专利名称：抗肿瘤整合素αVβ的制作方法
技术领域：
本发明涉及整合素抗原及其编码基因与应用，特别是涉及一种整合素αVβ3的抗原及其编码基因与其在制备预防和/或治疗性肿瘤疫苗及药物中的应用。
背景技术：
恶性肿瘤是威胁人类健康的最重要杀手之一。肿瘤的发生、发展和转移与肿瘤的血管形成密切相关，对根治性切除术的术后患者来说，无微血管侵袭的患者5年复发率为11％，而存在微血管侵袭的患者5年复发率高达50％。由于肿瘤区血管具有相同的特点，因此抗血管形成治疗适用于多种实体肿瘤。以血管为靶点、抑制血管形成，从而抑制肿瘤增殖和转移已成为一条新的肿瘤治疗途径。
研究表明，血管的形成不仅取决于血管内皮生长因子(vascular endothelialgrowth factor，VEGF)及其受体(vascular endothelial growth factor receptors，VEGF-R)，同时也受到细胞外基质(extracellular matrix，ECM)蛋白受体—整合素(integrin)的影响[Kerbel RS.A cancer therapy resistant to resistance[J].Nature，1997，390(6658)335-336.Ellis LM..Angiogenesis and its role incolorectal tumor and metastasis formation[J].Semin Oncol，2004，31(6)3-9.]。其中，VEGF-E、VEGF-R2和αVβ3与肿瘤血管形成的关系最为密切，可以作为抑制病理性血管形成的直接靶标。
近年来，对血管形成机理的研究已经越来越完善。研究发现，肿瘤血管的形成不仅取决于内皮生长因子及其受体，也受到细胞外基质(extracellular matrix，ECM)蛋白受体—整合素αVβ3的影响[Stromblad S，Becker JC，Yebra M，et al.Suppression of p53activity and p21WAF1/CIP1expression by vascular cellintegrin alphaVbeta3 during angiogenesis[J].J Clin Invest，1996，98(2)426-433.]。肿瘤组织中新生的血管内皮细胞表达高水平的αVβ3，而成人正常血管内皮细胞中无表达或某些组织极低水平表达。它可以在内皮细胞表面引发MMP-2降解基质的活性，并且抑制内皮细胞的p53及其所诱导的p21蛋白的活性，从而表现出抗凋亡效应。大量实验表明，动物体内应用整合素αVβ3拮抗剂，可导致参与生成血管的内皮细胞的凋亡；抗αVβ3抗体或αVβ3的拮抗剂能破坏鹌鹑胚胎、鼠视网膜、兔角膜的新生血管生成；肿瘤模型中应用αVβ3的拮抗剂不仅阻止了肿瘤相关的血管生成，而且可以引起肿瘤的退缩。αVβ3是由αV链和β3链非共价结合构成的一个异二聚体的跨膜糖蛋白，是一个能与ECM广泛结合的受体，凡是具有RGD序列(Arg-Gly-Asp)的ECM蛋白均能与其结合。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有抗肿瘤血管形成作用的整合素αVβ3抗原。
本发明所提供的整合素αVβ3抗原，来源于非洲爪蟾，具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列。
序列表中的SEQ ID №1由142个氨基酸残基组成。
编码上述整合素αVβ3抗原的基因也属于本发明的保护范围，可具有序列表中SEQ ID №2的DNA序列。
序列表中的SEQ ID №2由426个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-426位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列的蛋白质。
含有本发明整合素αVβ3抗原基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。
扩增所述抗原基因中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。
与上述整合素αVβ3抗原特异结合的抗体也属于本发明的保护范围。
所述抗体包括单克隆抗体及多克隆抗体，均可按照常规方法制备。
本发明的另一个目的是提供一种表达上述整合素αVβ3抗原的方法。
本发明所提供的表达上述整合素αVβ3抗原的方法，是将含有上述整合素αVβ3抗原基因的重组表达载体导入宿主细胞，表达得到整合素αVβ3抗原。
用于构建所述重组表达载体的出发载体可为在大肠杆菌中表达外源基因的表达载体，如pGEX-4T-2、pET-3a、pET-30a、pET-28a、pET-28b或pET-28c，优选为pGEX-4T-2。
以pGEX-4T-2为出发载体，构建的含有所述整合素αVβ3抗原基因的重组表达载体为pGEX-αVβ3。
上述重组表达载体均可按照常规方法构建。
