专利名称：治疗内毒素血症的方法
技术领域：
本发明涉及Lpsd基因在治疗和预防内毒素血症中的应用。
背景技术：
A)LPSLPS是一个复杂的大分子，来自某些细菌的细胞壁，其中部分细菌能引起肠热症、痢疾、泌尿道感染等疾病，其它细菌通常为动物和人肠道的寄生菌但一般不致病。所有这些细菌都有相同类型的细胞壁，并根据它们的染色特性而归类于革兰氏阴性菌。
LPS诱导免疫活性细胞因子及动物炎性应答的其它介质的产生和释放。细胞因子是由各种细胞产生的具有很高活性的一种物质，这些细胞如单核吞噬细胞和淋巴细胞，它们刺激其它细胞并相互刺激。内皮细胞和粒细胞也是内毒素的初级靶细胞。现已对动物体内细胞中的特定受体分子和信号传导途径进行了深入的研究，清楚地了解了内毒素的作用机理。
B)LPS应答性的遗传学通过对小鼠的深入研究，人们发现对内毒素的细胞应答受遗传控制。1968年对C3H/HeJ突变小鼠的发现首次明确了宿主对LPS的多重反应的遗传学基础(Sultzer等，自然，219，1253-1254(1968))。该鼠系对LPS中脂质A组分的免疫刺激和病理生理效应应答性偏低，并因此认为，与亲缘关系很近的应答性鼠系相比，它对LPS的反应有一种基本的缺陷。
C3H/HeJ缺陷是特异的，且表现为多种方式。例如，C3H/HeJ的B细胞接触LPS后，不发生增殖或分化，它们的胸腺细胞受伴刀豆球蛋白A诱导的增殖不被LPS增强。(Sultzer等，自然新生物学(Nature New Biology)(伦敦)240，198-200(1972)；Sultzer，美国微生物学会摘要(Abst.Am.Soc.Microbiol.)85页，M69(1973)；Tanabe等，微生物免疫学(Microbiol.Immuno.)23，1097-1104(1979)；Morrison等，免疫学进展(Adv.Immunol.)28，294-312(1979)；Sultzer，《内毒素的有益影响》11章，Plenum，NY(1983)；Sultzer等，免疫生物学(Immunobiology)187，257-271(1993)；Glode等，L.M.和D.L.Resenstreich，免疫学杂志(J.Immunol)117，2061，2068(1976)；Sultzer，B.M.感染与免疫(Infection and Immunity)13，1579-1584(1976)。巨噬细胞的吞噬作用和细胞毒作用并非由LPS刺激，而在反应细胞中LPS所刺激的细胞因子，如肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素(IFN)、集落刺激因子(CSF)、白细胞介素1(IL-1)和前列腺素在C3H/HeJ的巨噬细胞中并没被诱导。(Morrison等，免疫学进展28，294-312(1979))。此外，与正常的内毒素应答性小鼠相比，C3H/HeJ对致死性内毒素休克有很强的抗性(Sultzer，自然219，1253-1254(1968))。
C3H/HeJ细胞对LPS不发生应答并不是因为缺少辅助细胞、存在抑制细胞或LPS与其它免疫活性细胞的结合不足(Sultzer，《内毒素的有益影响》11章，Plenum，NY(1983))。更确切地，所提供的解释集中于细胞与LPS开始作用时，缺少一个关键受体或信号传导途径的某处出现了问题(Sultzer等，免疫生物学187，257-271(1993))。
用C3H/HeJ鼠系和各种反应鼠系进行的经典喂养实验结果显示，对LPS的促有丝分裂的应答受单个位点的几个共显性等位基因控制(Morrison等，免疫学进展，28，294-312(1979)；Sultzer，《内毒素的有益影响》11章，Plenum，NY(1983)；Sultzer等，免疫生物学187，257-271(1993)；Glode等，免疫学杂志117，2061-2068(1976)；Sultzer，感染与免疫13，1579-1584(1976))。Watson认为此基因位点(Lpsn)位于第4号染色体，与主要泌尿蛋白的基因位点(Mup-1)相连，在Mup-1基因和控制B细胞活化的Lyb2:2:4:6基因的下游(Watson等，免疫学杂志120，422-429(1979))。C3H/HeJ小鼠含有突变的Lpsd等位基因。
C)分离和定性Lpsn基因Sultzer等(免疫生物学187，257-271(1993))描述了用C3H/OuJ小鼠(对LPS有反应)的脾细胞制备的一个包含六个子库的cDNA文库。把包含2×104个不同克隆的一个子库导入C3H/HeJ小鼠(对LPS没有反应)的脾细胞，在培养基中加入LPS后与绵羊红细胞反应的空斑形成细胞增加了四倍。
Kang等(感染与免疫64，4612-4617(1996))描述了对C3H/OuJ cDNA文库的进一步功能筛选和分级分离，以及一个cDNA克隆的分离，该克隆能恢复C3H/HeJ脾B细胞由LPS介导的B细胞应答。这段1166个核甘酸的cDNA序列(SEQ ID NO1)包括一个648个核甘酸的开放阅读框，Q编码一个216个氨基酸的蛋白质(SEQ ID NO2)。
