专利名称：黄蜀葵花总黄酮提取物、其制备及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及黄蜀葵花总黄酮提取物、该提取物的制备方法、中药制剂，及其在制备治疗肾炎药物中的应用。
背景技术：
黄蜀葵花为锦葵科秋葵属植物黄蜀葵Abelmoschus Manihot(L.)Medic的干燥花，该药材收载于江苏省中药材标(1989年版)增补本，江苏省苏中药厂将黄蜀葵花醇提物开发为三类新药-黄葵胶囊，用于治疗肾炎疾病。治疗慢性肾小球肾炎，总有效率湿热证组78.95％，非湿热证组62.12％；治疗乳糜尿总有效率84.62％；治疗非胰岛素依赖型糖尿病并发糖尿病肾病，结果表明黄蜀葵花醇提物可显著减轻临床期DN的蛋白尿，结合降糖、降压治疗，近期总有效率为83.87％，其中近期缓解率为25.81％，疗效显著。但黄葵胶囊有效成分含量较低，服用量较大，因此需开发有效成分含量达到50％以上二类新药。
关于黄蜀葵花化学成分，王先荣等人于1981年，在植物学报，23(3)222-226(1981)报导了“黄蜀葵花的化学成分研究”，从黄蜀葵花中分离到槲皮素-3-洋槐糖苷、金丝桃苷、槲皮素-3′-葡萄糖苷、杨梅素、槲皮素等5种黄酮成分。王先荣等人又于2004年，在中国天然药物，2(2)91-93(2004)报导了“黄蜀葵花黄酮成分的研究”.从黄蜀葵花总黄酮中分离到棉皮素-3′-葡萄糖苷、异槲皮苷、金丝桃苷、槲皮素-3′-葡萄糖苷等4种黄酮成分，其中棉皮素-3′-葡萄糖苷为一新化合物。
目前研究黄蜀葵花有效成分的方法可归纳为两种1、先用水或醇提取，将回收溶剂后的提取物混悬于水中，分别用氯仿、醋酸乙酯、正丁醇提取，划分成几个提取部分。再用硅胶柱或葡聚糖凝胶柱层析、分离成单组分物质。
2、申请号200410035741.X的发明专利申请“治疗口腔溃疡、胃溃疡、烧烫伤、外伤感染的药物及制备方法”。
上述的第一种方法是试验室研究单一黄酮成分的方法，不适合总黄酮的制备。第二种方法是“取黄蜀葵花20kg，用20倍量-14倍量60-90％乙醇水回流提取2次，每次1hr，合并提取液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.13-1.16(60℃)的浓缩液；加适量水稀释，通过大孔吸附树脂柱或通过聚酰胺柱，用醇水溶液梯度洗脱，水洗脱3个柱体积，10％及30％乙醇各洗脱3个柱体积，70％乙醇洗脱1个柱体积，洗脱液浓缩，干燥，粉碎后得总黄酮提取物，其总黄酮含量为5-95％(重量比)”。该技术方案的缺点是其一，因六羟基黄酮杨梅素、棉皮素及其苷类成分在30％乙醇中不稳定，用30％乙醇洗脱总黄酮不妥，其二，没有具体明确所提供的有效部位由哪些黄酮成分组成及其含量。
黄蜀葵花总黄酮及其制剂目前只见到用于治疗口腔溃疡和心脑缺血性疾病的报道，尚未见到用于治疗肾炎疾病的报道。
发明内容
本发明是为避免上述现有技术所存在的问题，提供一种高含量黄蜀葵花总黄酮提取物，药理和化学研究表明该提取物活性成分明确，质量可控。
本发明另一目的是提供该黄蜀葵花总黄酮提取物的制备方法及其制剂。
本发明目的还在于提供该黄蜀葵花总黄酮提取物在制备治疗肾炎疾病药物中的应用。
