专利名称：一种细胞免疫疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及疫苗及其制备方法，特别是涉及一种在细胞水平上对多种传染性疾病具有预防保护作用的疫苗及其制备方法。
背景技术：
各种传染性疾病严重威胁着动物以及人类的健康，而且进入21世纪，还不断有新的疾病向人类发起挑战。从2003年的SARS，到现在的高致病性禽流感，都严重威胁到人类的健康乃至生命。此外，肿瘤与自体免疫疾病，也是对人类健康威胁巨大的顽症。因此，迫切需要一种对传染性疾病和/或肿瘤具有预防和/或治疗性作用的疫苗。
此外，利用高致死性病原体实施的恐怖袭击，会对人类社会造成巨大的恐慌与威胁，比如炭疽的使用，已经给美国及其它国家敲响了警钟，为此各国政府积极研究生物防恐措施，其中，新型的免疫接种与治疗方法将在生物反恐中发挥重要作用。
预防接种是预防传染性疾病的主要方法，为人类医学的发展和畜牧生产水平的提高起到了巨大的推动作用，现在依然是抗病的重要手段与方法。目前进行疫苗研究的主要对象是引发疾病的致病源(或病源体等)，但由于病原体的突变速度较快，研制疫苗的速度远远滞后，往往造成疾病流行早期的无法控制，为此将付出惨痛代价。另外，由于超强毒株的出现，通过病原体对新宿主的适应或定向突变，还会引发跨物种的传播与流行。迫切需要一种新的预防接种方法，以应对新病源体的突变与疾病的流行，将在应战生物恐怖袭击、提前发现病原体的生物学特性、进行超早期预防接种等方面发挥重要作用。
众所周知，机体对病原体的防御主要通过三个方面实现一、通过表皮与粘膜等防止病原体侵入机体；二、利用免疫细胞消灭侵入的病原体，也被称为非特异性免疫；三、利用病原体特异性标志在细胞与体液两个方面进行特异性免疫，又被称为获得性免疫。预防接种主要是引发特异性免疫，同时利用免疫细胞的记忆性，实现免疫接种后长期有效的目的。
在诱发免疫反应的过程中，首先是病原体侵入机体，机体内的上皮细胞、单核/巨噬细胞等具有抗原呈递功能的细胞将病原体吞噬、消化，在MHC I和MHC II的协同作用下，将分离出的抗原片段运送到细胞表面，之后呈递给T细胞，诱发细胞与体液免疫反应。在抗原呈递过程中，单核/巨噬细胞、树突状细胞(dendritic cell，DC)和B细胞的呈递效率较高，因此也被称为专职抗原呈递细胞。
单核细胞由骨髓的造血干细胞分化而来，在血液中停留一段时间后进入不同的组织后，或保持单核细胞特性(如单核细胞侵润)，或分化成巨噬细胞。组织内的巨噬细胞依据其所在组织的类型不同其名字也有不同，在上皮组织中的叫朗格汉斯细胞，在肺组织中的巨噬细胞叫做肺巨噬细胞，在肝脏被称为枯否(Kupffer)细胞等等。一般认为除少数单核细胞或低分化的巨噬细胞外，成熟的巨噬细胞很少有或没有增殖能力，并不断被骨髓前体细胞分化的细胞所补充。
发明内容
本发明的目的是提供一种在细胞水平上对传染性疾病具有预防和治疗作用的疫苗。
本发明所提供的细胞免疫疫苗，是将单核/巨噬细胞或树突状细胞与纯化的单一或多种病原体或其部分组分，或未经纯化的病料共培养后得到的免疫细胞。
所述病原体可以是致病微生物(包括病毒)、寄生虫，或者是灭活的微生物或寄生虫；所述病源体的部分组分可为病原体的蛋白质或RNA。所述病料可为肿瘤细胞等。
本发明的第二个目的是提供一种上述细胞免疫疫苗的制备方法。
本发明所提供的细胞免疫疫苗的制备方法，是将单核/巨噬细胞或树突状细胞与单一或多种病原体或其部分组分，或病料在36-38℃下共培养24-72h，清洗细胞，得到疫苗；所述单核/巨噬细胞或树突状细胞与病原体的比例为1∶1-10000，所述单核/巨噬细胞或树突状细胞与病料的比例为1∶1-10000。
在上述疫苗的制备方法中，所述单核/巨噬细胞或树突状细胞可直接来源于动物的外周血、骨髓、组织，或经体外诱导分化间接获得。
其中，单核/巨噬细胞或树突状细胞的体外诱导分化方法可为将单个核细胞用添加有浓度为10-100μg/mL细胞因子的RPMI1640或TCM199完全培养液在37℃下培养1-10d，得到单核/巨噬细胞或树突状细胞；所述细胞因子为GM-CSF、M-CSF、IL-4和IL-6中的一种或几种。
