专利名称：甘露聚糖－结合型凝集素(mbl)在免疫受损个体的治疗中的新意义的制作方法
技术领域：
本发明涉及甘露聚糖结合型凝集素(MBL)的亚单位和寡聚物在免疫受损个体的预防和/或治愈性治疗中的应用。
背景技术：
已知人体中有多组凝集素，即碳水化合物结合蛋白。其中一组是C型凝集素。C型凝集素包含钙依赖性碳水化合物识别结构域(C-型CRD)1。甘露聚糖结合型凝集素(MBL)(甘露糖结合型凝集素的同义词)、甘露聚糖结合蛋白或甘露糖结合蛋白(MBP)属于C型凝集素中称为胶原凝集素(collectin)的亚组，因为这些可溶性蛋白由能提呈附着于胶原性质的茎上的三个CRD的亚单位组成2。MBL与广泛多种微生物所提呈的碳水化合物相互作用，越来越多的证据表明，其在先天性免疫防御中起重要作用3。MBL当与碳水化合物结合后能活化补体系统。
补体系统可通过三种不同途径来激活经典途径、旁路途径、以及新描述的第三途径，甘露聚糖结合型凝集素(MBL)途径，该途径因MBL与微生物所提呈的碳水化合物的结合而启动。旁路途径的成分和MBL途径的成分都属于先天性免疫防御，也称为天然或非克隆化免疫防御的一部分，而经典途径则涉及与具有特异性免疫防御作用的抗体的合作4。
人MBL蛋白由18条相同的32kDa多肽链组成27，每条多肽链包含一个只有21个氨基酸的N-末端短片段，该片段包括三个半胱氨酸残基，紧接着是胶原蛋白基元Gly-X-Y的7个重复单位，其被一个Gln残基打断，后随另外12个Gly-X-Y重复。一个含有34个残基的“颈部区”将93个氨基酸的C末端钙依赖性凝集素结构域与该分子的胶原部分相连28。
三条多肽链的胶原区组合成一个经二硫键稳定地共价连接的亚单位。各个亚单位之间通过二硫键以及通过非共价相互作用而相连27。
但这些二硫键的位置尚未完全阐明。MBL的非还原SDS-PAGE显示出表观分子量(m.w.)大于200kDa的带，它们可能是3、4、5和甚至6个亚单位聚集成的大块。
天然人MBL蛋白中亚单位的真实数目尚有争论。Lipscombe等(1995)利用超速离心获得的数据提示，25％的人血清MBL由2-3个亚单位组成，仅有很少一部分达到6个亚单位的大小。离子交换层析所得级分经SDS-PAGE分析、Western印迹、然后利用化学发光的鲁米诺进行密度测定而获得相对定量，结果显示，大多数共价连接的MBL亚单位链由三聚体组成，但仅有五聚体或六聚体复合物能激活补体。相反，凝胶渗透层析(GPC)显示，MBL的大小与C1复合物相当。可在允许研究MBL分子的形成中蛋白质-蛋白质弱相互作用的重要性的条件下进行GPC。GPC级分中MBL的含量可通过标准的MBL分析技术测定。
MBL由肝细胞在肝脏中合成并分泌至血液。它结合细菌、酵母、寄生性原虫以及病毒表面的碳水化合物结构，可通过活化最终的裂解性补体成分或通过促进吞噬作用(调理作用)而杀死微生物，因此具有抗细菌活性。MBL的sertiform结构与C1q(经典途径中第一个成分的免疫球蛋白结合亚成分)的花束样结构十分相似3。C1q与两种丝氨酸蛋白酶C1r和C1s结合，形成C1复合物。类似地，MBL与两种丝氨酸蛋白酶MASP-15和MASP-26，以及另一种称为Map 19的蛋白7结合。MASP-1和MASP-2具有与C1r和C1s相同的分子结构6。MBL与碳水化合物的结合诱导MASP-1和MASP-2的活化，然后MASP-2裂解C4和C2产生C3转化酶C4b2b。有报道说，MASP-1可直接活化C3。目前对MBL/MASP复合物的化学计量以及活化顺序一无所知。在其它动物如啮齿类、牛(cattle)、小鸡和猴子中也鉴定出了MBL。
人血清中的MBL浓度主要通过基因测定，但据报道在急性期反应期间升高最多三倍8。三种导致结构改变的突变以及两种在启动子区域中的突变均与MBL缺陷相关9。MBL缺陷与对各种感染的易感性相关。对五例成人的罕见重症感染的检查显示，其中三例为MBL结构突变的纯合子，两例为杂合子10。由丹麦国家医院(Danish National Hospital)对229例儿童进行的非HIV相关免疫缺陷的调查显示，MBL结构性突变的等位基因中出现纯合子的频率比对照组所见高10倍以上11。伦敦St Mary’s医院的617位相继住院的儿童的异型分析(allotyping)显示，感染儿童群与未感染儿童群相比，突变的同种异型纯合子和杂合子的出现频率显著较高12。
