识别β淀粉样肽的人源化抗体的制作方法

专利名称：识别β淀粉样肽的人源化抗体的制作方法
本申请为国际申请PCT/US2001/046587于2003年6月6日进入中国国家阶段、申请号为01820170.9、发明名称为“识别β淀粉样肽的人源化抗体”的分案申请。
相关申请本申请要求以名称为“识别β-淀粉样肽的人源化抗体”的在先临时申请U.S.60/251,892(2000年12月6日提交)为优先权。上述申请在这里全文引用作为参考。
背景技术：
阿尔茨海默氏病(AD)是一种导致老年性痴呆的渐进性疾病。通常参见Selkoe，TINS 16403(1993)；Hardy等，WO92/13069；Selkoe，J.Neuropattiol.Exp.Neurol.53438(1994)；Duff等，Nature，373476(1995)；Games等，Nature，373523(1995)。广义上讲，该疾病分为两类发生在晚年(65岁以上)的晚期发作，和老年期之前例如35-60岁之间形成的早期发作。在该病的两种类型中，病理学是相同的，但是如果在早年开始，异常可能更加严重且分布更广泛。该疾病特征在于至少两种类型的大脑损伤、神经纤维缠结和老年斑。神经纤维缠结是由两根互相缠绕在一起的细丝组成的微管相关的τ蛋白质的胞内沉积物。老年斑(即淀粉样斑)是直径达150μm通过脑组织切片的显微分析观察到的中心穿插有胞外淀粉样沉积物的紊乱的神经纤维网区域。淀粉样斑在大脑中的积累也与唐氏综合征和其它的认知紊乱有关。
老年斑的主要成分是被称为Aβ或β-淀粉样肽的肽。Aβ肽是4-kDa的称作淀粉样前体蛋白(APP)的较大跨膜糖蛋白的39-43个氨基酸的中间片段。通过不同分泌型酶蛋白水解APP，结果人们发现Aβ主要为40个氨基酸长度的短型和42-43个氨基酸长度的长型两种。APP的部分疏水跨膜区域被发现在Aβ的羧基末端，且其可说明Aβ聚集成斑的能力，特别是长型的情况。淀粉样斑在大脑中的积累最终导致神经细胞坏死。与这种类型的神经系统坏死相关联的生理症状被描绘为阿耳茨海默氏病的特征。
APP蛋白的若干突变与阿耳茨海默氏病有关系。参见，例如，Goate等，Nature 349704(1991)(缬氨酸717突变为异亮氨酸)；Chartier Harlan等，Nature 353844(1991))(缬氨酸717突变为甘氨酸)；Murrell等，Science25497(1991)(缬氨酸717突变为苯丙氨酸)；Mullan等，Nature Genet.1345(1992)(双突变，赖氨酸595-甲硫氨酸596突变为天冬酰胺595-亮氨酸596)。这种突变被认为是通过增加或改变APP到Aβ的加工，特别是APP增量加工成为长型Aβ(即Aβ1-42和Aβ1-43)，导致阿耳茨海默氏病。其它基因例如早衰素(presenilin)基因PS1和PS2中的突变被认为是间接影响APP加工来产生增量的长型Aβ(参见Hardy，TINS 20154(1997))。
小鼠模型已被成功的用于检测淀粉样斑在阿耳茨海默氏病中的意义(Games等，同上，Johnson-Wood等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA941550(1997))。特别地，当PDAPP转基因小鼠(其表达人APP的突变体形式且在年青阶段发展阿耳茨海默氏病)被注射长型的Aβ时，它们显示出阿耳茨海默氏病状态的衰退和对Aβ肽的抗体效价的增加(Schenk等，Nature 400，173(1999))。上述论述表明Aβ，特别是它的长型，是引起阿耳茨海默氏病的病因。
McMichael在EP526511中提出了对预先确定为AD的患者采用顺势疗法的剂量给药Aβ(小于或等于10-2mg/天)。对于带有约5升血浆的一般人，甚至该剂量的上限预计产生不超过2pg/ml浓度。在人血浆中Aβ的正常浓度一般地在50-200pg/ml范围内(Seubert等，Nature 359325(1992)。由于在EP 526,511中建议的剂量只是改变内源性循环Aβ的水平，且在EP 526511中没有建议使用佐剂作为免疫刺激剂，因此产生的任何治疗性结果似乎都是难以置信的。
因此，存在着用于阿耳茨海默氏病的新的疗法和药剂的需求，特别是能够在生理学(例如，无毒的)剂量上产生有益治疗效果的治疗方法和药剂。
发明的概述本发明提供新的免疫药物，特别是用于致淀粉样的(amyloidogenic)疾病(例如，阿耳茨海默氏病)的预防和治疗的治疗抗体药物。本发明是基于，至少部分基于，两种特异性结合于Aβ肽并有效减少斑沉积和/或减少与致淀粉样紊乱有关的神经性营养障碍的单克隆抗体的鉴定和表征。这些抗体的结构和功能分析导致了用于预防和/或治疗的各种人源化抗体的设计。特别地，本发明突出了这些抗体的不同区域的人源化，并因此提供了人源化的免疫球蛋白或抗体链，完全人源化的免疫球蛋白或抗体以及功能性免疫球蛋白或抗体片段，尤其是特征抗体的抗原结合片段。
含有所述特征单克隆抗体的互补决定区的多肽和多核苷酸药物以及适用于编码所述多肽的载体和宿主也被本发明公开。
淀粉样遗传疾病(例如，阿耳茨海默氏病)的治疗方法以及在此方法中使用的药物组合物和试剂盒也被公开。
本发明还提供鉴定在所述特征单克隆抗体中对于特有免疫功能重要的残基的方法以及鉴定能够在当用于治疗药物时提高了结合亲合力和/或减少了免疫原性的人源化抗体的设计中负责取代的残基的方法。
附图的简要描述

图1描述了小鼠3D6、人源化3D6、Kabat ID 109230和种系A19抗体轻链的氨基酸序列的比对。CDR区域用箭头显示。粗斜体显示鼠稀有残基。粗体表示包装(VH+VL)残基。实体表示规范/CDR相互作用残基。星号表示人源化3D6改型1回复突变所选择的残基。
图2描述小鼠3D6、人源化3D6、Kabat ID 045919和种系VH3-23抗体的重链的氨基酸序列的比对。注解同图1。
图3图示了3D6、嵌合3D6和10D5的Aβ结合特性。图3A图解了Aβ结合于嵌合的3D6(PK1614)以及与结合于鼠3D6的比较。图3B图示了生物素酰化的3D6对未标记的3D6、PK1614和10D5竞争性结合Aβ。
图4描述了3D6 VH和VL的同源性模型，显示了α-碳主链迹线。VH被显示为点线，且VL被显示为实线。CDR区域被显示为条带的形式。
图5图示了嵌合3D6和人源化3D6的Aβ结合特性。图5A描述了人源化3D6v1和嵌合3D6结合于聚集Aβ的测定的ELISA结果。图5B描述了人源化3D6v1和人源化3D6v2结合于聚集Aβ的测定的ELISA结果。
图6是定量测定人源化3D6和嵌合3D6与来自PDAPP小鼠脑切片的Aβ斑结合的图表。
图7显示人源化3D6改型1和2、嵌合3D6、鼠3D6和10D5与鼠3D6竞争性结合Aβ的能力的竞争性结合测定试验的结果。
图8图示了测定人源化3D6v2、嵌合3D6和人IgG通过小神经胶质细胞介导Aβ摄取能力的离体吞噬作用测定试验。
图9描述了10D5 VL和3D6 VL氨基酸序列的比对。黑体表示与10D5精确匹配的残基。
图10描述了10D5 VH和3D6 VH氨基酸序列的比对。黑体表示与10D5精确匹配的残基。
发明的具体描述本发明提供了一种新的用于预防或治疗阿耳茨海默氏病或其它致淀粉样疾病的免疫药物和方法。本发明是基于，至少部分基于，在结合β淀粉样蛋白(Aβ)(例如，结合可溶性和/或聚集性Aβ)、介导吞噬作用(例如，聚集性Aβ的吞噬)、减少斑沉积和/或减少神经性营养障碍(例如在患者中)方面有效的两种单克隆免疫球蛋白3D6和10D5的表征。本发明进一步基于这些免疫球蛋白的可变轻链和重链的一级和二级结构的确定和结构表征以及对于活性和免疫原性是重要的残基的鉴定。
本发明提供免疫球蛋白，其包括此处所述的优选的单克隆免疫球蛋白的可变轻链和/或重链。还提供优选的免疫球蛋白，例如治疗性免疫球蛋白，其包括人源化的可变轻链和/或人源化的可变重链。优选的可变轻链和/或重链包括来自单克隆免疫球蛋白(例如，供体免疫球蛋白)的互补决定区(CDR)和基本上来自人受体免疫球蛋白的可变构架区。短语“基本上来自人受体免疫球蛋白”是指大多数或关键的构架残基是来自人受体序列，然而允许用选择来提高人源化免疫球蛋白活性(例如，改变活性使得其更接近模拟供体免疫球蛋白的活性)或降低人源化免疫球蛋白的免疫原性的残基在特定的位置进行残基取代。
在一个实施方案中，本发明提供了一种人源化免疫球蛋白轻链或重链，其包含3D6可变区互补决定区(CDR)(即包括一个、两个或三个来自轻链可变区序列如SEQ ID NO2所阐述的CDR或包括一个、两个或三个来自重链可变区序列如SEQ ID NO4所阐述的CDR)，并包括一个基本上来自人受体免疫球蛋白轻链或重链序列的可变构架区，条件是至少一个构架残基被回复突变为相应的鼠残基，其中所述的回复突变基本上不影响链和Aβ直接结合的能力。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种人源化免疫球蛋白轻链或重链，其包含3D6可变区互补决定区(CDR)(例如包括一个、两个或三个来自轻链可变区序列如SEQ ID NO2所阐述的CDR和/或包括一个、两个或三个来自重链可变区序列如SEQ ID NO4所阐述的CDR)，并包括一个基本上来自人受体免疫球蛋白轻链或重链序列的可变构架区，条件是至少一个构架残基用来自小鼠3D6轻链或重链可变区序列的相应氨基酸残基取代，其中构架残基选自(a)非共价直接结合抗原的残基；(b)与CDR相邻的残基；(c)CDR-相互作用的残基(例如，通过在同源的已知免疫球蛋白链的解开结构上模拟轻链或重链来确定)；以及(d)在VL-VH界面上共同参与的残基。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种人源化免疫球蛋白轻链或重链，其包含3D6可变区CDR和来自人受体免疫球蛋白轻链或重链序列的可变构架区，条件是至少一个构架残基用来自小鼠3D6轻链或重链可变区序列的相应氨基酸残基取代，其中通过可变区的三维模型分析，构架残基是一种能够影响轻链可变区构型或功能的残基，例如能够与抗原相互作用的残基、近接于抗原结合位点的残基、能够与CDR相互作用的残基、与CDR相邻的残基、在离CDR残基6_内的残基、规范的残基、游标区残基、链间包装残基、稀有残基或在结构模型表面上的糖基化位点残基。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种人源化免疫球蛋白轻链，其包括3D6可变区CDR(例如，来自3D6轻链可变区序列，如SEQ IDNO2所阐述)，并包括人受体免疫球蛋白可变构架区，条件是至少一个选自L1、L2、L36和L46(Kabat编号规则)的构架残基用来自小鼠3D6轻链可变区序列的相应氨基酸残基取代。在另一个实施方案中，本发明提供了一种人源化免疫球蛋白重链，其包括3D6可变区CDR(例如，来自3D6重链可变区序列如SEQ ID NO4所阐述)，并包括人受体免疫球蛋白可变构架区，条件是至少一个选自H49、H93和H94(Kabat编号规则)的构架残基用来自小鼠3D6重链可变区序列的相应氨基酸残基取代。
优选的轻链包括亚型κII的κII构架区(Kabat规则)，例如，来自受体免疫球蛋白Kabat ID 019230、Kabat ID 005131、Kabat ID 005058、Kabat ID 005057、Kabat ID 005059、Kabat ID U21040和Kabat IDU41645的构架区。优选的重链包括亚型III的构架区(Kabat规则)，例如，来自受体免疫球蛋白Kabat ID 045919、Kabat ID 000459、Kabat ID000553、Kabat ID 000386和Kabat ID M23691的构架区。
在一个实施方案中，本发明提供了一种人源化免疫球蛋白轻链或重链，其包括10D5可变区互补决定区(CDR)(例如包括一个、两个或三个来自如SEQ ID NO14所述的轻链可变区序列的CDR或包括包括一个、两个或三个来自如SEQ ID NO16所述的重链可变区序列的CDR)，且包括一个基本上来自人受体免疫球蛋白轻链或重链序列的可变构架区，条件是至少一个构架残基被回复突变为相应的鼠残基，其中所述的回复突变基本上不影响链和Aβ直接结合的能力。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种人源化免疫球蛋白的轻链或重链，其包含10D5可变区互补决定区(CDR)(例如包括一个、两个或三个来自如SEQ ID NO14所述的轻链可变区序列的CDR和/或包括一个、两个或三个来自如SEQ ID NO16所述的重链可变区序列的CDR)，并包括一个基本上来自人受体免疫球蛋白轻链或重链序列的可变构架区，条件是至少一个构架残基用来自小鼠3D6轻链或重链可变区序列的相应的氨基酸残基取代，其中构架残基选自(a)非共价直接结合抗原的残基；(b)与CDR相邻的残基；(c)与CDR-相互作用的残基(例如，通过在同源的已知免疫球蛋白链的解开结构上模拟轻链或重链来确定)；以及(d)在VL-VH界面上共同参与的残基。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种人源化免疫球蛋白轻链或重链，其包含10D5可变区CDR和自人受体免疫球蛋白轻链或重链序列的可变构架区，条件是至少一个构架残基用来自小鼠10D5轻链或重链可变区序列的相应的氨基酸残基取代，其中通过可变区的三维模型分析，构架残基是一种能够影响轻链可变区构型或功能的残基、例如能够与抗原相互作用的残基、近接于抗原结合位点的残基、能够与CDR相互作用的残基、与CDR相邻的残基、在离CDR残基6_内的残基、规范的残基、游标区残基、链间包装残基、稀有残基或在结构模型表面上的糖基化位点残基。
在另一个实施方案中，本发明提供了除上述取代之外的至少一个稀有人构架残基的取代。例如，稀有残基可用在此位置上的人可变链序列的普通氨基酸残基取代。或者，稀有残基可用来自同源的种系可变链序列的相应的氨基酸残基取代(例如，稀有的轻链构架残基可用来自A1、A17、A18、A2或A19种系免疫球蛋白序列的相应种系残基取代或稀有的重链构架残基可用来自VH3-48、VH3-23、VH3-7、VH3-21或VH3-11种系免疫球蛋白序列的相应种系残基取代。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种包含上述轻链和重链的人源化免疫球蛋白，或所述免疫球蛋白的抗原结合片段。在一个示例实施方案中，人源化免疫球蛋白结合(例如，特异性结合)β淀粉样肽(Aβ)，结合亲合力至少为107M-1、108M-1或109M-1。在另一个实施方案中，免疫球蛋白或抗原结合片段包括具有同种型γ1的重链。在另一个实施方案中，免疫球蛋白或抗原结合片段结合(例如，特异性结合)可溶性β淀粉样肽(Aβ)和聚集性Aβ。在另一个实施方案中，免疫球蛋白或抗原结合片段介导β淀粉样肽(Aβ)的吞噬作用(例如，诱导吞噬作用)。在另外一个实施方案中，免疫球蛋白或抗原结合片段越过受试者的血脑屏障。在另外一个实施方案中，免疫球蛋白或抗原结合片段减少受试者的β淀粉样肽(Aβ)沉积和神经炎性营养障碍。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种包含3D6可变区的嵌合免疫球蛋白(例如，如SEQ ID NO2或SEQ ID NO4所述的可变区序列)。在另一个实施方案中，本发明提供了一种免疫球蛋白或其抗原结合片段，其包括SEQ ID NO8所示的可变重链区以及SEQ ID NO5所示的可变轻链区。在另一个实施方案中，本发明提供了一种免疫球蛋白或其抗原结合片段，其包括SEQ ID NO12所示的可变重链区以及SEQ ID NO11所示的可变轻链区。在另一个实施方案中，本发明提供了一种包含10D5可变区的嵌合免疫球蛋白(例如，SEQ ID NO14或SEQ ID NO16所示的可变区序列)。在另一个实施方案中，免疫球蛋白或其抗原结合片段进一步含有来自IgG1的恒定区。
本文所述的免疫球蛋白特别适用于以预防或治疗致淀粉样疾病为目的治疗方法中。在另一个实施方案中，本发明提供了一种预防或治疗致淀粉样疾病(例如，阿耳茨海默氏病)的方法，其包括给药患者有效量的此处所述的人源化免疫球蛋白。另一个实施方案中，本发明提供了含有本文所述人源化免疫球蛋白和药用载体的药物组合物。也提供了用于制备本文所述免疫球蛋白或免疫球蛋白片段或链的分离的核酸分子、载体和宿主细胞，以及用于制备所述免疫球蛋白、免疫球蛋白片段或免疫球蛋白链的方法。
本发明进一步提供了一种当制备人源化3D6或10D5免疫球蛋白时用于分别确定负责取代的人源化3D6或10D5残基的方法。例如，确定负责取代的可变构架区残基的方法包括建立在解开同源免疫球蛋白结构上制作3D6或10D5可变区的三维结构模型并对能够影响3D6或10D5免疫球蛋白可变区构型或功能的残基分析所述模型，因而负责取代的残基得到确定。本发明进一步提供了SEQ ID NO2或SEQID NO4所示的可变区序列或其任意部分在产生3D6免疫球蛋白、3D6免疫球蛋白链或其结构域的三维图像中的应用。本发明也提供了SEQID NO14或SEQ ID NO16所示的可变区序列或其任意部分在产生10D5免疫球蛋白、10D5免疫球蛋白链或其结构域的三维图像中的应用。
在描述本发明之前，下面所用特定术语的定义将对理解是有帮助的。
术语“免疫球蛋白”或“抗体”(在这里交换使用)是指具有由两个重链和两个轻链组成的四条多肽链基本结构的抗原结合蛋白，所述链的稳定化，例如通过链间二硫键进行，其具有特异性结合抗原的能力。重链和轻链折叠到结构域中。术语“结构域”是指含有肽环(如含有3到4个肽环)的重链或轻链多肽的球形区域，所述肽环例如通过β-折叠和/或链内二硫键而稳定化。结构域本文进一步指“恒定的”或“可变的”，基于在为“恒定”域的情况下，不同类别的域中相对缺乏序列变化，或在为“可变”域的情况下，不同类别的域中有显著的序列变化。“恒定的”域在轻链上可被交换称为“轻链恒定区”、“轻链恒定域”、“CL”区或“CL”域。“恒定的”域在重链上可被交换称为“重链恒定区”、“重链恒定域”、“CH”区或“CH”域。“可变的”域在轻链上可被交换称为“ 轻链可变区”、“轻链可变域”、“VL”区或“VL”域。“可变的”域在重链上可被交换称为“重链可变区”、“重链可变域”、“CH”区或“CH”域。
术语“区”是指抗体链的局部或一部分且其包括此处所定义的恒定或可变的域，以及所述域的更多不连续的局部或部分。例如，轻链可变域或区包括分散在此处所定义的“构架区”或“FR”中的“互补决定区”或“CDR”。
免疫球蛋白或抗体可以为单体或多聚体的形式存在。术语“抗原结合片段”是指一个与抗原结合或与抗原结合(即特异性结合)的完整抗体(即与它们所衍生的完整抗体)竞争的免疫球蛋白或抗体的多肽片段。术语“构型”是指蛋白或多肽(例如，抗体、抗体链、结构域或其区域)的三级结构。例如，短语“轻(或重)链构型”是指轻(或重)链可变区的三级结构，短语“抗体构型”或“抗体片段构型”是指抗体或其片段的三级结构。
抗体的“特异性结合”是指抗体对抗原或优选的表位显示出可感知的亲合力并且优选不显示显著的交叉反应。“可感知”或优选的结合包括具有至少106、107、108、109M-1或1010M-1的亲合力的结合。亲合力大于107M-1，优选大于108M-1是更优选的。本文所述这些值的中间的数值也确定在本发明的范围中且优选的结合亲合力可显示为亲合力的范围，例如106到1010M-1，优选107到1010M-1，更优选108到1010M-1。“不显示显著的交叉反应”的抗体是一种不会可感知地结合于不期望的物质(例如，不期望的蛋白质物质)的抗体。例如，特异性结合于Aβ的抗体将可感知地结合Aβ但不会显著地与非-Aβ蛋白或肽(例如，包含在淀粉样斑中的非-Aβ蛋白质或肽)反应。对优选表位特异的抗体将，例如，与相同蛋白或肽上的较远的表位不产生显著的交叉反应。特异性结合可通过任意的用于检测此结合的本领域已知手段来测定。优选地，特异性结合是通过Scatchard分析和/或竞争性结合试验来测定的。
结合片段通过重组DNA技术来产生，或通过完整免疫球蛋白的酶解或化学裂解来产生。结合片段包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fabc、Fv、单链、以及单链抗体。不同于“双特异的”或“双功能的”免疫球蛋白或抗体、免疫球蛋白或抗体被认为具有各个同一的结合位点。“双特异的”或“ 双功能的抗体”是人工杂交的抗体，其具有两个不同的重/轻链对和两个不同结合位点。双特异抗体可通过不同的方法包括杂交瘤融合或Fab′片段的连接来制备。参见，例如，Songsivilai & Lachmann，Clin.Exp.Immunol.79315-321(1990)；Kostelny等，J.Immunol.148，1547-1553(1992)。