所述宿主可为大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或枯草杆菌等，优选为大肠杆菌。
所述大肠杆菌可为E.coli BL21(DE3)、E.coli JM109、E.coli HB101或E.coliTop10等。
可采用构建工程菌所用的出发菌株的常规培养条件对工程菌进行培养，当所述工程菌为重组大肠杆菌时，需加入IPTG诱导剂，所加入IPTG的浓度为0.8-1.2mmol/L，优选为1mmol/L，诱导温度为35-39℃，优选为37℃，诱导时间为2-4小时，优选为3小时。
本发明的整合素αVβ3抗原可用于制备预防和/或治疗性肿瘤疫苗，编码整合素αVβ3抗原的基因可用于制备预防和/或治疗性肿瘤DNA疫苗。
所述预防和/或治疗性肿瘤DNA疫苗中的整合素αVβ3抗原基因可存在于真核表达载体中。
用于构建携带有整合素αVβ3抗原基因的真核表达载体的出发载体可为任意一种可在哺乳动物中表达外源基因的表达载体，优选为pCI-GPI，其物理图谱见图18。
以pCI-GPI为出发载体，构建的携带有整合素αVβ3抗原基因的重组表达载体为pCI-αVβ3。
需要的时候，以血管内皮生长因子VEGF-E抗原制备的疫苗中还可以融入颗粒白细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-γ(IFN-γ)、白介素2(IL-2)、TGF-β4等一种或多种细胞因子的基因或蛋白质作为分子免疫佐剂。
本发明提供了整合素αVβ3的抗原及其编码基因。以分别含有本发明整合素αVβ3抗原基因及小鼠中相应区段的真核表达质粒作为免疫原免疫小鼠，结果与PBS、空载体和同种抗原对照组相比，抗原组小鼠血清中均产生了较高水平的抗体，抗原组小鼠脾细胞中分泌IFN-γ和IL-4的T淋巴细胞数量明显增加，CD4+/CD8+的比值也明显升高，且本发明的整合素αVβ3抗原较小鼠的相应抗原更能激发小鼠的体液免疫反应；免疫小鼠接受皮下移植瘤攻击后，与PBS、空载体和同种抗原对照组相比，抗原组小鼠的成瘤时间延长、肿瘤生长缓慢且瘤体积缩小、抑瘤率明显提高，且本发明的整合素αVβ3抗原较小鼠的相应抗原的抑瘤效果更加显著，抑瘤率可达80％以上。上述实验结果表明本发明的整合素αVβ3抗原及其编码基因具有显著的抑瘤效果，且具有表达量高，易纯化，生产周期短，生产规模大，成本低的优点，可制备成预防和/或治疗性肿瘤药物及疫苗。本发明在医学和生物制药领域具有较大的实际意义和广阔的应用前景。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
图1为用中心模板法分五步PCR扩增整合素αVβ3抗原基因的模式2为PCR扩增整合素αVβ3抗原基因的琼脂糖凝胶电泳检测结果图3为PCR扩增的mαVβ3基因片段的琼脂糖凝胶电泳检测结果图4为稳定转染细胞mRNA的RT-PCR鉴定结果图5为稳定转染细胞的免疫荧光检测结果图6为稳定转染细胞的Western Blotting鉴定结果图7为整合素αVβ3抗原基因原核表达载体的构建流程8为pCI-αVβ3和pGEX-4T-2质粒SalI和NotI双酶切产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果图9为原核表达及纯化的整合素αVβ3抗原的SDS-PAGE检测结果图10为免疫小鼠的IFN-γ和IL-4的ELISPOT检测结果图11为免疫小鼠中CD4+和CD8+T细胞数比例的流式细胞仪测定结果图12为免疫小鼠中CD4+和CD8+T细胞数比例的柱状13为各组免疫小鼠皮下移植瘤的平均成瘤时间图14为皮下移植瘤攻击后50天各组免疫小鼠的瘤体积测量结果图15为皮下移植瘤攻击后50天各组免疫小鼠的瘤重测量结果图16为以B组为对照组的各组免疫小鼠的抑肿瘤率统计结果图17为皮下移植瘤攻击后50天各组免疫小鼠的存活情况、在体瘤体积和体外瘤体积图18为载体pCI-GPI的物理图谱具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。所有引物合成及测序工作均由上海生工生物工程有限公司完成。
实施例1、整合素αVβ3抗原的设计及其编码基因的克隆一、整合素αVβ3抗原的设计通过国内外大范围文献检索及序列比较，获得了一系列整合素αVβ3功能性区域的氨基酸序列及其在不同物种中的同源性差异。选取非洲爪蟾αVβ3全长中的功能性片段包括自氨基端(N端)第118-131，126-129，217-231，211-221，109-118，99-118，209-220位由142个氨基酸残基组成的序列，即序列表中的SEQ ID №1。