所述单个核细胞的来源是广泛的，即具有单个核细胞的动物均可，包括人、牛、猪、犬、猫、鹿等哺乳动物，以及鸡、鸵鸟、孔雀等鸟类动物。
可采用常规方法进行单个核细胞的分离，例如静脉采血，用体积百分浓度为2.5-5％的肝素纳或2.5-5％的柠檬酸钠溶液抗凝血，再从抗凝血中用淋巴细胞分离液通过密度梯度离心法分离得到单个核细胞。所述淋巴细胞分离液可采用市售的即可。
为获得更纯的单个核细胞，可对单个核细胞进行纯化，纯化方法可为对单个核细胞进行体外培养，待细胞贴壁后，移走悬浮细胞，得到纯化的单个核细胞。
所述单个核细胞的体外培养条件可为用RPMI1640或TCM199等完全培养液在36-38℃下培养1-7d。
所述病原体可以是致病微生物(包括病毒)、寄生虫，或者是灭活的微生物或寄生虫；所述病源体的部分组分可为病原体的蛋白质、RNA等。
所述共培养培养基采用添加体积百分浓度8-12％血清的常规动物细胞培养基即可。所述血清可为胎牛血清等，动物细胞培养基可为RPMI1640或TCM199等完全培养基。
本发明疫苗在使用时，可将其回输至皮下、淋巴结、肌肉、血液、粘膜等可以引发免疫反应的相关部位，通过诱发体内免疫反应达到对疾病预防和/或治疗的作用。
本发明提供了一种细胞免疫疫苗及其制备方法。该疫苗是将单核/巨噬细胞或树突状细胞与纯化的单一或多种病原体或其部分组分，或病料共培养，在体外条件下实现了抗原呈递，回输体内后可诱发免疫反应，达到对疾病预防和/或治疗的作用。本发明的疫苗具有以下优点1)免疫性高，该疫苗可强烈地引发特异性抗体产生，抗体效价可达到1∶10-100000；2)安全性高，检测了体外攻击24小时后病原体在单核/巨噬细胞内的消化情况，结果没有发现存活的病原体；3)广谱性高，动物机体的特异性免疫都是通过单核/巨噬细胞或树突状细胞来实现的，因此该疫苗适用于除了攻击免疫细胞的病原体之外的所有致病生物；4)单核/巨噬细胞或树突状细胞具有自动处理与加工抗原的能力，比人为筛选的抗原表位更加准确，速度更快，可以说是抗原加工的自动化处理机器，因此用该疫苗处理未知病原体，可作为疾病爆发初期的一种预防手段；4)疗效显著，对鸡白痢病、猪丹毒病等均具有较好的治疗效果。此外，单核/巨噬细胞、树突状细胞的分离、纯化及体外培养方法简单，可大量获得，因而该疫苗的制备方法简单、成本低廉，具有工业化生产的可行性。本发明的疫苗及其制备方法将在医学、动物生产领域，特别是各种自体免疫疾病的预防与免疫治疗方面发挥重要作用，应用前景广阔。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
说明书附1为将纯化单个核细胞的吖啶橙(AO)染色、姬姆萨染色和CD14间接免疫荧光染色鉴定结果具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1、鸡白痢病疫苗的制备及其检测一、制备疫苗
1、单个核细胞的获取与纯化1)单个核细胞的分离从鸡中分离单个核细胞，具体方法为将鸡翅下静脉采血部位消毒，静脉采血，加入体积百分浓度为5％的肝素钠溶液抗凝血，再从抗凝血中用淋巴细胞分离液(购自Cedarlane公司)通过密度梯度离心法分离得到单个核细胞。
2)单个核细胞的纯化将单个核细胞用RPMI1640完全培养液在37℃、5％CO2保和湿度培养箱中培养8-24h，待细胞贴壁后，移走悬浮细胞，对贴壁细胞进行吖啶橙(AO)染色、姬姆萨染色和CD14间接免疫荧光染色鉴定，结果如
图1所示(a-1为新分离的单个核细胞(还有其它一些细胞)进行吖啶橙染色的结果，三种箭头标识的细胞从上到下分别为单个核细胞、粒细胞、淋巴细胞，a-2为荧光显微镜下的观察结果。b-1为培养7d的单个核细胞进行姬姆萨染色的结果，b-2为部分放大。c-1为培养7d的单个核细胞进行CD14间接免疫染色的结果，c-2为荧光显微镜下的观察结果(标尺为30μm))，表明获得了纯度较高的单个核细胞。
3)单核/巨噬细胞的获得将纯化的单个核细胞用RPMI1640完全培养液在37℃下培养5天，得到单核/巨噬细胞。
3、鸡白痢病疫苗的制备取鸡白痢沙门氏菌与单核/巨噬细胞按1000∶1的比例混合，用添加体积百分浓度10％胎牛血清的RPMI1640完全培养基在37℃的CO2培养箱中共培养1h，洗去未被消化的病原体，分两组，分别继续培养1h(A组)、24h(B组)小时，得到已吞噬病菌的免疫细胞，可作为鸡白痢病疫苗。