有较宽范围的寡糖可与MBL结合。由于目标糖通常并不以高密度暴露于哺乳动物细胞表面，因此MBL通常不识别自身决定簇，但特别适于与提呈重复的糖类决定簇的微生物细胞表面发生相互作用。在体外，酵母(白色念珠菌(Candida albicans)和新形隐球菌(Cryptococcus neoformans))、病毒(HIV-1，HIV-2，HSV-2，及各类甲型流感病毒(influenza A))和多种细菌已显示能被MBL识别。在一些细菌的例子中，与MBL的结合因荚膜的存在而受损13。但是，即使是有荚膜的细菌(脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitisdis))也显示与MBL的强有力结合14。
感染MBL缺陷型个体的微生物可来自多种不同的细菌、病毒和真菌物种12，15-17。缺陷还与习惯性流产有关18。事实上，MBL可作为针对绝大多数细菌的广谱防御分子，并因此被认为是如此多的细菌不能致病的一个原因。
虽然越来越多的信息提请人们注意MBL的保护作用，但也有发现提示，在MBL完善的个体中比在MBL缺陷的个体中，某些微生物，特别是胞内病原体的感染出现的频率更高19，20。这与一项动物实验的结果一致，在该实验中，小鼠肝脏在注射人的MBL之前HSV-2的数量增加21。
已能从供血者血浆中获得临床级MBL，它们可安全用于输注22。也能产生具有与天然MBL相似的结构和活性的重组MBL(专利申请PA 199900668/C5/KH)。
发明简述本发明涉及MBL在预防和/或治疗感染中的应用，所述MBL可从天然来源纯化，或从经重组技术产生的，或通过任何其它适当的MBL产生型细胞产生的物质中纯化。所述情况可能与一种治疗性或医疗性处理，如细胞毒性治疗有关。MBL可在开始所述处理之前或之后给与，并可持续任何被认为适当的时间。
本发明还涉及对具有正常MBL水平的个体进行处理，因为这些个体很可能-在任何细胞毒性处理之前-因MBL给药而受益。
相应地，本发明一个方面涉及对免疫受损个体的感染进行的治疗和/或预防，或涉及对由于接受了已知与免疫受损情况的发生有关的治疗而很可能出现这类病症的个体进行的治疗。所述治疗的实例如化疗和放疗如X-线处理。
化疗和放疗被作为数种癌症的治疗的一部分，它们旨在减缓疾病的进展或通过治愈性治疗而逆转这种进展。化疗和放疗都是损害免疫的，因为免疫系统的细胞被杀死，因而导致一种免疫抑制状态，其尤以嗜中性粒细胞缺少症为特征。
据信MBL主要通过其调理活性(使微生物做好被吞噬的准备)来发挥其抗微生物活性。该活性依赖于MBL结合至微生物表面后的补体活化以及C4b和C3b在该微生物表面的沉积。MBL还可促进直接由补体介导的对微生物的杀伤作用，其通过激活补体的最终裂解途径并将膜攻击复合物(MAC)插入细胞膜中而实现。该机制被认为重要性不大。多种微生物，如肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)等革兰氏阳性细菌均对MAC有抗性，但可通过调理吞噬而被裂解。当将调理吞噬作用作为MBL介导的微生物清除作用的主要效应机制时，惊奇地发现MBL处理对缺陷最重要的吞噬细胞，即嗜中性粒细胞的人有利。
在近30年前就已经认识到了嗜中性粒细胞缺乏症在接受细胞毒性化疗的癌症患者之严重感染危险性中的重要性。感染因此非常频繁地出现在接受化疗和其它免疫受损性干预治疗的血液癌症患者和其它癌症患者中。随着化疗的越来越强化应用，感染的问题增加，并且现已成为支持疗法中的主要难题24。相应地，所有血液学和癌症学部门都利用多种资源与感染作斗争。由于多重耐药的细菌菌株的出现，这种斗争不断变得越来越难。
在免疫受损期间或之后缺乏免疫系统中重要的细胞成分的人都依赖于一种有效的先天性体液免疫系统如补体系统，如在嗜中性粒细胞缺乏的情况中。目前尚无足够精确且可信的预后因素能预测接受化疗、放疗、或其它免疫损伤治疗的个体中严重感染的增加的危险性24。
相应地，因医疗处理而出现的免疫受损很可能使相应个体对感染高度易感。根据本发明，有可能在已知能导致免疫受损状况的处理之前或期间对处在所述免疫受损状况下的个体进行预防感染的处理。通过在已知能导致所述状况的处理之前或期间用MBL进行预防性处理，可预防随后的感染或减小该个体因免疫受损而对感染的易感性。如果该个体由于，例如，导致免疫受损状况的处理而发生感染，也可通过给与该个体以本发明的MBL组合物而治疗所述感染。
本发明还涉及通过输注MBL而治疗所述缺陷。此外，本发明还涉及MBL血浆浓度在预测接受诸如化疗的个体对感染的易感性中的用途。
