专利名称：白藜芦醇Mannich碱衍生物及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明属于医药技术领域，涉及几种白藜芦醇的衍生物及其制备方法和用途。
背景技术：
白藜芦醇广泛存在于毛叶藜芦、虎杖、大黄等中药和葡萄等食物中。早在1939年，日本就从毛叶藜芦中提取分离得到了白藜芦醇(日本化学会志，1939，601090～1100)。上世纪八十年代末，WHO进行的流行病调查发现，尽管法国人爱吃奶酪这种高脂肪的食物，但法国人冠心病发病率较其他西方国家低(即所谓的“法国悖论”)，究其原因便是法国人爱喝的葡萄酒中的白藜芦醇。深入研究发现白藜芦醇对肿瘤、心血管疾病、炎症等多种疾病具有良好的预防与治疗作用。
白藜芦醇对心血管作用主要表现抗动脉粥样硬化和抑制LDL氧化(Biochem Pharmacol，1997，53(9)1347～1355；Life Sci，1997，61(21)2103～2110；Biochem Mol Biol Int，1999，47(6)1089～1096；Biochem Pharmacol，1998，55(6)811～816)、抑制血小板聚集(JP 61171427；Planta Med，1992，58(3)274～276)、抗缺血后再灌注损伤(Cardiovasc Res，2000，47549～555；Free Radic Biol Med，1999，27(12)160～169；J Stud Alcohol，2001，62(6)730～735)和促进血管松弛、保护和维持内皮完整性(Gen Pharmacol，1996，27(2)363～366；J Hypertens，2000，18(12)1833～1840)等多方面。
1997年，Jang M等(Science，1997，275218～220)报道白藜芦醇具有很好的癌症预防作用，对致癌的三个阶段均有很强的抑制作用。研究发现，白藜芦醇通过抗氧化和抗突变作用抑制癌症的始发阶段，通过抗炎作用和抑制环氧化酶、过氧化酶活性来抑制癌促阶段，通过诱导癌细胞分化作用抑制癌症扩展阶段。在用DMBA作为诱发剂，TPA为促癌剂的小鼠的皮肤癌试验中，每周两次分别给予白藜芦醇1、5、10和25μmol，18周后，与对照组比较，肿瘤发生率分别降低50、63、63和88％，皮肤癌数分别降低68、81、76和98％，同时，未有任何毒性表现。因此，认为白藜芦醇是一个优良的癌症化学预防剂。研究发现白藜芦醇对肿瘤的作用与其抗氧化(Int J Biochem Cell Biol，2001，33(8)775～783；)、抗炎(Science，1997，275218～220；J Pharm Pharmacol，2004，56(9)1185～1189)、抑制肿瘤细胞增殖(Clin Cancer Res，2001，7(5)1466～1473；Cancer Lett，2001，163(1)43～49；Carcinogenesis，1999，20(2)237～242；Exp Cell Res，1999，249109～115；Biochem BiophyRes Commun，1998，25053～58等)、诱导肿瘤细胞凋亡与分化(Blood，1998，92(3)996～1002；第四军医大学学报，2004，25(19)1797～1799；陕西医学杂志，2004，33(11)1031～1033)等多方面的作用有关。
此外，白藜芦醇还具有预防老年痴呆症(J Neurochemistry，2000，75(1)141～150)、抑制H+-K+-ATP酶(Biochem Pharmacol，1992，44(10)1947～1951)、抗菌等多种活性。
