专利名称：一种含有转铁蛋白和槲皮素的结合物的混合溶液及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种含有转铁蛋白和槲皮素的结合物的混合溶液，具体地说是涉及一种生物大分子转铁蛋白(Tf)和药物小分子槲皮素相互作用，槲皮素调控转铁蛋白的构象变化产生的结合物，及其在制备治疗结肠腺癌细胞(LoVo)的药物中的用途。
背景技术：
药物小分子槲皮素(3，5，7，3′，4′-pentahydroxyflavone)是一种广泛分布的黄酮类化合物，其结构式如式I所示，其为两个苯环(式I中的A和B环)通过一含氧的杂环连接(C环)而成。
研究表明，在食物中，大多槲皮素都有抗氧化以及和金属离子鳌合的能力，同时也具有很多生物及生物化学的功效，如抗炎，抗肿瘤等活性。但是，由于其具有抗药性，限制了槲皮素在作为治疗肿瘤药物中的广泛应用。
在治疗疾病的过程中，为了提高药物疗效，降低其不良反应和减少药源性疾病，通常采用将药物定向浓集于靶器官、靶组织、靶细胞的靶向给药系统。其中，生物大分子转铁蛋白(Tf)是由肝脏合成的一种单链糖蛋白，转铁蛋白和转铁蛋白受体(TfR)介导的内吞作用是生物细胞最具特点的转运过程之一。在文献1Trends pharmacol Sci.2002，23(5)206中的研究表明，利用Tf-TfR的转运途径，将治疗药物特异性地转运至肿瘤部位是可行的。除了铁之外，许多治疗性与诊断性金属离子也可结合转铁蛋白的铁结合位点，形成复合物，DNA与转铁蛋白偶联转染靶细胞，可将外源性的DNA引入细胞，是一种非病毒载体基因治疗途径。然而，现有对药物靶向研究主要集中于通过偶联物使药物分子和转铁蛋白偶联，转铁蛋白作为介导系统运送至肿瘤细胞，这样不仅偶联过程涉及很多环节，而且偶联物在治疗肿瘤中也会对细胞有毒性作用。
发明内容
本发明的目的在于克服单独使用槲皮素，具有抗药性，限制了其应用，而使用转铁蛋白作为介导系统可以提高对肿瘤细胞的靶向作用，从而提供一种利用生物大分子转铁蛋白(Tf)将治疗性药物小分子槲皮素特异转运至肿瘤细胞，可以提高槲皮素对肿瘤细胞的靶向作用的且安全的含有转铁蛋白和槲皮素的结合物的混合溶液。
本发明的另一目的在于提供上述含有转铁蛋白和槲皮素的结合物的混合溶液在制备治疗结肠腺癌细胞(LoVo)的药物中的用途。
本发明的目的是通过如下的技术方案实现的本发明提供的含有转铁蛋白和槲皮素的结合物的混合溶液，是通过如下的方法得到的1)将槲皮素溶于pH6.8～7.8的磷酸缓冲溶液中，配成10×10-4M的溶液；2)将转铁蛋白溶于pH6.8～7.8磷酸缓冲溶液中，配成1.25×10-4M的溶液；3)将步骤1)和2)得到的相同pH的溶液混合，混合液中的转铁蛋白与槲皮素的摩尔浓度比为1∶4；再用pH6.8～7.8磷酸缓冲溶液稀释到混合液中槲皮素的浓度为40μM；将混合溶液摇匀后，静置9～15小时，转铁蛋白与槲皮素反应，得到含有转铁蛋白和槲皮素的结合物的混合溶液。
经紫外可见吸收光谱、荧光光谱以及圆二色谱分析，在中性条件(pH6.8～7.8)下，槲皮素通过氢键和具有介导作用的转铁蛋白结合，形成本发明提供的含有转铁蛋白和槲皮素的结合物的混合溶液，其中的槲皮素和人转铁蛋白相互作用，并且槲皮素可以调控转铁蛋白的构象。当处于酸性环境(pH5.5～4.5)时，结合物中的槲皮素从转铁蛋白解离，同时转铁蛋白恢复开放状态，达到在胞吞体内酸化释放的目的。
选用LoVo细胞为实验细胞，以MTT法测定转铁蛋白和槲皮素的结合物的混合溶液对上述细胞的杀伤作用。结果表明本发明提供的含有转铁蛋白和槲皮素的结合物的混合溶液通过将槲皮素和转铁蛋白结合，同时，在适宜pH值的磷酸缓冲溶液中，槲皮素可以诱导转铁蛋白构象发生变化，提高了槲皮素对肿瘤的细胞毒作用，达到了通过转铁蛋白，药物小分子对肿瘤细胞的靶向作用。