序列分析表明，这个LPS应答性基因(Lpsn基因)编码一个对细胞核转运很重要的GTP酶Ran/TC4(Raetz，C.R.H.，内毒素化学，生物化学年鉴(Ann.Rev.Biochem.)59，129-170(1990)；Watson等，免疫学杂志114，1462-1468(1975)；Kabir等，感染与免疫15，156-164(1977))。在氨基酸水平，Lpsn与人和狗中发现的Ran/TC4GTP酶相同，与鸡的Ju93和和酵母的Spil蛋白分别有98.6％和82.8％的同源性(Drivas等，Mol Cell Biol分子和细胞生物学，10，1793-1798(1990)；Dupree等，Gene基因120，325-326(1992)；Trueb等，FEBS 306，181-184(1992)；Matsumoto等，Cell细胞66，347-360(1991))。这个结论组合了上面的Kang、Drivas、Dupree、Trueb、Marsumoto的结论。在DNA水平，Lpsn基因的同源性在人的TC4/Ran、狗的TC4/Ran、鸡的Ju93和酵母的Spil中依次是89.7％、90.7％、85.4％和68.7％。因此，Lpsn分子在进化上高度保守，尤其该分子的5个结构域，G1-G5，已发现它们与鸟嘌呤核甘酸的结合和水解有关。
总之，Lpsn基因编码一个功能性基因产物，这种产物出现在LPS应答性小鼠(如C3H/HeOuJ小鼠)中产生多克隆性活化抗体的B细胞中，将LpsncDNA导入C3H/HeJ B细胞足以恢复细胞对于LPS刺激的应答性，从而使产生抗体的空斑形成细胞(PFC)的水平提高至反应者的水平。据信该基因不仅存在于B细胞中，而且也存在于其它对LPS有应答性的细胞中以及产生细胞因子和其他因子(这些因子量大时会对宿主产生毒害作用)的细胞中。
D)内毒素血症LPS有多种病理生理学效应，其中之一就是由于血液中存在大量内毒素而引起内毒素血症或败血性休克，致死率约40％。大部分败血症休克病例是血液中出现革兰氏阴性细菌的结果。但败血性休克也可能由其他生物如革兰氏阳性细菌和真菌引起。然而，对败血性休克病因的广泛研究证实，引发败血性休克的一个关键因素是LPS从革兰氏阴性细菌释放，随后内毒素对体内各种细胞产生影响，使它们变得高度活化。结果，宿主体内有过多的细胞物质，这导致循环衰竭、休克、和死亡。
脓毒症是重症监护病房的常见死因，目前仍然是一个严重的公共健康问题。当脓毒症发生时，主要的前炎性细胞因子包括TNF-α、IL-1和IL-6均有涉及。用抗TNF抗体或由TNF胞外结构域与IgG的Fc部分组成的融合蛋白抑制TNF的临床试验结果并不理想(Dellinger等，胸(Chest)111，744-753(1997)；Grau等，自然医学(Nature Medicine)3，1193-1195(1997))。
尽管能用强效抗生素和药物治疗心肺衰竭，但仍极需改良的药物和/或预防性治疗方案对内毒素血症进行控制，尤其在脓毒症早期进行控制。
发明简述本发明提供了在有此需要的患者中治疗内毒素血症的方法，其包括给予有效量的Lpsd基因。Lpsd基因区别于Lpsn基因之处在于它含有一个突变，使含有该突变的细胞中脂多糖内毒素的应答能力降低。在本发明的一个实施方案中，Lpsd基因与同种的相应Lpsn基因的区别在于，在LpsncDNA的3’非翻译区有一个突变。在一优选实施方案中，此突变在所述Lps DNA的870位有一个核苷酸置换，其中所述位置编号始于该DNA的翻译起始密码子。在一优选实施方案中，Lpsd基因是人的基因。在另一实施方案中，Lpsd基因是鼠基因。由于人和鼠的Lps基因编码相同的蛋白，故鼠基因可能也能用于治疗。在一更优选实施方案中，Lpsd基因以病毒载体中的形式给药。在一最优选实施方案中，该病毒载体为逆转录病毒载体。在另一优选实施方案中，该病毒载体为腺病毒载体。
本发明还提供了在有此需要的患者中预防内毒素血症的方法，其包括给予有效量的Lpsd基因。在一优选实施方案中，该Lpsd基因以病毒载体中的形式给药。在一最优选实施方案中，该病毒载体为逆转录病毒载体。在另一最优选实施方案中该病毒载体为腺病毒载体。
本发明还包括Lpsd基因在制备用于治疗或预防患者体内内毒素血症的药物中的应用。
本发明还涉及一种低应答性脂多糖内毒素应答基因Lpsd，该Lpsd基因区别于Lpsn基因之处在于它含有一个突变，使含有该突变的细胞中脂多糖内毒素的应答能力降低。在一个优选实施方案中，该Lpsd基因区别于同种的相应Lpsn基因之处在于该Lps cDNA的3’非翻译区中有突变。在一个优选实施方案中，所述突变包括该cDNA第870位的一个核苷酸取代，其中所述位点编号始于翻译起始密码子。
在一个更优选的实施方案中，所述Lpsd基因以病毒载体的形式存在，该病毒载体优选为逆转录病毒载体或腺病毒载体。
在一个优选实施方案中，所述Lpsd基因是人的基因。在另一实施方案中，Lpsd基因是鼠基因。
本发明的其它方面和优点均以图或对其优选实施方案的以下详述进行说明。
附图简述
图1A-1D显示一个LpsdcDNA的不同克隆的DNA序列。顶部一行是LpsncDNA的序列，分离自野生型LPS应答性C3H/HeOuJ小鼠。Lpsd-4，-10，-15和-17是4个分别选自含C3H/HeJ cDNA的质粒DNA序列。编号始于翻译起始位点ATG的A(第1位)，其用粗体和下划线表示。所有4个克隆的DNA在870位均含有相同的突变，即T残基被C残基置换。
