专利名称：一种天然纳米纤维基组织工程细胞支架的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种用于组织工程细胞培养用的天然纳米纤维基组织工程细胞支架的制备方法，特别涉及到所用纳米纤维为天然纳米蜘蛛丝纤维、天然纳米蚕丝纤维、天然纳米纤维素纤维、天然纳米甲壳素纤维以及天然纳米胶原纤维的组织工程细胞支架的制备，属于生物医学材料制备技术领域。
背景技术：
在已有纳米纤维基细胞支架的制备方法中，常采用的先是静电纺丝或湿法纺丝制备纳米纤维膜或纳米纤维丝，然后将纳米纤维膜处理成为细胞培养支架，或者将纳米纤维丝进行编织缝合成为三维结构，从而制备三维支架。
静电纺丝制备细胞支架的方法为首先制备高分子溶液，而后加入到一个带有毛细端的塑料管内，然后把一根与电源正高压相连的铜电极插到前驱体溶液中。塑料管的前方安装一个能够旋转的接地铁鼓，其上铺一层铝箔作为接收板。在喷头与接收板之间形成一个电场，从喷头喷出的高分子溶液在电场力作用下，在几秒内拉成直径大约30～400nm的纤维丝落到旋转的接收板上，从而可制备出高分子纳米纤维膜，作为细胞培养的支架，如在国内公开号为CN03137309.7的发明专利“利用电纺丝制备组织工程支架材料的方法及装置”公开了采用电纺丝技术制备组织工程支架材料。
湿法纺丝制备细胞支架的方法为将高分子纺丝原液加入到凝固液中凝固，形成高分子初丝纤维，而后经过第一拉伸浴与第二拉伸浴最终形成高分子微纳米纤维，将微纳米纤维进行编织缝合等工序形成三维结构，用以作为细胞支架，如在国内公开号为CN 1372023A的发明专利“一种组织工程用支架纤维及其制备方法”公开了采用丝素蛋白溶液湿法纺丝技术制备组织工程支架纤维，可通过后道加工制成三维支架。
静电纺丝与湿法纺丝方法工序复杂，能耗大，制备出的纳米纤维属再生纳米纤维。
发明内容
本发明的目的在于它针对具有多尺度(从宏观、微观至纳观等)分级结构的天然生物材料，克服现有的制备纳米纤维基组织工程细胞支架的缺点，提供一种极为简便、工序少、设备简单、能耗小、投入资金少、适合实验室研究制备和大规模工业生产的制备天然纳米纤维基组织工程细胞支架的方法。
本发明的目的是这样实现的一种天然纳米纤维基组织工程细胞支架的制备方法，该制备方法包括以下步骤(1)将天然生物材料完全浸泡在含有溶剂的容器中，开启一定频率一定功率的超声波装置，将超声波发射探头深入装载有天然生物材料溶液的容器中，进行超声波解离，从而制备得到天然纳米纤维；(2)将步骤(1)所得天然纳米纤维与一定天然高分子溶液混合，然后将混合溶液与一定交联剂进行交联形成凝胶，在室温静置，随后完全浸入甘氨酸水溶液中室温再次静置；(3)将步骤(2)制备的凝胶在一定温度下进行预冷冻一段时间，然后在冷冻干燥机中冷冻干燥一段时间，即得到天然纳米纤维基组织工程细胞支架。
由步骤(1)、步骤(2)与步骤(3)，从而可以方便且大规模地制备天然纳米纤维基组织工程细胞支架。
所述的天然生物材料具有以微原纤、原纤、纤维等不同尺度的分级结构，包括蜘蛛丝、家蚕丝、野蚕丝、羊毛、鱼鳞、竹纤维、骨胶原纤维、木纤维。
所述溶剂为弱酸、弱碱、纯水或超纯水中的任何一种或多种。
所述超声波装置是发射出超声波频率在10千赫兹～10兆赫兹，功率在100瓦特～2000瓦特的仪器设备；功率与频率越大，所需的超声波解离时间越短。
所述天然高分子为海藻酸、明胶、壳聚糖、糖蛋白、糖胺聚糖中的任何一种；天然纳米纤维的重量含量为天然高分子溶液的1％～60％。
所述交联剂为戊二醛、甲醛、碳二亚胺、葡萄糖二醛中的任何一种；交联剂的重量含量为混合溶液的0.1％～10％。
所述甘氨酸的含量为甘氨酸水溶液的0.1～10摩尔/升。
所述预冷冻温度为-20～-100℃，预冷冻时间为4～32小时。
所述的冷冻干燥设备，功率为100瓦特～5000瓦特；冷凝器温度为-20～-100℃。
所述冷冻干燥温度为-20～-100℃；冻干燥时间为4～120小时。