当单独使用浓度为100μM槲皮素溶液时，对LoVo的细胞杀伤率仅有3％，但是使用含有相同浓度转铁蛋白和槲皮素的结合物的本发明提供的含有转铁蛋白和槲皮素的结合物的混合溶液对LoVo细胞的杀伤率提高到了17％。本发明提供的含有转铁蛋白和槲皮素的结合物的混合溶液可以用于制备治疗结肠腺癌细胞(LoVo)的药物。
与现有技术相比，本发明提供的含有转铁蛋白和槲皮素的结合物的混合溶液的优点在于1)通过和转铁蛋白的结合，提高了槲皮素作为抗肿瘤药物的疗效，降低其耐药性；最重要的是，转铁蛋白作为药物小分子的载体，提高了药物小分子对肿瘤细胞的靶向作用。
2)通过将合适比例的转铁蛋白与槲皮素溶液混合，就能实现对转铁蛋白构象的调控，且不需要繁琐的后处理，该方法简便易行，实验条件温和；3)本发明直接将转铁蛋白和药物小分子槲皮素相互作用，形成的复合物直接将槲皮素转运至肿瘤靶细胞，提高槲皮素对肿瘤细胞的选择性，毒性和减少耐药的作用。同时，复合物进入胞吞体内酸化，槲皮素被释放。
图1为实施例1中的转铁蛋白和槲皮素在中性(A)和酸性(B)条件下的紫外可见吸收光谱。
图2为实施例1中的转铁蛋白和槲皮素在中性(A)和酸性(B)条件下的圆二色谱。
图3为实施例1中的转铁蛋白和槲皮素在中性(A)和酸性(B)条件下的荧光光谱，以及单独存在的10μM人转铁蛋白的磷酸缓冲溶液(pH7.4(A′)和4.8(B′))的荧光光谱。
图4为转铁蛋白和槲皮素复合物以及槲皮素对LoVo细胞的细胞毒作用。
具体实施例方式
实施例1、在5.00ml容量瓶中加入0.2ml 10×10-4M槲皮素的磷酸缓冲溶液(pH7.4)，然后加入0.4ml 1.25×10-4M人转铁蛋白(购自Sigma-Aldrich公司，T3309)的磷酸缓冲溶液(pH7.4)，混合液中的人转铁蛋白与槲皮素的摩尔浓度比为1∶4；再用磷酸缓冲溶液将溶液稀释到槲皮素的浓度为40μM；将混合溶液摇匀后，静置12小时，转铁蛋白与槲皮素反应，得到含有转铁蛋白和槲皮素的结合物的混合溶液。经紫外可见吸收光谱分析，结果如图1A所示，在323nm处出现了新的吸收峰，说明槲皮素和转铁蛋白发生了相互作用，形成了结合物，因而出现特征吸收。
类似的，将槲皮素和人转铁蛋白分别使用pH4.8的磷酸缓冲溶液配制后，再混合，混合液中的人转铁蛋白与槲皮素的摩尔浓度比为1∶4，且槲皮素的浓度为40μM，将该混合液进行紫外可见吸收光谱，结果如图1B所示，在酸性条件下，323nm处没有出现吸收峰，即不存在槲皮素和转铁蛋白的复合物，说明在酸性条件下槲皮素被释放。
使用圆二色谱分析上述两种混合液，结果如图2所示。在图2A中，可以看到在325nm和450nm处出现CD信号，而以单独存在的槲皮素和转铁蛋白的溶液做对照时，在290nm～600nm范围内并没有信号，说明在本发明提供的条件下，槲皮素和转铁蛋白结合改变了蛋白的构象，使得蛋白从开放的构象逐渐转变成闭合的构象，即槲皮素诱导转铁蛋白构象发生变化，导致在此出现CD信号。而在图2B中，并没有任何信号发生，说明在酸性条件下槲皮素和转铁蛋白解离，转铁蛋白构象恢复。
使用荧光光谱分析上述两种混合液，并以单独存在的10μM人转铁蛋白的磷酸缓冲溶液(pH7.4和4.8)做对照，结果如图3所示。在图3A和3A′中，可以看到在中性条件下，槲皮素和转铁蛋白的混合液(图3A)和转铁蛋白单独存在时的溶液(图3A′)的荧光光谱中，槲皮素对转铁蛋白有明显的猝灭现象，混合液的荧光强度降低，并在530nm处出现新的发射峰，说明在中性条件下，槲皮素和转铁蛋白相互作用，槲皮素对蛋白发生了荧光猝灭作用，导致荧光强度降低，且由于溶液的环境变化，出现了负离子。而在酸性条件下，槲皮素和转铁蛋白的混合液(图3B)和转铁蛋白单独存在时的溶液(图3B′)的荧光光谱中，峰形没有任何变化，只是混合液的荧光强度比蛋白单独存在时的溶液的荧光强度小一点，说明在酸性条件下，槲皮素和转铁蛋白没有发生相互作用，只是由于蛋白所处的溶液环境发生变化而导致荧光有所降低。
实施例2.