本发明目的是通过如下技术方案实现的本发明黄花蜀葵总黄酮提取物，其特征是所述提取物按重量百分比的总黄酮含量为50-90％；其中所含黄酮成分包括槲皮素-3-洋槐糖苷1.0-5.0％、金丝桃苷8.0-24.0％、异槲皮苷7.0-20.0％、槲皮素-3′-葡萄糖苷5.0-15.0％、棉皮素-3′-葡萄糖苷3.0-10.0％、杨梅素0.5-5.0％、棉皮素0.5-5.0％、槲皮素2.0-8.0％，其它黄酮类成分余量。
本发明黄蜀葵花总黄酮提取物制备方法是按如下步骤操作a、将干燥的黄蜀葵花粉碎成粗粉，用8-10倍量50-95％乙醇加热回流提取1-2小时，共提取2-3次；其中，用于回流提取的乙醇优选为60-80％乙醇；b、将提取液在低于60℃的条件下减压浓缩至60℃时比重为1.13-1.16的浸膏，加入原生药量3-5倍量沸水，分次溶解，静置12小时，过滤；c、滤液通过大孔吸附树脂柱，(可以包括各种非极性、弱极性和中极性大孔吸附树脂)或聚酰胺柱层析，首先用水冲洗4-8个柱体积，再用不同浓度醇水溶液洗脱、收集、浓缩的操作过程为用10％-20％乙醇或10％-20％甲醇洗脱1-2个柱体积、去除洗脱液；用70-80％乙醇或70-80％甲醇洗脱，收集洗脱液；将该洗脱液在低于60℃条件下减压浓缩，真空干燥得黄蜀葵花总黄酮提取物粗品；
d、总黄酮提取物粗品的精制，用10倍量醋酸乙酯-乙醇(76.89∶38.79 V/V)回流提取3次，每次2小时，回收溶剂，80℃减压干燥得产品，总黄酮含量达到50％-90％的黄蜀葵花总黄酮提取物。
本发明黄蜀葵花总黄酮提取物的中药制剂，其特征是所述中药制剂是以所述黄蜀葵花黄蜀葵花总黄酮提取物为药物有效成份，加入药用辅料后制成的滴丸、片剂、胶囊剂、软胶囊、颗粒剂。
本发明以黄蜀葵花总黄酮提取物用于制备治疗肾炎疾病的药物。
药理研究表明黄蜀葵花黄酮类成分是治疗肾炎的有效成分，化学研究表明黄蜀葵花黄酮类成分以槲皮素-3-洋槐糖苷、金丝桃苷、异槲皮苷、棉皮素-3′-葡萄糖苷、槲皮素-3′-葡萄糖苷、杨梅素、棉皮素和槲皮素8种成分含量较高。不同的提取方法得到的提取物由于包含不同的黄酮类化合物、不同的含量，其药理、药性存在很大差异，都是一种新的物质。因此在保证药效的前提下，尽可能提高提取物总黄酮的纯度和明确提取物中主要黄酮类成分及其含量是技术难点。
与已有技术相比，本发明的有益效果体现在1、本发明黄蜀葵花提取物是以总黄酮含量、槲皮素-3-洋槐糖苷、金丝桃苷、异槲皮苷、棉皮素-3′-葡萄糖苷、槲皮素-3′-葡萄糖苷、杨梅素、棉皮素、槲皮素的含量对其进行确切的表征，以这一表征方式进行表征的黄酮类物质以及黄蜀葵花总黄酮提取物具有显著的治疗肾炎疾病作用，均未见相关文献的报道。
2、本发明采用高效液相色谱法，可以对提取物中对槲皮素-3-洋槐糖苷、金丝桃苷、异槲皮苷、棉皮素-3′-葡萄糖苷、槲皮素-3′-葡萄糖苷、杨梅素、棉皮素、槲皮素的黄酮成分进行明确定性和定量。
3、本发明黄蜀葵花总黄酮提取物治疗肾炎疾病有可靠的疗效。
4、本发明可以满足广大肾炎患者对不同剂型的要求。
本发明黄蜀葵花总黄酮提取物，其提取分离工艺不仅限于上述工艺，亦可采用其它提取分离手段得到。
利用上述工艺得到的黄蜀葵花总黄酮提取物的总黄酮含量及各组成成分含量测定方法为1、黄蜀葵花总黄酮提取物干燥后，总黄酮含量的测定采用AlCl3络合比色法进行测定，本品含总黄酮(以芦丁计)为50-90％。