本发明另一方面涉及含有至少一种甘露聚糖结合型凝集素(MBL)亚单位，或至少一种寡聚体(其含至少一种甘露聚糖结合型凝集素(MBL)亚单位)的组合物在制备用于预防、缓解或治愈性治疗血浆MBL水平超过50ng/ml的个体中感染的药物中的应用。尤其所述个体可能具有能导致增加对感染的易感性的先天性MBL缺陷或后天获得的MBL缺陷。相应地，本发明还涉及对甘露聚糖结合型凝集素(MBL)缺陷(包括MBL的产生和/或功能方面的任何缺陷)个体中的感染的治疗。
本发明另一方面提供了一种评估正接受化疗或任何其它形式免疫损伤性治疗的患者体内任何临床显著感染发生的可能性的方法，所述方法包括测定得自该患者血浆或血清中的MBL浓度，并根据所测浓度评估所述可能性的步骤。
在本文中，免疫受损是指其原有含义，即一个个体由于正常免疫防御系统的一或多个要素中的原发性或继发性缺陷(诱导型或非诱导型)而不能激发足够的免疫应答。
本发明包括一种组合物在制备预防和/或治疗下述个体之感染所用药物中的应用，所述组合物含有至少一种甘露聚糖结合型凝集素(MBL)亚单位，或至少一种甘露聚糖结合型凝集素(MBL)寡聚体，该寡聚体含有至少一种甘露聚糖结合型凝集素(MBL)亚单位，所述个体分为a)有免疫受损状态的个体；和/或b)具有因医疗处理而获得免疫受损状态的危险的个体；和/或c)血清MBL水平高于50ng/ml血清的个体。
本发明还包括上述的应用，其中所述具有因医疗处理而获得免疫受损状态的危险的个体，其血清MBL水平高于50ng/ml血清。
发明详述迄今为止，MBL已用于治疗MBL缺陷，所述缺陷被限定为低于50ng/ml，或更经常是低于10ng/ml血清的任意水平，所述界值水平通常与各种MBL检测试验的敏感性水平一致，因此将该水平设定为基本上不能被现有技术中的各种试验检测到的MBL水平。
本发明显示，可在不关免疫受损个体的血清MBL水平的情况下对所述个体中的感染进行预防和/或处理。尤其当在MBL水平超过50ng/ml血清的免疫受损个体中给与MBL时，可阻止这些个体中的感染。此外，MBL水平超过75ng/ml血清的个体可能需要治疗，如MBL水平超过100ng/ml血清的个体，以及MBL水平超过150ng/ml血清的个体。
还可通过将MBL与相关抗生素、抗病毒试剂或抗真菌试剂联合给与这些个体，而用MBL治疗感染。
具体地，处在因接受医疗处理而导致免疫受损状态的危险中的个体将从所述治疗之前、期间、以及可能还有之后的MBL预防性处理中受益，从而防止与免疫受损状态相关的疾病，如感染。
一般情况下，已经免疫受损或处在免疫受损的危险中的所有个体应在不考虑他们的特异性MBL水平的情况下用MBL进行治疗。这样做的原因是，感染可能导致MBL耗竭，因此能提高MBL水平的MBL“激发剂(booster)”将减小MBL耗竭至缺陷水平以下的危险，而这些患者的免疫防御能力可通过给与重组型或天然血浆衍生型MBL而得到加强。尤其是，向MBL水平超过50ng/ml血清的个体给与MBL可防止感染。此外，MBL水平超过75ng/ml血清的个体可能需要治疗，如MBL水平超过100ng/ml血清的个体，以及MBL水平超过150ng/ml血清的个体。
本发明人还在本文中指出，MBL水平超过500ng/ml血清的个体的免疫受损状态尤其能从MBL治疗中受益。因此，MBL水平超过400ng/ml血清的个体尤其能受益，如MBL水平超过300ng/ml血清的个体，MBL水平超过250ng/ml血清的个体，MBL水平超过200ng/ml血清的个体。
故，本发明的一个优选实施方案涉及MBL在药物制备中的应用，所述药物用于在血清MBL水平处于50-500ng/ml范围内(如在100-500ng/ml范围内)的个体中治疗和/或预防感染，尤其与该个体的免疫受损状态有关的感染。
所述免疫受损状态可能归因于上述医疗处理，即化疗或其它免疫抑制性治疗，如由类固醇、环磷酰胺、硫唑嘌呤、氨甲蝶呤(metotrexate)、环孢菌素、和/或雷帕霉素(rapamycin)的治疗引起的那些，尤其与癌症治疗相关的那些。
免疫受损状态还可能归因于获得性免疫缺陷，如AIDS，或白血病，尤其嗜中性粒细胞缺乏症或其它继发性免疫缺陷。
此外，MBL水平高于50ng/ml且低于500ng/m的个体将总体上从MBL治疗中受益，从而防止感染，尤其慢性感染。
其中一组需要MBL治疗以便防止和/或治疗感染的个体是不管MBL水平本身如何但功能性MBL水平较低的个体。这是由于，对某些MBL突变而言，已发现尽管血清中表达了MBL亚单位及其寡聚体，但它们的功能较低。MBL的功能或功能性活性可通过其形成MBL/MASP复合物，从而导致补体系统活化的能力来评估。当C4被MBL/MASP裂解后，暴露出一个活性硫羟基酯，而C4则共价附着至邻近的亲核基团。C4b的绝大部分因此而附着至已包被的塑料孔中，可用抗C4抗体检测。