正因为白藜芦醇具有上述多种生物活性，引起人们对白藜芦醇及其衍生物、类似物的研究，大多为白藜芦醇的甲基衍生物、酯、羟基类似物等，其中白藜芦醇3，5-双甲基化产物—3，5-二甲氧基-4’-羟基二苯乙烯(Pterostilbene，紫檀茋)是受到广泛关注的白藜芦醇衍生物，其广泛存在于广西血竭(中国中药杂志，1998，23(10)616～618)、葡萄(J AgricFood Chem，2000，48(12)6103～6105)、蜂胶(Experientia，1978，34(2)157～159)等中，具有抗氧化、抗增殖、降血脂、中等强度抑制COX-1和COX-2的活性(IC50分别为19.8μM和83.9μM)、诱导HL-60细胞凋亡(IC5070μM)、预防DMBA诱发的癌变(ED504.8μM)、降血糖作用(对streptozotocen致糖尿病的大鼠模型，其降糖作用与二甲双胍相近)和抗真菌活性(其抗真菌活性为白藜芦醇的五倍)(J Agric Food Chem，2002，50(12)3453～3457；J Nat Prod，1997，60(6)609～610；J Agric FoodChem，2005，53(9)3403～3407；J Org Chem，2004，69(21)7101～7107)。
紫檀茋还有强大的抗增殖作用，较白藜芦醇作用强且选择性强，能抑制α-和λ-DNA聚合酶，也能抑制SV40 DNA的复制，其抑制活性与α-、δ-和ξ-DNA三重聚合酶抑制剂蚜肠霉素(Aphidicolin)相近。对恶性黑色素瘤细胞B16M-F10，每天用40μM的紫檀茋处理60分钟具有显著的抑制作用，抑制率达56％(Neoplasia，2005，7(1)37～47)。Tolomeo M等(Int J Biochem Cell Biol，2005，37(8)1709～1726)报道紫檀能诱导耐多药和BCR-ABL表达的白血病细胞的显著凋亡，而对正常细胞几乎没有影响，研究者认为其分子结构中的3，5-二甲氧基是其活性必需结构。
发明内容
本发明以白藜芦醇和紫檀茋为先导化合物，提供了白藜芦醇的多种衍生物及其制备方法和用途。
本发明所述化合物，与白藜芦醇和紫檀茋一样，对肿瘤、心血管疾病、炎症等多种疾病具有良好的预防与治疗作用，一些化合物的活性明显强于白藜芦醇和紫檀茋。而且这些化合物因结构中存在取代胺基，能够成盐可以提高白藜芦醇和紫檀茋的稳定性并可改善其药代动力学参数。
制备本发明所述化合物的起始原料3，5-二羟基(或二烷氧基)-4’-羟基二苯乙烯的制备，可以以3，5-二羟基苯甲酸为原料，在碱的作用下与卤代烃或硫酸酯成醚同时成酯，然后经还原、卤代，与亚磷酸三乙酯反应后，立即与4-苄氧基苯甲醛发生Wittig-Horner反应形成3，5-二烷氧基-4’-苄氧基二苯乙烯，再在三氯化铝/N，N-二甲基苯胺的作用下脱去苄基制得3，5-二烷氧基-4’-羟基二苯乙烯，进一步脱去烷基得到3，5-二羟基-4’-羟基二苯乙烯(即白藜芦醇)。以3，5-二甲氧基-4’-羟基二苯乙烯为例，其合成路线如下
本发明的化合物制备方法包括以3，5-二羟基(或二烷氧基)-4’-羟基二苯乙烯与各种取代二级胺和福尔马林溶液(或多聚甲醛)，在常见的溶剂(如甲醇、无水乙醇、95％乙醇、乙酸等)中，发生Mannich反应制得。以3，5-二甲氧基-4’-羟基二苯乙烯为例，其合成反应示意如下 分别采用如上方法制备的白藜芦醇衍生物，其制备方法简单，工艺稳定，可操作性强。所述化合物，与白藜芦醇和紫檀茋一样，对肿瘤、心血管疾病、炎症等多种疾病具有良好的预防与治疗作用，一些化合物的活性明显强于白藜芦醇和紫檀茋。而且这些化合物因结构中存在取代胺基，能够成盐可以提高白藜芦醇和紫檀茋的稳定性并可改善其药代动力学参数。
具体实施例方式实施例13，5-二甲氧基苯甲酸甲酯的合成向250ml三颈瓶中，加入7.7g(0.05mol)3，5-二羟基苯甲酸，20g(0.15mol)无水碳酸钾，15ml(0.15mol)硫酸二甲酯和160ml丙酮，充分搅拌回流反应5小时。滤除碳酸钾，蒸馏除去丙酮。加入160ml水和160ml乙醚，分取有机层，再依次用氨水(16ml×2)，水(32ml)，5％盐酸(32ml×2)，水(16ml)洗，加入无水硫酸钠干燥，蒸除乙醚，自然析晶，干燥，得9.53g产品，收率为93.6％，mp 42～43℃。