术语“人源化免疫球蛋白”或“人源化抗体”是指免疫球蛋白或抗体，其包括至少一种人源化免疫球蛋白或抗体链(即至少一种人源化轻或重链)。术语“人源化免疫球蛋白链”或“人源化抗体链”(即“人源化免疫球蛋白轻链”或“人源化免疫球蛋白重链”)是指一种免疫球蛋白或抗体链(即分别为轻链或重链)具有包括基本上来自人免疫球蛋白或抗体的构架区和互补决定区(CDR)(例如，至少一个CDR、优选两个CDR、更优选三个CDR)的可变区并进一步含有恒定区(例如，在轻链的情况下，至少一个恒定区或其部分，且在重链的情况下优选三个恒定区)的恒定区，术语“人源化可变区”(例如，“人源化轻链可变区”或“人源化重链可变区”)是指包括基本上来自人免疫球蛋白或抗体的构架区和基本上来自非人免疫球蛋白或抗体的互补决定区(CDRs)的可变区。
短语“基本上来自人免疫球蛋白或抗体”或“基本上人”是指为比较目的比对人免疫球蛋白或抗体氨基酸序列时，区域与人的构架或恒定区序列具有至少80-90％，优选90-95％，更优选95-99％的同一性(即局部序列同一性)，例如允许保守性取代、共有序列取代、种系取代、回复突变等。保守性取代、共有序列取代、种系取代、回复突变等的导入，通常被称为人源化抗体或链的“优化”。短语“基本上来自非人免疫球蛋白或抗体”或“基本上非人”是指与非人的生物，例如非人的哺乳动物的免疫球蛋白或抗体序列具有至少80-95％，优选90-95％，更优选96％、97％、98％或99％的同一性。
相应地，所有的人源化免疫球蛋白或抗体或人源化免疫球蛋白或抗体链的区域或残基，除了可能的CDR外，基本上与相应的一个或多个天然人免疫球蛋白序列的区域或残基相同。术语“相应的区域”或“相应的残基”是指当第一和第二序列为比较目的进行最佳比对时，在第二个氨基酸或核苷酸序列上的区域或残基与在第一个氨基酸或核苷酸序列上的区域或残基占有相同的(即同等的)位置。
术语“人源化免疫球蛋白”或“人源化抗体”不想包括嵌合的免疫球蛋白或抗体，如下面所定义的。尽管人源化免疫球蛋白或抗体在其构建中是嵌合的(即包含来自不止一种蛋白质的区域)，其包括在此处所定义的嵌合免疫球蛋白或抗体中没有发现的其他特征(即含有供体CDR残基和受体构架残基的可变区)。
术语“显著的同一性”是指两个多肽序列，当进行最佳比对时，例如通过GAP或BESTFIT程序采用默认间隙权重，具有至少50-60％序列同一性，优选60-70％序列同一性，更优选70-80％序列同一性，更优选至少80-90％同一性，更优选至少90-95％同一性，以及甚至更优选至少95％序列同一性或更多(例如，99％的序列同一性或更多)。术语“基本上同一性”是指两个多肽序列，当进行最佳比对时，例如通过GAP或BESTFIT程序采用默认间隙权重，具有至少80-90％序列同一性，优选90-95％序列同一性，以及更优选至少95％序列同一性或更多(例如，99％序列同一性或更多)。对于序列比较来说，通常，一个序列充当被比较的测试序列的参考序列。当使用序列比较算法时，测试序列和参考序列被输入到计算机中，如果需要，指定序列座标，以及指定序列算法程序参数。序列比较算法然后基于所设定的程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。术语“序列同一性”和“序列同一性”在此处可以互用。
序列比较的最佳比对可以通过，例如，Smith & Waterman的局部同源性算法，Adv.Appl.Math.2482(1981)，通过Needleman & Wunsch的同源性排列算法，J.Mol.Biol.48443(1970)，通过Pearson & Lipman的相似性检索法，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 852444(1988)，通过计算机实施的这些算法(威斯康星遗传学软件包中GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，遗传学计算机组，575 Science Dr.，Madison，WI)，或通过目测(通常参见Ausubel等，Current Protocols in MolecularBiology)来进行。一个适于确定序列同一性和序列相似性百分比的算法的实例是BLAST算法，其被描述在Altschul等，J.Mol.Biol.215403(1990)中。进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心公开获得(公众可通过国家卫生研究所NCBI因特网服务器来获得)。通常，可以利用默认的程序参数进行序列比对，尽管也可以使用用户参数。对于氨基酸序列来说，BLASTP程序默认码长(W)为3，期望值(E)为10，BLOSUM62计分矩阵(参见Henikoff & Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910915(1989))。
优选地，不相同的残基位置通过保守性氨基酸取代区分。为了将氨基酸取代分为保守性取代或非保守性取代，氨基酸分组如下组I(疏水侧链)亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸；组II(中性亲水侧键)半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸；组III(酸性侧链)天冬氨酸、谷氨酸；组IV(碱性侧链)天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸、精氨酸；组V(影响链方向的残基)甘氨酸、脯氨酸；和组VI(芳香族侧链)色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸。保守替代涉及同类氨基酸之间的替代。非保守替代由一组中的一个成员变为另一组中的一个成员。
优选地，人源化免疫球蛋白或抗体结合抗原的亲合力是相应的非人抗体的3、4或5倍。例如，如果非人抗体具有109M-1的亲合力，人源化抗体则会具有至少3×109M-1、4×109M-1或109M-1的结合亲合力。当描述免疫球蛋白或抗体链的结合特性时，链可被描述基于其“抗原(例如，Aβ)直接结合”的能力。当一条链针对完整的免疫球蛋白或抗体(或其抗原结合片段)赋予特异性结合特性或结合亲合力时，其被称为“抗原直接结合”。突变(例如，回复突变)被称为基本上影响重或轻链抗原直接结合的能力，如果其影响(例如，减小)与含有缺少所述突变的等同链的抗体(或其抗原结合片段)比较时含有至少一个数量级别的含有所述链的完整免疫球蛋白或抗体(或其抗原结合片段)的结合亲合力。突变“基本上不影响(例如，减小)链直接结合抗原的能力”，如果其影响(例如，减小)含有所述链的完整免疫球蛋白或抗体(或其抗原结合片段)的结合亲合力仅仅是含有缺少所述突变的等同链的抗体(或其抗原结合片段)的2、3或4倍。
术语“嵌合免疫球蛋白”或抗体是指免疫球蛋白或抗体其轻链和重链来自不同的种。嵌合免疫球蛋白或抗体可例如通过基因工程构建自属于不同种的免疫球蛋白基因区段。
“抗原”是一种与抗体特异性结合的物质(例如，蛋白质物质或肽)。
术语“表位”或“抗原决定簇”是指免疫球蛋白或抗体(或其抗原结合片段)特异性结合的抗原上的位点。表位可以自连续的氨基酸或非连续的氨基酸通过蛋白的三级折叠来形成。从连续的氨基酸形成的表位一般在接触变性溶剂后仍保留活性而通过三级折叠形成的表位则在变性溶剂中失活。表位通常在单一的空间构型上包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸。检测表位空间构型的方法包括，例如，x-射线晶体照相术以及2-维的核磁共振。参见，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，Vol.66，G.E.Morris编(1996)。
识别相同表位的抗体可通过显示一个抗体阻碍另一个抗体与靶抗原结合能力的简单的免疫测定，即竞争性结合试验来进行检测。竞争性结合通过在测免疫球蛋白抑制参照抗体特异性结合共同抗原例如Aβ的试验来测定。已知的竞争性结合试验有很多种，例如固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接的酶免疫测定(EIA)、夹心竞争性试验(参见Stahli等，Methods in Enzymology 9242(1983))；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA法(参见Kirkland等，J.Immunol.1373614(1986))；固相直接标记测定法、固相直接标记夹心测定法(参见Harlow和Lane，AntibodiesA Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Press(1988))；采用I-125标记的固相直接标记RIA法(参见Morel等，Mol.Immunol.25(1)7(1988))；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA法(Cheung等，Virology 176546(1990))；以及直接标记RIA法(Moldenhauer等，Scand.J.Immunol.3277(1990))。通常，这种测定包括使用纯化抗原结合到携带未标记的测试免疫球蛋白和标记的参照免疫球蛋白之一的固体表面或细胞。竞争性抑制通过在测试免疫球蛋白的存在下测定结合到固体表面或细胞的标记量而测定。通常，当竞争性抗体过量存在时，其将抑制参照抗体与共同抗原特异性结合至少50-55％、55-60％、60-65％、65-70％、70-75％或更多。
表位也被免疫学细胞例如B细胞和/或T细胞所识别。表位的细胞识别可以通过测定抗原依赖性增殖的体外试验而检测，如通过掺入3H-胸苷，通过细胞因子分泌，通过抗体分泌，或通过抗原-依赖性杀伤(细胞毒性T淋巴细胞试验)进行测定。
示例性表位或抗原决定簇可在人淀粉状前体蛋白(APP)中发现，但优选在APP的Aβ肽中发现。APP存在多重同工型，例如APP695APP751和APP770。APP中的氨基酸依据APP770同工型的序列被编号(参见，例如，GenBank登录号No.P05067，也如SEQ ID NO38所述)。Aβ(在这里也称为β淀粉样肽和A-β)肽是APP的39-43个氨基酸的～4-kDa的内部片段(Aβ39、Aβ40、Aβ41、Aβ42和Aβ43)。Aβ40，例如，由APP的第672-711位残基组成且Aβ42由APP的第673-713位残基组成。通过不同分泌型酶体内或原位水解处理APP，结果发现Aβ有“短型”，40个氨基酸长，以及“长型”，42-43个氨基酸长。优选的表位或抗原决定簇，如这里所描述，位于Aβ肽的N-末端且包括Aβ的第1-10位氨基酸的残基，优选来自Aβ42第1-3位、第1-4位、第1-5位、第1-6位、第1-7位或第3-7位的残基。其它优选的表位或抗原决定簇包括Aβ第2-4位、第5、6、7或8位的残基，Aβ第3-5位、第6、7、8或9位的残基，或Aβ42第4-7位、第8、9或10位的残基。
术语“致淀粉样疾病”包括任意与不溶解的淀粉样纤维的形成或沉积相关(或引起)的疾病。示例的致淀粉样疾病包括但不限于全身性淀粉样变性、阿耳茨海默氏病、成年糖尿病、帕金森氏病、杭廷顿氏舞蹈病、额-暂时性痴呆以及朊病毒-相关的传染性海绵状脑病(分别在人中为kuru和Creutzfeldt-Jacob疾病，在羊和牛中为瘙痒病和BSE)。不同的致淀粉样疾病由沉积的原纤维的多肽组分的特性所定义和表征。例如，患有阿耳茨海默氏病、β-淀粉样蛋白(例如，野生型、变体或平截的β-淀粉样蛋白)的受试者或患者具有淀粉样沉积物的多肽组分的特征。因此，例如在受试者或患者的脑中，阿耳茨海默氏病是一个“通过Aβ沉积物表征的疾病”或“与Aβ沉积物相关的疾病”的例子。术语“β-淀粉状蛋白”、“β-淀粉样肽”、“β-淀粉样”、“Aβ”和“Aβ肽”在这里可以互用。
术语“有效量”或“有效剂量”定义为足以获得或至少部分获得所期望的效果的量。术语“治疗有效量”定义为足以治愈或至少部分抑制疾病和已由该病引起的并发症的量。有效作用的量依据感染的程度以及患者本身免疫系统的基本状态。
术语“患者”包括接受预防性或治疗性治疗的人或其它哺乳动物对象。
“可溶解的”或“分离的”Aβ是指非-聚集性或解聚的Aβ多肽。“不溶解的”Aβ是指聚集的Aβ多肽，例如，通过非共价键连在一起的Aβ。Aβ(例如，Aβ42)被认为是聚集性的，至少部分是由于肽的C末端的疏水残基的存在(APP的部分跨膜结构域)。制备可溶性Aβ的一种方法是用超声波在纯的DMSO中溶解冷冻干燥的肽。产生的溶液被离心以去除任意不溶解的微粒。
I.免疫和治疗剂本发明的免疫和治疗剂含有或由这里所定义的免疫原或抗体，或功能性的或其抗原结合片段所组成。已知基本的抗体结构单位包括亚单位的四聚体。每个四聚体包含两个相同的多肽链对，每对含有一个“轻”链(约25kD)的和一个“重”链(约50-70kD)。每个链的氨基末端包括一个约100-110或更多个氨基酸的可变区，主要负责抗原识别。每个链的羧基末端限定一个主要负责效应子功能的恒定区。
轻链分为κ或λ且大约230个残基的长度。重链分为gamma(γ)、mu(μ)、alpha(α)、delta(δ)或epsilon(ε)，大约450-600个残基的长度，分别把抗体的同种型定义为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。重链和轻链折叠成结构域。术语“结构域”是指蛋白例如免疫球蛋白或抗体的球形区域。免疫球蛋白或抗体的结构域包括，例如，通过β折叠和链内二硫键形成的3或4肽环。完整的轻链具有，例如，两个结构域(VL和CL)而完整的重链具有，例如4或5个结构域(VH、CH1、CH2、和CH3)。
轻链和重链中约12或更多个氨基酸形成的“J”区连接可变区与恒定区，重链还包括约10或更多个氨基酸形成的“D”区(通常参见，Fundamental Immunology(Paul，W编，第二版，Raven Press，N.Y.(1989)，第7章，为了各种目的在此全文引入作为参考)。
每对轻链/重链的可变区形成抗体结合位点。因此，完整的抗体有两个结合位点。除了双功能或双特异性抗体，这两个结合位点是相同的。所有的链都显示同样的基本结构，由三个高度可变区也称为互补决定区或CDR所连接的相对保守的构架区。天然产生的链或重组产生的链的表达可带有在细胞加工过程中被去除而产生成熟链的前导序列。成熟的链也重组产生，具有非天然产生的前导序列，例如为增强分泌或改变特定目的链的加工。
每对两个成熟链的CDR通过构架区排列，使其能够与特异性表位结合。从N末端到C末端，轻链和重链包括区FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。“FR4”在本领域中也称作可变重链的D/J区和可变轻链的J区。每区氨基酸的排列按照Kabat定义，免疫学目的蛋白序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)(NationalInstitutes of Health，Bethesda，MD，1987和1991)。另一结构定义已由Chothia等提出，J.Mol.Biol.196901(1987)；Nature 342878(1989)；以及J.Mol.Biol.186651(1989)(此后共同简称为“Chothia等”，为了各种目的在此全文引入作为参考)。
A.Aβ抗体本发明的治疗剂包括与Aβ或淀粉斑的其它组分特异性结合的抗体。此种抗体可以是单克隆或多克隆的。其中有些抗体特异性结合Aβ的聚集形式而不结合可溶形式。一些特异性结合可溶形式而不结合聚集形式。还有一些与聚集和可溶形式均结合。一些这样的抗体结合Aβ天然产生的短型(即Aβ39、40或41)而不结合Aβ天然产生的长型(即Aβ42和Aβ43)。一些抗体体结合Aβ长型而不结合短型。一些抗体结合Aβ而不结合全长的淀粉样前体蛋白。在治疗方法中使用的抗体优选具有一个完整的恒定区或至少足以与Fc受体相互作用的恒定区。人同种型IgG1是优选的，因为其对吞噬细胞上的FcRI受体具有最高亲合力的人同种型。双特异性Fab片段也可以采用，其中抗体的一个臂对Aβ具有特异性，另一个臂对Fc受体具有特异性。优选的抗体结合Aβ的结合亲合力大于(或等于)大约106、107、108、109或1010M-1(包括这些值的中间的数值)。
多克隆血清通常含有沿着Aβ长度与若干表位结合的抗体的混合群。然而，多克隆血清可特异于Aβ的特殊区段，例如Aβ1-10。单克隆抗体与Aβ内的特异表位结合，其可以是构象或非构象的表位。抗体的预防和治疗效用可通过实施例中所描述的转基因动物模型法来测定。优选的单克隆抗体结合于Aβ第1-10位残基中的表位(天然Aβ的第一个N末端残基编号为1)。一些优选的单克隆抗体结合于第1-5位氨基酸的表位，而一些结合于第5-10位氨基酸的表位。一些优选的抗体结合于第1-3位、第1-4位、第1-5位、第1-6位、第1-7位或第3-7位氨基酸的表位。一些优选的抗体结合于从Aβ第1-3位残基开始至第7-11位残基终止的表位。较不优选的抗体包括那些结合于Aβ第10-15位、第15-20位、第25-30位、第10-20位、第20、30位或第10-25位残基的表位的抗体。建议这种抗体在使用前利用实施例中所描述的小鼠模型筛选其活性。例如人们已经发现特定结合第10-18位、第16-24位、第18-21位和第33-42位残基的表位的抗体缺少活性(例如，缺少减少斑沉积和/或消除与阿耳茨海默氏病相关的神经炎性病症的能力)。在一些方法中，采用具有结合不同表位的特异性的多单克隆抗体。此种抗体可按序或同时给药。对除Aβ外的其它淀粉样组分的抗体也可采用(例如，给药或辅助给药)。例如，抗体可针对淀粉样相关的蛋白共核蛋白(Synuclein)。
当一种抗体据说结合于指定残基中的表位，例如Aβ1-5时，意指其特异性结合含有指定残基的多肽(即本实施例中的Aβ1-5)。此种抗体不必要接触Aβ1-5中的所有残基。也并非Aβ1-5中的每一个氨基酸取代或缺失都必然显著影响结合亲合力。抗体的表位特异性可被检测，例如通过形成噬菌体展示文库，其中不同的成员显示不同的Aβ的亚序列。然后在噬菌体展示文库筛选其特异性结合在测抗体的成员。分离序列家族。通常，此族包括一个共有的核心序列，以及在不同成员中侧接序列的长度发生变化。显示与抗体特异性结合的最短的核心序列限定了通过抗体结合的表位。抗体也可用来与其表位特异性已被测定的抗体一起在竞争性试验中测定其表位特异性。例如，与3D6抗体竞争结合Aβ的抗体结合到与3D6相同或相似的表位即Aβ1-5的残基中。同样，与10D5抗体竞争的抗体结合到相同或相似的表位即Aβ3-7的残基中。筛选表位特异性的抗体对治疗效力的预知是有用的。例如，一个确定结合到Aβ第1-7位残基的表位的抗体可能在本发明预防和治疗阿耳茨海默氏病的方法中是有效的。
特异性的结合于优选的Aβ区段而不结合Aβ的其它区域的单克隆或多克隆抗体相对于结合其它区域的单克隆抗体或结合完整Aβ的多克隆血清具有大量的优点。首先，对于相等的重量剂量来说，特异性结合优选区段的抗体的剂量含有在清除淀粉样斑中有效的抗体的较高克分子剂量。第二，特异性结合优选区段的抗体可诱导抗淀粉样沉积物的清除反应而不诱导抗完整APP多肽的清除反应，从而减少可能的副作用。
1.非人抗体的制备本发明提供了非人抗体，例如，对本发明的优选的Aβ表位具有特异性的抗体。此种抗体可被用于配制本发明的各种治疗组合物，或优选地，提供用于人源化或嵌合抗体生产的互补决定区(具体描述在下文)。非人单克隆抗体，例如鼠科动物、豚鼠、灵长类动物、兔或大鼠可以通过例如用Aβ免疫动物来制备。也可以使用含有Aβ、Aβ的免疫原性片段或Aβ抗体的抗-独特型抗体的更长多肽链。参见Harlow &Lane，同上(为各种目的全文引入作为参考)。这样一种免疫原可以从天然来源获得、通过肽合成或者通过重组表达获得。可选择地，如以下所述，免疫原可以融合载体蛋白或与其复合给药。可选择地，免疫原可以结合佐剂给药。术语″佐剂″是指一种化合物当与抗原联合给药时增强对抗原的免疫应答，但当单独给药时不产生对抗原的免疫应答。佐剂可以增强免疫应答，其机制包括淋巴细胞募集、刺激B和/或T细胞以及刺激巨噬细胞。如下文所述，可以使用若干佐剂。完全弗氏佐剂和不完全佐剂的依次使用对于实验动物的免疫是优选的。
兔或豚鼠通常用于制备多克隆抗体。制备多克隆抗体的示例，例如，用于被动保护，可如下所述来进行。125个非-转基因小鼠用100μg的Aβ1-42加上CFA/IFA佐剂致免疫，并在4-5月时安乐死。从免疫的小鼠中收集血液。IgG分离自其它的血液组分。对免疫原特异的抗体可通过亲和层析部分纯化。每个小鼠获得平均约0.5-1mg免疫原特异的抗体，总共获得60-120mg。