本发明的超声波解离是基于超声波的声空化效应，即集中声场能量并迅速释放的过程。足够强度的超声波通过液体时，在声波负压半周期如果声压幅值超过液体内部静压强，存在于液体中的微小气泡(空化核)就会迅速增大，在相继而来的声波正压周期中，气泡又绝热压缩而崩溃，在崩溃瞬间产生极短暂的强压力脉冲，气泡中间会产生接近5000K的高温，压力超过50MPa，气泡与液体的界面处温度可达2000K，持续几微秒后，该热点随之冷却(温度变化率达109K/s)，并伴有强烈的冲击波(对于均相液体媒质)和时速高达400km的射流(对于非均相媒质)，这就为天然纳米纤维的制备创造了一个极端的物理环境。因此，对于具有不同尺度、分级结构的天然生物材料，在声空化效应的作用下，不断解离，从宏观解离到微观，从微观解离到纳观，从而制备出纯天然的纳米纤维。声化学反应主要源于声空化——液体中空腔的形成、振荡、生长、收缩至崩溃及其引发的物理、化学变化。
本发明冷冻干燥是把含有大量水分物质，预先进行降温冻结成固体，然后在真空的条件下使水蒸汽直接升华出来，而物质本身剩留在冻结时的冰架中，因此它干燥后体积不变，可形成疏松多孔三维材料。冷冻干燥是在低温下进行，因此对于许多热敏性的物质特别适用，如蛋白质、微生物之类不会发生变性或失去生物活力；由于在冻结的状态下进行干燥，因此体积几乎不变，保持了原来的结构，不会发生浓缩现象；由于干燥在真空下进行，氧气极少，因此一些易氧化的物质得到了保护干燥，且能排除95％～99％以上的水份，使干燥后产品能长期保存而不致变质，它在生物医学上得到广泛地应用。
本发明天然纳米纤维与天然高分子溶液混合是基于增强细胞支架的强度，用以调控细胞支架的孔隙率，改善细胞的亲和性与支架的生物相容性。
本发明的优点(1)本发明工艺简单、能耗少、资金投入少、可操作性强、易于实施，并对环境友好，无污染；适合实验室研究制备和大规模工业生产。
(2)本发明适合面广，只要具有不同尺度分级结构的天然生物材料，均可采用本发明制备相应的天然纳米纤维基组织工程细胞支架；(3)本发明制备的天然纳米纤维直接从天然生物材料中解离而得，不是再生纳米纤维；(4)本发明的天然纳米纤维基组织工程细胞支架的形状与孔隙率及其强度具有可控制性，可通过超声波的频率与功率、冷冻干燥机的功率、天然纳米纤维的含量以及溶剂成分来实现。制备出的天然纳米纤维基组织工程细胞支架有着很好的承载强度、可调控的支架孔隙率、很好的生物相容性与细胞亲和性，在组织工程细胞培养上有着广泛的应用前景。
图1是一种本发明采用的超声波解离装置设备示意图。
图2是一种本发明采用的冷冻干燥设备示意图。
图3是本发明流程示意图。
图4是本发明实施例1制备的天然蜘蛛丝纳米纤维基组织工程细胞支架表面的扫描电镜照片。
图5是本发明本发明实施例3制备的天然蚕丝纤维基组织工程细胞支架表面的扫描电镜照片。
具体实施例方式
下面结合附图和实施例对本发明进行详细地说明。
图1是一种本发明采用的超声波解离装置设备示意图。(超声波细胞粉碎仪的照片，其型号为JY92-II型，生产厂家为宁波新芝生物科技有限公司)，其规格为频率20千赫兹，最大功率900瓦特。显然，实施例是为了说明本发明而不是限制本发明的，在本发明中还可以采用其他能产生符合要求的频率和功率的超声波发生设备。类似的此类设备还有超声波细胞粉碎机、超声波塑料焊接机、超声波打孔机、超声波纳米制备机、超声波振荡器、超声波匀浆机等具有超声波发生器和超声波振动系统(主要包括超声波换能器、超声波变幅杆和超声波探头)的超声波类装置。
图2是一种本发明采用的冷冻干燥设备的照片，其型号为LGJ-18型真空冷冻干燥机(生产厂家为湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)，其规格为功率为3500瓦特，冷凝器温度为-45℃。显然，实施例是为了说明本发明而不是限制本发明的，在本发明中还可以采用其他能冷冻干燥的符合温度与功率要求的冷冻干燥设备。类似的此类设备一般由致冷系统、真空系统、加热系统、和控制系统四个主要部分组成，在结构上由冻干箱或称干燥箱、冷凝器或水汽凝集器、冷冻机、真空泵和阀门、电气控制元件等组成。