实施例23，5-二甲氧基苯甲醇的合成向250ml三颈瓶中加入4.0g(0.04mol)四氢锂铝，30ml无水乙醚。搅拌下滴加4.0g(0.02mol)3，5-二甲氧基苯甲酸甲酯的30ml无水乙醚溶液，滴完加热回流反应4h。停止反应，滴加10ml湿乙醚和60ml水，再滴加稀硫酸(10ml浓硫酸溶于30ml水)，反应剧烈，再滴加80ml水，分取醚层，用少量乙醚萃取水层两次，合并醚层，加入无水硫酸钠干燥，蒸除乙醚，自然析晶，得8.3g产品，收率为96.8％，mp47～49℃。
实施例33，5-二甲氧基氯苄的合成16.8g(0.1mol)3，5-二甲氧基苯甲醇置于三颈瓶中，加入150ml无水乙醚，搅拌使其溶解，滴加15ml(0.2mol)二氯亚砜，滴完后，室温反应3h，在冰水浴下往三颈瓶中滴加100ml水，分取乙醚层，醚层水洗后加入无水硫酸钠干燥，过滤，蒸出乙醚，得白色固体18.9g，收率为94.4％，mp46～47℃。
实施例4(E)3，5-二甲氧基-4’-苄氧基二苯乙烯的合成3.7g(0.02mol)3，5-二甲氧基苄氯和7ml(0.04mol)亚磷酸三乙酯置于50ml圆底烧瓶中，加热回流反应3h，减压蒸馏除去过量的亚磷酸三乙酯，得橘红色油状物，向油状物中加入15ml DMF，然后加入到乙醇钠(由0.54g钠和10ml无水乙醇制得)中，搅拌5min，滴加相应的2.7g 4-苄氧基苯甲醛的10ml DMF溶液，滴加完毕室温搅拌3h，倒入冰水中析出固体，抽滤，干燥得产品白色固体10.0g，mp120～122℃，收率80％。1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ(ppm)3.83(6H，s，OCH3)，5.09(2H，s，OCH2Ph)，6.38(1H，t，J＝2.2Hz)，6.65(2H，d，J＝2.2Hz)，6.90(1H，d，J＝16.3Hz，-CH＝CH-)，6.97(2H，d，J＝8.7Hz)，7.04(1H，d，J＝16.3Hz，-CH＝CH-)，7.39(7H，m).
实施例5(E)3，5-二甲氧基-4’-羟基二苯乙烯的制备6.2g(0.018mol)(E)3，5-二甲氧基-4’-苄氧基二苯乙烯溶于50ml干燥的二氯甲烷中，加入6.9ml(0.054mol)N，N-二甲基苯胺，冰浴下分次加入9.6g(0.072mol)无水三氯化铝，室温反应10小时，将反应液倾入到含适量盐酸的冰水中，分取有机层，水层用二氯甲烷萃取两次，合并有机层，分别用5％碳酸氢钠、水洗涤后，无水硫酸镁干燥，过滤，蒸去二氯甲烷，柱层析分离(洗脱剂石油醚-二氯甲烷1∶1)，得到(E)-3，5-二甲氧基-4’-羟基二苯乙烯，白色固体3.0g，mp87～89℃，收率64％。
1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ(ppm)3.83(6H，s，OCH3)，4.80(1H，brs，-OH)，6.38(1H，br)，6.64(2H，d)，6.82(2H，d，J＝8.6Hz)，6.89(1H，d，J＝16.3Hz，-CH＝CH-)，7.03(1H，d，J＝16.3Hz，-CH＝CH-)，7.40(2H，d，＝8.6Hz).
实施例6Mannich碱衍生物的制备(E)3，5-二甲氧基-4’-羟基二苯乙烯溶于乙醇中，加37％的甲醛水溶液和相应的胺，回流反应10至15小时后，将溶剂减压蒸干，残留物柱层析分离(洗脱剂为二氯甲烷或二氯甲烷-乙酸乙酯4～1∶1)，得其Mannich碱衍生物，将Mannich碱衍生物溶于干燥的乙酸乙酯中，通氯化氢，析出沉淀，过滤，得到相应的Mannich碱盐酸盐。
(E)-3，5-二甲氧基3’-二乙胺基甲基-4’-羟基二苯乙烯(RE9934)，白色固体0.43g，mp78～81℃，收率49％。1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ(ppm)1.14(6H，t，-CH2CH3)，2.67(4H，q，-CH2CH3)，3.82(6H，s，OCH3)，6.35(1H，t)，6.63(2H，d)，6.82(2H，m)，6.99(1H，d，J＝16.2Hz，-CH＝CH-)，7.15(1H，s)，7.34(1H，d).