小鼠通常用于制备单克隆抗体。抗片段的单克隆的制备方法是注射长型的Aβ或其片段到小鼠中，制备杂交瘤和筛选特异性结合Aβ的抗体的杂交瘤。可选择地，筛选结合Aβ的特异区域或所需片段而不结合Aβ的其它非重叠片段的抗体。通过确定抗体与Aβ肽的缺失突变体的集合，并测定哪些缺失突变体与抗体结合，从而完成后者的筛选。可以通过如Western印迹和ELISA的方法评估结合作用。显示特异性结合抗体的最小片段限定了该抗体的表位。可选择地，表位的特异性可以通过其中测试和参照抗体对Aβ的竞争结合的竞争试验来进行确定。如果测试抗体与参照抗体竞争，则它们结合相同表位或足够接近的表位，以至一个抗体的结合干扰了另一个抗体的结合。这些抗体的优选同种型是小鼠同种型IgG2a或其它物种中的等同的同种型。小鼠同种型IgG2a与人同种型IgG1等同。
2.嵌合和人源化抗体本发明也提供了对β淀粉样肽特异的嵌合和/或人源化抗体(即嵌合和/或人源化免疫球蛋白)。嵌合和/或人源化抗体具有与提供构建该嵌合或人源化抗体的初始材料的小鼠或其它非人抗体有相同或相似的结合特异性和亲合力。
A.嵌合抗体的制备术语“嵌合抗体”是指其轻链和重链基因通常通过基因工程从属于不同物种的免疫球蛋白基因区段已被构建的抗体。例如，小鼠单克隆抗体基因的可变区(V)区段可能结合人恒定(C)区段如IgG1和IgG4。优选人同种型IgG1。因此，典型的嵌合抗体是由小鼠抗体V或抗原结合结构域和人抗体的C或效应子结构域的杂种蛋白。
B.人源化抗体的制备术语“人源化抗体”是指一种抗体其包括至少一个含有基本上来自人抗体链(称为受体免疫球蛋白或抗体)的可变区构架残基的链以及至少一个基本上来自小鼠抗体的互补决定区(称为供体免疫球蛋白或抗体)。参见，Queen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8610029-10033(1989)、US5,530,101、US5,585,089、US5,693,761、US5,693,762、Selick等，WO 90/07861，以及Winter，US5,225,539(全文引入作为参考)。恒定区，如果存在，也基本上或整个来自人免疫球蛋白。
小鼠CDR在人可变区构架中的取代最可能导致保留其正确的空间取向，如果人可变区构架与其CDR源自的小鼠可变构架采用相同或相似的构象。此可以通过从构架序列显示与其CDR来源的鼠科动物可变构架区有高度的序列同一性的人抗体中获得人可变区来完成。轻链和重链可变构架区可衍生自相同的或不同的人抗体序列。人抗体序列可以是天然产生的人抗体序列或可以是几种人抗体的共有序列。参见Kettleborough等，Protein Engineering 4773(1991)；Kolbinger等，Protein Engineering 6971(1993)以及Carter等，WO 92/22653。
在鉴定鼠供体免疫球蛋白和适当的人受体免疫球蛋白的互补决定区后，接下来是确定，如果有，是哪些来自组分的残基应被取代以优化产生的人源化抗体的特性。通常，用鼠氨基酸取代人氨基酸残基应最小化，因为鼠残基的导入增加了抗体激发人体的人-抗-小鼠-抗体(HAMA)反应的危险。本领公认的检测免疫应答的方法可用来控制特定患者或在临床试验中的HAMA反应。给药人源化抗体的患者在进行所述治疗的开始和自始至终进行免疫原性评估。利用本领域公知的方法，包括表面胞质共振技术(BIACORE)和/或固相ELISA分析，例如通过测定在患者血清样品中对人源化治疗剂的抗体，来测定HAMA反应。
来自人可变区构架残基的特定氨基酸基于其对CDR构象和/或结合抗原的可能影响进行筛选取代。鼠CDR区与人可变构架区的非天然并列可产生非天然的构象抑制，除非通过特定氨基酸残基的取代来修正，否则会导致结合亲合力的丧失。
筛选用于取代的氨基酸残基部分是通过计算机模型来测定。计算机硬件和软件在此描述用于产生免疫球蛋白分子的三维图像。通常，分子模型产生自免疫球蛋白链或其结构域的解开结构。将待建模型的链与解开三维结构的链或结构域进行氨基酸序列相似性比较，且显示出最大序列相似性的链或结构域被选为分子模型构建的起始点。显示至少50％序列同一性的链或结构域被选择用于分子模型的构建，且优选至少60％、70％、80％、90％或更多的序列同一性的那些链或结构域被选择用于建模。解开的起始结构经修饰允许正在建模的免疫球蛋白链或结构域的实际氨基酸和起始结构间的差别。然后把修饰的结构装配到合成的免疫球蛋白中。最后，通过能量最小化以及通过核实所有的原子相互之间都在适当的距离内以及键长和角度在化学上可接受的限度内，使模型改进。
用于取代的氨基酸残基的选择也可部分通过测定在特定位置的氨基酸的特性，或跟据经验观察特定氨基酸取代或诱变的效果来确定。例如，当鼠可变区构架残基和所选择的人可变区构架残基之间不同时，人构架氨基酸通常应被来自小鼠抗体中等同的构架氨基酸取代，当合理地预期该氨基酸(1)直接非共价结合抗原，(2)与CDR区相邻，(3)或者与CDR区相互作用(例如，通过计算机模型测定在CDR区的约3-6_内)，或(4)参与VL-VH界面。
“直接非共价结合抗原”残基包括在构架区的适当位置的氨基酸，通过建立的化学力，例如通过氢键、范德华力、疏水作用等，具有与抗原上的氨基酸直接相互作用的较好概率。
CDR和构架区由Kabat等或Chothia等，同上所定义。当构架残基，如由Kabat等，同上所定义，构成结构环残基，如由Chothia等，同上所定义时，在小鼠抗体中存在的氨基酸可选择来取代至人源化抗体中。“与CDR区相邻”的残基包括在紧邻一个或多个人源化免疫球蛋白链的一级序列中的CDR位置上的氨基酸残基，例如在紧邻由Kabat所限定的CDR或由Chothia所限定的CDR的位置上的氨基酸残基(参见，例如，Chothia和Lesk JMB 196901(1987))。这些氨基酸特别可能与CDR中的氨基酸相互作用，并且如果选自于受体，则特别可能使供体CDR变形和降低亲合力。此外，相邻氨基酸可与抗原直接相互作用(Amit等，Science，233747(1986)，在此引入作为参考)且筛选这些来自供体的氨基酸可能理想地保持所有的抗原接触，提供在原始抗体中的亲合力。
“或者与CDR区相互作用”的残基包括那些通过二级结构分析而测定在空间方向足以影响CDR区的残基。在一个实施方案中，“或者与CDR区相互作用”的残基通过分析供体免疫球蛋白的三维模型而测定(例如，计算机产生的模型)。一种通常是原始供体模型的三维模型显示CDR外的特定氨基酸临近于CDR，并具有通过氢键、范德华力、疏水作用等与CDR中的氨基酸相互作用的良好概率。在这些氨基酸位置，选择供体免疫球蛋白氨基酸而非受体免疫球蛋白氨基酸。与此标准相符的氨基酸通常具有在CDR某个原子的约3埃单位(_)内的侧链原子且必须含有一个能够通过建立的化学力，例如上述所列举，与CDR原子相互作用的原子。
在原子可以形成氢键的情况下，测定它们原子核之间的距离为3_，但不形成键的原子，3_测定在其范德华表面之间。因此，在后一种情况下，原子核心必须在大约6_(3_加总范德华半径)内原子才被认为是能够相互作用的。在一些情况下原子核距离4或5到6_。在测定氨基酸能否与CDR相互作用，优选不考虑作为CDR部分的重链CDR2的最后8个氨基酸，因为从结构的观点来看，这8个氨基酸更多地充当构架的一部分。
能够与CDR中的氨基酸相互作用的氨基酸也可以通过其它的方式测定。每一构架氨基酸的溶剂可到达的表面面积以两种方式计算(1)在完整抗体中，以及(2)在由去除CDR的抗体组成的假定分子中。在这些大约10平方埃或更多的数之间的差异显示构架氨基酸接近溶剂至少部分被CDR阻断，且因此氨基酸与CDR接触。氨基酸的溶剂可进入的表面面积可以基于抗体的三维模型，利用本领域公知的算法计算(例如，Connolly，J.Appl.Cryst.16548(1983)以及Lee和Richards，J.Mol.Biol.55379(1971)，二者均被引入作为参考)。通过影响另一个依次接触CDRs的构架氨基酸的构象，构架氨基酸偶而也与CDR直接作用。
在构架的一些位置的氨基酸已知能够与很多抗体的CDR相互作用(Chothia和Lesk，同上，Chothia等，同上，以及Tramontano等，J.Mol.Biol.215175(1990)，所有文献均在此引入作为参考)。显著的是在轻链的位置2、48、64和71和重链的位置26-30、71和94(编号方式符合于Kabat)的氨基酸已知能够与很多抗体中的CDR相互作用。轻链位置35以及重链位置93和103的氨基酸也可能与CDR相互作用。在所有的这些编号位置，在人源化免疫球蛋白中选择供体氨基酸而非受体氨基酸(当不同时)是优选的。在其它方面，特定的残基能够与CDR区相互作用，例如轻链的头5个氨基酸，有时可选自受体免疫球蛋白而不会损失人源化免疫球蛋白中的亲合力。
“参与VL-VH界面”的残基或“包装残基”包括那些在VL和VH之间界面上的残基，如被Novotny和Haber，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，824592-66(1985)或Chothia等，同上所定义。通常，如果不常见的包装残基是不同于人构架中的那些，它们应保留在人源化抗体中。
一般而言，符合上述条件的一个或多个氨基酸被取代。在一些实施方案中，所有或大部分的符合上述条件的氨基酸被取代。有时候，一个特定的氨基酸是否符合上述条件很含糊，且可选择的变体免疫球蛋白被制备，其中的一个具有特定的取代，而其它的没有。如此产生的可选择的变体免疫球蛋白采用这里所描述的任何测定方法对其期望的活性进行检测，且挑出优选的免疫球蛋白。
通常人源化抗体的CDR区基本上是相同的，且更通常，与供体抗体的相应CDR区相同。尽管不是通常所期望的，有时候可能进行CDR残基的保守氨基酸取代而不明显影响产生的人源化免疫球蛋白的结合亲合力。保守性氨基酸取代是指组合例如甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。
其它的候选取代为受体人构架氨基酸，其对于人免疫球蛋白的该位置来讲是不寻常或“稀有”的。这些氨基酸可用来自小鼠供体抗体的等同位置的或来自更通常人免疫球蛋白的等同位置的氨基酸取代。例如，当在受体免疫球蛋白的人构架区的氨基酸对于该位置是稀少的并且相应的在供体免疫球蛋白的氨基酸对于人免疫球蛋白序列的该位置是普通的情况时，或当受体免疫球蛋白的氨基酸对该位置是稀少的并且相应的供体免疫球蛋白的氨基酸相对于其它的人序列也是稀少的时候，取代应是可期望的。这些标准有助于确保人构架中的非典型氨基酸不破坏抗体的结构。此外，通过用来自供体抗体的对人抗体碰巧是常见的氨基酸替换不常见的人受体氨基酸，人源化抗体可以产生较少的免疫原性。
此处所用的术语“稀有”是指一个在该位置处出现的氨基酸在序列的代表性样本中占少于序列的约20％但通常少于序列的约10％，且此处所用的术语“普通的”是指在该位置处出现的氨基酸在序列的代表性样本中占多于序列的约25％但通常超过序列的约50％。例如，所有的人轻链和重链可变区序列分别被归类到序列″亚组″中，其彼此尤其同源且在特定的关键位置具有相同的氨基酸(Kabat等，同上)。当判定人受体序列中的氨基酸在人序列中是“稀有”还是“普通的”时，通常优选仅考虑那些与受体序列在相同亚组中的人序列。
其它的取代候选为受体构架氨基酸，其在可选择的定义下被鉴定为CDR区的一部分，所述定义由Chothia等提出，同上。其它的取代候选为受体人构架氨基酸，其在AbM和/或接触定义下被鉴定为CDR区的一部分。尤其是，在可变重链中的CDR1被定义包括第26-32位的残基。
其它的取代候选为对应于稀有或非常见的供体构架残基的受体构架残基。稀有或非常见的供体构架残基是那些对鼠抗体而言在该位置为稀有的或非常见的。对于鼠抗体而言，亚组根据Kabat和经鉴定区别于共有序列的残基位置来确定。这些供体特异性差异可指向增强活性的鼠序列中的体细胞突变。预计影响结合的非常见残基被保留，而预计对结合不重要的残基被取代。
其它的取代候选为在受体构架区中出现的非种系残基。例如，当受体抗体链(即人抗体链与供体抗体链具有显著的序列同一性)与种系抗体链(同样与抗体链具有显著的序列同一性)比对时，在受体链构架和种系链构架之间不匹配的残基可用相应的来自种系序列的残基取代。
除了上面所讨论的特异氨基酸取代之外，人源化免疫球蛋白的构架区通常基本上相同，且更通常与它们所衍生的人抗体的构架区相同。当然，很多构架区中的氨基酸对抗体的特异性或亲合力有较少的或没有直接的帮助。因此，许多单独的构架残基的保守性取代可以容许而无需明显改变产生的人源化免疫球蛋白的特异性或亲合力。因此，在一个实施方案中，人源化免疫球蛋白的可变构架区与人可变构架区序列或此序列的共有序列有至少85％的序列同一性。
在另一个实施方案中，人源化免疫球蛋白的可变构架区与人可变构架区序列或此序列的共有序列有至少90％，优选95％，更优选96％、97％、98％或99％的序列同一性。然而，通常这种取代是未期望的。
人源化抗体优选显示对抗原有至少107、108、109或1010M-1的特异结合亲合力。通常人源化抗体对抗原的结合亲合力的上限在供体免疫球蛋白的3、4或5倍之内。通常结合亲合力的下限也在供体免疫球蛋白的3、4或5倍之中。可选择地，结合亲合力可与没有取代的人源化抗体的相比较(例如，具有供体CDR和受体FR，但没有FR取代的抗体)。在这种情况下，最优化的抗体(带有取代)的结合是优选至少二-到三倍大于，或三-到四-倍大于未取代的抗体的结合。为了进行比较，不同抗体的活性可通过例如BIACORE(即使用未标记的试剂的表面胞质团共振)或竞争性结合试验来确定。
C.人源化3D6抗体的制备本发明的一个优选的实施方案提供了一种针对Aβ的N末端的人源化抗体特别用于此处所述的治疗和/或诊断的方法中。一个特定的优选的用于人源化抗体生产的起始材料是3D6。3D6对Aβ的N末端是特异性的且已显示介导淀粉斑的吞噬作用(例如，诱导吞噬作用)(参见实施例I-V)。编码3D6抗体重链和轻链可变区的cDNA的克隆和测序描述在实施例VI中。
合适的人受体抗体序列通过计算机比较小鼠可变区的氨基酸与已知人抗体的序列得到鉴定。重链和轻链的比较分别进行，但原理是相似的。具体地，来自其构架序列显示与鼠VL和VH构架区高度序列同一性的人抗体的可变区的鉴定可通过Kabat数据库利用NCBIBLAST(公众通过国家卫生研究所NCBI因特网服务器来获得)与各自的鼠构架序列进行同一性检索。在一个实施方案中，选择与鼠供体序列有大于50％序列同一性的受体序列。优选地，选择有60％、70％、80％、90％或更多的序列同一性的受体抗体序列。
3D6计算机比较显示3D6轻链与亚型κII的人轻链有最大的序列同一性，且3D6重链与亚型κIII的人重链有最大的序列同一性，如Kabat等所定义的，同上。因此，轻链和重链人构架区优选来自这些亚型的人抗体，或来自此亚型的共有序列。与相应的来自3D6的区域有最大的序列同一性的优选的轻链人可变区是来自具有Kabat IDNO.019230、005131、005058、005057、005059、U21040和U41645的抗体，其中019230是较优选的。与相应的来自3D6的区域有最大序列同一性的优选的重链人可变区是来自Kabat ID NO.045919、000459、000553、000386和M23691的抗体，其中045919是较优选的。
接下来如下筛选残基用于取代。当氨基酸在3D6可变构架区和等同的人可变构架区之间有差别时，人构架氨基酸通常应被等同的小鼠氨基酸取代，如果合理地预期该氨基酸(1)非共价直接结合抗原，(2)与一个CDR区相邻，在由Chothia等，同上提出的可选择的定义下是CDR区的一部分，或者另与一个CDR区相互作用(例如，CDR区的约3A内)(例如，在3D6的L2、H49和H94位置上的氨基酸)，或(3)参与VL-VH界面(例如，氨基酸在3D6的L36、L46和H93位置上的氨基酸)。
3D6抗体重链和轻链可变区以及3D6抗体的人源化的计算机模拟描述在实施例VII中。简单地说，三维模型的生成是基于重链和轻链的最接近解开的鼠抗体结构。为此目的，命名为1CR9(蛋白质数据库(PDB)ID1CR9，Kanyo等，J.Mol.Biol.293855(1999))的抗体被选作模拟3D6轻链的模板，而命名为1OPG(PDB ID1OPG，Kodandapani等，J.Biol.Chem.2702268(1995))的抗体被选作模拟3D6重链的模板。模型通过一系列的能量最小化步骤来解除不期望的原子接触以及优化静电的和范德华相互作用而进一步被改进。1qkz的解开结构(PDB ID1QKZ，Derrick等，J.Mol.Biol.29381(1999))被选作模拟重链如3D6的CDR3的模板，因为3D6和1OPG在此区域中当用于比较目的进行比对时不显示显著的序列同源性。
此处所述的抗体的三维结构信息是公众可获得的，例如从生物结构信息学研究协作体的蛋白质数据库(Research Collaboratory forStructural Bioinformatics’Protein Data Bank)(PDB)。PDB是通过万维网免费进入的且由Berman等(2000)Nucleic Acids Research，28235描述。计算机模型化允许CDR-相互作用残基的测定。3D6结构的计算机模型可依次作为起始点，用于预测含有取代在人构架结构中的3D6互补决定区的抗体的三维结构。其它的模型可被构建，表示结构中导入进一步的氨基酸取代。
通常，满足上述条件的一个、大多数或所有的氨基酸的取代是所期望的。因此，本发明的人源化抗体通常会含有人轻链构架残基用相应的3D6残基在下述位置的至少1、2或3以及更通常4个位置上进行取代L1、L2、L36和L46。人源化抗体也通常含有人重链构架残基用相应的3D6残基在下述位置的至少1、2以及有时3个位置上进行取代H49、H93和H94。人源化抗体也可含有人重链构架残基用相应的种系残基在下述位置的至少1、2以及有时3个位置上进行取代H74、H77和H89。
然而有时候，一个特定的氨基酸是否符合上述条件很含糊，且产生可选择的变体免疫球蛋白，其中的一个具有特定的取代，而其它的没有。在其中用鼠残基的取代将导入在人免疫球蛋白的特定位置是稀有的残基的情况下，理想的是对带有或不带有取代的抗体的活性进行检测。如果带有或不带有取代的抗体的活性(例如，结合亲合力和/或结合特异性)大约相同，没有取代的抗体则是优选的，因为这将预计引起HAHA应答的减少，如本文所述。
其它的取代候选为受体人构架氨基酸，其在人免疫球蛋白的该位置上是非常见的。这些氨基酸可用来自更平常的人免疫球蛋白的等同位置的氨基酸进行取代。可选择地，当此种氨基酸在人免疫球蛋白的位置是特有的时，来自小鼠3D6的等同位置的氨基酸可被导入到人构架区。
在其它的实施方案中，当人轻链构架受体免疫球蛋白为Kabat IDNO 019230时，轻链含有在下列位置的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更通常13个取代L7、L10、L12、L15、L17、L39、L45、L63、L78、L83、L85、L100或L104。在其它的实施方案中，当人重链构架受体免疫球蛋白为Kabat ID NO.045919时，重链含有在下列位置的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或更通常15个取代H3、H5、H13、H16、H19、H40、H41、H42、H44、H72、H77、H82A、H83、H84或H108。这些位置用来自具有更典型氨基酸残基的人免疫球蛋白的等同位置的氨基酸进行取代。适当的氨基酸取代的实例显示于图1和2。
其它的取代候选为构架区中的非-种系残基。3D6与已知的种系序列的计算机比较表明显示最大程度的序列同一性的重链序列包括种系可变区序列VH3-48、VH3-23、VH3-7、VH3-21和VH3-11，其中VH3-23为较优选的。Kabat ID 045919与VH3-23的序列比对表明残基H74、H77和/或H89可选择用相应的种系残基取代(例如，残基H74、H77和/或H89，当比较Kabat ID 045919和VH3-23时)。同样，与3D6轻链有最大程度序列同一性的种系序列包括A1、A17、A18、A2和A19，其中A19是最优选的。在所选择的轻链受体构架和其中一个种系序列之间没有匹配的残基可选择用相应的种系残基来取代。
表1总结了3D6 VH和VL区的序列分析。其它的可以用于3D6抗体和其它的人抗体的计算机建模的小鼠和人结构与用于筛选氨基酸取代的种系序列一样被充分阐述。稀有的小鼠残基也列在表1中。稀有小鼠残基的鉴定方法是比较供体VL和/或VH序列与其它的供体VL和/或VH序列所属的亚组的成员的序列并鉴定其不同于共有序列的残基位置。这些供体的特异差异可指向增强活性的体细胞突变。接近于结合位点的不常见或稀有的残基可能接触抗原，使其理想地保留小鼠残基。然而，如果不常见的小鼠残基对于结合是不重要的，相应的受体残基的采用是优选的，因为小鼠残基可以在人源化抗体中产生免疫原性的新表位。如果在供体序列中的不常见残基在相应的受体序列中实际上是一个普通残基，则优选的残基毫无疑问是受体残基。
表13D6 V-区序列的概况
*来自相同抗体的重链和轻链(O-81，Hirabayashi等，NAR202601).