二、效价测定将步骤一获得的B组免疫细胞按1000个/只的剂量回输到鸡的皮下部位，以诱发免疫反应。注射后14d，用ELISA法检测免疫鸡的抗体效价，结果达到1∶10-100000，表明用本发明方法制备的鸡白痢病疫苗可诱发机体的免疫反应。
三、安全性检测将步骤一获得的A、B两组免疫细胞用PBS洗涤3次，然后加入1mL 1％Triton-X100裂解细胞膜释放胞内菌，然后稀释100倍，取200μl涂布于营养肉汤琼脂平板(购于北京奥博星生物技术责任有限公司)上，24小时后计数菌落数。结果A出现菌落，而B组没有发现菌落，说明病原体已经被免疫细胞所消化，没有相应的病原体产生，证明用本发明方法制备的疫苗具有较高的生物安全性。
四、免疫效果检测将步骤一获得的B组免疫细胞按1000个/只的剂量回输到未接触过鸡白痢沙门氏菌的健康鸡个体，使其获得免疫记忆。然后用浓度为107个/mL的沙门氏菌攻毒，结果获得100％保护，表明用本发明方法制备的鸡白痢沙门氏菌疫苗对鸡白痢病具有较好的效果。
实施例2、猪丹毒疫苗的制备及其检测一、制备疫苗1、单个核细胞的获取与纯化1)单个核细胞的分离从猪中分离单个核细胞，具体方法为将猪前腔静脉采血部位消毒，静脉采血，加入体积百分浓度为5％的柠檬酸钠溶液抗凝血，再从抗凝血中用淋巴细胞分离液通过密度梯度离心法分离得到单个核细胞。
2)单个核细胞的纯化将单个核细胞用RPMI1640完全培养液在37℃培养箱中培养24-48h，待细胞贴壁后，移走悬浮细胞，对贴壁细胞进行吖啶橙(AO)染色、姬姆萨染色和CD14间接免疫荧光染色鉴定，鉴定结果表明获得了纯度较高的单个核细胞。
3)单核/巨噬细胞的获得将纯化的单个核细胞用RPMI1640完全培养液在37℃下培养7天，得到单核/巨噬细胞。
2、猪丹毒疫苗的制备取猪丹毒杆菌与单核/巨噬细胞按10000∶1的比例混合，用添加体积百分浓度10％胎牛血清的RPMI1640完全培养基在37℃的CO2培养箱中共培养1h，洗去未被消化的病原体，继续培养24h，得到已吞噬病菌的免疫细胞，可作为猪丹毒疫苗。
二、效价测定将步骤一获得的免疫细胞按1000个/只的剂量回输到猪的淋巴结，以诱发免疫反应。注射后14d，用ELISA法检测免疫猪的抗体效价，结果达到1∶10-100000，表明用本发明方法制备的猪丹毒疫苗可诱发机体的免疫反应。
三、安全性检测将步骤一获得的免疫细胞用PBS洗涤3次，然后加入1mL 1％Triton-X 100裂解细胞膜释放胞内菌，然后稀释100倍，取200μl涂布于营养肉汤琼脂平板上，24h后计数菌落数。结果没有发现菌落，说明病原体已经被免疫细胞所消化，没有相应的病原体产生，证明用本发明方法制备的疫苗具有较高的生物安全性。
四、免疫效果检测将步骤一获得的免疫细胞按1000个/只的剂量回输到未感染猪丹毒杆菌猪的淋巴结，使其获得免疫记忆。然后用107个/mL的猪丹毒杆菌攻毒，发现获得保护，表明用本发明方法制备的猪丹毒疫苗对猪丹毒病具有较好的效果。
实施例3、牛结核病疫苗的制备及其检测一、制备疫苗1、单个核细胞的获取与纯化1)单个核细胞的分离从牛中分离单个核细胞，具体方法为将人静脉采血部位消毒，静脉采血，加入体积浓度为5％的柠檬酸钠溶液抗凝血，再从抗凝血中用淋巴细胞分离液通过密度梯度离心法分离得到单个核细胞。
2)单个核细胞的纯化将单个核细胞用TCM199完全培养液在37℃培养箱中培养24-72h，待细胞贴壁后，移走悬浮细胞，对贴壁细胞进行吖啶橙(AO)染色、姬姆萨染色和CD14间接免疫荧光染色鉴定，鉴定结果表明获得了纯度较高的单个核细胞。
3)树突状细胞的获得将纯化的单个核细胞用50μg/mL GM-CSF的TCM199完全培养液在37℃下培养3天，得到树突状细胞。
2、牛结核病疫苗的制备取牛结核分枝杆菌与树突状细胞按100∶1的比例混合，用添加体积百分浓度10％胎牛血清的TCM199完全培养基在37℃的CO2培养箱中共培养1h，洗去未被消化的病原体，继续培养48h小时，得到已吞噬病菌的免疫细胞，可作为牛结核病疫苗。
