专利名称：一种含基底膜结构的双层组织工程皮肤制备方法
技术领域：
本发明属于组织工程，具体涉及一种通过加入外源性层粘蛋白，促进双层组织工程皮肤的真表皮之间基底膜的形成方法。
背景技术：
基底膜是位于表皮与真皮之间的一条厚约0.5～1.0μm的重要结构，主要由IV型胶原、VII型胶原、巢蛋白、层粘蛋白等大分子构成，PAS染色显示紫红色均质带。基底膜具有许多重要生物学功能，最明显的功能是紧密连接表皮与真皮，为表皮和真皮提供有力的结合，避免生理条件下表皮分离；另一个显著作用是确定表皮的极性，提供表皮移行的屏障；此外，在保持皮肤的完整性和抗摩性能中起着不可替代的作用。
经过30年的努力，组织工程皮肤已经从开始的表皮片、真皮替代物，发展到具有双层结构的人工皮肤，较之原先简单的封闭创面，恢复皮肤缺损区的屏障功能，已经向主动促进创面愈合发展。但表真皮易于分离是目前双层组织工程皮肤的重要缺陷，其根本原因就是因为表真皮间没有构建完整的基底膜。部分研究显示，目前组织工程皮肤最多能形成断续的基底膜，且这种断续的基底膜发育不成熟，不能提供足够的结合力，造成表真皮间易于分离。
目前，有关基底膜的形成机理还不是很清楚，且研究极少；但影响基底膜力学性能的因素，从目前来看主要是半桥粒的数量、锚丝的多寡等，而真表皮间大量的半桥粒的形成，就能够为基底膜的最终构建提供核心支架。因此，在组织工程皮肤研究中，为提高组织工程皮肤的性能，提高表真皮间的连接稳定性，防止表皮部分轻易从真皮部分分离，就必须在体外培养系统中构建完整的基底膜结构。
现有技术中，有一件公开号为CN1795922A的中国发明专利申请于2006年7月5日公开，它是“皮肤基底膜形成促成剂、人工皮肤形成促成剂和人工皮肤的制造方法”，该方法将多种植物提取纯化获得基质金属蛋白酶抑制剂和基质蛋白合成剂，主要是提供了一种皮肤基底膜保持稳定的新型方式，虽然也向人工皮肤中添加该物质来促进基底膜的形成。但是该方法所涉及的物质来自多种植物提取物，植物的种类多达32种，成分复杂，其目的主要是用于化妆品行业，促进基底膜稳定，促进皮肤活化，防止皮肤老化。而组织工程皮肤的研究标准高，成分清楚，无毒无害，因此，该方法对用于组织工程皮肤的基底膜构建并不适用。经捡索，有关含基底膜结构的双层组织工程皮肤制备方法，至今尚未见有技术文献公开。
发明内容
本发明的目的就在于针对现有技术存在的空白，提供一种含基底膜结构的双层组织工程皮肤制备方法，使之能提高组织工程皮肤表皮与真皮间的紧密连接性能，防止表真皮在操作应用中易于分离，确保人工皮肤产品的稳定性好、同质性好。
本发明方法的总体构思是利用我们原有的复方壳多糖组织工程皮肤技术平台，通过调节培养基的钙浓度影响角质形成细胞与成纤维细胞的相互作用，加入外源性层粘蛋白促进基底膜的形成，从而达到提高组织工程皮肤产品性能的显著效果。
为实现本发明方法的总体构思和发明目的，所采取的技术方案如下。
一种含基底膜结构的双层组织工程皮肤制备方法，它由组织工程皮肤培养基配制、凝胶溶液制备、孵箱培养和筛网支架培养四步过程组成。
一)组织工程皮肤培养基配制在DMEM培养基中加入浓度为6M的氯化钙溶液，调节钙离子浓度至0.30～2.15mM；再加入浓度为200μg/ml的层粘蛋白溶液，调节层粘蛋白浓度至1～100μg/ml。
二)凝胶溶液制备将醋酸胶原、壳多糖、透明质酸和弹性蛋白按16∶2∶1∶1的重量份配比混匀，然后用1N氢氧化钠调节pH值至7.2～7.4。
三)孵箱培养在制备的凝胶溶液中加入成纤维细胞(1～100)×105/20ml，混匀；吸入培养皿中，静置15分钟，再轻轻加入角质形成细胞混悬液，(1～100)×105/20ml凝胶，最后再加入配制的组织工程皮肤培养基8ml，置37℃、5％CO2/95％空气、90％以上湿度孵箱内培养，每天更换培养基一次，8ml/次，至少培养3天。
四)筛网支架培养将孵箱培养的组织工程皮肤移行至≥3mm高的不锈钢筛网支架上，使组织工程皮肤的表面暴露于空气中，进行气-液界面培养；每日观察培养物的外观、透光度、表皮细胞生长情况，15天后结束培养，获得成熟的含基底膜结构的双层组织工程皮肤产品；置于液氮中保存，备用。
在本发明的双层组织工程皮肤基底膜构建方法中，所用原辅材料人源皮肤角质形成细胞、人源皮肤成纤维细胞、胶原、壳多糖、透明质酸、弹性蛋白、DMEM培养基、氯化钙和层粘蛋白等，均应符合无菌要求。
