究所Bengt Winblad教授和裴 进京博士赠送。A 3 片断由首都医科大学宣武医院北京脑老化实验室合 成，高效液相色谱法纯化，纯度98%以上，无血清MEM配成溶液，0.22um 虑膜抽滤，一2(TC保存。紫菜多糖经抗坏血酸和过氧化氢降解，制得分子 量分别为35KD和6KD的Pl和P2两个样品。试验方法细胞培养条件为MEM(GibcoBRL， 41500-067)培养基中加入 10%胎牛血清(Hyclone， SH30070. 03) 、 15腿o1. L—'HEPES(DNN co即any)、青霉素lxl(HU丄'、链霉素lxl05IU. L1， 5%C02， 37。C，每周换液两次，传代一次。MTT代谢率测定将SY5Y细胞以密度为1X10'个细胞接种于96孔板 (Costar产品)，3天后分为对照组、A e 35组和A P 35 + P2组(10、 40、 80"g/ml)、 AU Pl (10、 40、 80ug/ml)药物组，，每组8孔。接种后24小时每孔加MTT(5mg/ml)20ul， 370C孵育4小时，吸出培养液，每 孔加入DMS0200ii 1，振摇10分钟，用酶标仪(Diagnostic Pasteur LP400) 测定550nm处光密度值(0D)。结果如图1所示，样品Pl和P2在三个浓度时均能显著对抗20uM A13a —35毒性，提高培养细胞MTT代谢率，而且随着样品浓度增加其活性逐渐增强， 结果表明紫菜多糖能够保护神经细胞SY5Y对抗AP 2H5毒性，具有显著的神 经保护作用。神经细胞凋亡在神经细胞损伤中起十分重要的作用，药物可 通过干预凋亡过程阻止其进一步发展，对神经细胞起到保护作用。SH-SY5Y 细胞来源于人的神经母细胞瘤，其形态和生理功能与正常神经元相似，呈 锥形，且具有明显的轴突，是目前国际上研究神经细胞功能较好的-种细 胞。紫菜多糖对SY5Y细胞具有神经保护作用，表明紫菜多糖可以用于神经 系统疾病如帕金森病和老年性痴呆的治疗。实施例7:紫菜多糖的抗老年痴呆作用本发明以行为学和脑内乙酰胆碱酯酶和乙酰胆碱转移酶为指标，对紫 菜多糖的抗老年痴呆活性进行了深入研究。实验动物KM小鼠。在试验前，使平均体重约为26g的雄性KM小鼠自山 获取饲料和水一周以适应实验室环境。材料紫菜多糖经抗坏血酸和过氧化氢降解，制得分子量为35000Da的 Pl样品。AP卜4。购自Sigma公司，将其溶于无菌生理盐水，配成lmg/ml浓度，密 封后置于37 °C培养箱中7天使之凝聚。试验方法小鼠适应一周后，将其称重并随机分为5组，即对照组、模 型组、紫菜多糖低、中、高(75、 150、 300 mg/kg)三个剂量组，阳性对 照药盐酸多纳哌齐(2. 5 mg/kg)组。除对照组外，向小鼠单侧脑室内注射A {3 , —,。。参照Maurice方法，以水合氯醛麻醉后，右侧脑室定位(A: —2mm; L: 2匪；H: —4鹏)，垂直颅骨进针3腿，緩慢注射3"1/只的APh。，对照组为 等量的灭菌生理盐水。动物于术后第二天开始给予相应药物，给药量0.5 ml/20 g，对照组、 模型组灌服等量生理盐水，每日1次，连续至实验结束。(1) 小鼠避暗试验自A3卜4(1造模后第9天进行避暗试验。该避暗装置分为明(25X25X 16cm)暗(24X20X 15cm)两个隔室，之间由一个拱门(8.9X11.4cm)相 联，门可以由试验者根据需要关上或打开。隔室地板为不锈钢栅栏(3.175im)。暗室一侧的栅栏地板与刺激器相联，并可给予电击，明室一 侧则不与刺激器相联，故没有电流通过。将小鼠放入明室，10s后将明暗室 之间的门打开。待小鼠(四肢)完全进入暗室后，立即将中门关上，并给 予一次电击(电流为0.6mA)。让小鼠在暗室内停留10s，将小鼠放回笼内。 电刺激训练24小时后，将小鼠放回明室，中门打开，记录5min内小鼠进入 暗室的次数和潜伏期。(2) 小鼠迷宫实验自AP卜4。造模后第12天进行水迷宫试验，为期五天。该迷宫共有5个fif 端，试验第一天用一块黑色塑料板将迷宫分成两部分，使小鼠在只含有-个盲端的部分游泳；试验第二天，重新设置塑料板的位置，使小鼠在含有 三个盲端的部分游泳；试验第三天至第五天除掉塑料板，使小鼠游完全程。 