图2显示了逆转录病毒的基因转入C3H/HeJ小鼠的初级脾B细胞的流程图。
图3A示N2逆转录病毒载体。图3B示N2-Lpsn逆转录载体。图3C示N2-Lpsd逆转录载体。
图4A-4D显示启动LPS的刺激和逆转录病毒的感染后的MTT增殖试验。
图5显示逆转录病毒感染的脾B细胞的RT-PCR试验。MM为分子量标准。在3次或更多次重复实验中得到了相似的结果。
图6显示在衍生自正常近交系小鼠(Ana I)、LPS低应答性C3H/HeJ小鼠(GG2EE)的巨噬细胞系中，和在感染了逆转录病毒N2-Lps(d)(#1，#7，#9和P30)的Ana I细胞中，LPS对TNF-α表达的刺激作用。
图7A和7B分别显示了Lpsn和LpsdmRNA中3’-非翻译区的二级结构。870位是单碱基置换位点，由T(Lpsn)置换为C(Lpsd)。
图8图示了Ad5-Lps腺病毒载体的构建。黑框是病毒DNA复制所必需的病毒ITR(反向末端重复序列)。“Ψ”指包装序列，CMV为巨细胞病毒启动子。在构建体中，Ad5的E1区被LpsncDNA(1.1kb)，LpsdcDNA(1.1kb)或绿荧光蛋白(GFP)基因(0.8kb)置换。
图9是Lpsd，Lpsn或绿荧光蛋白(GFP)cDNA通过腺病毒载体转移至LPS敏感小鼠后的内毒素抗性图。每只小鼠接受1mg LD100的内毒素，1小时后，静脉注射各种腺病毒的含1010个感染性病毒颗粒的培养上清。然后随着时间对动物进行观察。死的(闭环)和活的(开环)动物如所示记录。
图10显示在不同时间点，感染了Ad5-Lpsd或Ad5-Lpsn的小鼠的外周血单核细胞中腺病毒基因的表达。用实施例6所述特异性引物对外周血单核细胞的总RNA提取物进行嵌套式RT-PCR扩增。扩增产物的预期大小为793bp。
发明详述A)定义和总方法学以下定义意在帮助理解本发明的范围和实践。
“LPS”指脂多糖内毒素。
“Lpsn”和“Lpsd”被用来描述正常(指LPS的应答性)和低应答性脂多糖内毒素应答基因的各自等位形式(不管来源的物种)。Lpsd包括编码LPS蛋白，但其基因包含一个突变，使含有这类突变的细胞对LPS反应过低的任何基因。Lpsn基因也称Ran/TC4或TC4/Ran。术语“Lps基因”包括Lpsn和Lpsd，以及其它形式的天然的和实验室产生的LPS内毒素应答基因。
“Lpsn蛋白”和“Lpsd蛋白”分别被用来描述Lpsn和Lpsd基因编码的多肽。术语“Lps蛋白”包括Lpsn蛋白和Lpsd蛋白，以及其它形式的天然的和实验室产生的LPS内毒素应答基因产物。
根据本发明的一个实施方案，Lpsd基因区别于相同生物的相应Lpsn基因之处在于，其mRNA的3’非翻译区(3’UTR)有一个突变。该突变使突变区中mRNA的二级结构出现差异。在一个更优选实施方案中，该突变为单个点突变，如C3H/HeJ小鼠Lps cDNA的870位(位点编号始于翻译起始密码子ATG)上的T-C突变。
总之，后文中关于细胞培养、分子遗传学、核酸化学和杂交的命名和实验室方法均为领域内已知并常用。本发明使用了重组核酸、多核苷酸合成、细胞培养和转基因插入的标准技术。酶反应、寡核苷酸合成和纯化步骤大都按厂家说明进行。所用技术和方法大都根据本领域的常规方法以及技术人员熟知的各种通用文献进行，这些文献包括Maniatis(分子克隆，冷泉港实验室，1982)和Ausubel(分子生物学最新实验技术(Current Protocols inMolecular Biology)，Wiley and sons，1987)，它们均引入本文作为参考。
B)载体以及基因运送方法人和鼠的Lpsn蛋白具有相同的氨基酸序列，在DNA水平上人和鼠的Lpsn(TC4/Ran)基因显示89.7％的同源性。可因此用定点诱变技术，或将人Lpsn基因与含有小鼠Lpsd突变的限制性片段组合而产生突变的人Lpsd基因(cDNA)。在一个实施方案中，此突变是C3H/HeJ小鼠特征性的Lpsn基因cDNA中870位的T→C突变。人的Lpsd基因可作为基因治疗剂下调对LPS的应答，并因此用于治疗或预防患者体内内毒素血症的发生。或者，由于人和鼠的Lps蛋白相同，鼠Lpsd基因可作为人类基因治疗的有效序列。
Lpsn基因中造成LPS应答性降低的突变可如下诱导用已知诱变技术，辅以对产生的有所需LPS应答性的突变体进行筛选。使LpsncDNA突变，克隆至相应载体如N2逆转录病毒载体(Wong等，分子细胞生物学9，798-808(1989)；Wong等，Genes Dev.1，358-365(1987))，此载体含有5’和3’MMLV LTR、剪接供体和剪接受体位点、以及一个新霉素抗性标记基因。用所得pN2-Lpsx质粒DNA转染包装了病毒的细胞，从这类细胞获得病毒上清。用已知技术沉淀病毒颗粒。用N2-Lpsx载体感染巨噬细胞，如衍生自正常近交系小鼠的Ana I巨噬细胞系。分析转导的细胞经LPS刺激后TNFα的产生。
转导细胞中LPS介导的信号传递的下调通过未转导的最大值相位对照细胞中TNFα产生的减少而测定。选择通过导入巨噬细胞而诱导LPS应答性下调的突变cDNA。将Lpsx基因通过逆转录病毒运送至靶效应细胞的代表性技术述于以下实施例中。
优选地，能引起LPS应答性降低的Lpsn基因的突变可显著降低，但不会彻底消除宿主细胞的LPS应答性。