二、整合素αVβ3抗原基因及其鼠源相应基因的克隆根据步骤一设计的整合素αVβ3抗原的氨基酸序列推导出编码该序列的核苷酸序列，即序列表中的SEQ ID №2，由426个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-426位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列的蛋白质。将全基因分成两段，利用中心模板法分5步合成该基因，同时克隆出小鼠αVβ3相应的片段作为对照，简称mαVβ3，具体方法如下1、整合素αVβ3抗原基因的克隆根据推导的整合素αVβ3抗原基因的核甘酸序列设计PCR扩增引物，并在引物F5、R5两端分别添加限制性内切酶Xho I和EcoR V识别位点，引物序列如下前段F1 5’-ATGATTTAATTAAGATCCAAACCCTGGGCACTAGTTTGTCAGAGA-3’前段R1 5’-ATCCGCAGGTTACTAGTTAGCCGGCGCATCCTCTCTGACAAACTA-3’前段F2 5’-ACCTTATGGACCTTTCCTATTCCATGAAGGATGATTTAATTAAGA-3’前段R2 5’-ATCGGCTTGTCAACGAATGCACCAAATCCAATCCGCAGGTTACTA-3’前段F3 5’-AAGTAGAAGACTATCCTGTGGACATATACTACCTTATGGACCTTT-3’前段R3 5’-TCAGGAGGTGACATGAACATGTACGGTGACATCGGCTTGTCAACG-3’前段F4 5’-GTCTTCAACCTACAGGTGAGGCAAGTAGAAGACTATC-3’前段R4 5’-ATAGCATGGGTTCTTGATGACTTCAGGAGGTGACATG-3’后段F1 5’-GCACGTCTTGACTTTGACAGAGGAAGTCTTGCTGTTTAACGAGGAGGT-3’后段R1 5’-GAGAATCCCGGTTTCGGGAGACCTTCTGTTTCTGGACCTCCTCGTTAA-3’后段F2 5’-TCAATACCGAGTGCATGCCGACATTCGGATATAAGCACGTCTTGACTT-3’后段R2 5’-GCTGCCTGTAGCACCGCATCAAATCCACCCTCTGGAGAATCCCGGTTT-3’后段F3 5’-CCTGAAGTCATCAAGAATCCATGCTATGAATTCAATACCGAGTGC-3’后段R3 5’-ATTTCTCCAGCCAATCTTCTCGTCGCATACTGCTGCCTGTAGCAC-3’F5 5’-GCCTCGAGGTCTTCAACCTACAGGTGAGGCAAG-3’(带下划线碱基为限制性内切酶XhoI识别位点)R5 5’-GCGATATCATTTCTCCAGCCAATCTTCTCGTCG-3’(带下划线碱基为限制性内切酶EcoRV识别位点)采用中心模板法分五步PCR扩增目的基因，合成模式图见图1(F上游引物，R下游引物)，将全基因分成前、后两段，两片段均用四步PCR合成法获得目的基因，然后利用PCR方法将前后两端拼接起来，具体方法如下第一步扩增体系为10×PCR缓冲液5μl，MgCl2(2.5mM)5μl，dNTPs(2.5mM)4μl，引物R1、F1(20μM)各1μl，TaqDNA聚合酶(5U/μl)1μl，加去离子水至50μl。PCR反应条件为先94℃预变性5min；然后94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共5个循环；最后72℃继续延伸10min。
第二步、第三步和第四步扩增均以上一步PCR产物稀释50倍后作模板进行。扩增体系同上，只是引物第二步PCR扩增选用引物和F2，第三步选用引物R3和F3，第四步选用引物R4和F4。PCR反应条件为94C 1min，55C1min，72C 1min，共30个循环。四次PCR扩增后所得的两段目的基因，分别命名为前段和后段。
最后一步PCR扩增体系为10×PCR缓冲液5μl，MgCl2(2.5mM)5μl，dNTPs(2.5mM)4μl，合成引物(20μM)F5和R5各1μl，Taq DNA聚合酶(5U/μl)1μl，稀释50倍后的前段1μl，稀释50倍后的后段1μl，加去离子水至50μl。PCR反应条件同步骤二至四。五次PCR扩增后，对PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图2所示(泳道M.DNA相对分子质量标准DL-2000；泳道1-4.前段分步PCR产物；泳道5.αVβ3的PCR终产物(426bp)；泳道6-8.后段分步PCR产物)，结果经PCR扩增获得了长度约为426bp的基因片段(图2中箭头所指片段)，与预期结果相符。用北京博大泰克生物基因技术有限责任公司的“PCR片断快速胶回收试剂盒”并参照试剂盒说明书回收并纯化该目的片段，将其克隆到pMD18-T载体(TaKaRa公司)中，对含有回收片断的重组载体进行测序，结果扩增片断具有序列表中SEQ ID №2的核苷酸序列，扩增序列正确。
2、小鼠中相应基因片断的扩增1)设计引物根据GeneBank中小鼠的整合素αVβ3基因序列(序列号L-13591)设计扩增相应区域(将该片段命名为mαVβ3)的引物，并在上、下游引物的两端分别引入限制性内切酶酶Xho I和EcoR V的识别位点，引物序列如下F6(上游引物)5’-GCGCTAGCATCTTCTCACTTCAAGTGCGGCAGGT-3’(带下划线碱基为限制性内切酶Xho I识别位点)R6(下游引物)5’-GCGATATCATTCCTCCAGCCAATTTTTTCATCAC-3’(带下划线碱基为限制性内切酶EcoR V识别位点)。