2、黄蜀葵花总黄酮提取物干燥后，组成成分槲皮素-3-洋槐糖苷、金丝桃苷、异槲皮苷、棉皮素-3′-葡萄糖苷、槲皮素-3′-葡萄糖苷、杨梅素、棉皮素、槲皮素的含量测定均采用高效液相色谱法，各成分含量见实施例1-4。
黄蜀葵花总黄酮提取物组成成分的化学结构如下 棉皮素-3′-葡萄糖苷棉皮素 杨梅素 槲皮素 异槲皮苷 金丝桃苷 槲皮素-3′-葡萄糖苷槲皮素-3-洋槐糖苷下面用药理实验结果阐明其药效作用一、用大鼠系膜增生性肾炎(MsPGN)模型，观察对大鼠肾炎的治疗作用，结果如下1、黄蜀葵花总黄酮对第8周末和第10周末24h尿蛋白影响尿蛋白自造模第六周起，模型组与治疗组均有不同程度的蛋白尿，且随时间推渐加重。第8、10周末时，24小时尿蛋白定量黄蜀葵花总黄酮组均显著低于模型组，二者相比亦有显著性差异，提示黄蜀葵花总黄酮能明显减轻MsPGN大鼠的蛋白尿(见表1)。
表1黄蜀葵花总黄酮对第8周末和第10周末24h尿蛋白影响
注与正常组比较，△△P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
2、黄蜀葵花总黄酮对尿素氮、肌酐的影响生化检查第10周末时，模型组的血CRE、BUN均明显高于正常组，黄蜀葵花总黄酮各剂量组和肾炎康复片组的血CRE、BUN与模型组相比亦有显著性差异，表明黄蜀葵花总黄酮能改善MsPGN大鼠的肾功能(见表2)。
表2黄蜀葵花总黄酮对尿素氮、肌酐的影响
注与正常组比较，△△P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01。
3、黄蜀葵花总黄酮对血清白蛋白的影响第10周末时，黄蜀葵花总黄酮大剂量组血清白蛋白与模型组相比有显著性差异，提示黄蜀葵花总黄酮能改善MsPGN大鼠的蛋白质代谢，提高ALB(见表3)。
表3黄蜀葵花总黄酮对血清白蛋白的影响
注与正常组比较，△△P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01。
4、黄蜀葵花总黄酮对肾病理组织学改变的影响光镜检查模型组病变主要表现为部分肾小球增大，个别肾小球出现萎缩而至纤维化，多数呈现弥漫的轻重不等的系膜组织增生，大部分区域为轻中度增生，表现为系膜区增宽，增宽的系膜区内系膜细胞和系膜基质均有增生，毛细血管腔狭小，个别结构破坏，血管消失。黄蜀葵花总黄酮组个别区域肾小球系膜细胞轻度增生，系膜基质轻度增宽，管管腔无挤压现象。肾炎康复片组肾小球病理改变与肾疏宁组大致相同，系膜区轻度增宽，血管腔有轻度挤压现象，但毛细血管基底膜无明显改变。
二、结论黄蜀葵花总黄酮对大鼠肾炎有治疗作用附图
为黄蜀葵花总黄酮提取物HPLC图谱。
该图谱能对黄蜀葵花总黄酮提取物组成成分槲皮素-3-洋槐糖苷、金丝桃苷、异槲皮苷、棉皮素-3′-葡萄糖苷、槲皮素-3′-葡萄糖苷、杨梅素、棉皮素、槲皮素的黄酮成分进行明确定性和定量。
具体实施例方式下面通过实施例对黄蜀葵花总黄酮提取物提取方法及其制剂的制备方法作进一步详述。