这里所指的Kabat ID序列是公众可获得的，例如，获自西北大学生物医学工程系(Northwestern University Biomedical EngineeringDepartment)的免疫学目的蛋白序列的Kabat数据库。此处所述的抗体的三维结构信息是公众可获得的，例如，获自生物结构信息学研究协作体的蛋白质数据库(PDB)。PDB是通过万维网免费进入的且描述在Berman等，(2000)Nucleic Acids Research，第235-242页。此处所述的种系基因序列是公众可获得的，例如，获自收集了Igh、Igκ和Igλ种系V基因的序列的国家生物技术信息中心(NCBI)数据库(作为在国家卫生研究所(NIH)的国家医学图书馆(NLM)的分支机构)。NCBI“Ig种系基因”数据库的同源性检索由IgG BLASTTM所提供。
在一个优选的实施方案中，本发明的人源化抗体含有(i)包括含有鼠3D6 VL CDR和人受体构架的可变区的轻链，其中构架具有至少一个，优选两个、三个或四个选自L1、L2、L36和L46用相应的3D6残基取代的残基，以及(ii)含有3D6 VH CDR和人受体构架的重链，其中构架具有至少一个，优选两个或三个选自H49、H93和H94用相应的3D6残基取代的残基，以及可优选地，至少一个，优选两个或三个选自H74、H77和H89用相应的人种系残基取代的残基。
在另一个优选的实施方案中，本发明的人源化抗体含有(i)包括含有鼠3D6 VL CDR和人受体构架的可变区的轻链，其中构架具有用酪氨酸(Y)取代的残基1，用缬氨酸(V)取代的残基2，用亮氨酸(L)取代的残基36和/或用精氨酸(R)取代的残基46，和(ii)包括3D6 VH CDR和人受体构架的重链，其中构架具有用丙氨酸(A)取代的残基49，用缬氨酸(V)取代的残基93和/或用精氨酸(R)取代的残基94，以及可优选地，具有用丝氨酸(S)取代的残基74，用苏氨酸(T)取代的残基77和/或用缬氨酸(V)取代的残基89。
在一个特别优选的实施方案中，本发明的人源化抗体具有此处所描述的结构特征，且进一步具有至少一个(优选两个、三个、四个或全部)下述的活性(1)结合聚集的Aβ1-42(例如，通过ELISA测定)；(2)结合斑中的Aβ(例如，AD和/或PDAPP斑的染色)；(3)结合与嵌合3D6相比较具有两倍到三倍的结合亲合力的Aβ(例如，具有鼠CDR和人受体FR的3D6)；(4)介导Aβ的吞噬作用(例如，在离体吞噬作用测定中，如这里所述)；以及(5)通过血脑屏障(例如，证明短期的脑定位作用，例如在PDAPP动物模型中，如这里所述)。
在另一个实施方案中，本发明的人源化抗体具有此处所述的结构特征，以一种方式或足以激发至少一种下述体内影响的亲合力结合Aβ(1)减少Aβ斑沉积；(2)预防班形成；(3)降低可溶性Aβ的水平；(4)减少与致淀粉样疾病相关的神经炎性病症；(5)减少或改善至少一种与致淀粉样疾病相关的生理症状；和/或(6)提高认知功能。
在另一个实施方案中，本发明人源化抗体具有此处所述的结构特征，并且特异性结合于含有Aβ第1-5位或第3-7位残基的抗原决定簇。
3.人抗体抗Aβ人抗体通过以下所述的多种技术提供。一些人抗体通过竞争性结合实验选择，或相反具有与特定的小鼠抗体相同的表位特异性，例如在这里所述的小鼠单克隆抗体之一。人抗体也可以通过仅用Aβ的片段作为免疫原，和/或通过筛选抗Aβ缺失突变体集合的抗体，对特定表位特异性进行筛选。人抗体优选具有人IgG1同种型特异性。
a.三杂交瘤(trioma)法Oestberg等，Hybridoma 2361(1983)，美国专利No.4,634,664；以及Engleman等，美国专利4,634,666(为所有目的分别在此引入作为参考)描述了基本方法和该方法中作为范例的细胞融合组分SPAZ-4。由于抗体产生细胞系来自三个细胞两个人细胞和一个小鼠细胞，这种获得抗体产生细胞系的方法称为三杂交瘤法。首先，将小鼠骨髓瘤细胞系与人B淋巴细胞融合，得到非抗体产生的异种杂交细胞，如Oestberg同上所述的SPAZ-4细胞系。接着使该异种细胞与免疫化的人B淋巴细胞融合，获得抗体产生的三杂交瘤细胞系。发现三杂交瘤比来自人细胞的普通杂交瘤细胞有更稳定的抗体生产。
免疫化的B淋巴细胞从人供体的血液、脾脏、淋巴结或骨髓中获得。如果期望抗体抗特异抗原或表位，优选使用该抗原或其表位免疫。免疫可以是体外或体内。对于体内免疫，B细胞通常从用Aβ、其片段，带有Aβ或其片段的更大的多肽或Aβ抗体的抗-独特型抗体免疫的人中获得。在一些方法中，B细胞来自最终被给药抗体治疗的同一患者。对于体外免疫，通常使B淋巴细胞在添加有10％人血浆的培养基如RPM-1640中(参见Engleman，同上)接触抗原7-14天的时间。
通过本领域公知的方法，免疫化的B淋巴细胞与异种杂交细胞如SPAZ-4融合。例如，细胞用分子量为1000-4000的40-50％聚乙二醇在37℃处理约5-10分钟。从融合混合物中分离细胞并在选择性培养基中扩增所需的杂交细胞(如HAT或AH)。通过分析三杂交瘤培养基中结合Aβ或其片段的能力，可以鉴定分泌具有所需的结合特异性抗体的克隆。生产具有所期望特异性的人抗体的三杂交瘤细胞用限制稀释技术亚克隆，并在培养基中体外培养。然后，测定获得的三杂交瘤细胞系结合Aβ或其片段的能力。
尽管三杂交瘤细胞遗传上稳定，但并不高水平产生抗体。可以将来自三杂交瘤细胞的抗体基因克隆到一个或多个表达载体中，并把载体转化标准的哺乳动物、细菌或酵母细胞系，以增加表达水平。
b.转基因非人哺乳动物抗Aβ人抗体也可以由转基因的非人哺乳动物生产，其具有至少编码人免疫球蛋白基因座区段的转基因。通常，这种转基因哺乳动物的内源免疫球蛋白基因座在功能上是无活性的。优选地，人免疫球蛋白基因座区段包括重链和轻链成分的未经重排的序列。内源免疫球蛋白基因的失活和外源免疫球蛋白基因的导入都可以通过定向同源重组，或YAC染色体的导入实现。由此过程获得的转基因哺乳动物能够功能性重排免疫球蛋白成分序列，大量表达由人免疫球蛋白基因编码的各种同种型抗体，且不表达内源免疫球蛋白基因。具有这些特性的哺乳动物的生产与特性详细描述于例如，Lonberg等，WO93/12227(1993)；US5,877,397，US5,874,299，US5,814,318，US5,789,650，US5,770,429，US5,661,016，US5,633,425，US5,625,126，US5,569,825，US5,545,806，Nature 1481547(1994)，Nature Biotechnology 14826(1996)，Kucherlapati，WO 91/10741(1991)(为各种目的分别引入本文作为参考)。转基因小鼠是特别合适的。用Aβ或其片段免疫转基因的非人哺乳动物可以获得抗-Aβ抗体，如Lonberg或Kucheriapati，同上所述。利用常规的Kohler-Milstein技术，通过例如将来自这些哺乳动物的B细胞和合适杂交瘤细胞系融合可以用来制备单克隆抗体。还可以从用免疫原性药剂免疫的人血清中提供人多克隆抗体。或者，该多克隆抗体可以利用Aβ或其它淀粉样肽作为亲合试剂，通过亲和纯化来浓缩。
c.噬菌体展示法另外获得人抗-Aβ抗体的方法是筛选人B细胞的DNA文库，一般方案概述见Huse等，Sciences 2461275-1281(1989)。如在三杂交瘤法中所描述，B细胞可以从用Aβ、其片段，带有Aβ或片段的更大的多肽或抗-独特型抗体免疫的人中获得。或者，B细胞可以从最终接受抗体治疗的患者中获得。选择结合Aβ或其片段的抗体。然后克隆并扩增编码这些抗体(或结合片段)的序列。Huse所述方案和噬菌体展示法一同使用将会更加有效。参见例如，Dower等，WO 91/17271，McCafferty等，WO 92/01047，Herzig等，US5,877,218，Winter等，US5,871,907，Winter等，US5,858,657，Holliger等，US5,837,242，Johnson等，US5,733,743和Hoogenboom等，US5,565,332(为各种目的分别引入本文作为参考)。在这些方法中，产生噬菌体文库，其中的成员在它们的外表面上展示不同的抗体。抗体通常展示为Fv或Fab片段。通过亲和富集选择对Aβ或其片段具有所期望的特异性的噬菌体展示抗体。
在变化的噬菌体展示方法中，生产具有所选择的鼠抗体结合特异性的人抗体。参见Winter WO 92/20791。这种方法中，选择的鼠抗体的轻链或重链的可变区用作起始材料。例如，如果轻链的可变区用作起始材料，构建的噬菌体文库其成员展示相同的轻链可变区(即鼠起始材料)和不同的重链可变区。重链可变区获自重排的人重链可变区文库。选择对Aβ显示强特异性结合(例如，至少108，优选至少109M-1)的噬菌体。然后来自该噬菌体的人重链可变区作为构建另一个噬菌体文库的起始材料。该文库中，每个噬菌体展示相同的重链可变区(即从第一个展示文库中鉴定的区域)和不同的轻链可变区。轻链可变区获自重排的人轻链可变区文库。再一次，选择对Aβ显示强特异性结合的噬菌体。这些噬菌体展示完全的人抗-Aβ抗体的可变区。这些抗体通常与鼠起始材料具有相同或相似的表位特异性。
4.可变区的制备在已经概念性地选择人源化免疫球蛋白的CDR和构架组分之后，各种各样的方法可以用来制备这样的免疫球蛋白。因为密码子的简并性，各种核酸序列将编码各自的免疫球蛋白氨基酸序列。所需核酸序列的产生方法是全程固相DNA合成或对较早制备的所需多核苷酸进行PCR诱变。寡核苷酸介导的诱变是优选的制备靶多肽DNA的取代、缺失和插入的变体的方法。参见Adelman等，DNA 2183(1983)。简而言之，靶多核苷酸DNA通过杂交编码所需突变的寡核苷酸与单链DNA模板而改变。在杂交后，DNA聚合酶用于合成模板的整个第二互补链，所述模板掺入寡核苷酸引物且编码靶多肽DNA中选择的改变。
5.恒定区的选择如上所述制备的抗体的可变片段(例如，嵌合、人源化或人抗体的重链和轻链可变区)通常连接于免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，一般是人免疫球蛋白的部分。人恒定区DNA序列可通过公知的方法分离自各种人细胞，但优选无限增值化的B细胞(参见Kabat等，同上，以及Liu等，WO87/02671)(为所有目的分别以全文引入作为参考)。照例，抗体将含有轻链和重链恒定区。重链恒定区通常包括CH1、铰链、CH2、CH3和CH4区。这里描述的抗体包括具有所有类型恒定区的抗体，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE以及任意的同种型，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。恒定区的选择部分依赖于期望的是否是抗体依赖性补体和/或细胞介导的毒性。例如，同种型IgG1和IgG3有补体活性但同种型IgG2和IgG4没有。当所期望的抗体(例如，人源化抗体)显示胞毒活性时，恒定区一般是固定恒定区的补体，通常为IgG1类。当此种胞毒不是所期望的时，恒定区可以属于IgG2类。同种型的选择也影响抗体进入脑部的通路。人同种型IgG1是优选的。轻链恒定区可以是λ或к。人源化抗体可含有来自一个以上的类型或同种型的序列。抗体可以表达为含有两个轻链和两个重链的四聚体，可以为单独的轻链和重链，如Fab、Fab′F(ab′)2和Fv，也可以作为其中轻链和重链可变区通过间隔区连接的单链抗体。
6.重组抗体的表达嵌合、人源化和人抗体通常通过重组表达来制备。将编码可选择地连接于恒定区的人源化轻链和重链可变区的核酸插入到表达载体中。轻链和重链可被克隆到相同或不同的表达载体中。使编码免疫球蛋白链的DNA区段可操作连接到表达载体中的调控序列来确保免疫球蛋白多肽的表达。表达调控序列包括但不限于启动子(例如，天然相关的或异源的启动子)、信号序列、增强子元件以及转录终止序列。优选地，表达调控序列是能转化和转染真核宿主细胞的载体中的真核启动子系统。一旦该载体进入合适的宿主后，使宿主维持在适合该核苷酸序列高水平表达以及适合交叉反应抗体的收集和纯化的环境中。
这些表达载体通常作为游离基因或作为宿主染色体DNA的整合部分可在宿主生物体中复制。通常，表达载体含有选择标记(例如，氨苄青霉素-抗性、潮霉素-抗性、四环素抗性或新霉素抗性)以使得这些用所需DNA序列转化的细胞得以检测(参见例如，Itakura等，美国专利4,704,362)。
大肠杆菌(E.Coli)是对于本发明的多核苷酸(例如DNA序列)的克隆特别有用的一种原核宿主。其它适用的微生物宿主包括杆菌，例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilus)，以及其它的肠细菌，例如沙门氏菌(Salmonella)、沙雷氏菌(Serratia)以及各种假单胞菌(Pseudomonas)种。在这些原核宿主中，其也可以产生表达载体，通常含有与宿主细胞相容的表达调控序列(例如复制的起点)。另外，任意的各种已知的启动子也会存在，例如乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统或来自噬菌体λ的启动子系统。启动子一般将调控表达，可选择地与操纵基因序列一起，且具有核糖体结合位点序列等，用于启动和完成转录和翻译。
其它的微生物，例如酵母，也可用于表达。糖酵母(Saccharomyces)是优选的酵母宿主，带有具有表达调控序列(例如启动子)、复制的起点、终止序列等的合适载体是所期望的。典型的启动子包括3-磷酸甘油激酶和其它糖酵解酶。可诱导的酵母启动子尤其包括来自乙醇脱氢酶、同型细胞色素和参与麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子。
除了微生物外，哺乳动物组织细胞培养物也可用于表达和生产本发明的多肽(例如编码免疫球蛋白或其片段的多核苷酸)。参见Winnacker，From Genes to Clones，VCH Publishers，N.Y.，N.Y.(1987)。真核细胞实际上是优选的，因为本领域中开发了许多能够分泌异源蛋白(如完整的免疫球蛋白)的合适宿主细胞系，包括CHO细胞系、各种COS细胞系、HeLa细胞，优选骨髓瘤细胞系或转化的B细胞和杂交瘤。优选地，细胞为非人的细胞。这些细胞的表达载体包括表达调控序列，如复制起点、启动子和增强子(Queen等，Immunol.Rev.8949(1986))，以及必须的加工信号位点，如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多聚腺苷酸化位点和转录终止序列。优选的表达调控序列是来自免疫球蛋白基因、巨细胞病毒、SV40、腺病毒、牛乳头瘤病毒等的启动子。参见Co等，J.Immunol.1481149(1992)。
或者，抗体编码序列可掺入到转基因中，用于导入转基因动物基因组并随后在转基因动物乳汁中表达(参见，例如Deboer等，US5,741,957，Rosen，US5,304,489，和Meade等，US5,849,992)。合适的转基因包括与哺乳动物乳腺特异基因，例如酪蛋白或β乳球蛋白的启动子和增强子可操作连接的轻链和重链的编码序列。
含有目的多核苷酸序列(例如重链和轻链编码序列和表达调控序列)的载体可依据细胞宿主的类型通过公知的方法被转到宿主中。例如，氯化钙转染常用于原核细胞，而磷酸钙处理、电传孔、脂质转染、生物裂解(biolistics)和病毒介导的转染可用于其它细胞宿主。(通常参见Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual(Cold SpringHarbor Press，第2版，1989)(全文引入作为参考)。转化哺乳动物的其它方法包括使用聚凝胺(Polybrene)、原生质体融合、脂质体、电传孔以及显微注射(通常参见，Sambrook等，同上)。为了获得转基因动物，转基因可以置微注射入受精卵细胞，或可以引入胚胎干细胞的基因组中，以及将这些细胞的细胞核转入去核卵母细胞中。
当重链和轻链克隆在单独的表达载体上时，载体被共转染从而获得完整免疫球蛋白的表达和装配。一旦表达，整个抗体、其二聚物、独立的轻链和重链或本发明的其它免疫球蛋白形式可通过本领域标准的技术纯化，包括硫酸铵沉淀、亲和柱层析、柱层析法、HPLC纯化、凝胶电泳等(通常参见Scopes，Protein Purification(Springer-Verlag，N.Y.，(1982))。作为药物用途，至少90到95％同质性的基本上纯化的免疫球蛋白是优选的，98到99％或更高的同质性是更优选的。
7.抗体片段也在本发明的范围内的是抗体片段。在一个实施方案中，提供非人的片段、嵌合和/或人抗体。在另一个实施方案中，提供人源化抗体的片段。通常，这些片段显示特异性结合抗原，其具有至少107，且更通常108或109M-1亲合力。人源化抗体片段包括单独的重链，轻链Fab、Fab′F(ab′)2、Fabc以及Fv。片段通过重组DNA技术，或通过酶解或化学分离完整的免疫球蛋白来产生。
8.抗体在动物模型中的治疗功效的测试各组7-9月大的PDAPP小鼠用0.5mg PBS中的多克隆抗-Aβ或特异性抗-Aβ单克隆抗体注射。所有的抗体制剂纯化到具有低的内毒素水平。抗片段单克隆的制备方法是将Aβ的片段或长型注射到小鼠中，制备杂交瘤并筛选特异性结合Aβ的所需片段而不结合Aβ的其它非重叠片段的抗体的杂交瘤。
如有必要，小鼠腹膜内注射4个月时期以维持流动的抗体浓度，通过ELISA测定的效价大于对Aβ42或其它的免疫原由ELISA所确定的1/1000。监测效价且小鼠在6个月注射的末期实施安乐死。死后进行组织化学、Aβ水平以及毒理学操作。每组使用10个小鼠。
9.筛选具有清除活性的抗体本发明也提供在淀粉样沉积物或任何其它抗原或相关生物实体的清除中具有活性的抗体的筛选方法，这种清除活性是所期望的。为了筛选对淀粉样沉积物的清除活性，将来自阿尔茨海默氏病患者的脑部组织样品或具有阿尔茨海默氏病病理现象之动物模型与带有Fc受体的吞噬细胞，如小胶质细胞，以及受测抗体在培养基中体外接触。吞噬细胞可以是初级培养物或如BV-2、C8-B4或THP-1之类的细胞系。在一些方法中，这些成分被集合于显微镜载玻片上以便显微监控。一些方法中，多个反应在微量滴定板的孔中平行进行。以这种方式，独立的微型显微镜载玻片可以放置在独立的小孔中，或者在可以使用非显微检测的方式，如Aβ的ELISA检测。优选地，对体外反应混合物中淀粉样沉积物的量进行一系列测定，从反应前的基线值开始，以及反应进行中的一个或多个测试值。抗原可以通过染色检测，如荧光标记的Aβ抗体或其它淀粉样斑的成分。用于染色的抗体可以与受测清除活性的抗体相同，也可以不同。如果在淀粉样沉积的反应中出现相对于基线的降低，则认为受测抗体具有清除活性。这些抗体可能在用于预防或治疗阿尔茨海默氏病和其它致淀粉样病中是有用的。