分别记录其找到平台的潜伏期和到达盲端的错误次数。(3) 皮层乙酰胆碱酯酶(AChE)和乙酰胆碱转移酶(ChAT)活性测定 行为学测试结束之后，小鼠断头取脑，于冰浴中迅速剥离海马组织，以预冷的生理盐水制成10%组织匀浆。按照试剂盒说明书操作，测定该组 织的乙酰胆碱酯酶和乙酰胆碱转移酶活性。 结果小鼠避暗试验1) 由图2可以看出，AP模型组与对照组和紫菜多糖的三个剂量组相比 小鼠潜伏期显著縮短，错误次数明显增多(p〈0.05)。2) 小鼠迷宫试验由图3可以看出，模型组和对照组相比，小鼠找到平台的潜伏期及经过 盲端的错误次数明显延长(p<0. 05) A3卜")单侧脑室注射致小鼠痴呆模型建 立成功。随着训练时间的延长，小鼠潜伏期和错误次数逐渐縮短。从第三 天开始，AP h。单侧脑室注射模型组与对照组和紫菜多糖的三个剂量组相比，小鼠错误次数明显增多，其中紫菜多糖高浓度组小鼠潜伏期与模型组 相比显著縮短。训练第四天，对照组和紫菜多糖的中、高剂量组与模型组 相比潜伏期显著縮短，而阳性对照药盐酸多纳哌齐未显效，表明紫菜多糖 显效快。训练第五天，紫菜多糖的三个剂量组和盐酸多纳哌齐组同模型组相比，小鼠的潜伏期明显縮短和错误次数明显减少。 3)海马乙酰胆碱酯酶和乙酰胆碱转移酶活性乙酰胆碱酯酶和乙酰胆碱转移酶分别是乙酰胆碱的分解酶和合成酶， 两者共同调节脑内乙酰胆碱的含量。如图4所示，在海马组织中，盐酸多纳 哌齐组和紫菜多糖的三个剂量组与A e卜4。单侧脑室注射模型组相比乙酰胆 碱转移酶活性升高，但没有显著性。如图5所示对照组、盐酸多纳哌齐组和 紫菜多糖三个剂量组与模型组相比，乙酰胆碱酯酶活性显著降低，而且位 得说明的是前两组乙酰胆碱酯酶活性比对照组低约50%，说明中剂量的紫 菜多糖和盐酸多纳哌齐都能够显著抑制海马内乙酰胆碱的分解，从而提高 海马内乙酰胆碱的含量。这可能是紫菜多糖改善A 0卜,。单侧脑室注射造成AD 症状的途径之一。结论紫菜多糖能够A^—4。损伤的小鼠的行为学指标，改善小鼠的记 忆力，降低错误次数。提高乙酰胆碱转移酶活性，降低乙酰胆碱酯酶活性。 具有显著的抗老年性痴呆作用。以上描述了本发明的具体实施例，然并非用以限定本发明，本领域技 术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和 变化。
权利要求
1.紫菜多糖在制备预防和治疗神经系统疾病药物中的应用。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述神经系统疾病包 括帕金森病或老年性痴呆。
3. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述的紫菜多糖 是从红藻门红毛菜目红毛菜科紫菜属的海洋藻类中提取的硫酸多糖。
4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述紫菜多糖是指含有D—半乳糖和L一半乳糖一6—硫酸基，或者同时还含有3， 6—内醚一L —半乳糖的多糖。
5. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述紫菜属藻类包括条斑紫菜、甘紫菜、圆紫菜、皱紫菜、长紫菜、坛紫菜、边紫菜等中的 种或几种。
6. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物为含有紫菜 多糖和药学可接受的载体的药物组合物。
7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述药物的剂型为注 射剂、口服制剂或局部给药制剂。
全文摘要
本发明提供紫菜多糖在预防和治疗神经系统疾病药物中的用途，其安全性高，可长期限服用。
文档编号A61K31/737GK101152207SQ20061004790
公开日2008年4月2日 申请日期2006年9月27日 优先权日2006年9月27日
发明者虹 张, 张全斌, 徐祖洪, 李智恩, 牛锡珍, 綦慧敏, 赵婷婷 申请人:中国科学院海洋研究所