实施例1取黄蜀葵花生药粗粉1kg，加10倍量80％乙醇加热回流提取2小时，共提取3次，合并提取液，放冷，过滤，减压回收乙醇至无醇时，并浓缩至60℃相对密度为1.13的浸膏；加相当于生药5倍量的沸水，分次搅拌使溶解，过滤，滤液加于非极性D101大孔吸附树脂柱上，用水冲洗6个柱体积后，用10％乙醇洗脱2个柱体积，用70％乙醇洗脱至无AlCl3反应，收集70％乙醇洗脱液，将该洗脱液在低于60℃条件下减压浓缩，真空干燥得黄蜀葵花总黄酮提取物粗品；取粗品总黄酮提取物，用10倍量醋酸乙酯-乙醇(76.89∶38.79 V/V)回流提取3次，每次2小时，回收溶剂，80℃减压干燥得产品。总黄酮提取物收得率为3.5％，按重理百分比其总黄酮以芦丁计含量为68.5％，其成分含量为槲皮素-3-洋槐糖苷3.0％、金丝桃苷17.2％、异槲皮苷12.5％、槲皮素-3′-葡萄糖苷9.5％、棉皮素-3′-葡萄糖苷5.6％、杨梅素1.5％、棉皮素4.0％、槲皮素4.0％，其它黄酮类成分余量。
实施例2取黄蜀葵花生药粗粉1kg，加8倍量70％乙醇加热回流提取2小时，共提取3次，合并提取液，放冷，过滤，减压回收乙醇至无醇时，并浓缩至60℃相对密度为1.14的浸膏；加相当于生药4倍量的沸水，分次搅拌使溶解，过滤，滤液加于弱极性AB-8大孔吸附树脂柱上，用水冲洗8个柱体积后，用10％乙醇洗脱2个柱体积，用70％乙醇洗脱至无AlCl3反应，收集70％乙醇洗脱液，将该洗脱液在低于60℃条件下减压浓缩，真空干燥得黄蜀葵花总黄酮提取物粗品；取粗品总黄酮提取物，用10倍量醋酸乙酯-乙醇(76.89∶38.79 V/V)回流提取3次，每次2小时，回收溶剂，80℃减压干燥得产品。总黄酮提取物收得率为3.2％，按重量百分比其总黄酮以芦丁计含量为69.5％，其成分含量为槲皮素-3-洋槐糖苷2.8％、金丝桃苷18.0％、异槲皮苷13.0％、槲皮素-3′-葡萄糖苷10.0％、棉皮素-3′-葡萄糖苷5.0％、杨梅素1.5％、棉皮素4.2％、槲皮素4.0％，其它黄酮类成分余量。
实施例3取黄蜀葵花生药粗粉1kg，加8倍量60％乙醇加热回流提取2小时，共提取3次，合并提取液，放冷，过滤，减压回收乙醇至无醇时，并浓缩至60℃相对密度为1.16的浸膏；加相当于生药4倍量的沸水，分次搅拌使溶解，过滤，滤液加于中极性DM301大孔吸附树脂柱上，用水冲洗5个柱体积，用10％乙醇洗脱1个柱体积，用70％乙醇洗脱至无AlCl3反应，收集70％乙醇洗脱液，将该洗脱液在低于60℃条件下减压浓缩，真空干燥得黄蜀葵花总黄酮提取物粗品；取粗品总黄酮提取物用10倍量醋酸乙酯-乙醇(76.89∶38.79 V/V)回流提取3次，每次2小时，回收溶剂，80℃减压干燥得产品。按重量百分比的总黄酮提取物收得率为3.6％，其总黄酮以芦丁计含量为69.0％，其成分含量为槲皮素-3-洋槐糖苷2.5％、金丝桃苷17.5％、异槲皮苷13.5％、槲皮素-3′-葡萄糖苷9.8％、棉皮素-3′-葡萄糖苷5.3％、杨梅素1.3％、棉皮素4.0％、槲皮素4.0％，其它黄酮类成分余量。