类似的方法可以用于筛选在清除其它类型生物实体中具有活性的抗体。该分析可以用于对几乎任何类型生物实体检测清除活性。通常，生物实体在人和动物的疾病中有某个作用。生物实体可以组织样品或分离的形式提供。如果是组织样品，优选非固定的组织样品，以使其成分易于接触，以及避免伴随着固定对成分构象的干扰。在本分析中可用于测试的组织样品的例子包括癌组织、癌变前组织、良性生长的组织如疣或痣、感染了病原微生物的组织、炎性细胞所浸润的组织、含有细胞间病理基质(如血纤维蛋白性心包炎)的组织、带有异常抗原的组织以及瘢痕组织。可以使用的分离的生物实体包括Aβ、病毒抗原或病毒、蛋白聚糖、其它病原微生物的抗原、肿瘤抗原以及粘连分子。这些抗原可以从天然来源、重组表达或化学合成方法或其它方式获得。使该组织样品或分离的生物实体与带有Fc受体的吞噬细胞，如小胶质细胞或单核细胞以及受测抗体在培养基中接触。该抗体可针对受测生物实体或与之相关的抗原。在后一种情况中，目的在于测试带有该抗原的生物实体是否替代性地被吞噬。通常，尽管并不必需，抗体与生物实体(有时带有相关抗原)相互接触发生在吞噬细胞加入之前。然后监测残存于培养基中的生物实体和/或相关抗原的浓度，如果存在的话。培养基中的生物实体或相关抗原浓度或量的减少显示，在吞噬细胞参与时，该抗体对于该生物实体和/或相关抗原具有清除活性(参见例如，实施例IV)。
B.编码免疫和治疗剂的核酸对淀粉样沉积物的免疫应答也可以通过给药编码用于被动免疫的抗体及其组分链的核酸进行诱导。所述核酸可以是DNA或RNA。编码免疫原的核酸区段通常与调控元件相连，例如启动子和增强子，这使DNA区段得以在患者的预期靶细胞中表达。对于在血细胞中的表达，诱导免疫应答理想的是，来自免疫球蛋白轻链或重链基因的启动子和增强子元件或者CMV主要中早期启动子和增强子适用于指导表达。相连的调控元件和编码序列经常被克隆到载体中。给药双链抗体时，其两条链可以克隆于同一个载体中，也可以分别克隆于不同载体中。
一些可获得的病毒载体系统包括逆转录病毒系统(参见例如，Lawrie和Tumin，Cur.Opin.Genet.Develop.3102-109(1993))；腺病毒载体(参见例如，Bett等，J.Virol.675911(1993))；腺相关病毒载体(参见例如，Zhou等，J.Exp.Med.1791867(1994))；来自痘病毒家族的病毒载体，包括牛痘病毒和禽痘病毒；来自α病毒属的病毒载体，例如来自新培斯病毒和塞姆利基森林病毒的那些载体(参见例如，Dubensky等，J.Virol.70508(1996))；委内瑞拉马脑炎病毒(参见Johnston等，US5,643,576)和甲病毒，如水泡性口膜炎病毒(参见，Rose，WO96/34625)以及乳头瘤病毒(Ohe等，Human Gene Therapy 6325(1995)；Woo等，WO 94/12629和Xiao & Brandsma，Nucleic Acids.Res.24，2630-2622(1996))。
编码免疫原的DNA或含该DNA的载体可以包装于脂质体中。合适的脂质和相关类似物描述于Eppstein等，US5,208,036，Felgner等，US5,264,618，Rose，US5,279,833以及Epand等，US5,283,185。载体和编码免疫原的DNA还可以吸附或连接到颗粒性载体上，载体的例子包括聚甲基丙烯酸甲酯聚合物和聚丙交酯类以及聚(丙交酯-共-乙交酯)，参见例如，McGee等，J.Micro Encap.(1996)。
可以通过向体内传递基因治疗载体或裸DNA对个体患者给药，一般通过全身性给药(例如静脉内、腹膜内、鼻腔、胃、皮内、肌内、皮下或头颅内灌输)或者局部给药(参见例如，Anderson等，US5,399,346)。术语“裸多核苷酸”是指多核苷酸没有与胶体物质复合。裸多核苷酸有时被克隆到质粒载体中。这种载体进一步可以包含如丁哌卡因的辅助药剂(Attardo等，US5,593,970)。还可以利用基因枪给药DNA。参见Xiao和Brandsma，同上。编码免疫原的DNA可以沉淀到显微的金属珠表面。用冲击波或扩散氦气加速微粒，使它透过组织到达几个细胞层的深度。例如，Agacetus，Inc.Middleton WI生产的AccelTM基因传送装置是适用的。或者，仅需用化学或机械刺激将裸DNA点在皮肤上即可使DNA穿过皮肤到达血流(参见Howell等，WO 95/05853)。
在进一步变例中，可以将编码免疫原的载体输送给离体细胞，例如来自个体患者的移植细胞(例如淋巴细胞、骨髓穿刺液、组织活检)或者一般供体的造血干细胞，通常对已插入了载体的细胞进行挑选后，再次将细胞移植到患者体内。
II.预防和治疗方法本发明尤其涉及阿耳茨海默氏病和其它的致淀粉样疾病的治疗，通过给患者施用针对Aβ特异表位的治疗免疫剂(例如，人源化免疫球蛋白)在患者中产生有益治疗反应的条件下(例如，诱导Aβ吞噬作用，减少斑沉积、抑制斑的形成、减少神经炎性营养障碍、改进认知功能和/或回复、治疗或预防认知衰退)，例如，用于预防和治疗致淀粉样疾病。本发明也公开了已知的免疫因子(例如，人源化免疫球蛋白)在用于治疗和预防致淀粉样疾病的药物的应用。
在此所述的术语“治疗”定义为治疗剂对患者应用或给药，或治疗剂对来自具有疾病、疾病症状或发病倾向的患者的分离的组织或细胞系应用或给药，其目的在于治愈、痊愈、减轻、缓解、改变、改善、改进或影响疾病、疾病症状或发病倾向。
在一方面，本发明提供了预防和治疗与患者脑中的Aβ淀粉样沉积物相关的疾病的方法。此种疾病包括阿耳茨海默氏病、唐氏综合症和认知损伤。后者可与有或没有致淀粉样疾病的其它特征一起出现。本发明的一些方法需要给患者施用有效剂量的特异性结合淀粉样沉积物成分的抗体。这些方法特别适用于人类患者阿尔茨海默氏病的预防与治疗。示例的方法需要给药有效剂量的结合Aβ的抗体。优选的方法需要给药有效剂量的特异性结合位于Aβ第1-10位残基内的表位的抗体，例如特异性结合于Aβ第1-3位残基的表位的抗体，特异性结合于Aβ第1-4位残基的表位的抗体，特异性结合于Aβ第1-5位残基的表位的抗体，特异性结合于Aβ第1-6位残基的表位的抗体，特异性结合于Aβ第1-7位残基的表位的抗体，或特异性结合于Aβ第3-7位残基的表位的抗体。在另一方面，本发明提供了给药结合于包含Aβ游离N-末端残基的表位的抗体。在另一方面，本发明提供了给药结合于Aβ第1-10位残基内的表位的抗体，其中Aβ的第1位残基和/或第7位残基为天冬氨酸。然而在另一方面，本发明提供了给药特应性结合于Aβ肽而不结合全长淀粉样前体蛋白(APP)的抗体。在另一个方面，所述抗体的同种型是IgG1。
在另一方面，本发明提供了给药结合患者的淀粉样沉积物并诱导对淀粉样沉积物的清除反应。例如，这种清除反应可以通过Fc受体介导的吞噬作用来实现。
本发明的治疗剂通常是基本上纯的，不含不需要的污染物。这是指药剂通常至少约50％w/w(重量/重量)纯度，同时基本上不含干扰蛋白和污染物。有时候药剂至少约80％w/w以及更优选至少90或约95％w/w纯度。然而，使用常规蛋白纯化技术，至少99％w/w的均一性蛋白可以获得。
这些方法可以用于无症状的患者和那些目前出现症状的患者。在这些方法中使用的抗体可以是人抗体、人源化的、嵌合的或非人的抗体或其片段(例如抗原结合片段)且可以是单克隆或多克隆的，如本文所述。在另一个方面，本发明提供了给药由用Aβ肽免疫人中制备的抗体，该人可以是将由抗体治疗的患者。
在另一个方面，本发明提供了给药抗体和药用载体作为药用组合物。或者，抗体可给药于患者通过给药编码至少一个抗体链的多核苷酸。多核苷酸在患者体内表达产生抗体连。或者，多核苷酸编码抗体的重链和轻链。这种多核苷酸在患者中表达产生重链和轻链。在示例的实施方案中，监控患者给药抗体在血液中的水平。
因此本发明满足了预防或改善神经病理的治疗方法以及在一些患者中与阿耳茨海默氏病相关的认知损伤的长期需求。
A.接受治疗的患者接受治疗的患者包括具有患病危险但没有表现出症状的个体，以及目前表现出症状的患者。对于阿尔茨海默氏病，实际上任何人，只要他或她活得足够长，都存在患阿尔茨海默氏病的风险。因此，本发明方法可以对普通群体预防性给药，而无需评估受试患者的危险。本发明尤其对已知具有阿尔茨海默氏病遗传危险的个体有用。所述个体包括那些有亲属已患该病的个体，和那些通过遗传学和生化标记分析确定存在风险的个体。对于阿尔茨海默氏病的危险遗传学标记包括APP基因的突变，尤其是在第717位、第670和671位的分别被称为Hardy突变和Swedish突变的突变(参见Hardy，同上)。其它危险标记是早衰素基因PS1和PS2以及ApoE4中的突变、AD家族史、血胆固醇过多或动脉粥样硬化。目前正患阿尔茨海默氏的个体可以通过特征性痴呆以及上述危险因子的存在来识别。另外，大量诊断测试可用来鉴定患AD的患者。这些测试包括测定CSFτ和Aβ42的水平。τ水平升高和Aβ42水平下降表示患有AD。也可以通过实施例部分论述的ADRDA标准来诊断患阿尔茨海默氏病的个体。
对于无症状患者，可以在任何年龄开始治疗(例如10、20、30岁)。然而，通常在患者到40、50、60或70岁时才需要开始治疗。治疗通常需要在一段时期内进行多剂量给药。可以通过随时间分析抗体水平来监测治疗。如果应答失败，表明需要升高剂量。对于潜在的唐氏综合症患者，可以在产前对母亲给药治疗剂开始治疗，也可以在出生后不久对患者给药。
B.治疗方案和剂量在预防应用中，对易患阿尔茨海默氏病或有患阿尔茨海默氏病危险的患者给药足以消除或降低危险、减轻严重性或延缓疾病发作的剂量的药物组合物或药物，包括疾病的生化、组织学和/或行为症状，疾病发展中呈现的中间病理现象及其并发症。在治疗应用中，对易患或已经患所述疾病的患者给药足以治愈或至少部分抑制疾病症状(生化、组织学和/或行为症状)包括疾病发展中出现的中间病理现象及其并发症的剂量的组合物或药物。
在一些方法中，药剂的给药减少或消除了尚未表现典型阿尔茨海默氏病病理现象的患者的认知损伤。足以实现治疗或预防治疗的量称为治疗-或预防-有效剂量。在预防和治疗方案中，通常药剂给药几个剂量，直到实现充分的免疫应答。术语“免疫应答”或“免疫学应答”包括体液(抗体介导)和/或细胞(通过抗原特异的T细胞或其分泌产物介导)针对接受者中的抗原反应的发展。此种反应可以是主动反应，即通过给药免疫原诱导，或被动反应，即通过给药免疫球蛋白或抗体或接触过抗原的T细胞诱导。
“免疫原因子”或“免疫原”在给药哺乳动物后能够诱导抵抗其本身的免疫应答，可选择地与佐剂结合。通常免疫应答受到监控，并且如果免疫应答开始减弱则重复给药。
本发明用于治疗上述病症的组合物的有效剂量随一些不同因素而改变，包括给药方法、靶部位、患者的生理状况、患者是人还是动物、所给药的其它药物以及处理是治疗性的还是预防性的。通常，患者为人，但也可以治疗包括转基因哺乳动物在内的非人哺乳动物。治疗剂量需要用滴定法测量，以优化安全性和有效性。
对于利用抗体的被动免疫，剂量范围为约0.0001到100mg/kg受体体重，更经常为0.01到5mg/kg受体体重。例如，剂量可能为1mg/kg受体体重或10mg/kg受体体重或在1-10mg/kg受体体重范围之内，优选至少1mg/kg受体体重。受试者可每天、几天间隔、每周或根据任何其它的经验给药这些剂量。一种示例的治疗需要以多剂量给药延续一段时间，例如至少6个月。其它的示例的治疗方案包括每两周一次或一个月一次或每3到6个月一次给药。示范性的给药时间表包括1-10mg/kg或15mg/kg连续多天，30mg/kg几天间隔或每周60mg/kg。在一些方法中，同时给药两种或多种具有不同结合特异性的抗体，其中所给药的每种抗体的剂量都落入所述的范围之中抗体通常多次给药。每次的间隔可以是以周、月、年计。间隔也可以是不定期的，如通过测试患者中Aβ的抗体血液水平所示。在一些方法中，把剂量调整到血浆中抗体浓度达1-1000μg/ml，而在一些方法中为25-300μg/ml。或者，抗体可以持续释放剂量给药，这种情况下，不需要频繁给药。根据患者中抗体的半衰期改变使用的剂量和频率。通常，人抗体有最长的半衰期，接下来依次为人源化抗体、嵌合抗体和非人抗体。
给药的剂量和频率可依赖于处理是治疗性还是预防性的。在预防性应用中，将含有本发明抗体或其合剂的组合物给药于并非在病态的患者以增强病人的抗性。该量定义为“预防有效量”。在此应用中，精确量再次取决于患者的健康状态和基本的免疫力，但通常在0.1-25mg/剂量的范围，特别是0.5-2.5mg/剂量的范围。在一段长的时期内，以相对不频繁的间隔给药相对低的剂量。一些患者在余生中继续接受治疗。
在治疗应用中，有时要求以相对短的间隔给药相对高的剂量(例如，从大约1到200mg抗体/剂量，更普遍地使用从5到25 mg)直到疾病进展得以减轻或终止，更优选地直到该患者的疾病症状有部分或完全的改善。此后，可以给患者施用一种预防性的方案。
编码抗体的核酸的剂量范围为每位患者约10ng到1g，100ng到100mg，1μg到10mg，或30-300μg DNA。感染性病毒载体的剂量为每剂量10-100个毒粒或更多毒粒。
治疗剂可以经非肠道、局部、静脉内、口腔、皮下、关节内、颅内、腹膜内、鼻内或肌内方式给药，用于预防和/或治疗处理。最典型的免疫原药剂给药途径为皮下给药，当然其它的途径同样有效。其次最常用的途径是肌内注射。这种注射类型最通常在胳膊或腿的肌肉内注射。在一些方法中，直接将药剂注射到沉积物已累积的特定组织中，例如颅内注射。抗体给药优选静脉输注或肌内注射。一些方法中，特殊的治疗抗体直接注射于颅内。一些方法中，抗体以一种缓释组合物或装置如MedipadTM装置进行给药。
本发明的药剂可选择性地与其它治疗致淀粉样病至少部分有效的药剂组合给药。对于脑中发生淀粉样沉积物的阿尔茨海默氏病和唐氏综合症，还可以将本发明的药剂与其它促进本发明药剂穿过血脑屏障的药剂一起组合给药。
C.药物组合物本发明的药剂通常作为包含活性治疗因子即很多其它可药用成分的药物组合物给药。参见Remington′s Pharmaceutical Science(第15版，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania(1980))。优选剂型根据预期给药和治疗应用方式决定。组合物还可以根据所需的剂型包括可药用的、非毒性载体或稀释剂，它们被认为是常规用于配制给动物或人施用的药物组合物的载体。稀释剂以不影响组合后的生物活性来选择。这类稀释剂的例子是蒸馏水、生理磷酸盐缓冲液、林格液、葡萄糖溶液、和Hank氏溶液。另外，药物组合物或制剂还可以包括其它载体，佐剂或非毒性、非治疗性、非免疫原性稳定剂等。
药物组合物还可以包括较大的、代谢缓慢的大分子，例如蛋白质、多糖如聚氨基葡糖、聚乳酸、聚羟基乙酸和共聚物(例如树胶官能化的琼脂糖凝胶TM、琼脂糖、纤维素等)、多聚氨基酸、氨基酸共聚物、以及脂类聚集物(例如油滴或脂质体)。另外，这些载体具备作为免疫刺激剂的功能(即佐剂)。
对于非肠道给药，本发明的药剂可以作为物质在生理可接受稀释剂中的溶液或悬浮液与药物载体的可注射剂型一起给药，所述药物载体可以是无菌液体，例如水油、盐水、甘油或乙醇。另外，组合物中还可以含有辅助物质，例如湿润剂或乳化剂、表面活性剂、pH缓冲物质等。药物组合物的其它成分是石油，动物、植物或合成来源的，例如花生油、大豆油和矿物油。液体载体通常优选二醇例如丙二醇或聚乙二醇，尤其是对可注射溶液。抗体可以以补给注射(clepot injection)的形式或移植制剂的形式给药，其可以以使活性成分持续释放的方式进行配制。一个示例的组合物包括5mg/ml的单克隆抗体，配制于由50mM L-组氨酸、150mM NaCl组成、用HCl调整pH到6.0的水相缓冲液中。
通常，将组合物制备成液体溶液或悬浮液的可注射形式；也可以制备成注射前可适于溶解或悬浮在液体媒介物的固体剂型。如前面所述，还可以将制剂乳化于或包埋于脂质体或微颗粒，例如聚丙交酯、聚乙交酯或共聚物中来增强佐剂效果(参见Langer，Science 2491527(1990)和Hanes，Advanced Drug Delivery Reviews 2897(1997))。本发明的药剂可以以储存注射的形式或移植制剂的形式给药，其可以以使活性成分持续或脉动释放的方式来配制。
适合其它给药方式的其它剂型包括口服、鼻内和肺部施用的制剂、栓剂和经皮应用制剂。对于栓剂，粘合剂和载体包括例如，聚亚烷基二醇或甘油三酯；该种栓剂可以从含活性成分在0.5％到10％，优选1％-2％范围内的混合物制各。口服制剂包括赋形剂，例如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素和碳酸镁。这些组合物配制成溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、控释制剂或粉剂的形式，含有10％-95％活性成分，优选25％-70％活性成分。
局部应用可导致经皮或皮内送递。局部给药可以通过共同给药霍乱毒素或其脱毒衍生物或亚基或者其它类似的细菌毒素促进(参见Glenn等，Nature 391，851(1998))。通过应用经化学交联得到的作为混合剂或连接分子的成分，或者表达为融合蛋白，来实现共同给药。
或者，可利用皮肤通道或利用转移体(transferosome)实现经皮送递(Paul等，Eur.J.Immunol.253521(1995)；Cevc等，Biochem.Biophys.Acta 1368201-15(1998))。
III.治疗过程的监测本发明提供了监测患有或易患阿尔茨海默氏病的患者的治疗的方法，即监测给药患者的治疗的过程。该方法可用于监测有症状患者的治疗处理以及无症状患者的预防处理。尤其地，该方法对于监测被动免疫(例如，检测给药抗体的水平)是有用的。
一些方法需要在确定药剂的给药剂量之前测定患者体内例如抗体的免疫应答水平基线值，然后将该值与治疗后的免疫应答值相比较。免疫应答水平的显著增加(即同一样品重复测定中，高于一般的试验误差幅度，表示为所述测定平均值的标准差)表明治疗结果为阳性(即药剂的给药已得到了所需的反应。如果免疫应答的水平没有显著改变或者有所降低，表明治疗结果为阴性。
在其它方法中，测定对照组免疫应答的对照值(即平均值和标准差)。通常，对照组中的个体没有接受预先治疗。然后将给药治疗剂后患者体内的免疫应答测量值与对照值比较。相对于对照值的显著增加(例如高于平均值的一个标准差)表明阳性或足够的治疗结果。缺乏明显的增加或降低则表明阴性或不够的治疗结果。通常连续给药药剂，免疫应答相对于对照值不断增加。和前面一样，相对于对照值出现稳定期，表明治疗给药可以间断或者降低剂量或次数。
在其它方法中，测定接受治疗药剂治疗并且其免疫应答对治疗的响应已经达到稳定期的个体对照组的免疫应答对照值(例如平均值和标准差)。患者体内免疫应答的测定值与对照值相比较。如果患者的测定值与对照值没有显著的不同(例如，高于一个标准差)，则治疗可以间断。如果患者体内的水平显著低于对照值，则需要保证连续给药药剂。如果患者体内的水平持续低于对照值，则表明应改变治疗方案。
在其它方法中，对目前没有接受治疗但以前曾接受一个疗程治疗的患者监测其抗体的水平或分布，以确定是否需要恢复治疗。在起始一个疗程治疗之后，可以将患者体内免疫应答的测量值与患者以前获得的免疫应答值比较。相对于前期测量显著降低(即在相同样品的重复测量中，高于一般误差幅度)表明可以恢复治疗。或者，可以将患者的测量值与接受一个疗程治疗后的患者组所测定的对照值相比较(平均值加标准差)。或者，可以将患者的测量值与接受预防处理、保持没有疾病综合症的患者组或者接受治疗处理、表现疾病症状改善的患者组体内的对照值相比较。在所有的这些情况下，相对于对照水平的显著降低(即超过一个标准差)表明患者应当恢复治疗。
用于分析的组织样品通常是来自患者的血液、血浆、血清、粘液或脑脊液。分析样品，例如对Aβ肽的抗体的水平或分布，例如人源化抗体的水平和分布进行分析。在实施例部分描述了检测特异于Aβ的抗体的ELISA法。在一些方法中，给药抗体的水平和分布通过清除分析进行测定，例如本文所述的体外吞噬作用测定。这些方法中，来自被测试患者的组织样品与淀粉样沉积物(例如，来自PDAPP小鼠)及带有Fc受体的吞噬细胞接触。接着检测随后的淀粉样沉积物的清除。清除反应的存在和程度显示了在被测患者组织样品中有效清除Aβ的抗体的存在和水平。