实施例1采用如图1与图2所示的装置，按照图3的工艺制备天然蜘蛛丝纳米纤维基组织工程细胞支架天然纳米纤维将蜘蛛丝浸泡在装有超纯水的烧杯中；超声波的功率为600瓦特，频率为20千赫兹，将超声波发生器的探头深入到烧杯中，超声解离2.5个小时，制备出30～120纳米的天然蜘蛛丝纳米纤维，将重量含量为明胶溶液60％的天然纳米纤维与明胶溶液混合，加入重量含量为混合溶液的10％的戊二醛进行交联形成天然蜘蛛丝纳米纤维凝胶，在室温静置24个小时，随后放入10mol/升的甘氨酸水溶液中室温静置24小时，然后将甘氨酸反应后的凝胶在-20℃进行预冷冻4个小时，然后在冷冻干燥机中冷冻干燥4小时，冷冻干燥的功率为3500瓦特，冷凝器温度为-45℃，即可制备出天然蜘蛛丝纳米纤维基组织工程细胞支架，如图4所示。
实施例2采用如图1与图2所示的装置，按照图3的工艺制备天然甲壳素纳米纤维基组织工程细胞支架天然纳米纤维将天然甲壳素纤维浸泡在装有超纯水的烧杯中；超声波的功率为600瓦特，频率为20千赫兹，将超声波发生器的探头深入到烧杯中，超声解离2.5个小时，制备出30～120纳米的天然甲壳素纳米纤维，将重量含量为明胶溶液20％的天然纳米纤维与明胶溶液混合，加入重量含量为混合溶液的5％的甲醛进行交联形成天然甲壳素纳米纤维凝胶，在室温静置12小时，随后放入5mol/升的甘氨酸水溶液中室温静置12小时，然后将甘氨酸反应后的凝胶在-20℃进行预冷冻14个小时，然后在冷冻干燥机中冷冻干燥14小时，冷冻干燥的功率为3500瓦特，冷凝器温度为-85℃，即可制备出天然甲壳素纳米纤维基组织工程细胞支架。
实施例3采用如图1与图2所示的装置，按照图3的工艺制备天然蚕丝纳米纤维基组织工程细胞支架天然纳米纤维将自蚕茧上缫丝出的蚕丝浸泡在装有超纯水的烧杯中；超声波的功率为600瓦特，频率为20千赫兹，将超声波发生器的探头深入到烧杯中，超声空化1.5个小时，制备出30～120纳米的天然蚕丝纳米纤维，将重量含量为壳聚糖溶液10％的天然蚕丝纳米纤维与壳聚糖溶液混合，加入重量含量为混合溶液的2％的碳二亚胺进行交联形成天然蚕丝纳米纤维凝胶，在室温静置12小时，随后放入2mol/升的甘氨酸水溶液中室温静置1小时，然后将甘氨酸反应后的凝胶在-20℃进行预冷冻10个小时，然后在冷冻干燥机中冷冻干燥10小时，冷冻干燥的功率为3500瓦特，冷凝器温度为-85℃，即可制备出天然蚕丝纳米纤维基组织工程细胞支架，如图5所示。
实施例4采用如图1与图2所示的装置，按照图3的工艺制备天然胶原纳米纤维基组织工程细胞支架天然纳米纤维将处理后的鱼鳞浸泡在装有超纯水的烧杯中；超声波的功率为600瓦特，频率为20千赫兹，将超声波发生器的探头深入到烧杯中，超声空化3.5个小时，制备出30～120纳米的天然胶原纳米纤维，将重量含量为海藻酸溶液1％的天然胶原纳米纤维与海藻酸溶液混合，加入重量含量为混合溶液的0.1％的戊二醛进行交联形成天然胶原纳米纤维凝胶，在室温静置0.1小时，随后放入0.1mol/升的甘氨酸水溶液中室温静置0.1小时，然后将甘氨酸反应后的凝胶在-20℃进行预冷冻32个小时，然后在冷冻干燥机中冷冻干燥120小时，冷冻干燥的功率为3500瓦特，冷凝器温度为-100℃，即可制备出天然胶原纳米纤维基组织工程细胞支架。
实施例5采用如图1与图2所示的装置，按照图3的工艺制备天然纤维素纳米纤维基组织工程细胞支架天然纳米纤维将处理后的木纤维浸泡在装有超纯水的烧杯中；超声波的功率为600瓦特，频率为20千赫兹，将超声波发生器的探头深入到烧杯中，超声空化5.5个小时，制备出30～120纳米的天然纤维素纳米纤维，将重量含量为糖蛋白溶液1％的天然纤维素纳米纤维与糖蛋白溶液混合，加入重量含量为混合溶液的1％的葡萄糖二醛进行交联形成天然纤维素纳米纤维凝胶，在室温静置0.1小时，随后放入1mol/升的甘氨酸水溶液中室温静置1小时，然后将甘氨酸反应后的凝胶在-20℃进行预冷冻32个小时，然后在冷冻干燥机中冷冻干燥120小时，冷冻干燥的功率为3500瓦特，冷凝器温度为-20℃，即可制备出天然纤维素纳米纤维基组织工程细胞支架。