MBL功能性活性的定量TRIFMA可如下进行1)用1mg甘露聚糖的100ml缓冲液包被微滴板上的孔；2)用吐温20封闭；3)加入待检样品，如稀释的MBL制剂；4)加入MBL缺陷型血清(这导致形成MBL/MASP复合物)；或可先将MBL与MBL缺陷型血清混合，然后加入微滴板的孔中；5)加入5mg/ml纯化的补体因子C4；6)37℃保温1小时；7)加入Eu标记的抗C4抗体；8)加入增强(enhancement)液；9)利用时间分辨型荧光测定法(timeresolved fluorometry)读取Eu。除了步骤8和9以外，各步骤之间，都将所述平板室温保温并洗涤。
基于ELISA的评估可类似地进行，如在步骤7)中加入生物素标记的抗C4；8)加入碱性磷酸酶标记的亲和素；9)加入底物；和10)读取色度。
功能性可表示为MBL的比活性，如1个单位的MBL活性/ng MBL。非功能性MBL可限定为比活性小于血浆比活性的50％，如小于血浆比活性的25％，其中血浆MBL比活性是从不含任何MBL突变的个体中纯化得到的。具体地，血浆MBL基准为血浆库LJ 6.5728/04/97。
故，本发明还涉及对个体中感染的防止和/或治疗，所述个体在他们的MBL基因中带有一个突变，其导致MBL的表达减少和/或非功能性MBL的表达。
特别是，MBL基因中的所述突变可导致第52位(此编号包括MBL的先导肽)的氨基酸从精氨酸变为半胱氨酸，第54位的氨基酸从甘氨酸变为天冬氨酸或第75位的氨基酸从甘氨酸变为谷氨酸。
MBL基因的启动子区中的突变还可导致MBL水平降低。尤其-位和-221位的突变对MBL的表达有影响。
MBL序列可在swiss.prot中找到，录入号为11226。
用于制备MBL药物的MBL组合物可从现有的任何MBL源产生。MBL源可以是天然MBL，其中MBL均产生于天然宿主生物中，即MBL由通常表达MBL的细胞产生。产生MBL组合物的一个常规方法是，从人类体液，如血液或血浆中提取MBL，但也可从肝细胞培养物中收获MBL。
另一方面，MBL寡聚体可由天然状态下不表达MBL多肽的宿主生物，通过诸如重组技术而产生。
在第一个实施方案中，MBL源可以是血清，从中可通过纯化血清、血浆、乳产物、初乳等等而获得MBL组合物，所述纯化利用适当的纯化方法，如利用了碳水化合物衍生的基质(如甘露糖或甘露聚糖偶联型基质)的亲和层析。WO99/64453公开了这样一种方法，其中在纯化步骤之后，是除去病毒以除去来自MBL源的感染因子的步骤，因为从体液纯化的蛋白质的主要问题之一就是在引入所需蛋白的同时导入感染因子的危险。WO99/64453已全文引入作为参考。
用于制备MBL药物的MBL组合物优选含有MBL寡聚体，其中所述寡聚体具有与血清中MBL的大小分配基本上相同的大小分配，如与血清中MBL的大小分布谱至少50％相同的大小分布谱。相同，指至少50％的寡聚体具有高于200kDa的表观分子量(当用SDS-PAGE和/或Western印迹进行分析时)。
在一个更优选的实施方案中，所述大小分布谱与血清MBL的大小分布谱至少75％相同，如与血清MBL的大小分布谱至少90％相同，更优选与血清MBL的大小分布谱至少95％相同。
当从原本具有另一种大小分布谱的MBL源进行纯化时，优选使得用于从所述MBL源进行纯化的亲和层析有利于纯化表观分子量高于200kDa的寡聚体。这可通过利用对MBL亚单位和/或二聚体基本不具有亲和力的碳水化合物衍生化基质来实现。优选所述碳水化合物基质基本上仅对重组MBL四聚体、五聚体和/或六聚体具有亲和力。
所述基质可用任何碳水化合物或碳水化合物混合物来衍化，所述化合物或混合物可与MBL结合，并优选与MBL的较高级寡聚体结合。所述碳水化合物衍生的基质优选为己糖衍生的基质，如甘露糖-或N-乙酰葡糖胺衍生的基质，如最优选甘露糖衍生的基质。
碳水化合物衍生的基质的选择性可通过确保该基质本身，即未衍生的基质基本上对MBL多肽不具备亲和力，尤其对MBL三聚体或更小的寡聚体不具有亲和力来获得。当基质本身不含碳水化合物时可确保这一点。尤其所述基质应该不含任何Sepharose或类似物。优选，基质由含有非碳水化合物的聚合物，如FractogelTSK珠组成。
所述基质可以是适于层析的任何形式，优选为珠子，如塑料珠子。
将所述MBL源上样至层析柱后，洗柱，优选用非变性缓冲液洗柱，该缓冲液所具有的组成、pH以及离子强度导致消除蛋白质但不洗脱较高级的MBL寡聚体。如缓冲液可以是TBS。MBL的洗脱用能有效洗脱较高级MBL寡聚体的选择性脱附剂，如含有EDTA(例如5mM EDTA)或甘露糖(例如50mM甘露糖)等脱附剂的TBS进行，然后收集MBL寡聚体。这种纯化方法已在与本申请同一天提交的题为“重组人甘露聚糖结合型凝集素”的共同未决之国际专利申请中描述。