2)制备鼠胚组织匀浆断颈处死孕鼠，浸泡于75％乙醇中5min；无菌取出子宫及其中的胚胎、胎盘，用剪刀尽量剔除脂肪和结缔组织并剪碎；将剪碎的组织放于研钵中加液氮研细至粉末状，收集于冰预冷的玻璃匀浆器中，加入1mL Trizol，匀浆至透明；组织匀浆迅速转入无菌RNase-free EP管中备用。
3)Trizol法提取组织匀浆的总RNA收获组织匀浆的EP管中加入氯仿200μl，立即颠倒混匀15s，室温静置5min；4℃/12000rpm，离心15min；小心将上层液相移入另一新的无菌RNase-free的1.5mL EP管中，加入等量的异丙醇，颠倒混匀，室温静置10min；4℃、12000rpm离心10min；弃上清，加入75％的乙醇1mL，颠倒混匀，4℃、7500rpm离心5min，弃上清；重复上步后彻底弃上清，将沉淀自然干燥，加入DEPC水10μl溶解沉淀，直接用于逆转录反应。
4)逆转录反应将步骤3)提取的小鼠胚组织的总RNA为模板，以olig(dT)20为引物，用美国Invitrogen的SuperScript III RNase H-Reverse Transcriptase并参照产品说明书逆转录合成cDNA。
5)mαVβ3的PCR扩增以步骤4)反转录合成的cDNA为模板，在引物F6和R6的引导下进行PCR扩增，100μl PCR反应体系为2×GC缓冲液I(TaKaRa公司La Taq附带)50.0μl，dNTPs混合物(2.5mM)16.0μl，TaKaRa La Taq(5U/μl)1.0μl，逆转录产物2.0μl，F6(20μM)2.0μl，R6(20μM)2.0μl，用灭菌去离子水补充总体积至100μl。PCR反应条件先94℃预变性5分钟；然后94℃30s，60℃30s，72℃2分钟，共30个循环；最后72℃延伸10分钟。反应结束后，对PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图3所示(泳道1为DL-2000Marker；泳道2为扩增基因)，结果经PCR扩增获得了长度约为426bp的基因片段，与预期结果相符。用北京博大泰克生物基因技术有限责任公司的“PCR片断快速胶回收试剂盒”并参照试剂盒说明书回收并纯化该目的片段，将其克隆到pMD18-T载体(TaKaRa公司)中，对含有回收片断的重组载体进行测序，结果扩增序列正确。
实施例2、整合素αVβ3抗原基因真核表达载体的构建及其鉴定一、整合素αVβ3抗原基因真核表达载体的构建将实施例1扩增的整合素αVβ3抗原基因用限制性内切酶Xho I和EcoR V进行双酶切后，与经相同酶双酶切的载体pCI-GPI[在Promega公司的真核表达质粒pCI-neo+基础上构建而成。主要是在pCI-neo+原多克隆位点Nhe I和Xba I酶切位点之间插入通用序列构建而成。通用序列的基因顺序为5’-Nhe I-信号肽-Xho I-EcoR V-EcoRI-IgG Fc-GPI-Xba I-3’，外源免疫分子基因可以在Nhe I-EcoR I之间选择合适的酶切位点插入。pCI-GPI除含有人IgG Fc段(GenBank号Z17370)和糖基化磷脂酰肌醇GPI(GenBank号XM676434)编码序列外，还含有pCI载体的主要骨架结构，如CMV早期启动子、嵌合内含子、Neo筛选标记、SV40增强子和氨苄抗性基因Ampr+等，物理图谱见图18]在16℃下连接12-24小时，连接体系为10×T4DNA连接缓冲液1μl，T4DNA连接酶(12u/μl)1μl，PCR纯化产物4μl，pCI-GPI载体1μl，加灭菌双蒸水至10μl。将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，将转化细胞涂布于含100mg/mL氨苄青霉素的LB抗性平板上进行筛选。然后挑取在抗性平板上长出的单菌落进行菌落PCR鉴定将单菌落接种于3mL含100mg/mL氨苄青霉素(Amp+)的LB液体培养基中扩大培养3h。培养结束后，取1μl菌液用100μl水稀释，煮沸10min，12000rpm离心3min，取上清做模板，在引物F5和R5的引导下进行PCR扩增，25μl PCR反应体系为上清5μl，引物F5和R5各1μl，10×PCR缓冲液2.5μl，MgCl22.5μl，dNTPs 0.5μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，加灭菌双蒸水至25μl。PCR反应条件先94℃预变性5分钟；然后94℃30s，60℃30s，72℃2分钟，共30个循环；最后72℃延伸10分钟。反应结束后，对PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，经PCR扩增可获得长度约为426bp的DNA片段的为阳性重组子。提取经PCR鉴定出的阳性重组子的质粒，用测序方法作进一步鉴定，测序结果表明目的基因的序列及在载体中的位置均正确，得到了血管内皮生长因子受体VEGF-R2抗原基因的真核表达载体，命名为pCI-αVβ3。同时用相同方法将实施例1扩增的小鼠mαVβ3基因片段也连接入载体pCI-GPI中，得到mαVβ3的真核表达载体，命名为pCI-mαVβ3。