实施例4取黄蜀葵花生药粗粉1kg，加8倍量70％乙醇加热回流提取2小时，共提取3次，合并提取液，放冷，过滤，减压回收乙醇至无醇时，并浓缩至60℃相对密度为1.14的浸膏；加相当于生药4倍量的沸水，分次搅拌使溶解，过滤，滤液加于聚酰胺柱上，用水冲洗8个柱体积后，用10％乙醇洗脱1个柱体积，用70％乙醇洗脱至无AlCl3反应，收集70％乙醇洗脱液，将该洗脱液在低于60℃条件下减压浓缩，真空干燥得黄蜀葵花总黄酮提取物粗品；取粗品总黄酮提取物，用10倍量醋酸乙酯-乙醇(76.89∶38.79 V/V)回流提取3次，每次2小时，回收溶剂，80℃减压干燥得产品。按重量百分比的总黄酮提取物收得率为3.5％，其总黄酮以芦丁计含量为71.5％，其成分含量为槲皮素-3-洋槐糖苷2.8％、金丝桃苷18.5％、异槲皮苷14.0％、槲皮素-3′-葡萄糖苷10.0％、棉皮素-3′-葡萄糖苷5.5％、杨梅素1.5％、棉皮素4.2％、槲皮素4.0％，其它黄酮类成分余量。
实施例5黄蜀葵花总黄酮片组分量黄蜀葵花总黄酮提取物1-100g糊精90g微晶纤维素 105g低取代羟丙甲纤维素 15g70％的乙醇溶液 15ml硬脂酸镁1g制备过程黄蜀葵花总黄酮提取物、糊精、硬脂酸镁、低取代羟丙甲纤维素分别粉碎过80目筛；将黄蜀葵花总黄酮与糊精、2/3量的低取代羟丙甲纤维素及70％的乙醇溶液混合研磨，使均匀，制软材；再20目筛制颗粒，干燥，整粒后加入剩余的低取代羟丙甲纤维素，混匀，再加入硬脂酸镁混匀，压1000片；检验合格后包装。
实施例6黄蜀葵花总黄酮滴丸组分 量黄蜀葵花总黄酮提取物1-50gPEG4000 15gPEG6000 22g制备过程将聚乙二醇4000、聚乙二醇6000加热，再将熔融黄蜀葵花总黄酮提取物加入其中，充分搅拌，使药物充分分散于基质中；将上述药液转移至滴丸机上，70℃～80℃密闭保温10～20分钟，用无水甲基硅油作冷却剂，10℃～20℃梯度冷却，用30～60滴/分速度进行滴制，即得成型丸粒。再收集滴丸，用无水石油醚洗涤用30～60滴/分速度进行滴制，即得成型丸粒。再收集滴丸，用无水石油醚洗涤2次，凉干，包装即可。
实施例7黄蜀葵花总黄酮软胶囊组分量黄蜀葵花总黄酮提取物5-100g蜂蜡10g食用植物油 150g明胶10g甘油3g水 13g
制备过程称取黄蜀葵花总黄酮提取物与经过加热灭菌、澄清的食用植物油及蜂蜡熔融物混合，充分搅匀即得囊心物。取明胶加入适量水使其膨胀；另将甘油及余下的水置煮胶锅中加热至70℃～80℃，混合均匀，加入膨胀的明胶搅拌，熔化，保温1-2小时，静置，使泡沫上浮，除去上浮的泡沫，以洁净白布滤过，保温待用。将已制好的明胶液，置明胶液贮槽中控制温度在60℃左右，将黄蜀葵花总黄酮提取物放入药液贮槽内；液状石蜡温度以10-25℃为宜，室温10-20℃，滴头温度30-60℃，开始滴丸。滴出的胶丸先均匀地摊于纱网上，在10℃以下低温吹风4小时以上，再用擦丸机擦去表面的石蜡，然后再低温(10℃以下)吹风20小时以上，于40-50℃干燥约24小时。取出干燥的胶丸，灯检，除去废丸后，用95％乙醇洗涤，再在40-50℃以下吹干，经质量检查合格后，即可包装。
实施例8黄蜀葵花总黄酮胶囊剂组分 量黄蜀葵花总黄酮提取物 5-100g淀粉 125g70％乙醇 适量制备过程将淀粉、黄蜀葵花总黄酮提取物混匀，过80目筛，加入适量的70％乙醇，制软材，再用20目筛制颗粒，干燥，整粒，装胶囊，共制成1000粒，每粒含黄蜀葵花总黄酮提取物5-100mg，即可。