Lpsd基因优选以病毒载体的形式导入患者体内。可用于本发明的病毒载体包括腺病毒载体和逆转录病毒载体。
腺病毒是真核细胞DNA病毒，可经修饰而将核酸有效地转入各种类型的细胞中。腺病毒有各种血清型，包括2型和5型人腺病毒以及动物腺病毒。优选本发明的复制缺陷性腺病毒载体包含ITR、一种壳内序列、以及目的核酸。更优选，至少腺病毒载体的E1区无功能。其它区可能也已被修饰，包括E3区(见WO 95/02697)、E2区(见WO 94/28938)，E4区(见WO 94/28152，WO 94/12649，和WO 95/02697)，或晚期基因L1-L5中的任一种。
本发明的复制缺陷性重组腺病毒载体可用本领域技术人员已知的技术制备。具体是可用腺病毒与携带目的DNA序列的质粒的同源重组而制备。将腺病毒和质粒共转染至相应细胞系可进行有效同源重组。所用细胞系应能用所述组分转化，并包含能弥补该复制缺陷性腺病毒的缺陷区的序列。可用的细胞系实例包括人胚细胞系293(Graham等，普通病毒学杂志(J.Gen.Virol.)36，59(1977))，其基因组中整合有Ad5腺病毒基因组的左端序列(占该病毒基因组的12％)，和能够弥补E1区和E4的功能的细胞系，如WO 94/26914和WO 95/02697所述。回收重组腺病毒，用本领域技术人员熟知的标准生物学技术纯化。
一般优选将腺病毒载体用于治疗内毒素血症，其中有效治疗应通常发生在24小时内。可产生高滴度的腺病毒载体(如1010-1012感染单位/毫升)，并能以非组织特异性方式瞬时表达LPS的不应答性表型。
逆转录病毒是整合病毒，通常感染正在分化的细胞。逆转录病毒基因组包括两个LTR、一个壳内序列和三个编码区(gag，pol和env)。重组逆转录病毒载体的构建为本领域技术人员已知。
重组逆转录病毒载体中，gag，pol和env基因通常都全部或部分缺失，代之以外源的目的核酸序列。这些载体可从不同类型的逆转录病毒构建，如M-MuLV、MSV(小鼠Moloney肉瘤病毒)、HaSV(Harvey肉瘤病毒)、SNV(脾坏死病毒)、RSV(Rous肉瘤病毒)和Friend病毒。
通常，为了构建包含本发明序列的重组逆转录病毒，需构建一个质粒，其包含LTR、壳内序列以及编码序列。用该构建体转染一个能反式补充质粒中逆转录病毒的功能缺陷的包装细胞系。通常，该包装细胞系因此能表达gag，pol和env基因。这类包装细胞系已在现有技术中描述。具体可提及细胞系PA317(US 4,861,719)、PsiCRIP细胞系(WO 90/02806)、和GP+envAm-12细胞系(WO 89/07150)。重组逆转录载体可用本领域技术人员已知的标准技术纯化。
可用衍生自诸如用HIV-1、HIV-2和SIV等慢病毒的逆转录病毒载体向非分裂细胞中运送物质。这些病毒可带有其它病毒，如M-MuLV或VSV(水泡性口炎病毒)的表面糖蛋白，从而具有假表型。Bartz和Vodicka描述了带有VSV糖蛋白假表型的高滴度HIV-1的制备(方法(Methods)12(4)；337-42(1997年，8月))，Zufferey等描述了多次减毒的慢病毒载体(自然生物技术15871-75(1997年，9月))。这类慢病毒载体可感染非分裂细胞，有较宽宿主范围，并可通过超速离心浓缩至高滴度。
嵌合腺病毒/逆转录病毒载体系统也可用于进行有效基因传递和长期基因表达。Feng等人描述了一种嵌合病毒系统，其中用腺病毒载体体内生成瞬时逆转录病毒产生者细胞，以使子代逆转录病毒颗粒感染邻近细胞(自然生物技术15866-70(1997年，9月))。
逆转录病毒载体优选用于预防内毒素血症高危患者体内的内毒素血症。如，烧伤(burn)患者几乎100％发生内毒素血症。由于逆转录病毒载体能整合至造血干细胞，因而它们能生成LPS抗性T细胞、B细胞和巨噬细胞的储备库。
重组病毒载体均以有效量给予患者以治疗或预防内毒素血症。有效量取决于病人的特征、待处理之病况的类型和严重性、预期疗程、给药方法及其它因素。有效量可由医生或其他有经验的医学专家决定。本发明的重组病毒载体一般以每剂104-1014pfu的形式配制并给药。
实施例本发明的实践经以下实施例举例说明。这些实施例只为举例说明本发明的范围，并非限制。
实施例1C3H/HeJ小鼠Lpsd基因的分离与鉴定Kang等的研究(感染与免疫，64，4612-4617(1996))显示Lpsn基因能恢复C3H/HeJ小鼠脾B细胞中脂多糖介导的B细胞应答。
为证实C3H/HeJ小鼠基因组中Lps基因是缺陷的，且这种缺陷导致了对LPS刺激的低应答性，从pCD-HeJ的cDNA文库中分离Lps基因。
用C3H/HeJ脾B细胞的RNA构建Okayama-Berg cDNA表达文库(Okayama，H.和Berg，P.等，分子细胞生物学(Mol.Cell Biol.)，2，161-170(1982))。将pCD-HeJ cDNA文库涂布于8个平板(每150mm平板上5.8×104个克隆)，用LPS反应者小鼠C3H/HeOuJ的LpsncDNA中0.9kb的BamHI-PstI片段探测该文库(感染与免疫，64，4612-4617(1996))。鉴定了25个阳性克隆。