二、真核表达质粒的鉴定1、瞬时转染RenCa细胞将步骤一获得的分别携带有真核表达载体pCI-αVβ3和pCI-mαVβ3的阳性克隆菌接种于LB液体培养基中，在37℃下培养12-24小时，用QIAGEN公司的质粒小量提取试剂盒并参照产品说明书提取质粒，然后用QIAGEN公司的转染试剂SuperFectTransfection Reagent并参照产品说明书将pCI-αVβ3和pCI-mαVβ3质粒转染肾癌细胞系RenCa，以pCI-neo(Promega公司)为对照。
2、稳定转染细胞的筛选将转染细胞培养约48小时至细胞密度达到50-70％融合时，弃培养液，换用含有G-418(400μg/mL)的RPMI 1640培养基(Gibco公司)进行抗性细胞筛选培养，同时用未转染的RenCa细胞作对照。当对照细胞几乎全部死亡时，G-418浓度可降至200μg/mL以维持筛选作用。两周后，可见有抗性克隆形成，待其逐渐增大后，用0.25％(质量百分浓度)的胰酶将细胞消化下来，用有限稀释法挑取单克隆并进行扩大培养。
3、稳定转染细胞的鉴定1)稳定转染细胞mRNA的RT-PCR鉴定用0.25％的胰酶将扩大培养的单克隆细胞消化制成单细胞悬液，收集于玻璃离心管中，1000rpm离心5min，弃上清；PBS洗三次后完全吸弃上清；重悬细胞并计数，使细胞的终密度为1×106/mL；取1mL细胞悬液加1mL Trizol混匀，提取细胞总RNA，然后用引物F5和R5对转染有pCI-αVβ3质粒的细胞进行RT-PCR鉴定，用引物F6和R6对转染有pCI-mαVβ3质粒的细胞进行RT-PCR鉴定，鉴定结果如图4所示(泳道M.DNA相对分子质量标准DL-2000；泳道1.αVβ3；泳道2.mαVβ3)，经扩增均获得了长度约为426bp的片段，表明整合素αVβ3基因在转染有pCI-αVβ3质粒的RenCa细胞中已在mRNA水平上表达，mαVβ3基因在转染有pCI-mαVβ3质粒的RenCa细胞中也已在mRNA水平上表达。
2)稳定转染细胞的免疫荧光检测将步骤1)鉴定的稳定转染细胞(以pCI-neo+转染细胞和RenCa细胞为对照)用0.25％的胰酶消化制备成单细胞悬液；PBS洗3次后，封闭剂(3％BSA)室温封闭20-30分钟；去除封闭剂，加入荧光素标记的鼠抗人IgG(购自北京中杉金桥技术有限公司)，4℃避光孵育12-24小时；PBS洗3次，调整细胞浓度至5×105/mL；细胞悬液滴到载玻片上，封片剂(购自北京中杉金桥技术有限公司)封片。检测结果如图5所示(1.pCI-αVβ3转染细胞；2.pCI-mαVβ3转染细胞；3.pCI-neo+转染细胞；4.RenCa细胞)，表明整合素αVβ3抗原基因、mαVβ3基因分别在各自的转染细胞中获得表达。
3)稳定转染细胞的Western Blotting鉴定将步骤2)鉴定的稳定转染细胞(以pCI-neo+转染细胞和RenCa细胞为对照)用0.25％胰酶消化，收集细胞，PBS洗涤两次；用含1％Triton X-100的TBS(50mMTris-Cl，pH7.6，150mM NaCl)裂解细胞30min；4℃、12000rpm离心10min收集上清；对待测样品进行15％SDS-PAGE电泳分离后，用半干转移仪将蛋白从聚丙烯酰胺凝胶转移至硝酸纤维素膜(电压15V，转移1小时)；用含5％脱脂奶粉的TBST(TBS+0.05％Tween 20)室温封闭1小时；用HRP标记的鼠抗人IgG单克隆抗体(购自北京中杉金桥技术有限公司，按1∶500比例稀释)4℃孵育12-24小时；TBST洗涤后，加辣根过氧化物酶标记的二抗山羊抗小鼠IgG(购自北京中杉金桥技术有限公司，按1∶2000比例稀释)室温孵育2小时；TBST洗涤后，用ECL进行曝光显色。检测结果如图6所示(泳道1.pCI-αVβ3转染细胞；泳道2.pCI-mαVβ3转染细胞；泳道3.pCI-neo+转染细胞；泳道4.RenCa细胞)，进一步证明整合素αVβ3抗原基因、mαVβ3基因分别在各自的转染细胞中获得表达。