二、效价测定将步骤一获得的免疫细胞按1000个/只的剂量回输到牛的淋巴结，以诱发免疫反应。注射后14d，用ELISA法检测免疫牛的抗体效价，结果达到1∶10-1000000，表明用本发明方法制备的牛结核病疫苗可诱发机体的免疫反应。
三、安全性检测将步骤一获得的免疫细胞用PBS洗涤3次，然后加入1mL 1％Triton-X 100裂解细胞膜释放胞内菌，然后稀释100倍，取200μl涂布于营养肉汤琼脂平板上，24小时后计数菌落数。结果没有发现菌落，说明病原体已经被免疫细胞所消化，没有相应的病原体产生，证明用本发明方法制备的疫苗具有较高的生物安全性。
四、免疫效果检测将步骤一获得的免疫细胞按1000个/只的剂量回输到未曾感染牛结核分枝杆菌的健康牛牛淋巴结，使其获得免疫记忆。然后用浓度为107个/mL的牛结核分枝杆菌攻毒，发现牛获得免疫保护，表明用本发明方法制备的牛结核病疫苗对牛结核病具有较好的效果。
权利要求
1.一种细胞免疫疫苗，是将单核/巨噬细胞或树突状细胞与经纯化的单一或多种病原体或其部分组分，或未经纯化的病料共培养后得到的免疫细胞。
2.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于所述病原体为致病微生物、寄生虫，或者是灭活的致病微生物或寄生虫；所述病源体的部分组分为病原体的蛋白质或RNA。
3.根据权利要求1或2所述的疫苗，其特征在于所述病料为肿瘤细胞。
4.一种制备权利要求1所述疫苗的方法，是将单核/巨噬细胞或树突状细胞与单一或多种病原体或其部分组分，或病料在36-38℃下共培养24-72h，清洗细胞，得到疫苗；所述单核/巨噬细胞或树突状细胞与病原体的比例为1∶1-10000，所述单核/巨噬细胞或树突状细胞与病料的比例为1∶1-10000。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述单核/巨噬细胞或树突状细胞来源于动物的外周血、骨髓、组织，或经体外诱导分化获得。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述单核/巨噬细胞或树突状细胞的体外诱导分化方法为将单个核细胞用添加有浓度为10-100μg/mL细胞因子的RPMI1640或TCM199完全培养液在36-38℃下培养1-10d，得到单核/巨噬细胞或树突状细胞；所述细胞因子为GM-CSF、M-CSF、IL-4和IL-6中的一种或几种。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述单个核细胞来源于哺乳动物或鸟类动物；所述哺乳动物为人、牛、猪、犬、猫或鹿，所述鸟类动物为鸡、鸵鸟或孔雀。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于对单个核细胞进行纯化的方法为对单个核细胞用RPMI1640或TCM199完全培养液在36-38℃下培养5-7d，待细胞贴壁后，移走悬浮细胞，得到纯化的单个核细胞。
9.根据权利要求4-8任一项所述的方法，其特征在于所述病原体为致病微生物、寄生虫，或者是灭活的微生物或寄生虫；所述病源体的部分组分为病原体的蛋白质或RNA。
10.根据权利要求4-8任一项所述的方法，其特征在于所述共培养培养基为添加体积百分浓度8-12％血清的RPMI1640或TCM199完全培养基。
全文摘要
本发明公开了一种细胞免疫疫苗及其制备方法。该疫苗是将单核/巨噬细胞或树突状细胞与单一或多种病原体或其部分组分，或病料共培养后得到的免疫细胞。本发明的疫苗具有以下优点1)免疫性高；2)安全性高；3)广谱性高；4)保护效果显著。此外，单核/巨噬细胞、树突状细胞的分离、纯化及体外培养方法简单，可大量获得，因而该疫苗的制备方法简单、成本低廉，具有工业化生产的可行性。本发明的疫苗及其制备方法将在医学、动物生产领域，特别是各种自体免疫疾病的预防与免疫治疗方面发挥重要作用，应用前景广阔。
文档编号A61K39/00GK1951499SQ200610113608
公开日2007年4月25日 申请日期2006年10月9日 优先权日2006年10月9日
发明者连正兴, 邹炜, 李海 申请人:中国农业大学