在所分析的25个独立克隆中，8个为全长cDNA，如与C3H/HeOuJ(野生型)LpsncDNA的大小比较所确定的。再对其中4个独立的全长cDNA克隆(Lpsd-4，-10，-15和-17)进行测序。将这4个独立克隆子的序列与野生型LpsncDNA进行比较。
这4个克隆子均显示在LpsncDNA的第870位发生了相同点突变(残基编号始于ATG)，即T残基被C残基取代，如图1A-1D所示。有趣的是，这一单点突变发生在3’非翻译区。通过Northern(RNA)印迹分析，C3H/HeJ和C3H/HeOuJ细胞在Lps mRNA水平上没有显著差异。
这些数据表明，发生在突变的HeJ Lpsd基因上的点突变是引起C3H/HeJ细胞对LPS低应答性的原因。
利用GCG序列分析软件包(Wisconsin)的SQUIGGLES程序比较Lpsn和LpsdmRNA的二级结构。图7A(Lpsn)和图7B(Lpsd)显示在点突变邻近区RNA二级结构有重大差异，而在远离点突变的区域则没有显著的结构差异。发生在LpsdmRNA的3’UTR区域的单碱基取代提示，存在一个独特的mRNA结构域，其可被调控蛋白结合并实施转录后调节，影响翻译效率，或影响mRNA的稳定性、运送或胞内定位。为了进一步鉴定野生的和突变的Lps基因的产物，及其在LPS应答中的作用，构建了Lpsn和Lpsd的逆转录病毒载体。
实施例2Lpsn和Lpsd逆转录病毒载体的构建将实施例1的Lpsn和LpsdcDNA克隆至N2逆转录病毒载体的XhoI位点(Wong等，分子细胞生物学，9，798-808(1989)；Wong等，Genes Dev.1，358-365(1987))。该N2逆转录病毒载体包括5’和3’MMLV LTR，剪接供体位点和剪接受体位点，及一个新霉素抗性标记基因。
将LpsncNDA从pCD-LPS的XhoI限制性片段分离(感染与免疫，64，4612-4617(1996))并连接至N2逆转录病毒载体的XhoI限制性片段的位点上，产生pN2-Lpsn。使用同样的方法产生pN2-Lpsd载体，不同的是所用为突变的LPSdcDNA。
为了产生携带Lpsn和Lpsd序列的逆转录病毒储备物，分别用pN2-Lpsn和pN2-Lpsd质粒DNA以磷酸钙DNA共沉淀法转染GP/E病毒包装细胞(Markowitz，等，病毒学杂志，62，1120-1124，(1988))。在含1mg/ml G418的培养基上筛选阳性转染子。单个G418抗性克隆得到分离、增菌和鉴定。
为了产生浓缩的病毒上清，从产生病毒的细胞中收集病毒，并用600μl病毒上清在0.4M NaCl和8.5％的PEG 8000(Sigma)中于4℃连续搅拌1-1.5小时以使病毒沉淀。7500rpm离心10分钟以收集沉淀。沉淀用原体积1％的NTE缓冲液(100mM NaCl，10mM Tris-Cl pH 7.4，1mM EDTA，过滤除菌)溶解。然后将该溶液于4℃上样于Sepharose CL-4B层析柱。收集并汇总多个级分。每个汇总级分经过滤除菌并用NIH/3T3细胞测定G418抗性以反映病毒效价(Wong等，分子细胞生物学，9，798-808(1989))。
N2亲代载体、N2-Lpsn及N2-Lpsd载体的构建均分别示于图3A-3C。
实施例3Lpsn和Lpsd基因经逆转录病毒转入C3H/HeJ小鼠的脾B细胞中A)逆转录病毒基因的转移取自C3H/HeJ小鼠的脾B细胞，去掉血红细胞，在100μg/ml LPS存在下，进行逆转录病毒感染，然后在S17间质细胞条件培养基(已知能刺激前B细胞生长)中培养(Collins等，免疫学杂志，138，1082-1087(1987)；Dorshkind等，免疫学方法杂志(J.Immunol.Meathods)，123，93-101(1989)；Narendran等，欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)，22，1001-1006(1992))。为了使逆转录病毒的感染效率最高，反复用浓缩的病毒上清新鲜原液更新培养液，如图2的流程图所述。N2亲代载体、N2-Lpsn或N2-Lpsd载体的浓缩原液的病毒滴度均标准化为2×106G418个菌落/ml。
B)MTT增殖试验启动LPS的刺激及逆转录病毒的感染后，在不同时间点收集细胞，进行MTT[3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物]增殖试验(Han等，美国国家科学院学报92，11014-11018(1995))。
一个100mm的细胞培养平板，含10ml S17CM(在含10％胎牛血清和5μM 2-巯基乙醇的RPMI中培养S17细胞24小时，在0、12、24、48小时的alignment)，将107个已去掉血红细胞的C3H/HeJ脾细胞置于该平板中培养6小时。然后收集未贴壁的细胞，并用10ml感染混合物在一个100mm平板上再感染16小时。该感染混合物含有3ml浓缩的病毒上清(滴度为2×106个病毒颗粒/ml)，1ml S17CM，10μg/ml polybrene，10-100μg/ml热酚提取的鼠伤寒沙门氏菌LPS。16小时后，收集细胞，再用新鲜的感染混合物感染16小时。然后，用2ml S17CM中的10μg/ml或100μg/ml LPS刺激收集的细胞，并在24孔板上培养0，12，24，48小时。然后，将受到逆转录病毒感染及LPS刺激的细胞取100μl置于96孔板上。加入10μl 5mg/ml MTT并与细胞混合，然后将该平板置于培养箱。培养4小时后，加入100μl含0.04NHCl的异丙醇，充分混合，在微滴板读数仪上读取570nm处的O.D.。