实施例3、整合素αVβ3抗原基因的原核表达一、整合素αVβ3抗原基因原核表达载体的构建参见图7构建整合素αVβ3抗原基因的原核表达载体，具体方法为将纯化的pCI-αVβ3质粒和pGEX-4T-2(Pharmacia公司)分别用限制性内切酶Sal I和Not I进行双酶切，对酶切产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图8所示(泳道M1.DNA相对分子质量标准DL-15000；泳道M2.DNA相对分子质量标准DL-2000；泳道1.pGEX-4T-2酶切前；泳道2.pGEX-4T-2酶切后；泳道3.pCI-αVβ3的酶切片段)，用北京博大泰克生物基因技术有限责任公司的“PCR片断快速胶回收试剂盒”并参照试剂盒说明书回收并纯化线形化的pGEX-4T-2及426bp的pCI-αVβ3的酶切片段(图8中箭头所指片段)，然后将纯化的目的片段和线性化pGEX-4T-2载体16℃连接12-24小时，连接体系为10×连接酶缓冲液1μl，T4DNA连接酶1μl，目的基因4μl，pGEX-4T-2载体1μl，用双蒸水补充反应体系至10μl。将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，将转化细胞涂布于含100mg/mL氨苄青霉素的LB抗性平板上进行筛选，然后挑取在抗性平板上长出的单菌落并在引物F5和R5的引导下进行菌落PCR鉴定，经PCR扩增可获得长度约为426bp的DNA片段的为阳性重组子。提取经PCR鉴定出的阳性重组子的质粒，用测序方法作进一步鉴定，测序结果表明目的基因的序列及在载体中的位置均正确，得到了整合素αVβ3抗原基因的原核表达载体，命名为pGEX-αVβ3。
二、工程菌的获得及包涵体的大量制备将pGEX-αVβ3转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，用与步骤一相同的方法筛选出阳性重组菌株，然后按1∶100的比例将阳性重组菌接种至含100mg/mL氨苄青霉素的1000mL LB液体培养基中在37℃下进行大量培养，培养至对数生长期时加入化学诱导剂IPTG至终浓度为1mmol/L，在37℃下继续培养12-24小时。培养结束后，4℃、6000rpm离心15min收集菌体，用100mL TE缓冲液(20mmol/L，pH8.0)重悬菌体沉淀，加入溶菌酶(1mg/mL)于室温磁力搅拌10min；冰浴中超声波(30s/开，20s/停，15个循环)破碎菌体；4℃、12000rpm离心20min分别收集包涵体沉淀和上清。将包涵体沉淀用1mol/L的NaCl(TE配制)洗涤1次，4℃、12000rpm离心20min以去除包涵体中的杂蛋白，弃上清后再用TE缓冲液洗涤2次，4℃、12000rpm离心20min收集沉淀，用下述步骤进行纯化。
三、目的蛋白的纯化用8mol/L的脲溶解包涵体，20℃、12000rpm离心10min后添加巯基乙醇至1％(体积百分浓度)；将Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱(购自Pharmacia公司)用6mol/L脲的TE缓冲液平衡后上样；用6moI/L脲的TE缓冲液洗脱出穿过峰后，用不同浓度(浓度为0.05M、0.1M、0.15M、0.2M、0.25M、0.5M和1M)的NaCl(6mol/L脲的TE缓冲液配制)洗脱，收集相关洗脱峰；每个峰取样进行SDS-PAGE鉴定，根据电泳结果，将43KD的目的蛋白组分再进行S-Sepharose Fast Flow阳离子交换柱和SephardexG-50柱(购自Pharmacia公司)进行纯化，最后对经纯化的目的蛋白进行SDS-PAGE检测，检测结果如图9所示，表明获得了43KD经纯化的目的蛋白，即整合素αVβ3抗原。
实施例4、整合素αVβ3抗原的抑瘤活性检测一、动物的分组与免疫6周龄Balb/c小鼠分为5组，每组9只。A组为空白对照组；B组为PBS对照组；C组为pCI-neo+空载体组；E-1组为pCI-m αVβ3组，E-2组为pCI-αVβ3组。
将三种质粒DNA(pCI-neo、pCI-mαVβ3(实施例2构建)、pCI-αVβ3(实施例2构建))分别与转染试剂LipofectAMINE按1∶1(m∶v)的比例混合，轻轻振荡后室温放置15分钟，得到LipofectAMINE-质粒DNA复合物，作为免疫用DNA。免疫采用股四头肌肌肉多点注射，100μg/只首先注射100μl 0.25％布比卡因预处理接种部位，72h后在相同部位初次免疫，分别于第3周和第6周各加强免疫1次。
二、血清抗体效价的ELISA检测每组小鼠于每次免疫后2周经尾静脉取血，室温放置3h后3000rpm离心10min，取上层血清用ELISA法检测抗体滴度，以验证抗原的体液免疫反应，同时设立免疫前鼠血清的阴性对照和PBS空白对照，ELISA检测方法如下将实施例3制备的蛋白用包被液稀释至终浓度为5μg/mL，包被ELISA板，4℃静置12-24小时；PBST洗涤甩弃ELISA板孔中的包被液，PBST洗涤1次；用2％酪蛋白液室温封闭4h，弃去封闭液，拍干ELISA板；将免疫鼠血清用PBS倍比稀释后加入各孔，100ul/孔，37℃静置30min；用PBST洗涤后加入HRP标记的羊抗鼠IgG(购自北京中杉金桥技术有限公司)，37℃反应20min；PBST洗涤后，用TMB显色10min，2M硫酸终止反应；最后用SPECTRAIII酶联仪检测450nm的OD值。结果判定待测样品的OD值与阴性对照的OD值之比大于或等于2.1(P/N≥2.1)为阳性，显示阳性结果的最大抗体稀释度为免疫小鼠血清的抗体效价。免疫小鼠血清中的抗体效价检测结果如表1所示，表1免疫小鼠血清中的抗体效价