本发明的双层组织工程皮肤基底膜构建方法，系采用调节培养基中钙浓度和添加外源性层粘蛋白，来促进真表皮间基底膜结构形成的设计理念，，使组织工程皮肤表皮与真皮间的连接得以增强，对维持表真皮的完整性起了重要作用。本发明方法具有以下优点一是方法简便，所有材料均为液体形式，便于产品的合成和生产线操作；二是所采用的任何材料均具有良好的生物安全性和生物相容性，对于移植个体不会产生危害；三是获得的产品便于临床操作，表皮不易分离；四是产品的一致性和同质性好。
四
以下为本发明方法制备的含基底膜结构复方壳多糖组织工程皮肤产品各种染色显示图片。
图1是含基底膜结构复方壳多糖组织工程皮肤H.E.染色显示由分化良好的表皮与其下的真皮组成(H.E.染色×200)；图2是含基底膜结构复方壳多糖组织工程皮肤PAS染色显示基底膜为表真皮间连续的紫红色带状结构(PAS染色×200)；图3是含基底膜结构复方壳多糖组织工程皮肤表真皮间IV型胶原免疫组织化学染色显示单抗阳性反应(IV型胶原免疫组织化学染色×200)；图4是含基底膜结构复方壳多糖组织工程皮肤层粘蛋白免疫组织化学染色显示多抗阳性反应(层粘蛋白免疫组织化学染色×200)。
五具体实施例方式
下面是含基底膜结构复方壳多糖组织工程皮肤的一个制备实例，但本发明方法绝不局限于所举的制备实例。
首先在DMEM培养基中加入浓度为6M的氯化钙溶液，调节钙离子浓度至1.85mM，再加入浓度为200μg/ml的层粘蛋白溶液，调节层粘蛋白浓度至20μg/ml，配制获得组织工程皮肤培养基；将醋酸胶原、壳多糖、透明质酸和弹性蛋白按16∶2∶1∶1的重量份配比混匀，用1N氢氧化钠调节凝胶溶液pH值至7.2，制备凝胶溶液20ml；在凝胶溶液中加入成纤维细胞1×106，混匀；吸入培养皿中，15分钟后，轻轻加入角质形成细胞混悬液1×106，最后再加入配制的组织工程皮肤培养基8ml，置37℃、5％CO2/95％空气、90％以上湿度孵箱内培养，每天换液，8ml/次；培养3天后，用≥3mm高的不锈钢筛网支架进行行气-液界面培养；每日观察培养物的外观、透光度、表皮细胞生长情况，15天后结束体外培养，获得成熟的含有基底膜结构的复方壳多糖组织工程皮肤产品；置于液氮中保存，备用。
将按上述方法制备的成熟含基底膜结构复方壳多糖组织工程皮肤置于中性福尔马林溶液中固定(样品与固定液的体积比为1∶5)，固定24h后，依次进行脱水、透明、浸蜡、包埋、铺片、烤片，然后分别进行组织学检查，包括H.E.染色、PAS染色和免疫组织化学染色。通过各种染色显示的显微放大照片(见图1、图2、图3和图4)，可以说明采用本发明方法制备的含基底膜结构复方壳多糖组织工程皮肤，表皮与真皮间的连接紧密，产品的一致性和同质性好。
权利要求
1.一种含基底膜结构的双层组织工程皮肤制备方法，其特征在于1)它由组织工程皮肤培养基配制、凝胶溶液制备、孵箱培养和筛网支架培养四步过程组成；2)组织工程皮肤培养基配制是在DMEM培养基中加入浓度为6M的氯化钙溶液，调节钙离子浓度至0.30～2.15mM；再加入浓度为200μg/ml的层粘蛋白溶液，调节层粘蛋白浓度至1～100μg/ml；3)凝胶溶液制备是将醋酸胶原、壳多糖、透明质酸和弹性蛋白按16∶2∶1∶1的重量份配比混匀，然后用1N氢氧化钠调节pH值至7.2～7.4；4)孵箱培养是在制备的凝胶溶液中加入成纤维细胞(1～100)×105/20ml，混匀；吸入培养皿中，静置15分钟，再轻轻加入角质形成细胞混悬液，(1～100)×105/20ml凝胶，最后再加入配制的组织工程皮肤培养基8ml，置37℃、5％CO2/95％空气、90％以上湿度孵箱内培养，每天更换培养基一次，8ml/次，至少培养3天；5)筛网支架培养是将孵箱培养的组织工程皮肤移行至≥3mm高的不锈钢筛网支架上，使组织工程皮肤的表面暴露于空气中，进行气-液界面培养；每日观察培养物的外观、透光度、表皮细胞生长情况，15天后结束培养，获得成熟的含基底膜结构的双层组织工程皮肤产品。
全文摘要
一种含基底膜结构的双层组织工程皮肤制备方法，它由组织工程皮肤培养基配制、凝胶溶液制备、孵箱培养和筛网支架培养四步过程组成；系采用调节培养基中钙浓度和添加外源性层粘蛋白，来促进真表皮间基底膜结构形成的设计理念，使组织工程皮肤表皮与真皮间的连接得以增强，对维持表真皮的完整性起了重要作用。它具有以下优点一是方法简便，所有材料均为液体形式，便于产品的合成和生产线操作；二是所采用的任何材料均具有良好的生物安全性和生物相容性，对于移植个体不会产生危害；三是获得的产品便于临床操作，表皮不易分离；四是产品的一致性和同质性好。
文档编号A61L27/60GK1923301SQ20061009512
公开日2007年3月7日 申请日期2006年9月14日 优先权日2006年9月14日
发明者伍津津, 鲁元刚, 雷霞 申请人:中国人民解放军第三军医大学第三附属医院