权利要求
1.一种天然纳米纤维基组织工程细胞支架的制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下步骤(1)将天然生物材料完全浸泡在含有溶剂的容器中，开启一定频率一定功率的超声波装置，将超声波发射探头深入装载有天然生物材料溶液的容器中，进行超声波解离，制备得到天然纳米纤维；(2)将步骤(1)所得天然纳米纤维与一定天然高分子溶液混合，然后将混合溶液与一定交联剂进行交联形成凝胶，在室温静置，随后完全浸入甘氨酸水溶液中室温再次静置；(3)将步骤(2)制备的凝胶在一定温度下进行预冷冻一段时间，然后在冷冻干燥机中冷冻干燥一段时间，即得到天然纳米纤维基组织工程细胞支架。
2.根据权利要求1所述的一种天然纳米纤维基组织工程细胞支架的制备方法，其特征在于，所述天然生物材料为蜘蛛丝、家蚕丝、野蚕丝、羊毛、鱼鳞、竹纤维、骨胶原纤维、甲壳质纤维、木纤维中的任何一种。
3.根据权利要求1所述的一种天然纳米纤维基组织工程细胞支架的制备方法，其特征在于，所述溶剂为弱酸、弱碱、纯水或超纯水中的任何一种或多种。
4.根据权利要求1所述的一种天然纳米纤维基组织工程细胞支架的制备方法，其特征在于，所述的超声波装置频率为10千赫兹～10兆赫兹，功率为10瓦特～2000瓦特。
5.根据权利要求1所述的一种天然纳米纤维基组织工程细胞支架的制备方法，其特征在于，所述天然高分子为海藻酸、明胶、壳聚糖、糖蛋白、糖胺聚糖中的任何一种。
6.根据权利要求1所述的一种天然纳米纤维基组织工程细胞支架的制备方法，其特征在于，所述天然纳米纤维的重量含量为天然高分子溶液的1％～60％。
7.根据权利要求1所述的一种天然纳米纤维基组织工程细胞支架的制备方法，其特征在于，所述交联剂为戊二醛、甲醛、碳二亚胺、葡萄糖二醛中的任何一种。
8.根据权利要求1所述的一种天然纳米纤维基组织工程细胞支架的制备方法，其特征在于，所述交联剂的重量含量为混合溶液的0.1％～10％。
9.根据权利要求1所述的一种天然纳米纤维基组织工程细胞支架的制备方法，其特征在于，所述甘氨酸水溶液甘氨酸的含量为甘氨酸水溶液的0.1～10摩尔/升。
10.根据权利要求1所述的一种天然纳米纤维基组织工程细胞支架的制备方法，其特征在于，所述预冷冻温度为-20～-100℃；预冷冻时间为4～32小时。
11.根据权利要求1所述的一种天然纳米纤维基组织工程细胞支架的制备方法，其特征在于，所述的冷冻干燥设备，功率为100瓦特～5000瓦特；冷凝器温度为-20～-100℃。
12.根据权利要求1所述的一种天然纳米纤维基组织工程细胞支架的制备方法，其特征在于，所述冷冻干燥温度为-20～-100℃，冻干燥时间为4～120小时。
全文摘要
一种天然纳米纤维基组织工程细胞支架的制备方法，涉及天然纳米蜘蛛丝纤维、天然纳米蚕丝纤维、天然纳米纤维素纤维、天然纳米甲壳素纤维以及天然纳米胶原纤维基组织工程细胞支架的制备，属于生物医学材料领域。天然生物材料浸泡在溶剂中，并通过超声波解离制得天然纳米纤维，与天然高分子溶液混合交联形成凝胶，预冷冻一段时间，然后在冷冻干燥机中冷冻干燥一段时间，即得到天然纳米纤维基组织工程细胞支架。制备出的天然纳米纤维基组织工程细胞支架有着很好的承载强度、可调控的支架孔隙率、很好的生物相容性与细胞亲和性，在组织工程细胞培养上有着广泛应用前景；本发明操作简便，工序少，能耗小，投入资金少，适合实验室研究制备和大规模工业生产。
文档编号A61L27/38GK1895684SQ200610089499
公开日2007年1月17日 申请日期2006年6月30日 优先权日2006年6月30日
发明者冯西桥, 赵红平 申请人:清华大学