被动免疫后的抗体图通常先是抗体浓度迅速上升到峰值，接着指数式降低。如果没有进一步给药，根据给药抗体半衰期的不同将在几天到几个月的时期内降低至治疗前的水平。例如，一些人抗体半衰期为20天。
在一些方法中，在给药前对患者的Aβ抗体进行基线测量，在此不久之后的第二次测量是为确定抗体的峰值，间隔进行一次或更多次的测量，以监测抗体水平的下降。当抗体降低到基线或预先确定峰值百分数的更低基线(如50％、25％或10％)，给药另一剂量的抗体。一些方法中，峰值或其后测定值的更低背景与预先确定的参照水平比较，以构成对其它患者产生有益的预防性或治疗性处理方案。如果测得的抗体水平明显小于参照水平(例如，小于治疗受益的患者群中参照值平均数减去一个标准差)则表明需要施用额外剂量的抗体。
其它的方法包括在治疗过程的自始至终监测本领域识别的任意生理症状(例如，身体或精神症状)，这些症状通常依赖研究者或医师诊断或监控致淀粉样疾病(例如，阿耳茨海默氏病)。例如，可监测认知损伤。后者是阿耳茨海默氏病和唐氏综合症的症状但也可产生没有这些疾病的其它症状。例如，认知损伤可根据惯例在治疗全过程中通过检测患者在微型精神状态测试(Mini-Mental State Exam)中的得分来监测。
C.试剂盒本发明进一步提供了实施上述监测方法的试剂盒。通常，该试剂盒含有特异性结合Aβ抗体的试剂。试剂盒还包括一种标记物。对于检测Aβ抗体，标记物通常是标记的抗-独特型抗体的形式。对于检测抗体，可以预先将试剂结合到固相上使用，例如结合到微滴定板的孔中。试剂盒一般还含有提供指导试剂盒使用的标签。该标签还可以包括显示测定的标记水平与Aβ抗体水平之间相关性的图或其它相应方式。术语标签是指在试剂盒的生产、运输、销售或使用过程的任何时间，贴附于或附在试剂盒中的任何书面或记录材料。例如，术语标签包括广告宣传页和手册、包装材料、说明书、音频或视听磁带、计算机磁盘以及直接印刷在试剂盒上的书写印记。
本发明还提供了诊断试剂盒，例如，研究、检测和/或诊断的试剂盒。该试剂盒通常含有结合于Aβ表位的抗体，优选是与其第1-10位残基结合。优选地，标记是抗体或试剂盒含有二级标记试剂。优选地，试剂盒含有用于实施所需应用的说明书的标签，例如，用于进行体内成像分析。示例性的抗体为在这里所述的那些。
D.体内成像本发明提供了对患者中的淀粉样沉积物进行体内成像方法。这种方法可用于诊断或确证阿尔茨海默氏病或对其的怀疑。例如，该方法可用于出现痴呆症状的患者身上。如果患者有异常的淀粉样沉积物，则该患者可能患有阿尔茨海默氏病。该方法也可用于无症状的患者。异常淀粉样沉积物的存在表明将来易发展成有症状疾病。该方法也可用于监测早先被诊断为阿尔茨海默氏病患者的疾病发展和/或对治疗的反应。
该方法是给药患者一种药剂，如结合Aβ的抗体，并在其结合后检测该药剂。优选的抗体结合患者的Aβ沉积物，但不结合全长的APP多肽。特别优选结合于Aβ第1-10位氨基酸内表位的抗体。在一些方法中，抗体结合于Aβ第7-10位氨基酸内的表位。这类抗体通常结合且不诱导显著的清除反应。在其它方法中，抗体结合于Aβ第1-7位氨基酸内的表位。这类抗体通常结合并诱导对Aβ的清除反应。然而，利用缺少全长恒定区的抗体片段，如Fabs，可以避免这种清除反应。在一些方法中，同样的抗体可以作为治疗和诊断试剂。通常，结合Aβ的C末端到第10位残基的表位的抗体没有显示与结合第1-10位残基内表位的抗体一样强的信号，可能是因为淀粉样沉积物内的C末端表位是难于接触的。因此，这种抗体较不优选。
可以通过静脉内注射到患者身体，或颅内注射或钻孔穿过头骨直接对大脑给药诊断试剂。试剂的剂量应在与治疗方法中相同的剂量范围内。通常，试剂是标记的。尽管在一些方法中，对Aβ有亲和性的一级试剂未标记，而二级标记药剂用于结合一级试剂，标记的选择基于检测的方式。例如，荧光标记适用于光学检测。顺磁标记适用于无须手术参与的X射线断层检测。放射性标记也可以用PET或SPECT来检测。
比较标记位点与相应基线值的数目、大小和/或强度来进行诊断。基线值代表未生病群体的平均水平。基线值也代表同一患者先前确定的水平。例如，基线值可以在患者治疗开始前确定，而将之后的测定值与基线值比较。相对于基线的数值的下降是对治疗阳性反应的信号。
本发明将通过下面的非限制性实施例更充分地描述。
实施例实施例I.抗-Aβ抗体mAb 2H3、mAb 10D5、mAb 266、mAb 21F12和pAb Aβ1-42的治疗功效本实施例测试各种Aβ多克隆和单克隆抗体抑制Aβ在异源转基因小鼠脑中累积的能力。
A.实验设计60只8.5-10.5月龄的雄性和雌性杂合PADPP转基因小鼠获自charles River实验室。小鼠被分成6组，分别用针对Aβ的各种抗体处理。将动物分配以使组内的动物在性别、月龄、家系和来源上尽可能近地匹配。表2显示了试验设计。
表2试验设计
a.实验终止时组内的小鼠数所有的组以每组10只动物开始。
b. NA不适用的c.小鼠多克隆抗-聚集的Aβ42d.mAb单克隆抗体如表2所显示，抗体包括四种鼠Aβ-特异的单克隆抗体2H3(针对Aβ第1-12位残基)、10D5(针对Aβ第1-16位践基)、266(针对Aβ第13-28位残基结合于可溶性而非聚集的AN1792)、21F12(针对Aβ第33-42位残基)。第五组用Aβ特异的多克隆抗体组分(用聚集的AN1792免疫获得)处理。阴性对照组仅接受稀释剂PBS，没有抗体。
B.监测处理过程单克隆抗体以约10mg/kg(假设小鼠重50克)的剂量注射。抗体的效价在处理的28周期间检测。平均每七天进行腹膜内注射给药，使抗Aβ效价维持在1000以上。尽管因mAb 266不与本测定中用作捕捉抗原的聚集的AN1792良好结合，从而效价测定较低，但对该组仍然维持同样的剂量方案。由于抗体在体内被快速清除，接受单克隆抗体2H3的组在前三周内实验中断。
对于测定抗体的效价，仅在腹膜内接种之前从每组中随机选出三个小鼠进行采血，总共30次取血。Aβ1-42-结合抗体的抗体效价采用Aβ1-42包被的塑料多孔板进行夹心ELISA来测定，具体描述在“基本材料和方法”部分。每一血液的多克隆抗体和单克隆10D5和21F12的平均效价显示在表3中。
表3
多克隆抗体在此段时间的效价平均值大约1000且其稍高于10D5-和21 F12-处理的动物的此种水平。
处理持续超过六个月的时间，总共196天。动物在最后一次给药一周后实施安乐死。
C.脑中Aβ和APP水平用各种抗-Aβ抗体制剂处理约6个月后，移出动物脑部，然后盐水灌注。脑的一个半球准备用于免疫组织化学分析，第二个半球用于定量测定Aβ和APP水平。为了测定各种形式的β淀粉样沉积物和淀粉样前体蛋白(APP)的浓度，解剖大脑半球，并在5M胍中制备海马区、皮层区和小脑区三个区的匀浆。进行一系列稀释，通过与ELISA模式中已知浓度的Aβ肽或APP的一系列稀释标准比较，来量化淀粉样肽或APP的水平。
通过ELISA测定的皮层和海马匀浆液中总Aβ和Aβ1-42的水平，以及小脑中总Aβ的水平分别显示在表4、5和6中。接种PBS的对照组总Aβ浓度的中值在海马中比皮层中高3.6倍(海马组织中值63,389ng/g而皮层组织中值17,818ng/g)。对照组小脑的中值(30.6ng/g组织)比海马中要低2000倍以上。这些水平与从前报道的此年龄的杂合PDAPP转基因小鼠水平相似(Johnson-Wood等，同上)。
对于皮层，一个处理组具有Aβ中值水平，以Aβ1-42测定，与对照组的显著不同(p＜0.05)，那些动物接受了表4所示的多克隆抗-Aβ抗体。与本处理组的对照组相比，Aβ1-42的中值水平降低了65％。与另外一个处理组中的对照相比，Aβ61-42的中值水平也显著降低了55％，这些动物服以单克隆抗体(mAb)10D5(p＝0.0433)。
表4
脚注a.实验结束时每组动物的数目b.ng/g组织c.Mann Whitney分析d.NA不适用的e.标准偏差在海马区中，与多克隆抗-Aβ抗体处理相关的总Aβ的中值降低的百分率(50％，p＝0.0055)小于皮层中观察到的(65％)(表5)。但海马区中降低的绝对量几乎比皮层大3倍，海马中净降低为31,683ng/g组织而皮层中为11,685ng/g组织。如不以总Aβ，而以Aβ1-42这种更加致淀粉样的Aβ形式为测定基准，多克隆抗体导致的降低是显著的(p＝0.0025)。单克隆抗体10D5和266处理组的中值分别降低33％和21％。
表5
a.实验结束时每组动物的数目b.ng/g组织c.Mann Whitney分析d.NA不适用的e.标准偏差也测定了小脑中的总Aβ(表6)。在服用多克隆抗-Aβ抗体和266抗体的处理组中，总Aβ水平显著降低(分别为43％和46％，p＝0.0033和p＝0.0184)，而用10D5处理组有几乎显著的降低(29％，p＝0.0675)。
表6
a.实验结束时每组动物的数目b.ng/g组织c.Mann Whitney分析d.NA不适用的e.标准偏差通过ELISA测定了来自抗原处理、对照和PBS处理的小鼠皮层和小脑APP浓度。使用两种不同的APP分析。第一种分析命名为APP-α/FL，识别APP-α(α，APP的分泌型，已在Aβ序列中切割)和APP的全长型(FL)。第二种分析只识别APP-α。与Aβ在处理组亚组中的处理相关性降低相反，与对照动物相比，在所有处理组中APP水平几乎不变。这些结果表明用Aβ抗体免疫消耗Aβ，但不消耗APP。
总之，在抗AN1792的多克隆抗体处理的小鼠中，其皮层、海马和小脑中Aβ的水平显著降低。在较小程度上，针对Aβ1-42的氨基末端区域特别是第1-16位和第13-28位的氨基酸的单克隆抗体也表现显著的治疗效果。
D.组织化学分析在用PBS、多克隆Aβ42、21F12、266和10D5处理组的小鼠脑的亚组中，Aβ免疫活性斑的形态与之前接着使用Aβ42的标准免疫方法的研究中的形态进行定性比较。
淀粉样斑的程度和外形的最大变化均产生在多克隆Aβ-42抗体免疫的动物中。淀粉样沉积、侵蚀的斑形态以及细胞相关的Aβ免疫活性，这三者的降低非常类似由标准免疫程序所产生的效果。这些观察支持ELISA的结果，其中给药多克隆Aβ42抗体可以导致总Aβ和Aβ42显著降低。
在类似的定性评估中，10D5组的淀粉样斑在数量和外形上也有所减少，并存在细胞相关的Aβ免疫活性。相对于对照处理动物，抗Aβ的多克隆Ig组分和单克隆抗体之一(10D5)分别降低了93％和81％的斑沉积(p＜0.005)。似乎21F12对斑沉积有相对较弱的效果。相对于对照处理的动物，对多克隆pabAβ1-42处理后的脑部显微照相显示出弥散的沉积物，以及pabAβ1-42处理组中许多更大紧密斑消失。
F.淋巴细胞增殖反应利用最后一次抗体输注8天后收集的脾细胞，测定Aβ-依赖的淋巴细胞增殖。将新鲜收集的细胞以每孔105个，在起刺激作用的浓度为5μM的Aβ1-40存在下培养5天。作为阳性对照，另外的细胞与T细胞促细胞分裂剂PHA共同培养，作为阴性对照，细胞的培养无外加的肽。
用各种抗Aβ抗体被动免疫的衰老PDAPP小鼠的脾细胞在体外经AN1792刺激，并测定增殖和细胞因子反应。这些分析的目的在于确定被动免疫是否促使抗原呈递，并因此引发对AN1792特异的T细胞反应。在用抗-Aβ抗体被动免疫的小鼠中未观察到AN1792特异的增殖或细胞因子反应。
实施例II抗-Aβ抗体mAb 2H3、mAb 10D5、mAb 266、mAb 21F12、mAb 3D6、mAb 16C11和pAb Aβ1-42的治疗功效在第二项研究中，重复10D5的处理并检测另外两种抗Aβ抗体单克隆抗体3D6(Aβ1-5)及16C11(Aβ33-42)。对照组接受PBS或一种不相关的同种型-匹配抗体(TM2a)。小鼠较前述研究中大(11.5-12月龄的杂合体)，其它的实验设计都相同。再一次，在处理6个月后，相对于PBS或同种型-匹配抗体对照组，10D5使斑沉积降低了超过80％(p＝0.003)。另外一个抗Aβ抗体3D6同样有效，产生86％的降低(p＝0.003)。相反，第三个抗该肽的抗体16C11对斑沉积无效。Aβ42的ELISA测定也获得相似的结果。
这些结果表明在缺少T细胞免疫情况下，抗Aβ肽的抗体反应足以降低PDAPP小鼠中的淀粉样沉积，但并非所有的抗-Aβ抗体都有效。针对含有Aβ第1-5位或第3-7位氨基酸的表位的抗体特别有效。总之，可以表明被动给药抗Aβ抗体(即被动免疫)降低了患阿尔茨海默氏病的小鼠模型中的斑沉积的程度。
实施例IIICNS中抗体结合的监测此实施例证明了在较为温和的血清浓度(25-70μg/ml)时，获得的抗体以足以修饰β-淀粉样斑的水平进入CNS。
为了检测抗Aβ抗体是否可以在CNS内直接作用，取实施例II结束时盐水灌注的小鼠脑部，检查外周给药的抗体是否存在。未固定的恒冷脑切片暴露于抗鼠免疫球蛋白(羊抗小鼠IgG-Cy3)的荧光试剂中。10D5和3D6处理组的脑中的斑被抗体强烈地着色，而16C11组无染色。为充分展示斑沉着的程度，首先用抗-Aβ抗体与各个脑组织的系列切片进行免疫反应，然后与第二种试剂进行免疫反应。10D5和3D6在外周给药后获得接触CNS内的大多数淀粉样斑。与16C11组相比，这些组中的斑沉积极大地降低。抗体进入CNS并非由于血脑屏障的异常泄漏，因为Evans Blue检测PDAPP小鼠，未发现血管通透性的增加。此外，衰老PDAPP小鼠脑软组织中的抗体浓度和非转基因小鼠相同，血清中抗体浓度显示0.1％(不考虑同种型)。
这些数据表明，外周给药的抗体可以进入CNS内，并在其中直接引发淀粉样沉积物的清除。可能16C11也已接触到淀粉样斑，但却不能结合。
实施例IV抗淀粉样沉积物抗体的活性的离体筛选试验为了检测抗体对斑清除的效果，我们建立了一种离体分析，其中将初级小胶质细胞与来自PDAPP小鼠或人AD脑的未固定的恒冷切片共同培养。小胶质细胞获自新生DBA/2N小鼠(1-3天)的脑皮层。在HBSS-(Hank氏平衡盐溶液，Sigma)和50μg/ml DNA酶I中通过机械方法解离皮层。用100μm细胞滤器(Falcon)过滤解离的细胞，1000rpm离心5分钟。沉淀重悬于生长培养基中(高葡萄糖DMEM、10％FBS、25ng/ml rmGM-CSF)，以每个T-75培养瓶两个脑组织的密度铺细胞。7-9天后，培养瓶在定轨摇床以200rpm的速度37℃培养2小时。细胞悬浮物以1000rpm离心，重悬于分析培养基。
PDAPP小鼠或人AD脑(死亡时间＜3小时)的10-μm恒冷切片融化后，装到多聚赖氨酸包被的圆形玻璃盖片上，并放置在24孔组织培养平板的孔中。用分析培养基冲洗盖玻片二次，分析培养基由含有1％FBS、谷氨酰胺、青霉素/链霉素以及5ng/ml rmGM-CSF(R&D)的H-SFM(无杂交瘤细胞血清培养基，Gibco BRL)组成。一小时内加入两倍浓度的对照或抗-Aβ抗体(终浓度5ng/ml)。然后以0.8×106细胞/ml分析培养基的密度接种小胶质细胞。培养物在加湿的培养箱内(37℃，5％CO2)孵育24小时或更长时间。孵育结束后，用4％的低聚甲醛固定培养物并浸透于0.1％的Triton-X100。切片用生物素酰化的3D6染色，接着链霉素/Cy3共轭物(Jackson ImmunoResearch)染色。外源的小胶质细胞通过核染色(DAPI)可见。用倒置荧光显微镜(尼康，TE300)观察培养物，以SPOT数码相机用SPOT软件(Diagnostic instruments)进行光学显微照相。对于Western印迹分析，培养物用8M尿素抽提，在还原tricine样品缓冲液中以1∶1稀释，并上样于16％tricine凝胶中(Novex)。转至转移膜(immobilon)上后，印迹暴露于5μg/ml的pabAβ42，接着与HRP共轭的抗小鼠抗体接触，并在ECL(Amersham)中显影。
当有16C11(一种抗Aβ抗体，在体内无效)存在下对PDAPP脑切片进行分析时，β淀粉样斑保持其完整性，并且末观察到吞噬作用。相反，当邻近的切片在10D5存在下进行培养时，淀粉样沉积物大多不存在，并且小胶质细胞显示许多含有Aβ的吞噬泡。AD脑切片也有同样的结果；10D5诱导对AD斑的吞噬，而16C11无效。此外，当以小鼠或人小胶质细胞和小鼠、兔或灵长类动物抗Aβ抗体进行操作时，该分析提供了可比性结果。
表7比较几种不同抗体结合特异性的Aβ结合与吞噬作用。可见，结合于第1-7位氨基酸内表位的抗体结合并清除淀粉样沉积物，而结合于第4-10位氨基酸内表位的抗体结合但不清除淀粉样沉积物。结合于C末端到第10位残基的表位的抗体既不结合也不清除淀粉样沉积物。
Table7表位特异性分析
表8显示的结果获自几种抗Aβ抗体，比较其离体分析中诱导吞噬作用的能力，以及在体内被动转移研究中减少斑沉积的能力。尽管16C11和21F12可以高亲合力结合于聚集的合成Aβ肽，这些抗体不能与末固定的脑切片中的Aβ淀粉样斑反应，因此不能引发离体分析中的吞噬作用，并在体内没有功效。在三种测定中，10D5、3D6和多克隆抗Aβ抗体都有活性。这些结果显示体内效果是基于CNS中抗体直接介导的斑清除作用，并且离体分析可以预示体内效果。
表8离体分析预示体内功效
同样的分析已用来检测抗一个称为NAC的共核蛋白片段的抗体的清除活性。共核蛋白已显示是一种淀粉样斑相关蛋白。NAC的抗体与含有淀粉样斑的脑组织样品和小胶质细胞接触，同前。用兔血清作对照。随后的监测表明斑的数目和大小有显著的减少，显示了抗体的清除活性。
共聚焦显微镜用来确认在离体分析过程中Aβ已内化。在对照抗体的存在下，使外源的小胶质细胞维持在组织上方的一个共聚焦平面，在此区域没有含Aβ的吞噬泡，并且淀粉样斑在切片内是完整的。在10D5存在时，几乎所有的淀粉样斑物质都存在于外源小胶质细胞的小泡中。为了确定内化肽的最终命运，在各个时间点对10D5处理的培养物用8M尿素抽提，并通过Western印迹分析检测。在第一小时时间点，还未产生吞噬作用，与多克隆抗Aβ抗体的反应显示一个强的4kD条带(相应于Aβ肽)。Aβ的免疫活性在第一天降低，并第三天消失。因此，抗体介导Aβ的吞噬作用导致了其降解。
为了确定在离体分析中吞噬作用是否由Fc-介导，制备抗Aβ抗体3D6的F(ab’)2片段。尽管F(ab’)2片段保持了其与淀粉样斑反应的全部能力，它们不能引发小胶质细胞发生吞噬作用。此外，整个抗体的吞噬可以被抗鼠Fc受体(抗-CD16/32)的试剂阻断。这些数据显示Aβ的体内清除是通过Fc受体介导的吞噬作用进行的。
实施例V抗体通过血脑屏障的途径本实施例在静脉内注射抗体到正常或PDAPP小鼠外周组织后，测定进入脑部的抗体的浓度。处理后，用0.9％NaCl溶液灌注PDAPP或对照的正常小鼠。剖出脑区(海马和皮层)并快速冷冻。在0.1％Triton+蛋白酶抑制剂中匀浆脑组织。ELISA检测抽提物中的免疫球蛋白。F(ab)’2羊抗小鼠IgG包被到RIA板上作为捕捉剂。将脑抽提物或血清孵育1小时。用抗小鼠IIgG1-HRP或IgG2a-HRP或IgG2b-HRP(Caltag)检测同种型。发现无论何种同种型，存在于CNS中的抗体与其在血液中的浓度都为1∶1000。例如，当血液中IgG1浓度是血液中IgG2a浓度的三倍时，在脑部的浓度也是它的三倍，二者的浓度都是血液中浓度水平的0.1％。在转基因或未转基因的小鼠中都观察到这一结果，这表明PDAPP没有独特的血脑屏障泄漏。