(E)-3，5-二甲氧基-3’-吗啉基甲基-4’-羟基二苯乙烯(RE9935)，白色固体0.36g，mp86～89℃，收率53％。1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ(ppm)2.7(4H，brs)，3.83(12H，brs)，6.37(1H，s)，6.63(2H，s)，6.85(2H，brs)，7.01(1H，d，J＝16.3Hz，-CH＝CH-)，7.25(1H，brs)，7.42(1H，brs).ESI-MS356.2[M+H]+，353.9[M-H]-(E)-3，5-二甲氧基-3’-哌啶基甲基-4’-羟基二苯乙烯(RE9936)，白色固体0.47g，mp77～80℃，收率51％。1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ(ppm)1.67(6H，brs)，2.53(4H，brs)，3.79(2H，s，-CH2-)，3.84(6H，s，OCH3)，6.38(1H，t，J＝2.1Hz)，6.52(2H，d，J＝2.2Hz)，6.82(1H，d，J＝8.4Hz)，6.87(1H，d，J＝16.3Hz，-CH＝CH-)，7.01(1H，d，J＝16.2Hz，-CH＝CH-)，7.29(1H，d，J＝3.8Hz)，7.35(1H，d，J＝2.0Hz).ESI-MS354.1[M+H]+，351.9[M-H]-.
(E)-3，5-二甲氧基-3’-二甲胺基甲基-4’-羟基二苯乙烯(RE9937)，白色固体0.37g，mp73～76℃，收率48％。1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ(ppm)2.73(6H，s，N(CH3)2)，3.76(6H，s，OCH3)，4.21(2H，s，PhCH2N)，6.39(1H，s)，6.69(2H，d，J＝2.0Hz)，6.98(1H，d，J＝16.3Hz，-CH＝CH-)，6.98(1H，d，J＝8.6Hz)，7.17(1H，d，J＝16.3Hz，-CH＝CH-)，7.49(1H，d，J＝8.3Hz)，7.66(1H，s)，9.71(1H，brs，ArOH)，10.55(1H，s，HCl).13C-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ(ppm)42.20，55.27，99.56，104.21，115.98，117.03，126.35，128.44，129.75，130.87，139.34，156.43，160.78.ESI-MS314.0[M+H]+，312.7[M-H]-.
(E)-3，5-二甲氧基-3’，5’-双(二甲胺基甲基)-4’-羟基二苯乙烯(RE9938)，白色固体0.67g，mp 124～126℃，收率62％。1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ(ppm)2.34(12H，s，N(CH3)2)，3.59(4H，s，-CH2-)，3.84(6H，s，OCH3)，6.38(1H，t，J＝2.1Hz)，6.65(2H，d，J＝2.1Hz)，6.90(1H，d，J＝16.3Hz，-CH＝CH-)，7.02(1H，d，J＝16.3Hz，-CH＝CH-)，7.22(2H，s).
其二盐酸盐1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ(ppm)2.74(12H，s，N(CH3)2)，3.76(6H，s，OCH3)，4.36(4H，s，-CH2-)，6.42(1H，s)，6.69(2H，d，J＝2.1Hz)，7.07(1H，d，J＝16.5Hz，-CH＝CH-)，7.17(1H，d，J＝16.3Hz，-CH＝CH-)，7.77(2H，s)，10.23(3H，brs，HCl and OH).
(E)-3，5-二甲氧基-3’，5’-双(哌啶基甲基)-4’-羟基二苯乙烯盐酸盐(RE9939)，白色固体0.78g，mp 144～148℃，收率58％。1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ(ppm)1.58(12H，brs)，2.53(8H，brs)，3.66(4H，s，PhCH2N-)，3.83(6H，s，OCH3)，6.36(1H，t)，6.64(2H，d)，6.87(1H，d，J＝16.2Hz，CH＝CH-)，7.01(1H，d，J＝16.2Hz，-CH＝CH-)，7.24(2H，s).ESI-MS451.1[M+H]+，449.0[M-H]-.
(E)-3，5-二甲氧基-3’，5’-双(N-吗啉基甲基)-4’-羟基二苯乙烯盐酸盐(RE9940)，白色固体0.89g，mp 156～158℃，收率48％。1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ(ppm)2.53(8H，brs)，3.66(4H，s，-CH2-N)，3.76(8H，brs)，3.83(3H，s，OCH3)，6.37(1H，brs)，6.64(2H，d)，6.87(1H，d，J＝16.3Hz，-CH＝CH-)，7.00(1H，d，J＝16.3Hz，-CH＝CH-)，7.24(2H，s).ESI-MS455.1[M+H]+，452.9[M-H]-.
(E)-3，5-二甲氧基-3’，5’-双(N-四氢吡咯基甲基)-4’-羟基二苯乙烯二盐酸盐(RE9941)，白色固体0.96g，mp153～156℃，收率48％。1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)，δ(ppm)1.95(8H，brs)，3.38(8H，brs)，3.77(6H，s，OCH3)，4.43(4H，s，PhCH2N)，6.42(1H，s)，6.69(2H，s)，7.14(2H，m，-CH＝CH-)，7.83(2H，s)，10.22(3H，brs).