在一个优选的方面，临床级MBL组合物可利用重组技术所产生的MBL源来获得，其中所述MBL源为MBL产生细胞的培养物。
因此，本发明包含用产生重组甘露聚糖结合型凝集素(MBL)的方法产生的MBL，所述方法包括以下步骤-制备基因表达构建体，其含有编码MBL多肽或其功能等效物的DNA，-用所述构建体转化宿主细胞培养物，-培养所述宿主细胞培养物，从而表达所述多肽并将其分泌至培养基中，然后-获得含有人重组MBL的培养基。
含有人重组MBL多肽的培养基可然后如上文关于MBL纯化所述进行处理。
所述MBL多肽优选为哺乳动物MBL多肽，如更优选人的MBL多肽。所述基因表达构建体可通过本领域已知的传统方法产生，如美国专利5,270,199所述的方法。
在另一个实施方案中，所述基因表达构建体如丹麦专利申请PA 199900668或与本申请同一天提交的题为“重组人甘露聚糖结合型凝集素”的共同未决之国际专利申请中所述而制备。
表达优选在诸如哺乳动物细胞中进行，本发明的制剂通过应用含有MBL基因的内含子序列以及至少一个外显子序列的表达载体而获得。本文中，将转基因动物作为表达系统，这种动物已经被遗传修饰，因而包含并能表达人MBL基因或其片段或其类似物。
除了纯化方法，优选所述基因表达构建体和宿主细胞也有利于较高级寡聚体的产生，所述产生可利用下述基因表达构建体实现，所述构建体含有来自人MBL基因或其功能等效物，哺乳动物细胞以及昆虫细胞的至少一种内含子序列。
尤其MBL组合物可用于治疗和/或预防个体中与免疫受损状态相关的感染。任何微生物感染，即由一个微生物物种引起的任何感染均可用MBL进行治疗和/或预防。
因此，MBL组合物可用于预防和/或治疗免疫受损个体中由真菌、酵母、原生动物和/或细菌这些微生物物种引起的感染。
MBL组合物还可用于治疗由抗常规药物的微生物物种所致的感染，如由能抗至少一种抗生素的细菌物种引起的感染。更重要的是，对多重耐药的细菌物种所致感染的预防和/或治疗。
所述免疫受损个体可能患有由病原性细菌物种，如肺炎链球菌、沙门氏菌(Salmonelle)和葡萄球菌物种引起的感染。
但目前已知，特别是免疫受损的个体还常常患有由通常的非致病性细菌物种，即条件致病菌，如大肠埃希氏菌引起的感染，这些物种中有很多对常规抗生素治疗有抗性。
与免疫受损状态有关的感染还可以是病毒感染，如逆转录病毒的感染。
免疫受损状态还可以是人类免疫缺陷病毒(HIV)这种逆转录病毒的感染。但根据本发明所治疗和/或预防的病毒感染通常并非由逆转录病毒引起，而可能由诸如DNA病毒引起。
可利用亲和层析等的洗脱物来制药。但优选在使用前进一步纯化该洗脱物。
除了MBL寡聚体，所述药物还可包含可药用的载体物质和/或赋形剂。尤其，可加入稳定剂以稳定MBL蛋白。稳定剂可以是糖醇，糖类，蛋白和/或氨基酸。稳定剂的实例如麦芽糖或白蛋白。
可根据诸如给药形式在药物中添加其它常规的添加剂。在一个实施方案中，所述药物为适于注射的形式。可使用常规载体物质，如等渗盐水。
在另一实施方案中，所述药物为适于经肺给药的形式，如可吸入的粉末或可局部应用的乳膏(crème)或流体。
给药途径可以是任何适当的途径，如静脉内、肌肉内、皮下、或皮内。本发明还考虑了经肺给药或局部给药。
MBL组合物给药还可与另一治疗同时、顺次、或分开进行，所述另一治疗为导致该个体免疫受损的治疗，如化疗。可在化疗或其它治疗开始前的一段时间内，以及在化疗开始后的至少一段时间内给与所述药物。
MBL组合物给药采用适当的剂量方案，优选以适当间隔重复给药，如一周1或2次，始于化疗开始前并按一定的间隔维持(如每周1次)，直至至少化疗全程的其中一部分时间段，优选维持化疗全程。
通常根据接受治疗的个体每剂给药1-100mg，如2-10mg，最优选给与5-10mg/剂，例如给与约0.1mg/kg体重。
MBL组合物还可以以试剂盒中的药物之一的形式使用，该试剂盒中可含有另一种药物，如抗真菌、抗酵母、抗细菌和/或抗病毒的药物。
抗病毒药物可以是能使病毒减毒和/或彻底消灭的药物。
本发明还涉及利用对MBL水平的测量作为个体发生感染的危险性的预示指标，并因此指示是否需要治疗。具体是，当MBL水平低于500ng/ml时，可作为预示指标来指示需用MBL进行治疗，特别是对那些免疫受损的个体或具有免疫受损危险性的个体而言更是如此。
预示指标可能与任何感染相关，但尤其与正接受免疫损伤性细胞毒治疗的个体中的败血症或肺炎相关。