实施例VI.小鼠3D6可变区的克隆和测序3D6 VH的克隆和测序分析。3D6的重链可变VH区利用由两种独立的方法从杂交瘤细胞制备的mRNA通过RT-PCR进行克隆。首先，共有引物用于包括翻译起始密码子的VH区前导肽作为5’引物(DNA#3818-3829)，以及g2b(DNA#3832)作为恒定区特异的3’引物。来自PCR扩增的产物和来自多种独立衍生的克隆的序列彼此完全一致。对3D6VH区的序列进一步核查，结果通过对由5’RACE RT-PCR法和3’g2b特异性引物(DNA #3832)获得的VH片段进行测序而得到确认。再一次，该序列获自PCR产物以及多种独立分离的克隆。两个序列彼此完全一致，(在来自5’RACE产物前导区的V8I取代除外)，表明该序列是来自编码3D6的VH区的mRNA。3D6 VH区的核苷酸(SEQ ID NO3)和氨基酸序列SEQ ID NO4)分别显示在表9A和图2中。
表9A小鼠3D6 VH核苷酸序列ATGAACTTCGGGCTCAGCTTGATTTTCCTTGTCCTTGTTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAAGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGCGTCTCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTATGGCATGTCTTGGGTTCGCCAGAATTCAGACAAGAGGCTGGAGTGGGTTGCATCCATTAGGAGTGGTGGTGGTAGAACCTACTATTCAGACAATGTAAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGAGAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAGTAGTCTGAAGTCTGAGGACACGGCCTTGTATTATTGTGTCAGATATGATCACTATAGTGGTAGCTCCGACTACTGGGGCCAGGGCACCACT(SEQ ID NO3)*前导肽加下划线。
小鼠3D6 VL的克隆和测序分析。将3D6的轻链可变VH区以和VH区类似的方式克隆。在第一个实验中，用于扩增鼠VL区的共有引物设计如下5’引物(DNA#3806-3816)设计来杂交于包含翻译起始密码子的VL区，以及3’引物(DNA#3817)特异于V-J结合区下游的鼠Ck区。PCR片段以及使用此共有轻链引物对分离出的独立衍生的克隆的DNA序列分析，揭示了获得的cDNA是来自非功能性重排信息，因为该序列含有在V-J区接点之间的移码突变。
在第二个实验中，5’RACE用于克隆编码cDNA的第二VL。此产物(共有序列11)的DNA序列分析显示其编码一个功能性的mRNA。因此，可以推断该序列编码正确的3D6轻链mRNA。3D6 VL区的核苷酸(SEQ ID NO1)和氨基酸序列(SEQ ID NO2)分别显示在表9B和图1。
表9B小鼠3D6 VL核苷酸序列
ATGATGAGTCCTGCCCAGTTCCTGTTTCTGTTAGTGCTCTGGATTCGGGAAACCAACGGTTATGTTGTGATGACCCAGACTCCACTCACTTTGTCGGTTACCATTGGACAACCAGCCTCCATCTCTTGCAAGTCAAGTCAGAGCCTCTTAGATAGTGATGGAAAGACATATTTGAATTGGTTGTTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTAATCTATCTGGTGTCTAAACTGGACTCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAGAATAGAGGCTGAGGATTTGGGACTTTATTATTGCTGGCAAGGTACACATTTTCCTCGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA (SEQID NO1)*前导肽加下划线用于3D6 VL cDNA克隆的引物显示在表10中。
从N末端到C-末端，轻链和重链含有结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。每一结构域氨基酸的分配与Kabat等的编号规则一致，同上。
嵌合3D6抗体的表达可变重链和轻链区经重新改造来编码各自VDJ或VJ接头下游剪接的供体序列，并被克隆到重链的哺乳动物表达载体PCMV-hγ1和轻链的载体PCMV-hκ1中。这些载体编码人γ1和Ck恒定区作为插入的可变区表达盒下游的外显子片段。在证实序列之后，重链和轻链表达载体被共同转染到COS细胞中。两个不同的重链克隆(H2.2&H3.2)独立地与3种不同的嵌合轻链克隆(L3、L4、& L10)共转染以确证结果的再现性。嵌合的21.6抗体转染作为载体的阳性对照。转染48小时后收集调节的培养基并通过western印迹来分析抗体的产生或通过ELISA分析其Aβ结合。
多种转染子全部表达了重链+轻链组合，其在western印迹上由羊抗人IgG(H+L)抗体识别。
3D6和嵌合3D6(PK1614)抗体与Aβ的直接结合通过ELISA分析来进行测定。发现嵌合3D6高亲和性地结合Aβ，类似于由3D6所论证的(图3A)。此外，基于竞争性抑制试验的ELISA表明嵌合3D6和鼠3D6抗体与生物素化-3D6同等地竞争结合于Aβ(图3B)。嵌合抗体显示与3D6参考样品不能区分的结合特性。
表11.
此外，3D6和PK1614在清除Aβ斑中是有效的。离体分析表明随着抗体的浓度增加，Aβ量减少的方式类似于鼠和嵌合3D6抗体。因此，可以推断该序列分别编码功能性3D6重链和轻链。
实施例VII.3D6人源化同源性/分子建立模型。为了鉴定鼠3D6抗体中的关键结构构架残基，三维模型的建立基于最接近的重链和轻链的鼠抗体。为达到此目的，一个称为1CR9的抗体选择作为建立3D6轻链模型的模板(PDB ID1CR9，Kanyo等，同上)，以及命名为1OPG的抗体选择作为建立3D6重链模型的模板(PDB ID1OPG Kodandapani等，同上)(也参见表1)。3D6与这些抗体的重链和轻链的氨基酸序列的比对揭示，除了重链的CDR3以外，1CR9和1OPG抗体与3D6有显著的序列同源性。此外，所选抗体的CDR环如同3D6的CDR环落入到相同的规范Chothia结构分类中，同样除了重链的CDR3以外。因此，1CR9和1OPG最初选作解开结构的抗体，用于3D6的同源性建模。
基于上述抗体的3D6可变区的第一同源性模型是利用Look &SegMod Modules GeneMine(v3.5)软件包来构建的。此软件可购买自Molecular Applications Group(Palo Alto，CA)。此软件包由Michael Levitt和Chris Lee博士开发，通过自动运行步骤基于序列的同源性在已知结构的模板上建立一级序列结构模型，促进了分子建模的进程。其运行在Silicon Graphics IRIS工作站的UNIX环境下，模型的结构通过一系列能量最小化步骤来去除不必要的原子接触并优化静电的和范德华作用而自动改进。
更精确的模型的建立利用Quanta_的建模能力。3D6重链的CDR3在PDB数据库中的查询鉴定了1qkz为最同源的且具有与3D6相同的残基数。因此，3D6重链的CDR3的建模利用1qkz的晶体结构作为模板。3D6模型的α-碳主链迹线显示于图4。VH结构域显示为点画线，且VL区域显示为实线，以及CDR环显示为条带形式。
人受体抗体序列的筛选。合适的人受体抗体序列通过计算机比较小鼠可变区的氨基酸序列与已知人抗体的序列来进行鉴定。3D6重链和轻链的比较分别进行。特别地，来自其构架序列显示与鼠VL和VH构架区高度序列同一性的人抗体的可变区使用NCBI BLAST(公众可通过国家卫生研究所NCBI因特网服务器获得)通过Kabat数据库查询各自的鼠构架序列来进行鉴定。
两个候选的序列选作受体序列基于下述的条件(1)与受试序列同源；(2)与供体序列共有规范的CDR结构；以及(3)在构架区不含有任何稀有氨基酸残基。所选VL的受体序列是 Kabat IDNO(KABID)019230(Genbank登录号No.S40342)，VH的受体序列是KABID 045919(Genbank登录号No.AF115110)。人源化3D6抗体的第一个改型利用了这些所选的受体抗体序列。
氨基酸残基的取代。如上所述，本发明的人源化抗体含有基本上来自人免疫球蛋白的可变构架区(受体免疫球蛋白)以及基本上来自小鼠免疫球蛋白称为3D6的互补决定区(供体免疫球蛋白)。在鉴定了3D6的互补决定区和适当的人受体免疫球蛋白后，接下来的步骤是确定来自这些元件的哪一些残基，如果有的话，被取代以优化产生的人源化抗体的特性。前面所述的标准用于筛选取代的残基。
图1和2分别描述了原始鼠3D6 VL和VH与人源化序列的改型1、相应的人构架受体序列，以及显示与人构架受体序列有最高的同源性的人种系V区序列的比对。阴影部分的残基显示规范(实体)、游尺(点线)、包装(粗体)以及稀有氨基酸(粗斜体)，并标在图上。星号表明残基在人受体构架序列中回复突变为鼠残基，且CDR区显示为上划线的。插入到人源化3D6 VH和VL的变体1中的变化概括在表12中。
表12.人源化3D6.v1中变化的概括
表13和14分别阐述了不同轻链和重链的Kabat编号检索表13轻链Kabat编号检索
Table 14.重链Kabat编号检索
人源化抗体优选显示出特异性结合Aβ的亲合力至少为107、108、109或1010M-1。通常人源化抗体对Aβ的结合亲合力的上限为3D6的亲合力上限的三、四或五倍
(即～109M-1)。通常结合亲合力的下限也为3D6的亲合力下限的三、四或五倍。
人源化3D6 VH和VL、改型1的组装和表达简单地说，对于每一个V区，把4个大的单链重叠寡核苷酸进行合成。此外，将4个短的PCR引物合成用于每一V区域以进一步促进特定V区的组装。用于此目的寡核苷酸的DNA序列显示在表15中。
表15DNA寡核苷酸
人源化轻链利用PCR进行装配。至于所预计的序列，对两打以上的DNA序列进行分析表明分散的点突变和贯穿VL区的缺失。序列的分析显示克隆2.3负责修复氨基末端区域的2个间隔接近的单核苷酸缺失。因此定点诱变在克隆pCRShum3D6v12.3上进行，通过寡核苷酸来导入2个缺失的核苷酸，且点突变的修复通过DNA序列分析得到确认，以及将VL插入片段克隆到轻链表达载体pCMV-cK中。
利用基于PCR的方法装配人源化VH产生了5’端一半序列全部缺失的克隆。进一步地努力优化PCR的条件来满足部分的成功。通过优化的PCR条件而装配的克隆在定位到A+B片段重叠的区域中仍具有10-20核苷酸缺失。所以，可选择的路线应用于VH装配，通过利用DNA聚合酶(T4、Klenow和Sequenase)介导的重叠延伸，然后通过T4 DNA连接酶来共价连接重叠末端。利用后一方法对来自VH装配的克隆亚组进行DNA序列分析揭示了克隆中的分散的点突变和缺失。对两打以上克隆的分析揭示了克隆的如图所示基本相同的模式。在VH和VL克隆的第一次装配之后所观察到的类似结果表明DNA序列误差产生在用于装配的长DNA的合成过程中自动合成仪的误差。
人源化VH克隆2.7选择用于通过观察含有的3个核苷酸缺失的定点诱变介导的修复。
实施例XIII人源化3D6v2抗体的特征鉴定人源化3D6的第二改型具有改型1所显示的所有取代，除了在残基1处D→Y的取代。在改型1中该残基的取代是因为该残基被鉴定为一个CDR作用残基。但是，取代缺失了一个在该位点对与人免疫球蛋白来说稀有的残基。然而，建立了一个没有该取代的改型。此外，在重链构架区的非种系残基被命名为H74＝S，H77＝T和H89＝V的种系残基取代。改型2轻链和重链的Kabat编号分别与表13和14所述相同，除了改型2轻链的残基1为天冬氨酸(D)，重链的残基74为丝氨酸(S)，重链的残基77为苏氨酸(T)，重链的残基89为缬氨酸(V)。人源化 3D6改型1轻链和重链的核苷酸序列分别见序列SEQ ID NO34和36。人源化3D6改型2轻链和重链的核苷酸序列分别见序列SEQID NO35和37。
实施例IX人源化3D6抗体的功能试验人源化3D6v1结合聚集态Aβ.人源化3D6v1的功能性试验通过来自瞬时转染的COS细胞的条件培养基来进行。该细胞用嵌合重链+人源化轻链或嵌合轻链+人源化重链混合物的全嵌合抗体以及最终用完全人源化抗体转染。条件培养基通过ELISA试验测试其对聚集态Aβ1-42的结合。人源化抗体在实验误差内显示出良好的活性，且显示出与嵌合3D6参照样品不能区分的结合特性。结果显示在表16中。
表16
为了比较人源化3D6v1和3D6v2抗体的结合亲合力，利用聚集态Aβ作为抗原进行ELISA分析。结果显示3D6v1(H1L1)和3D6v2(H2L2)具有几乎完全相同的Aβ结合特性(附图5)。
h3D6v2的替代网(rNET)分析. rNET表位图谱分析提供了关于在表位中的单个残基对抗体的综合结合活性的贡献的信息。rNET分析利用了合成的系统的单一取代的肽类似物。被测试抗体的结合被测定抗天然肽(天然抗原)和抗19个可选择的“单一取代”肽，每一个肽在第一位置用该位置的19个非天然氨基酸之一取代。一种分布图被产生来反映不同非天然残基位置取代的影响。在延着抗原肽的连续位置同样地产生分布图。联合的分布图，或表位图谱，(反映所有19个非天然残基的每一位置的取代)可与第二抗体的类似图谱比较。大体上类似或相同的图谱表明被比较的抗体具有相同或相似的表位特异性。
此分析被用于3D6和人源化3D6，改型2。抗体被测试其对天然Aβ肽DAEFRHDSGY(SEQ ID NO33)的结合。残基1-8被系统地用19个非天然残基的每一个在其位置进行取代。3D6和h3D6v2的相应的图谱被产生。结果显示在表17的表格中。
表17Aβwt3D6和人源化3D6的替换网状表位(rNET)图谱
显著地，当注意每一位置的取代时，3D6和h3D6v2的分布图实质上是相同的(即，当比较栏1(3D6)和栏2(h3D6v2)的数据时，值以相同的方式波动)。这些数据证实了h3D6v2的特异性被保留，正如h3D6v2的rNET表位图谱与m3D6利用Aβ残基1-4和5-8的实质上相同性。
PDAPP脑切片的免疫组织化学分析证实了h3D6v1抗体的特异性。人源化3D6v1抗体识别来自PDAPP小鼠的恒冷箱脑切片的Aβ。人源化3D6v1和PKl614以相同的剂量反应方式结合于PDAPP斑，通过测定每玻片荧光的量(像素的定量测定)对用于染色组织的抗体的量(附图6)。相同的抗人第二抗体被用于此实验中。切片、染色和成像的方法如前面所述。在相同的试验中，h3D6v2对PDAPP和AD脑切片的污染的成像分析表明h3D6v2以与3D6v1类似的方式识别Aβ斑(例如，高度修饰斑)。
h3D6的竞争性结合分析。h3D6抗体v1和v2与鼠3D6竞争性结合的能力通过ELISA利用生物素酰化的3D6抗体抗体来测定。竞争性结合分析表明h3D6v1，h3D6v2，和嵌合PKl614均可与m3D6竞争性结合Aβ(附图7)。h3D6v1和h3D6v2与3D6竞争性结合Ap的能力是相同的。10D5抗体被用作阴性对照，因为其具有与3D6不同的结合表位。BIAcore分析也显示了h3D6v1和h3D6v2高度结合Aβ的亲合力(表18)。
表18利用BIAcore技术测定Aβ抗体的亲合力
与具有0.88nM Kd的3D6相比，h3D6v1和h3D6v2具有大约小2到3倍的结合亲合力，测定h3D6v1和h3D6v2分别具有2.06nM和2.24nM的Kd。ELISA竞争性结合试验表明h3D6v1和h3D6v2具有大约小6-倍的结合亲合力。典型的，人源化抗体与其鼠的相应抗体比较损失大约3-4倍的结合亲合力。因此h3D6v1和h3D6v2的大约3倍(ELISA和BIAcore结果的平均值)的损失是在可接受的范围内。
h3D6v2抗体的离体试验。h3D6v2刺激小神经胶质细胞的能力通过离体吞噬作用试验被测定(附图8)。h3D6v2与嵌合3D6在诱导来自PDAPP小鼠脑组织的Aβ的吞噬作用中是同样有效的。IgG在此实验中被用作阴性对照，因为其不能够结合Aβ且因此不能够诱导吞噬作用。
h3D6在体内脑中的定位。125I标记的h3D6v2，m3D6，和抗体DAE13在单独的实验中各自被IV-注射到14个独立的PDAPP小鼠中。第7天后处死小鼠并灌注用于进一步的分析。其脑区被切割并测定在特异性脑区域的125I活性。脑中的放射性标记的活性与血清样品中的活性比较。血清和脑区域的结果分别显示在表19和20中。
表19
表20
数据表明h3D6v2集中到脑中，且特别聚集在已知Aβ集中的海马区。m3D6和DAE13的脑部计数与h3D6v2可比。通过体内的Aβ斑结合证实所有的三种抗体能够通过血脑屏障。
实施例X.小鼠10D5可变区的克隆和测序10D5 VH的克隆和序列分析.来自杂交瘤细胞的10D5的VH和VL区通过RT-PCR利用5’RACE法克隆。得自两个独立的编码假定10D5 VL区的cDNA克隆的核苷酸序列(SEQ ID NO13)以及推导的氨基酸序列(SEQ ID NO14)，被列在表21和附图9中。得自两个独立的编码假定10D5 VH区的cDNA克隆的核苷酸序列(SEQ ID NO15)以及推导的氨基酸序列(SEQ ID NO16)，被列在表22和附图10中。10D5 VL和VH序列满足功能性V区的条件就需含有一个与C区的启动甲硫氨酸邻近的ORF，且具有免疫球蛋白V区基因的保守残基的特性。
表21小鼠10D5 VL DNA序列ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTACTGATGTTCTGGATTCCTGCTTCCAGCAGTGATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAACATTATACATAGTAATGGAAACACCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAAGAAAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAATTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGGAA(SEQ IDNO13)*前导肽加下划线表22小鼠10D5 VH DNA序列ATGGACAGGCTTACTTCCTCATTCCTGCTGCTGATTGTCCCTGCATATGTCCTGTCCCAGGCTACTCTGAAAGAGTCTGGCCCTGGAATATTGCAGTCCTCCCAGACCCTCAGTCTGACTTGTTCTTTCTCTGGGTTTTCACTGAGCACTTCTGGTATGGGAGTGAGCTGGATTCGTCAGCCTTCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGCACACATTTACTGGGATGATGACAAGCGCTATAACCCATCCCTGAAGAGCCGGCTCACAATCTCCAAGGATACCTCCAGAAAGCAGGTATTCCTCAAGATCACCAGTGTGGACCCTGCAGATACTGCCACATACTACTGTGTTCGAAGGCCCATTACTCCGGTACTAGTCGATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO15)*前导肽加下划线.