在32小时(即图2所示的培养0小时)，所有培养物之间未发现细胞增殖的显著差异(图4A)。在44小时(即图2所示的培养12小时)，N2-Lpsn感染细胞显示明显的细胞增殖，而N2-Lpsd细胞或N2感染细胞则没有(图4B)。培养物的感染启动68小时后(即图2所示的培养48小时)，N2-Lpsn感染培养物与N2感染培养物或N2-Lpsd感染培养物之间，在LPS应答中存在4倍的最大差别。该应答自92小时开始降低。
在培养中，N2-Lpsn感染的C3H/HeJ脾B细胞在44小时所观察到的LPS应答，与C3H/HeOuJ反应者脾B细胞接受LPS刺激24小时后的LPS应答水平相同(未显示数据)。这种延迟可归因于(1)48小时后，仅有约50％的细胞被N2-Lpsn载体转导，(2)病毒的整合以及转导基因的表达需要一个滞后时间。N2-Lpsn感染的培养物比N2或N2-Lpsd感染的培养物的细胞增殖更明显，因为前者正在增殖的小淋巴细胞和母细胞化的细胞数都远高于后者(数据未列出)。而且，还发生了多克隆B细胞的分化，因为N2-Lpsn转导的C3H/HeJ脾B细胞能被LPS刺激而产生裂解绵羊红细胞的抗体，这与过去曾报道过的相似(Kang等，感染与免疫，64，4612-4617，(1996))，但N2或N2-Lpsd载体转导的C3H/HeJ脾B细胞则不能。
C)RT-PCR分析为了进一步说明，对LPS的应答或不应答是由于相应野生型或突变型Ran cDNA经逆转录病毒的成功转移，对所有培养物的细胞进行RT-PCR分析。其中用到逆转录病毒载体中出现的SV40启动子的特异性5’寡聚引物，和特异于Lpsn或LpsdcDNA的3’引物。
用4M GTC和酚/氯仿从逆转录病毒感染的脾B细胞中提取总RNA。用AWV-RT产生cDNA。PCR反应有两个引物5’引物(TCTAAAAGCTGCTGCAGG，SEQ ID NO3)来自pCD的XhoI片段，3’引物(GTACACGATCTGCTTAGC，SEQ ID NO4)来自Lps cDNA，用于产生一个907bp的片段。结果如图5所示。
N2-Lpsn和N2-Lpsd所转导的细胞均可见预期的907bp条带，而N2病毒所转导的细胞则没有，这证明转导的基因成功表达。该引物特异于LpsRNA，因为当用基因组DNA进行PCR反应时，未见图5所示的907bp条带。这是因为5’引物特异于Lps cDNA上游的载体序列。故C3H/HeJ小鼠脾B细胞中LpsncDNA而非LpsdcDNA的导入和表达导致了对LPS刺激的显著应答能力的恢复。C3H/HeJ系和其它反应者品系小鼠的经典繁殖实验表明，LPS的促有丝分裂应答受由共显性等位基因所组成的单个位点控制。在此显示的结果清楚表明，Ran是Lps应答基因，它在对LPS应答降低的C3H/HeJ小鼠中是缺陷的。
实施例4Lpsd基因经逆转录病毒转移至正常近交系小鼠的巨噬细胞中Ana I是来自正常近交系小鼠的巨噬细胞系，GG2EE是来自C3H/HeJ低应答者小鼠的巨噬细胞系。用实施例2的N2-Lps(d)逆转录病毒载体感染Ana I细胞，并分析转导的细胞受LPS刺激后不同时间点的TNFα的产生。
逆转录病毒转导时，使1×106个细胞的悬浮液与5毫升逆转录病毒上清在有10μg/ml polybrene存在时混合。于37℃，5％CO2中振荡培养4小时。然后使细胞于1500rpm离心10分钟，用D10G(DMEM加10％热灭活的FBS，2mM L-谷氨酰胺，10μg/ml庆大霉素和1mg/ml G418)洗并重悬于5ml D10G中。将1.6ml甲基纤维素、0.4ml逆转录病毒转导的细胞、1mg/ml G418混合以制备甲基纤维素混合物，将该混合物(每平板约1.1ml)铺到35mm平板上。挑取菌落，增菌，两周后收集。
进行LPS刺激时，将细胞(Ana I，GG2EE，及逆转录病毒转导的Ana I细胞)接种在24孔的板上(5×105个细胞/孔)，于37℃5％CO2中培养。分别在0，24，48或72小时时用100ng/ml的LPS刺激细胞。收集培养上清，用ELISA法测定TNFα的量。
做TNFα分析，微滴板上每孔加50μl的TNFα捕获抗体(2μg/ml)，4℃过夜。然后平板用PBST洗4遍，每孔加入封闭液(200μl)，室温30分钟。平板再用PBST洗4次，每孔加入样品100μl。4℃过夜，而后以PBST洗4遍。为了检测TNFα，每孔加入生物素化的TNFα抗体(1μg/ml，100μl/孔)，将板室温放置1小时，然后以PBST洗。加入链抗生物素蛋白-HRP偶联酶(1∶1000稀释，100μl/孔)，将板室温放置30分钟，用PBST洗8次。加入ABTS底物(100μl/孔)，于室温中显色。通过读取OD 405nm值测定颜色。结果如图6所示。
#1，#7，和#9都是独立的克隆，而P30是从30个独立克隆的混合物所衍生的细胞。该实验表明，Lpsd基因在Ana I反应者细胞中的表达可下调这些细胞中LPS介导的信号传递。Lpsd基因可因此作DNA药物来治疗或预防患者体内内毒素血症的发生。