因此，本发明还涉及利用MBL组合物预防和/或减少个体中感染的方法，该方法包括以下步骤i)测定个体中的血清MBL水平，ii)评估该个体出现显著临床感染的可能性，并任选，给与该个体一种MBL组合物。
测定了血清或血浆中的MBL水平，方法可以是时间分辨型免疫荧光试验(TRIFMA)，ELISA，RIA或比浊法。
MBL水平还可以根据如上所述对MBL基因的基因型分析来推断，其中MBL的突变导致MBL水平下降。
本发明已就多个方面进行了详细描述，再用以下图1和图2，以及优选实施方案的非限制性实施例进一步举例说明。
图1具有显著临床感染(CSI)的白血病患者以及非CSI白血病患者的血浆中MBL浓度的分布。
图2具有显著临床感染(CSI)的多发性骨髓瘤患者以及非CSI多发性骨髓瘤患者的血浆中MBL浓度的分布。
实施例以下实施例证实了，关于MBL缺陷对一组接受化疗的血液病患者体内显著临床感染的发生的影响的检查结果。
研究人群本研究包括对依次来丹麦Aarhus大学血液学系就诊的一组患者的检查。这些患者中大多数接受了化疗。他们包括7例急性髓细胞白血病，17例多发性骨髓瘤(MM)，11例红细胞增多症，13例非Hodgkin’s淋巴瘤，1例Brritt’s淋巴瘤，1例Waldenstrm’s巨球蛋白血症，5例慢性淋巴细胞白血病，3例不确定型显著性单克隆γ球蛋白病(MGUS)，5例Hodgkin’s淋巴瘤，2例慢性髓细胞性白血病，1例急性淋巴细胞白血病，1例再生障碍性贫血，和1例骨髓纤维变性。其中MM组全部接受了化疗。一共使用了三种不同治疗VAD长春新碱(0.4mg/24hr)和阿霉素(9mg/m2/24hr)通过连续输注给药4天，在每28天一个循环的其中第1-4天、第9-12天、第17-20天给药地塞米松(40mg，口服(p.o.))；NOP米托蒽醌(10mg/m2)和长春新碱(1.4mg/m2)通过连续输注给药一次，强的松(2×50mg，口服)在每个循环的每一天给药；MP苯丙氨酸氮芥(melphalan)(0.25mg/kg/天)通过输注给药4天，强的松(2×50mg，口服)给药4天。
表现显著临床感染(CSI，限定为菌血症或肺炎)的患者通过对患者数据库的回顾性计算机搜索来鉴定。在表现CSI的MM患者中，4例患有肺炎球菌性肺炎，3例为非特异性肺炎，1例患有金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)所致的肺炎。
在开始化疗前采血至含EDTA的空试管(使EDTA终浓度为约10mM)。将血浆分成数等份，于-80℃保存直至分析。用类似方法从健康供血者获得血浆样品。患者采血时没有感染。
MBL分析MBL浓度通过时间分辨型免疫荧光分析(TRIFMA)测定。微滴孔(fluoroNunc，Nunc，Kamstrup，丹麦)用抗体包被，方法是室温下与500ng抗人MBL抗体(Mab 131-1，Statens Serum Institut，哥本哈根，丹麦)的100μl PBS(0.14M NaCl，10mM磷酸，pH 7.4)溶液保温过夜。用含吐温的缓冲液(TBS，0.14M NaCl，10mM Tris/HCl，7.5mM NaN3，pH 7.4，含0.05％吐温20)洗涤后，在含有0.5M NaCl和10mM EDTA的TBS/吐温中添加待检样品(血浆1/20)和校准品的稀释液。
4℃保温过夜并洗涤后，在含25μM的TBS/吐温中添加显色的铕标记型抗体(用含Eu的螯合剂异硫氰酸-苯甲基-二亚乙基-三胺-四乙酸标记的Mab131-1 12.5ng，按厂商Wallac，Turku，芬兰的建议)。
保温2小时并洗涤后，添加荧光增强液(Wallac)，在时间分辨型荧光测定仪(Delfia 1232，Wallac)上读板。用保存于-80℃的一等份血浆的稀释液制备标准曲线。该血浆中的MBL浓度(3.6μg/ml)通过与高纯度MBL(经定量氨基酸分析而定量)比较而测定。
结果多个MBL缺陷的个体显示，在血液病患者和正常人之间无差异。
CSI型血液病患者的MBL水平显著低于非CSI患者(图1)。对一组MM患者进行分析发现，其中的CSI型患者的MBL水平较低(图2)。
讨论迄今，关于MBL缺陷与感染频率之间相关性的研究，是通过限定一个有关缺陷的任意水平(如50ng/ml18)来进行，或利用两条染色体上都发生MBL等位基因突变而指示缺陷来进行11，12。在本研究中，患者本身将所述水平限定为临床症状明显时，即低于500ng MBL/ml。在另一组患者中，所述水平经明确证实不同于此，因为在不同患者人群中不同免疫学参数具有不同的重要性。