(E)-3，5-二甲氧基-3’，5’-双(N-甲基哌嗪甲基)-4’-羟基二苯乙烯四盐酸盐(RE9942)，白色固体1.03g，mp186～188℃，收率55％。1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ(ppm)2.78(8H，brs，哌嗪环)，2.79(6H，s，NCH3)，3.76(6H，s，OCH3)，3.88(4H，s，PhCH2N)，4.21(8H，brs，哌嗪环)，6.40(1H，s)，6.68(2H，d，J＝2.2Hz)，7.06(1H，d，J＝16.4Hz，-CH＝CH-)，7.14(1H，d，J＝16.2Hz，-CH＝CH-)，7.72(2H，s)，9.73(1H，brs，OH)，11.76(4H，brs，HCl).ESI-MS481.1[M+H]+.
实施例7部分目标化合物诱导人急性早幼粒白血病细胞凋亡实验1.实验方法1.1细胞培养人急性早幼粒白血病细胞株(NB4)购于美国ATCC，培养于含有10％经加热灭活的胎牛血清、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素及1mmol/lL谷氨酰胺RPMI1640培养液中，37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中孵育。
1.2细胞活力的测定细胞活力通过台盼蓝排斥法测定。称取台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水稀释到4％，用滤纸过滤，4℃保存。使用时，将该母液用PBS稀释至0.4％工作浓度。取NB4细胞(1×105/ml)接种于12孔板，每孔2ml。加入不同浓度药物孵育后制备单个细胞悬液，取50μl细胞悬液加入50μl的0.4％台盼蓝溶液，混匀，在3分钟内，于显微镜下观察，死细胞被染成蓝色，而活细胞拒染。用血球计数板分别计数活细胞和死细胞(共约300个细胞)。活细胞数占总细胞数的百分率即为细胞存活率。
1.3细胞凋亡的形态学检测利用吖啶橙(AO)和溴化乙啶(EB)双染法考察凋亡细胞的形态学变化。取对数生长期的NB4细胞，以每孔1×105个/ml的细胞密度接种于12孔板中，每孔2ml。药物处理后，取1ml细胞悬液，离心，弃取上清液，重悬于25μl PBS中，然后加入AO/EB等体积混合液3μl(100μg/ml AO，100μg/ml EB)，混匀。吸一滴混合液点于洁净载玻片上，用盖玻片封片，在荧光显微镜下观察并拍照。
EB拒染并出现核皱缩、发芽、发泡以及凋亡小体的细胞被认为是凋亡细胞。在镜下不同区域随机选择300个细胞，凋亡细胞占其百分比为细胞凋亡率。
经试验证明，所述化合物对肿瘤、炎症、心血管疾病均有较好的治疗效果。
权利要求
1.白藜芦醇Mannich碱衍生物，其特征在于由下列通式(I)表示的白藜芦醇衍生物或其可药用盐 其中R1和R2为H、甲基、乙基或丙基；NR3R4为常见的胺，如二甲胺、二乙胺、二丙胺、二异丙胺、四氢吡咯、哌啶、吗啉或取代的哌嗪；R5，R6，R7，R8为H或CH2NR3R4。
2.一种制备式I化合物的方法，其特征在于按如下方法制备式II化合物，与各种取代二级胺和福尔马林溶液或多聚甲醛，在常见的溶剂中，发生Mannich反应，制得式I化合物
3.根据权利要求1所述的一种制备式I化合物的方法，其特征在于所述溶剂为甲醇、无水乙醇、95％乙醇、乙酸。
4.一种药物组合物，其特征在于含有一种或多种可药用载体和有效量的权利要求1的化合物(I)。
5.权利要求1化合物在制备治疗肿瘤、炎症、心血管疾病药物中的应用。
全文摘要
本发明属于医药技术领域，公开了白藜芦醇Mannich碱衍生物及其制备方法和用途。以3，5－二羟基(或二烷氧基)－4’－羟基二苯乙烯与各种取代二级胺和福尔马林溶液(或多聚甲醛)，在常见的溶剂中，发生Mannich反应制得制备了化合物(I)，工艺简单易行。其可药用游离碱和可药用盐对肿瘤、心血管疾病、炎症等多种疾病具有良好的预防与治疗作用，活性明显强于白藜芦醇和紫檀茋，且成盐可以提高白藜芦醇和紫檀茋的稳定性并可改善其药代动力学参数。其中R
文档编号A61K31/445GK1948275SQ20061013400
公开日2007年4月18日 申请日期2006年10月25日 优先权日2006年10月25日
发明者陈国良, 李 杰, 王爱萍, 黎亮, 景永奎, 吴春福 申请人:沈阳药科大学