实施例5腺病毒载体的构建及用于腺病毒性Lps体内转移的病毒的制备将Lpsd，Lpsn及GFP基因按如下方法克隆到Ad5腺病毒载体上并取代其E1区。载体的构建按图8所示的流程。
用BamHI从pCD-Lpsn和pCD-Lpsd的3249位和35位切下Lpsn和Lpsd的cDNA(后者在cDNA的870位含有T-C突变，其由StemCell Therapeutics提供)。分别将它们插入到Ad5基因组的E1区，并受CMV启动子驱动。pEGFP质粒的GFP(绿色荧光蛋白)基因用BamHI和NotI切出，插入至相同位点，并同样受CMV启动子驱动。重组腺病毒因缺失E1而为复制缺陷型。但它们可在含有E1基因的293细胞中复制。为了制备重组病毒，用重组Ad5DNA转染293细胞。10天后，通过从培养瓶中刮取而收集细胞。经过三轮的乙醇/干冰浴冷冻及37度快速化冻的过程，取1ml病毒裂解液感染20个150mm平板上的293细胞。三天后，如上述收集病毒，用CsCl将其离心为带状以纯化并对PBS透析三次。为测定病毒滴度，在6孔平板上接种293细胞。24小时后，用系列稀释的病毒原液感染。两小时后，去掉培养基，将细胞覆盖在含2％PBS和1％琼脂糖的培养基上，10天后，计数平板上的空斑数。腺病毒载体滴度为1012pfu/ml。
实施例6Lps用腺病毒载体进行的体内转移在本研究中，远交系CD1小鼠买自Charles River公司，经诱导使其得败血性休克，然后用带有Lpsd，Lpsn或GFP cDNA的载体处理。使用远交系CD1小鼠是为了观察实验结果中的异质性程度。
A)接种用小鼠测定内毒素的LD50和LD100分别为0.6mg和1mg。然后每只小鼠腹膜内接种1mg内毒素(相当于LD100)。1小时后，每只小鼠静脉注射1010pfu/ml的Ad5-Lpsd，Ad5-Lpsn或Ad5-GFP病毒0.5ml。
B)存活每隔6-12小时观察小鼠。结果如图9所示。所有用1mg LPS处理的小鼠在36小时内死亡，用Ad5-Lpsn或Ad5-GFP处理的小鼠亦如此。用Ad5-Lpsd处理的小鼠有一半在同样的时间段内死亡，但另一半存活(图9)。基因转移治疗后存活的异质性与远交系小鼠的使用相关。该组内的一只存活鼠开始时表现得萎靡不振，但康复后则变得很健康。只注射Ad5病毒的小鼠都没有死亡，说明其没有毒性。因此，突变的LpsncDNA的转移可挽救对内毒素敏感的小鼠于败血休克。
C)转导小鼠的PCR检测为了确定腺病毒基因转移的存在，在不同时间收集用Ad5-Lpsd或Ad5-Lpsn进行了体内基因转移的小鼠的外周血液单核细胞，以提取RNA，如下所述。
CD1小鼠尾静脉接种约1010pfu的感染性重组腺病毒颗粒。在2，4，6，10和24小时后将全血收集在血细胞比容管中。离心，收集淡黄色白细胞层，在GTC缓冲液中裂解(Wong等，病毒学杂志，68，5523-5531，1994)以提取总RNA。每份RNA样品的终体积为10μl；这些样品都用oligo-dT引物如所述(同上)进行逆转录。RT反应的总体积为20μl。从20μl中取出2μl用于如曾报道过的(同上)一样进行嵌套式PCR扩增。每一反应中，在50μl的反应体积中使用1.5个单位的Taq聚合酶(Sigma)。第一轮PCR扩增时，样品先经95℃5分钟变性，然后经变性(94℃1分钟)、退火(60℃1分钟)和引物延伸(72℃1分钟)共20个循环。最后一轮再一次72℃10分钟的引物延伸。第一轮PCR扩增中，5’引物序列(T7正义链)为5’-TAA TAC GAC TCA CTATAG GGA GA-3’(SEQ ID NO5)，其特异于T7启动子序列，3’引物序列(D2反义链)为5’-GAA ATT CAG AAA GGA AAC AAC TCT GTT CCA-3’(SEQ ID NO6)，其为特异于Lps cDNA(始于810位核苷酸)的反义序列。预计所扩增的DNA片段为1020bp。第二轮嵌套式PCR扩增中，从第一轮PCR扩增的反应总体积50μl中取出2μl进行第二轮PCR。5’引物为pcDNA3(Invitrogen)正义链序列5’ACT ATA GGG AGA CCC AAG CT-3’(SEQ ID NO7)，其特异于pcDNA3，该载体序列在构建时与腺病毒载体中的Lps cDNA连接。3’引物(R1反义链)序列为5’-AGC AGT CGT CTG AGCAAC CT-3’(SEQ ID NO8)，其特异于Lps cDNA(始于第606位核苷酸)。预计PCR扩增的产物为790bp。样品先经95℃5分钟变性，然后进行94℃1分钟，60℃1分钟及72℃1分钟的35个循环，最后再进行一步72℃10分钟的引物延伸反应。
D)PCR结果体内基因转移后，仅2小时的细胞RNA即包含一个793bp的条带，说明有逆转录病毒的mRNA存在(图10)。缺乏逆转录或cDNA模板时未见这种条带(图10)。这些数据表明静脉接种载体后仅2小时就能发生腺病毒基因的表达。
所有引用的参考文献，包括公开了合成，制备和分析方法的文献，均在此引入作为参考。
本发明也可以按其他特殊的方案实施，只要没有其精神或基本特征，因此，在说明本发明的范围时，除了参照前面的说明书以外，更应参照所附权利要求。
序列表<110>Wong，Peter M.C.