图1和图2的结果说明，血浆MBL浓度低于500ng/ml的患者在接受化疗后更容易被感染。应在该组患者接受化疗期间使用MBL对他们进行替代治疗。该治疗可在开始化疗之前就启动，并维持至其它免疫学参数正常为止。MBL可从人血浆来制备，或可利用重组技术来生产。
显然，可预见接受细胞毒治疗(化疗或X-线治疗)的其它癌症患者应该也能从MBL治疗中受益。
未公开的结果显示败血症之后MBL浓度下降，因此MBL治疗可能是针对首先表现出正常MBL水平的患者的有效疗法。
MM患者的存活期从几个月至几年不等。人们已付出相当的努力，尝试对接受化疗之癌症患者的存活力限定预后参数。
所示结果表明，MBL浓度是化疗后的一种很好的预示指标。对MBL浓度的测定因此是化疗患者的重要预后参数，并应假定对接受其它细胞毒治疗的患者也具有类似意义。由于MBL的基因型确定了MBL的血浆浓度，因此对个体中MBL基因的分析可间接用于评估MBL浓度。
在参考文献中，有两项研究包括了对癌症患者中MBL的测定。Aittoniemi等分析了慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者中MBL缺陷与感染的关系25。28例患者中仅6例接受了化疗，其中3例接受了瘤可宁(chlorambucil)-[氢化泼尼松(prednisolone)]，3例接受了瘤可宁-[氢化泼尼松]和环磷酰胺-(羟基柔红霉素(hydroxydaunorubicin))-长春灭瘟碱(oncovine)-氢化泼尼松。将MBL缺陷限定为MBL浓度低于所用MBL试验的检测极限(＜20ng/ml)。所有28例患者中仅1例为MBL缺陷。
该研究未尝试分析化疗患者中MBL水平与感染率之间的关系。因此，该研究未能得出本专利申请的权利要求中的结论。
Lehrnbecher等检查了白细胞介素-6，白细胞介素-8，C反应蛋白，可溶性Fcγ受体III型，或MBL是否能作为患有癌症和嗜中性粒细胞减少症的发热儿童中严重感染的指示26。共研究了56例儿童，他们经证实患有恶性疾病以及化疗诱导的嗜中性粒细胞减少症。所测定的MBL水平确实未出现在纸件中。正文中仅指出，“MBL水平不能用于区分威胁生命的感染与不明原因的暂时发热或可能由导管引起的菌血症”。
该项研究中的分组不同于本申请中所示，因为他们均为儿童，且其中27例儿童是因为实体瘤而非白血病才归为该组。他们未对其余29例白血病患者进行分析。在没有真实数据的情况下，不可能将该研究与本文所示结果进行比较。
其它生物学及免疫调节性试剂已用于治疗嗜中性粒细胞减少症和发热的患者。静脉注射免疫球蛋白不能有效阻止嗜中性粒细胞减少症患者中的发热或感染，但有可能对抗体不足的患者具有温和(moderate)效应。干扰素γ有可能对某些嗜中性粒细胞缺陷患者有利，但这一点未得到最后证实。细胞生长因子(粒细胞以及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)可能缩短嗜中性粒细胞减少症的病程，并因此需要抗生素。
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权利要求
1.一种组合物在制备预防和/或治疗下述个体之感染所用药物中的应用，所述组合物含有至少一种甘露聚糖结合型凝集素(MBL)亚单位，或至少一种甘露聚糖结合型凝集素(MBL)寡聚体，该寡聚体含有至少一种甘露聚糖结合型凝集素(MBL)亚单位，所述个体分为a)有免疫受损状态的个体；和/或b)具有因医疗处理而获得免疫受损状态的危险的个体。
2.权利要求1的应用，其中所述组合物包含至少一种甘露聚糖结合型凝集素(MBL)寡聚体，该寡聚体包含至少一种甘露聚糖结合型凝集素(MBL)亚单位。
3.权利要求2的应用，其中所述寡聚体优选选自四聚体，五聚体和/或六聚体。
4.权利要求1的应用，其中所述有免疫受损状态的个体的血清MBL水平高于50ng/ml血清。
5.权利要求1-4中任一项的应用，其中所述血清MBL水平是功能性血清MBL水平。
6.权利要求1的应用，其中所述免疫受损状态是嗜中性粒细胞减少症。
7.权利要求1的应用，其中所述免疫受损状态是自身免疫性嗜中性粒细胞减少症。
8.权利要求1的应用，其中所述感染是微生物感染。
9.权利要求8的应用，其中所述微生物为真菌。
10.权利要求8的应用，其中所述微生物为酵母。
11.权利要求8的应用，其中所述微生物为细菌。
12.权利要求11的应用，其中所述细菌能抵抗至少一种抗生素。
13.权利要求11的应用，其中所述细菌为多重耐药细菌。
14.权利要求11的应用，其中所述细菌为致病性细菌。