注※与PBS、pCI-neo+和小鼠来源的同物种抗原对照组相比，该组小鼠均产生特异性抗体(P＜0.05)※※两次加强免疫可明显增强免疫小鼠血清的抗体效价(P＜0.05)与PBS和空载体对照组相比，抗原组(E-1组、E-2组)小鼠血清中均产生了较高水平的抗体，两次加强免疫可明显增强免疫小鼠血清的抗体效价，此外，本发明的整合素αVβ3抗原较小鼠的相应抗原更能激发小鼠的体液免疫反应。
三、免疫小鼠的IFN-γ和IL-4的ELISPOT检测
1、免疫小鼠脾淋巴细胞的分离每组免疫小鼠各取三只，无菌分离脾淋巴细胞，方法为断颈处死小鼠，75％乙醇中灭菌5min，随即放入超净台内成右侧卧位；无菌取出脾脏，放于平皿(内装预冷的8mL无血清RPMI1640培养液)中，尽量剔除脂肪和结缔组织，于200目不锈钢网上用研磨棒轻轻挤压脾组织；将脾细胞悬液8mL缓慢沿管壁缓慢加入装有4mL Ficoll淋巴细胞分离液(购自Pharmacia公司)的透明离心管中，2000rpm水平离心20min；小心吸取白膜层，用10mL预冷的培养基洗2次(1000rpm、10min)，将细胞重悬于含20％胎牛血清的RPMI1640培养基中，调整细胞浓度至1×107/mL。
2、免疫小鼠的IFN-γ和IL-4的ELISPOT检测对步骤1分离的免疫小鼠的脾淋巴细胞用Murine IFNγ和IL-4ELISPOT试剂盒并参照试剂盒说明书进行IFN-γ和IL-4的ELISPOT检测，检测结果见表2和图10所示，表2免疫小鼠IFN-γ和IL-4的ELISPOT检测
注※与B、C对照组比较，ELISPOT检测该组小鼠斑点数增多P＜0.05，※※P＜0.01与PBS和空载体对照组相比，抗原组(E-1组、E-2组)小鼠脾细胞中分泌IFN-γ和IL-4的T淋巴细胞数量与对照组比均明显增加，且本发明的整合素αVβ3抗原较小鼠的相应抗原更能激发小鼠的体液免疫反应。
四、免疫小鼠脾淋巴细胞的T细胞亚群测定取小鼠脾细胞1×106/mL-2×106/mL，PBS洗两次；分别加入PE标记的抗CD4+mAb和FITC标记的抗CD8+mAb(购自北京晶美生物有限公司)各20ul，混匀后4℃避光反应30min；PBS洗两次后，加入0.5mL荧光保存液(0.15mol/L PBS，20g/L葡萄糖，10g/L甲醛及1g/L NaN3)重悬细胞，用流式细胞仪分析T细胞亚群，免疫小鼠CD4+和CD8+T细胞数比例的流式细胞仪测定结果如表3和图11、图12所示。
表3流式细胞仪测定的免疫小鼠CD4+和CD8+T细胞数的比例
注※与B、C对照组比较，该组小鼠CD4+/CD8+的比值显著增高P＜0.05，※※P＜0.01与PBS和空载体对照组相比，抗原组(E-1组、E-2组)小鼠脾细胞中CD4+/CD8+的比值明显升高，且本发明的整合素αVβ3抗原较小鼠的相应抗原更能激发小鼠的体液免疫反应。
五、检测免疫小鼠对皮下移植瘤攻击的保护作用末次免疫后一周对各组余下6只免疫小鼠进行皮下移植瘤攻击。收获对数生长期的RenCa细胞，制备单细胞悬液，用生理盐水洗两次，调整细胞浓度至1×107/mL，于小鼠背部右侧皮下接种100μl细胞悬液即1×106/只。皮下移植瘤攻击后，观察小鼠移植瘤的生长情况。待肿瘤结节形成后(可扪及，长径约2-3mm)，记录每组小鼠的成瘤时间，同时观察小鼠的存活状况。于肿瘤细胞攻击后50天处死小鼠，拍照；用游标卡尺测量肿瘤的垂直长径(a)和垂直短径(b)，依照公式计算移植瘤体积；称取瘤重，依照公式计算肿瘤的抑制率。
各组免疫小鼠皮下移植瘤的平均成瘤时间见表4和图13，皮下移植瘤攻击后50天各组免疫小鼠的存活情况、在体瘤体积和体外瘤体积见图17(从左到右依次是小鼠存活情况、在体显示肿瘤体积、离体显示肿瘤体积)，其中存活率统计结果见表5，瘤体积测量结果见表6和图14，瘤重测量结果见图15，各组免疫小鼠的抑肿瘤率统计结果见表7，其中以B组为对照组的各组免疫小鼠的抑肿瘤率统计结果的柱状图见图16，表4各组免疫小鼠皮下移植瘤的平均成瘤时间
注※与B、C对照组比较该组小鼠成瘤潜伏期延长(P＜0.05)表5皮下移植瘤攻击后50天各组免疫小鼠的存活情况
注※与B、C对照组比较该组小鼠存活率明显增加(P＜0.05)表6皮下移植瘤攻击后50天各组免疫小鼠的瘤体积
注※与B、C对照组比较该组小鼠肿瘤体积明显缩小(P＜0.001)表7各组免疫小鼠对肿瘤的抑制作用
注※与对照组相比，该组小鼠对肿瘤的抑制作用非常显著(P＜0.01)；※※P＜0.001免疫小鼠接受皮下移植瘤攻击后，与PBS和空载体对照组相比，抗原组(E-1组、E-2组)小鼠的成瘤时间延长、肿瘤生长缓慢且瘤体积缩小、抑瘤率明显提高，且本发明的整合素αVβ3抗原较小鼠的相应抗原的抑瘤效果更加显著。