<120>治疗内毒素血症的方法<130>252PC<140>尚未有申请号<141>1999-04-26<150>60/083,210<151>1998-04-27<160>8<170>PatentIn ver.2.0<210>1<211>1166<212>DNA<213>小鼠<400>1cccccctccg cgcgccggcg tccgctgcgt ctccggcatt tgaatcgcgt ccgccatctt60tccagctcca gtcggacagg cgcgcagact cttctggaag gatccgccgc gatggccgcc120cagggagagc cgcaggtcca gttcaagctc gtcctggtgg gcgacggcgg caccgggaag180acaaccttcg tgaagcgcca cttgacgggc gagtttgaga agaagtatgt agccaccctg240ggcgtggagg tgcacccgct cgtcttccat accaacagag gacccatcaa gttcaacgtg300tgggacacgg ccggccagga gaagttcggg ggcctgcgcg atggctacta catccaagcc360cagtgtgcca ttataatgtt tgatgtaacc tcaagagtta cttacaagaa tgtacctaac420tggcatagag atctggtacg agtgtgtgaa aacatcccca ttgtattgtg tggcaacaaa480gtggatatta aagacaggaa agtgaaggca aaatctattg tcttccaccg gaagaagaat540cttcagtact atgacatttc tgccaaaagt aactacaact ttgaaaagcc tttcctctgg600cttgccagaa agctcattgg agatcctaac ttggagtttg ttgccatgcc tgctcttgcc660ccacctgagg tggtcatgga cccagctttg gcagcacagt acgagcatga tttagaggtt720gctcagacga ctgctctccc agatgaggat gatgacctgt gagaaagtga agctggatgc780cctgcgtcag aagtctagtt ttataggcaa ctgtcctgtg atgtcaagcg gtgcagcgcg840tgtgccacct tatttagcta agcagatcgt gtacttcatt gggatgctga aggagatgaa900tgggcttcga gtgaatgtgg cagttaaaca taccttcatt ttttggactt gcatatttag960ctgtttggaa cagagttgtt tcttttctga atttcaaaga taagactgct gcagtcccat1020cgcaatatcc agtggggaaa tcttgtttgt tactgtcatt cccattcttt tcgttagaat1080cagaataaag ttgtatttca aataatctaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa1140aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 1166
<210>2<211>216<212>PRT<213>小鼠<400>2Met Ala Ala Gln Gly Glu Pro Gln Val Gln Phe Lys Leu Val Leu Val1 5 10 15Gly Asp Gly Gly Thr Gly Lys Thr Thr Phe Val Lys Arg His Leu Thr20 25 30Gly Glu Phe Glu Lys Lys Tyr Val Ala Thr Leu Gly Val Glu Val His35 40 45Pro Leu Val Phe His Thr Asn Arg Gly Pro Ile Lys Phe Asn Val Trp50 55 60Asp Thr Ala Gly Gln Glu Lys Phe Gly Gly Leu Arg Asp Gly Tyr Tyr65 70 75 80Ile Gln Ala Gln Cys Ala Ile Ile Met Phe Asp Val Thr Ser Arg Val85 90 95Thr Tyr Lys Asn Val Pro Asn Trp His Arg Asp Leu Val Arg Val Cys100 105 110Glu Asn Ile Pro Ile Val Leu Cys Gly Asn Lys Val Asp Ile Lys Asp115 120 125Arg Lys Val Lys Ala Lys Ser Ile Val Phe His Arg Lys Lys Asn Leu130 135 140Gln Tyr Tyr Asp Ile Ser Ala Lys Ser Asn Tyr Asn Phe Glu Lys Pro145 150 155 160Phe Leu Trp Leu Ala Arg Lys Leu Ile Gly Asp Pro Ash Leu Glu Phe165 170 175Val Ala Met Pro Ala Leu Ala Pro Pro Glu Val Val Met Asp Pro Ala180 185 190Leu Ala Ala Gln Tyr Glu His Asp Leu Glu Val Ala Gln Thr Thr Ala195 200 205Leu Pro Asp Glu Asp Asp Asp Leu210 215<210>3<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
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<400>3tctaaaagct gctgcagg 18<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>对人工序列的描述3’引物<400>4gtacacgatc tgcttagc 18<210>5<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>对人工序列的描述5’引物<400>5taatacgact cactataggg aga23<210>6<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>对人工序列的描述3’引物<400>6gaaattcaga aaggaaacaa ctctgttcca 30<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述5’引物<400>7actataggga gacccaagct 20<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>对人工序列的描述3’引物<400>8agcagtcgtc tgagcaacct 20
权利要求
1.一种低应答性脂多糖内毒素应答基因Lpsd，该Lpsd基因区别于同种的相应Lpsn基因之处在于该Lps cDNA的3’非翻译区中有突变。
2.权利要求1的一种低应答性脂多糖内毒素应答基因Lpsd，其中所述突变包括该cDNA第870位的一个核苷酸取代，其中所述位点编号始于翻译起始密码子。
3.权利要求1的一种低应答性脂多糖内毒素应答基因Lpsd，其中所述Lpsd基因以病毒载体的形式存在，该病毒载体优选为逆转录病毒载体或腺病毒载体。
4.低应答性脂多糖内毒素应答基因Lpsd在制备治疗或预防有需要的患者中内毒素血症的药物中的用途，其中所述Lpsd基因区别于同种的相应Lpsn基因之处在于该Lps cDNA的3’非翻译区中有突变。
5.权利要求4的用途，其中所述突变包括该cDNA第870位的一个核苷酸取代，其中所述位点编号始于翻译起始密码子。
6.权利要求4的用途，其中所述Lpsd基因以病毒载体的形式存在。
7.权利要求6的用途，其中所述病毒载体是逆转录病毒载体。
8.权利要求6的用途，其中所述病毒载体是腺病毒载体。
9.权利要求4的用途，其中所述患者为烧伤患者。
全文摘要
本发明提供了一种治疗剂，其包含能下调Lps介导的信号传递并因此可以给药用于治疗和预防内毒素血症的发生的Lps
文档编号A61K48/00GK1990865SQ200610100640
公开日2007年7月4日 申请日期1999年4月26日 优先权日1998年4月27日
发明者彼得·M·C·王 申请人:联邦高等教育系统坦普尔大学