在5.00ml容量瓶中加入0.2ml 10×10-4M槲皮素的磷酸缓冲溶液(pH6.8)，然后加入0.4ml 1.25×10-4M人转铁蛋白(购自Sigma-Aldrich公司，T3309)的磷酸缓冲溶液(pH6.8)，混合液中的人转铁蛋白与槲皮素的摩尔浓度比为1∶4；再用磷酸缓冲溶液将溶液稀释到槲皮素的浓度为40μM；将混合溶液摇匀后，静置12小时，转铁蛋白与槲皮素反应，得到含有转铁蛋白和槲皮素的结合物的混合溶液。经紫外可见吸收光谱、荧光光谱以及圆二色谱分析，得到和实施例1中相同的结果，即在中性条件下，二者结合。
实施例3.
在5.00ml容量瓶中加入0.2ml 10×10-4M槲皮素的磷酸缓冲溶液(pH7.8)，然后加入0.4ml 1.25×10-4M人转铁蛋白(购自Sigma-Aldrich公司，T3309)的磷酸缓冲溶液(pH7.8)，混合液中的人转铁蛋白与槲皮素的摩尔浓度比为1∶4；再用磷酸缓冲溶液将溶液稀释到槲皮素的浓度为40μM；将混合溶液摇匀后，静置12小时，转铁蛋白与槲皮素反应，得到含有转铁蛋白和槲皮素的结合物的混合溶液。经紫外可见吸收光谱、荧光光谱以及圆二色谱分析，得到和实施例1中相同的结果，即在中性条件下，二者结合。
实施例4.
将实施例1中得到的含有转铁蛋白和槲皮素的结合物的混合溶液以磷酸缓冲溶液(pH7.4)释至槲皮素的浓度为100μM，选用结肠腺癌细胞(LoVo)为实验细胞，以MTT法测定不同浓度的复合物对LoVo细胞的杀伤作用。
将LoVo制成悬液，每孔2×104铺96孔板，所得结果列于图4。通过MTT试验发现当槲皮素浓度为100μM时，对LoVo的细胞杀伤率仅有3％，但是相同浓度的转铁蛋白和槲皮素的结合物对LoVo细胞的杀伤率提高到了17％。槲皮素和转铁蛋白结合后提高了对肿瘤细胞的细胞毒作用，达到了对肿瘤细胞的作用目的。
权利要求
1.一种含有转铁蛋白和槲皮素的结合物的混合溶液，是通过如下的方法得到的1)将槲皮素溶于pH 6.8～7.8的磷酸缓冲溶液中，配成10×10-4M的溶液；2)将转铁蛋白溶于pH 6.8～7.8磷酸缓冲溶液中，配成1.25×10-4M的溶液；3)将步骤1)和2)得到的溶液混合，混合液中的转铁蛋白与槲皮素的摩尔浓度比为1∶4；再用pH 6.8～7.8磷酸缓冲溶液稀释到混合液中槲皮素的浓度为40μM；将混合溶液摇匀后，静置9～15小时，转铁蛋白与槲皮素反应，得到含有转铁蛋白和槲皮素的结合物的混合溶液。
2.如权利要求1所述的含有转铁蛋白和槲皮素的结合物的混合溶液在制备抗结肠腺癌细胞的药物中的用途。
全文摘要
本发明涉及一种含有转铁蛋白和槲皮素的结合物的混合溶液，其为将槲皮素和转铁蛋白分别溶于pH 6.8～7.8的磷酸缓冲溶液后，分别取槲皮素溶液和转铁蛋白溶液，按照转铁蛋白与槲皮素的摩尔浓度比1∶4再混合，然后用磷酸缓冲溶液稀释到槲皮素的浓度为40μm；将混合溶液摇匀、静置，得到含有转铁蛋白和槲皮素的结合物的混合溶液。本发明提供的含有转铁蛋白和槲皮素的结合物的混合溶液通过将槲皮素和转铁蛋白结合，同时，在适宜pH值的磷酸缓冲溶液中，槲皮素可以诱导转铁蛋白构象发生变化，提高了槲皮素对肿瘤的细胞毒作用，达到了通过转铁蛋白，药物小分子对肿瘤细胞的靶向作用。可以用于制备治疗结肠腺癌细胞(LoVo)的药物。
文档编号A61K47/48GK101088502SQ20061008680
公开日2007年12月19日 申请日期2006年6月16日 优先权日2006年6月16日
发明者杜鸿雁, 张亚周, 向俊峰, 唐亚林 申请人:中国科学院化学研究所