序列表<160>2<210>1<211>142<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>1Val Phe Asn Leu Gln Val Arg Gln Val Glu Asp Tyr Pro Val Asp Ile1 5 10 15Tyr Tyr Leu Met Asp Leu Ser Tyr Ser Met Lys Asp Asp Leu Ile Lys20 25 30Ile Gln Thr Leu Gly Thr Ser Leu Ser Glu Arg Met Arg Arg Leu Thr35 40 45Ser Asn Leu Arg Ile Gly Phe Gly Ala Phe Val Asp Lys Pro Met Ser50 55 60Pro Tyr Met Phe Met Ser Pro Pro Glu Val Ile Lys Asn Pro Cys Tyr65 70 75 80Glu Phe Asn Thr Glu Cys Met Pro Thr Phe Gly Tyr Lys His Val Leu85 90 95Thr Leu Thr Glu Glu Val Leu Arg Phe Asn Glu Glu Val Gln Lys Gln100 105 110Lys Val Ser Arg Asn Arg Asp Ser Pro Glu Gly Gly Phe Asp Ala Val115 120 125Leu Gln Ala Ala Val Cys Asp Glu Lys Ile Gly Trp Arg Asn130 135 140
<210>2<211>426<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2gtcttcaacc tacaggtgag gcaagtagaa gactatcctg tggatatcta ctaccttatg 60gacctttcct attccatgaa ggatgattta atcaagatcc aaaccctggg cactagttta 120tcagaaagga tgcgccggct aactagtaac ctgcggattg gatttggtgc atttgttgac 180aagcctatgt caccgtacat gtttatgtca cctcctgaag tcatcaaaaa cccctgctat 240gaatttaaca ccgagtgcat gcccactttt ggatataaac acgtcttgac tttgacagag 300gaagtcttga gatttaacga ggaggtccag aaacagaagg tctcccgaaa ccgggattct 360ccagagggtg gatttgatgc ggtgctacag gcagcagtat gcgacgagaa gattggctgg 420agaaat 42权利要求
1.整合素αVβ3抗原，具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列。
2.编码权利要求1所述整合素αVβ3抗原的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于所述基因具有序列表中SEQ ID №2的DNA序列。
4.含有权利要求2或3所述的基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌。
5.一种表达整合素αVβ3抗原的方法，是将含有权利要求2或3所述整合素αVβ3抗原基因的重组表达载体导入宿主细胞，表达得到整合素αVβ3抗原。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于用于构建所述重组表达载体的出发载体为pGEX-4T-2、pET-3a、pET-30a、pET-28a、pET-28b或pET-28c；以pGEX-4T-2为出发载体，构建的含有所述整合素αVβ3抗原基因的重组表达载体为pGEX-αVβ3；所述宿主为E.coli BL21(DE3)、E.coli JM109、E.coli HB101或E.coli Top10。
7.与权利要求1所述整合素αVβ3抗原特异结合的抗体。
8.权利要求1所述的整合素αVβ3抗原在制备预防和/或治疗性肿瘤疫苗及药物中的应用。
9.权利要求2或3所述的整合素αVβ3抗原基因在制备预防和/或治疗性肿瘤DNA疫苗及药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述DNA疫苗中的整合素αVβ3抗原基因存在于真核表达载体中；所述携带有整合素αVβ3抗原基因的真核表达载体为pCI-αVβ3。
全文摘要
本发明公开了抗肿瘤整合素αVβ
文档编号A61K39/395GK1903875SQ200610089098
公开日2007年1月31日 申请日期2006年8月2日 优先权日2006年8月2日
发明者于继云, 阎瑾琦, 陈兴, 刘颖, 贾锐, 刘国栋, 王浩 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所