15.权利要求8的应用，其中所述感染为病毒感染。
16.权利要求15的应用，其中所述病毒为逆转录病毒。
17.权利要求16的应用，其中所述逆转录病毒为人类免疫缺陷病毒。
18.权利要求1作为试剂盒的一部分的应用，所述试剂盒进一步包括一种能使微生物减毒或被消灭的抗微生物药物。
19.权利要求18的作为试剂盒一部分的应用，所述试剂盒进一步包括一种能使细菌减毒或被消灭的抗细菌药物。
20.权利要求1的应用，其中所述MBL亚单位或MBL寡聚体在天然宿主生物中产生。
21.权利要求20的应用，其中所述天然宿主生物为能天然表达所述MBL亚单位或MBL寡聚体的人类细胞。
22.权利要求1的应用，其中所述MBL亚单位或MBL寡聚体由并非天然表达MBL多肽的宿主生物产生。
23.权利要求1的应用，其中所述MBL亚单位或MBL寡聚体通过包含至少一步体外重组DNA步骤的方法产生。
24.权利要求22或23的应用，其中所述MBL亚单位或MBL寡聚体的产生通过并非天然与MBL多肽表达相关的表达控制序列来控制。
25.权利要求20-24中任一项的应用，其中所述MBL亚单位或MBL寡聚体从所述宿主生物中分离。
26.权利要求25的应用，其中所述MBL亚单位或MBL寡聚体通过包含至少一步涉及亲和层析的步骤的方法来分离。
27.权利要求26的应用，其中所述亲和层析步骤能从还含有其它MBL寡聚体和/或MBL亚单位的组合物中分离出MBL四聚体，五聚体和/或六聚体。
28.权利要求22-27中任一项的应用，其中所述MBL亚单位和/或MBL寡聚体不含任何当产生于天然宿主生物中时与所述MBL天然相关的杂质。
29.权利要求1的应用，其中所述MBL亚单位为哺乳动物MBL亚单位。
30.权利要求29的应用，其中所述哺乳动物MBL亚单位是人的MBL亚单位。
31.权利要求1的应用，其中所述药物在另一导致所述个体免疫受损状态的治疗之前给与该个体。
32.权利要求1的应用，其中所述药物与一种医疗处理同时、顺次、或分开给与所述个体，其中所述医疗处理导致该个体中的免疫受损状态。
33.权利要求31的应用，其中所述药物在所述医疗处理之前，期间，和之后给与该个体。
34.在先权利要求中任一项的应用，其中所述治疗是一种预防性治疗。
35.权利要求31的应用，其中所述医疗处理是化疗。
36.权利要求31的应用，其中所述医疗处理是放疗。
37.权利要求1-36中任一项的应用，其中所述药物是使血清MBL水平超过预定之最低血清MBL水平的个体中的血清MBL水平升高的一种激发剂。
38.权利要求37的应用，其中所述个体的血清MBL水平低于预定的最大血清MBL水平。
39.权利要求1或37的应用，其中所述个体的血清MBL水平超过75ng/ml。
40.权利要求1或37的应用，其中所述个体的血清MBL水平超过100ng/ml。
41.权利要求1或37的应用，其中所述个体的血清MBL水平超过150ng/ml。
42.权利要求1或38的应用，其中所述个体的血清MBL水平低于500ng/ml。
43.权利要求1或38的应用，其中所述个体的血清MBL水平低于400ng/ml。
44.权利要求1或38的应用，其中所述个体的血清MBL水平低于300ng/ml。
45.在先权利要求中任一项的应用，其中所述个体中的血清或血浆MBL水平通过定量分析确定。
46.权利要求45的应用，其中所述分析包括ELISA，TRIFMA，RIA或比浊法中的至少一种。
47.应用MBL组合物防止和/或减少个体中的感染的方法，该方法包括以下步骤a)测定个体的血清MBL水平，b)评估该个体中出现显著临床感染的可能性，并任选c)给予该个体一种MBL组合物。
全文摘要
本发明涉及含有至少一种甘露聚糖结合型凝集素(MBL)亚单位，或至少一种甘露聚糖结合型凝集素(MBL)寡聚体(其包含至少一种甘露聚糖结合型凝集素(MBL)亚单位)的组合物在制备用于预防和/或治疗感染的药物中的应用。尤其本发明涉及对免疫受损个体；和/或对由于医疗处理所致的免疫受损易感个体中的感染进行预防和/治疗。本发明尤其适于预防和/或治疗中性粒细胞减少症患者和/或接受或将要接受化疗或类似治疗的患者的感染。所述个体可在不考虑他们的血清MBL水平的前提下进行治疗，但已显示，尤其在血清MBL水平为50ng/ml－500ng/ml的患者体内进行的预防和/或治疗较有利。
文档编号A61P31/00GK1899603SQ20061009584
公开日2007年1月24日 申请日期2000年5月10日 优先权日1999年5月14日
发明者斯蒂芬·蒂尔, 詹斯·C·詹斯尼厄斯 申请人:斯蒂芬·蒂尔, 詹斯·C·詹斯尼厄斯