实施例9黄蜀葵花总黄酮颗粒剂组分量黄蜀葵花总黄酮提取物1-10g糊精28g糖粉10g酒石酸 1g50％乙醇(体积分数) 适量将黄蜀葵花总黄酮提取物、糊精、糖粉分别过100目筛，按等体积递增配研法将黄蜀葵花总黄酮提取物与辅料混匀，再将酒石酸溶于50％乙醇(体积分数)中，一次加入上述混合物中，混匀，制软材，过16目尼龙筛，60℃以下干燥，整粒后用塑料袋包装，每袋2g，含黄蜀葵花总黄酮提取物50-500mg。
权利要求
1.一种黄蜀葵花总黄酮提取物，其特征是所述提取物按重量百分比的总黄酮含量为50-90％；其中所含黄酮成分包括槲皮素-3-洋槐糖苷1.0-5.0％、金丝桃苷8.0-24.0％、异槲皮苷7.0-20.0％、槲皮素-3-葡萄糖苷5.0-15.0％、棉皮素-3-葡萄糖苷3.0-10.0％、杨梅素0.5-5.0％、棉皮素0.5-5.0％、槲皮素2.0-8.0％，其它黄酮类成分余量。
2.一种权利要求1所述黄蜀葵花总黄酮提取物的制备方法，其特征是按如下步骤操作a、将干燥的黄蜀葵花粉碎成粗粉，用8-10倍量50-95％乙醇加热回流提取1-2小时，共提取2-3次；b、将提取液在低于60℃的条件下减压浓缩至60℃时比重为1.13-1.16的浸膏，加入原生药量3-5倍量沸水，分次溶解，静置12小时后过滤；c、滤液通过大孔吸附树脂柱或聚酰胺柱层析，首先用水冲洗4-8个柱体积，再用不同浓度醇水溶液洗脱、收集、浓缩的操作过程为用10-20％乙醇或10-20％甲醇洗脱1-2个柱体积、去除洗脱液；用70-80％7乙醇或70-80％甲醇洗脱至无AlCl3反应，收集洗脱液；将该洗脱液在低于60℃条件下减压浓缩，真空干燥得黄蜀葵花总黄酮提取物粗品；d、总黄酮提取物粗品的精制，用10倍量醋酸乙酯-乙醇(76.89∶38.79V/V)回流提取3次，每次2小时，回收溶剂，80℃减压干燥得按重量百分比总黄酮含量达到50％-90％的黄蜀葵花总黄酮提取物。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征是所述步骤a中用于回流提取的乙醇是60-80％的乙醇。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征是所述步骤c中用于柱层析的大孔吸附树脂包括非极性、弱极性和中极性大孔吸附树脂。
5.权利要求1所述黄蜀葵花总黄酮提取物的中药制剂，其特征是所述中药制剂是以所述黄蜀葵花总黄酮提取物为药物有效成份，加入药用辅料后制成的滴丸、片剂、胶囊剂、软胶囊、颗粒剂。
6.权利要求1或2所述黄蜀葵花总黄酮提取物用于制备治疗肾炎疾病的药物。
全文摘要
黄蜀葵花总黄酮提取物、其制备及应用，其特征是所述提取物按重量百分比总黄酮含量为50－90％，其所含黄酮成分为槲皮素－3－洋槐糖苷1.0－5.0％、金丝桃苷8－24.0％、异槲皮苷7.0－20.0％、槲皮素－3′－葡萄糖苷5.0－15.0％、棉皮素－3′－葡萄糖苷3.0－10.0％、杨梅素0.5－5.0％、棉皮素0.5－5.0％、槲皮素2.0－8.0％，以及其它数种黄酮类成分。本发明黄蜀葵花总黄酮提取物用于制备治疗肾炎药物，黄酮成分定性和定量明确，疗效可靠。
文档编号A61K9/48GK1994337SQ20061009761
公开日2007年7月11日 申请日期2006年11月11日 优先权日2006年11月11日
发明者王先荣, 周亚球, 戴敏, 杜安全, 周正华 申请人:周亚球, 王先荣