实施例XI.人受试者的预防和治疗进行单剂量I期试验确定在人体内的安全性。以逐步增加的剂量对不同患者给药治疗药物，从推测功效的水平约0.01开始，以3为系数增长，直到达到10倍有效小鼠剂量的水平。
进行II期试验确定治疗的功效。挑选利用阿尔茨海默氏病和相关病症协会(ADRD)为可能发生的AD制定的标准确定的患早期到中度阿尔茨海默氏病的患者。按照做微精神状况检查(MiniMental StateExam，MMSE)，合适的患者的得分在12-26范围内。其它选择标准是，患者在研究期间容易生存，且不会出现复杂问题，例如可能带来干扰的伴随药物的使用。利用典型心理测量法例如MMSE、ADAS对患者功能作基线评价，这些方法对于评价阿尔茨海默氏病的状况和功能是一种综合判断。这些心理测量标准能够测量阿尔茨海默氏病的发展。合适的定性生命标准也可以用来监测治疗。还可以通过MRI监测疾病的发展。也可以监测患者的血液状况，包括分析免疫原特异性抗体和T细胞应答。
测定基线后，患者开始接受治疗。将其完全打乱，以双盲方式用治疗药物或安慰剂治疗。至少每六个月监测患者一次。通过进展中治疗组相对于安慰剂组的有效降低来确定效果。
进行第二次II期试验，评价患者从非阿尔茨海默氏病的早期记忆丢失，有时被称为年龄有关的记忆损伤(AAMI)或轻度认知损伤(MCI)到经ADRDA标准确定为可能的阿尔茨海默氏病的转变。通过筛选参照群体的记忆丢失早期迹象或其它与前阿尔茨海默氏病症候学、阿尔茨海默氏病的家族史、遗传危险因素、年龄、性别和已发现的其它预示阿尔茨海默氏病高危特征有关的不利特征，从非临床群体中选择具有转化成阿尔茨海默氏病高风险的患者。收集基于包括MMSE和ADAS的合适法则和其它设计用来评价较为正常群体法则的基线积分。将这些患者群体分成合适的安慰剂对交替剂量药物组。以间隔约六个月，对这些患者群体进行跟踪，终点是每个患者到观察结束时他或她是否转化成按照ADRDA标准判断的可能的阿尔茨海默氏病。
一般材料和方法A.多克隆和单克降Aβ抗体的制备从两组动物采集的血液中制备抗Aβ多克隆抗体。第一组含有6-8周龄的100只雌性Swiss Webster小鼠。在0、15和29天用100μg与CFA/IFA组合的AN1792免疫。第36天进行第四次注射，给药一半剂量的AN1792。第42天放血法处死动物，制备血清，共收集血清64ml。第二组含有24只6-9周龄的雌性小鼠，与PDAPP小鼠等基因，但对于人APP基因是非转基因的。在0、14、28和56天用100μg与CFA/IFA组合的AN1792免疫。第63天放血法处死动物，制备血清，共收集血清14ml。混合这两种血清。使用50％饱和硫酸铵进行两次连续的沉淀作用，以纯化抗体组分。最终的沉淀物在PBS中透析并检测内毒素。内毒素的水平小于1EU/mg。
抗Aβ单克隆抗体制备于腹水液。冰冷的腹水液中加入浓缩的硫酸葡聚糖钠盐进行脱脂，在冰上搅动使终浓度为0.238％。搅动加入浓缩的CaCl2，使其终浓度为64mM。10000xg离心该溶液，弃沉淀。在冰上搅动逐滴加入等体积的饱和硫酸铵于上清液中。10000xg再次离心该溶液，丢弃上清液。沉淀重悬并透析于20mM Tris-HCl，0.4M NaCl中，pH7.5。此部分上Pharmacia FPLC Sepharose Q柱，并以反向梯度从0.4M到0.275M NaCl(溶于20mM Tris-HCl，pH7.5)洗脱。
抗体的峰值可以通过280纳米的吸收被鉴定，从而收集合适的部分。通过BCA方式测定蛋白浓度，以及SDS-PAGE测定纯度，从而对纯化的抗体制备物进行定性。也检测抗体池的内毒素。内毒素水平低于1EU/mg。低于100的效价被任意地给一个25的效价值。
B.抗体效价的测定在小鼠尾静脉切开小口取血，采集约200μl血置于微量离心管。豚鼠如下取血，首先剃去后腿背面的毛，然后用18号针头划破跖骨静脉，采血于微量离心管。室温下(RT)静置1小时使血液凝结成块，旋涡振荡，然后在14000xg离心10分钟，将血块从血清中分离出来。然后将血清转移到干净的微量离心管中，4℃储存直到测定效价。
用ELISA测定抗体效价。在Well包被缓冲液(0.1M磷酸钠，pH8.5，0.1％叠氮化钠)中含有10μg/ml Aβ42或SAPP或如各单独报道的其它抗原的100μl溶液包被96孔微滴定板(Costsr EIA平板)，室温过夜。吸干各孔，从1/100稀释度的样品稀释液(0.014M磷酸钠、pH7.4、0.15M NaCl、0.6％牛血清白蛋白、0.05％硫柳汞)开始向孔中加入血清。以三倍的跨度制备七个连续稀释度的样品，置于平板中，终稀释度为1/218700。稀释液在经包被的平板的孔中室温保温1小时。然后用含0.05％吐温20的PBS冲洗四次。将第二抗体，结合辣根过氧化物酶的羊抗小鼠Ig(获自Boehringer Mannheim)，作为100μl的1/3000稀释度的样品稀释液加到孔中，室温保温1小时。再次用PBS、吐温20冲洗平板四次。为了形成色原体，将100μl的Slow TMB(3，3’，5，5’-四甲基对二氨基联苯，获自Pierce Chemicals)加入各孔，室温保温15分钟。加入25μl的2M H2SO4终止反应。然后在Molecular Devices Vmax装置上读取450nm-650nm处的光密度。
效价被定义为得到最大OD一半时血清稀释度的倒数。最大OD通常取自起始的1/100稀释液，除非该条件下具有非常高的效价，在这种情况下，需要建立较高起始稀释度的最大OD。如果50％的点落在两个稀释液之间，则利用线性外推法计算最终效价。为了计算几何平均抗体效价，低于100的效价被任意地指定效价值为25。
C.脑组织制备无痛处死后取脑，一个脑半球准备进行免疫组织化学分析，解剖另一个脑半球的三个脑区(海马、皮层和小脑)用于利用特异性ELISA测定各种Aβ蛋白质和APP型的浓度(Johnson-Wood等，同上)。
将用于ELISA的组织在10体积的冰冷胍缓冲液(5.0M胍-盐酸，50mM Tris-HCl，pH 8.0)中匀浆。匀浆液利用Adams Nutator(Fisher)温和搅拌，室温下混合3到4小时，然后于-20℃储藏，留待定量Aβ和APP时使用。前面的试验已经表明，在该储藏条件下，分析物是稳定的，当合成的Aβ蛋白(Bachem)掺入同窝生小鼠的对照脑组织匀浆中时，可以定量提取(Johnson-Wood等，同上)。
D.Aβ水平的测定用冰冷却的酪蛋白稀释液(0.25％酪蛋白、PBS、0.05％叠氮化钠、20μg/ml抑酶肽、5mM EDTA pH 8.0，10μg/ml亮肽素)以1∶10稀释脑匀浆，然后在4℃，16000×g离心20分钟。制备合成的Aβ蛋白质标准品(1-42氨基酸)和APP标准品，使终组合物中包括0.5M胍和0.1％牛血清白蛋白(BSA)。“总”Aβ夹心ELISA利用单克隆抗体266，特异于Aβ第13-28位的氨基酸(Seubert等，同上)作为捕捉抗体，和生物素酰化的单克隆抗体3D6，特异于Aβ第1-5位的氨基酸(Johnson-Wood等，同上)作为报道抗体。3D6单克隆抗体不能识别分泌型APP或全长APP，仅可检测氨基末端为天冬氨酸的Aβ类型。该分析法灵敏度下限约为50ng/ml(11nM)，不与浓度至多1ng/ml内源性鼠Aβ蛋白质表现交叉反应性(Johnson-Wood等，同上)。
Aβ1-42特异性夹心ELISA采用mAβ21F12，特异于Aβ的氨基酸33-42(Johnson-Wood等，同上)作为捕捉抗体。该分析同样用生物素酰化的mAβ3D6作为报道抗体，其灵敏度下限约为125μg/ml(28μM，Johnson-Wood等，同上)。当进行AβELISA时，用100μl mAβ266(10μg/ml)或mAβ21F12(5μg/ml)包被96孔的免疫测试平板(Costar)，室温下保温过夜。通过抽吸除去溶液，向各孔中加入200μl 0.25％的人血清蛋白PBS溶液，于室温将各孔封闭至少1小时。除去封闭液，在4℃下储藏干燥的平板直到使用。在使用前用冲洗缓冲液(Tris-缓冲盐水(0.15M NaCl，0.01M Tris-HCl，pH 7.5)加0.05％吐温20)使平板再水化。将样品和标准品以每孔100μl三等份加入，然后于4℃保温过夜。分析的每个步骤之间用冲洗缓冲液至少冲洗平板三次。加入生物素酚化的mAβ3D6(用酪蛋白分析缓冲液(0.25％酪蛋白，PBS，0.05％吐温20，pH 7.4)稀释到0.5μg/ml，室温下保温1小时。将抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶结合物((抗生物素蛋白-HRP得自Vector，Burlingame，CA)用酪蛋白分析缓冲液以1∶4000的比例稀释)加到孔中，室温保持1小时。加入比色物质，Slow TMB-ELISA(Pierce)，使反应在室温下进行15分钟，之后，加入25μl 2N H2SO4终止反应。利用Molecular Devices Vmax装置读取450nm和650nm处的吸收度差值，定量反应产物。
E.APP水平的测定应用了两种不同APP测定法。其一种分析被命名为APP-α/FL，识别APP-α和APP的全长型(FL)。第二种分析特异于APP-α。APP-α/FL分析法识别包括Aβ的前12个氨基酸的分泌型APP。因为报道抗体(2H3)对存在于APP695第612-613位的氨基酸之间(Esch等，Science 2481122-1124(1990))的α-发夹-位点不具有特异性；因此该分析也可以识别全长APP(AP-FL)。利用针对APP-FL细胞质末端的固定APP抗体消耗脑匀浆APP-FL的初步试验表明，约30-40％的APP-α/FL APP是FL(数据未显示)。APP-α/FL和APP-α分析的捕捉抗体均为mAb 8E5，其针对APP695型第444到592位的氨基酸(Games等，同上)。用于APP-α/FL分析的报道mAb是mAb 2H3，其特异于APP695第597-608位的氨基酸(Johnso-Wood等，同上)，APP-α分析的报道抗体是mAb 16H9的生物素酰化衍生物，其针对APP第605-611位的氨基酸。APP-α/FL分析的灵敏度下限约为11ng/ml(150ρM)(Johnson-Wood等)，APP-α特异性分析的灵敏度下限约为22ng/ml(0.3nM)。对于这两种APP检测，如前面mAb 266所述，将mAb8E5包被到96孔EIA平板上。纯化的重组分泌型APP-α用作APP-α分析和APP-α/FL分析的参照标准品(Esch等，同上)。5M胍中的脑匀浆样品用ELISA样品稀释液(0.014M磷酸盐缓冲液，pH 7.4，0.6％牛血清白蛋白，0.05％硫柳汞，0.5M NaCl，0.1％NP40)以1∶10的比例稀释。然后用含0.5M胍的样品稀释液以1∶4的比例稀释它们。然后在室温下，16000xg离心稀释的匀浆15秒。将APP标准品和样品平行两份加入平板，室温下保温1.5小时。将生物素酰化的报道抗体2H3或16H9与样品一起在室温下保温1小时。链霉抗生物素蛋白-碱性磷酸酶(Boehringer Mannheim)，在样品稀释液中稀释1000倍，加入孔中室温下保温1小时。加入荧光物质4-甲基-umbellipheryl-磷酸酯，室温下保温30分钟，在Cytofluor tm 2350荧光计(Millipore)上在激发光365nm和发射光450nm处对平板读数。
F.免疫组织化学脑在4％多聚甲醛的PBS液中于4℃固定三天，然后在1％多聚甲醛PBS液中于4℃储存1到7天，直到被切片。在振动切片机上室温下将其切成40微米厚的冠状切片，在防冻剂(30％甘油，30％乙二醇，在磷酸缓冲液中)中于-20℃储存直到进行免疫组织化学处理。对于每个脑，在背侧海马水平上的六个切片，连续间隔240μm彼此分离，与下述之一的抗体中一起温育过夜(1)生物素酰化的抗-Aβ(mAb，3D6，特异于人Aβ)在PBS和1％马血清中稀释到浓度为2μg/ml；或(2)特异于人APP的生物素酰化的mAb，8E5，在PBS和1.0％马血清中稀释到浓度为3μg/ml；或(3)特异于神经胶质纤丝酸性蛋白质的mAb(GFAP；Sigma Chemical Co.)，用含0.25％Triton X-100和1％马血清的Tris-缓冲盐水(pH7.4)(TBS)以1∶500的比例稀释；或(4)特异于CD11b(MAC-1抗原)的mAb(Chemicon International)，用0.25％TritonX-100和1％兔血清的TBS液以1∶100的比例稀释；或(5)特异于MHCII抗原的mAb(Pharmingen)，用含0.25％Triton X-100和1％兔血清的TBS液以1∶100的比例稀释；或(6)特异于CD 43的大鼠mAb(Pharmingen)，用含1％兔血清的PBS液以1∶100的比例稀释；或(7)特异于CD 45RA的大鼠mAb(Pharmingen)，用含1％兔血清的PBS液以1∶100的比例稀释；或(8)特异于CD 45RB的大鼠单克隆Aβ(Pharmingen)，用含1％兔血清的PBS液以1∶100的比例稀释或(9)特异于CD 45的大鼠单克隆Aβ(Pharminge)，用含1％兔血清的PBS液以1∶100的比例稀释；或(10)特异于CD3e的生物素酰化多克隆仓鼠Aβ(Pharmingen)，用含1％兔血清的PBS液以1∶100的比例稀释；或(11)特异于CD 3的大鼠mAb(Serotec)，用含1％兔血清的PBS液以1∶200的比例稀释；或(12)含1％正常马血清的无一级抗体的PBS溶液。
与上面所列的1、2和6-12号抗体溶液反应的切片首先用含1.0％Triton X-100，0.4％过氧化氢的PBS液在室温下预处理20分钟，以阻断内源性过氧化物酶。接着将它们与一级抗体在4℃下保温过夜。然后使与3D6或8E5或CD3e mAb反应的切片在室温下与辣根过氧化物酶-抗生物素蛋白-生物素-复合物与用PBS稀释75倍的试剂盒成分“A”和“B”(Vector Elite Standard Kit，Vector Labs，Burlingame，CA)一起反应1小时。与特异于CD 45RA、CD 45RB、CD45、CD3的抗体和无一级抗体的PBS溶液反应的切片分别与在PBS中稀释为1∶75的生物素酰化的抗-大鼠IgG(Vector)，或者在PBS中稀释为1∶75的生物素酰化的抗-小鼠IgG(Vectot)一起在室温下保温1小时。然后将切片与辣根过氧化物酶-抗生物素蛋白-生物素-复合物与试剂盒成分“A”和“B”(用PBS稀释75倍)(Vector Elite Standard Kit，Vector Labs，Burlingame，CA)在室温下反应1小时。
将切片置于0.01％过氧化氢、0.05％3，3’-二氨基联苯(DAB)中室温下。用于与GFAP-、MAC-1-和MHC II-特异性抗体一起保温的切片首先用0.6％过氧化氢在室温下预处理，以阻断内源性过氧化物酶，然后与一级抗体在4℃下保温过夜。与GFAP抗体反应的切片与在TBS中稀释成1∶200的生物素酰化的马抗-小鼠IgG(VectorLaboratories；Vectastain Elite ABC试剂盒)在室温下保温1小时。接着将切片与在TBS中稀释成1∶1000的抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物(Vector Laboratories；Vectastain Elite ABC试剂盒)反应1小时。接着将与MAC-1或MHCII-特异性单克隆抗体作为一级抗体一同保温的切片与在TBS中稀释成1∶200的生物素酰化的兔抗-大鼠IgG在室温下反应1小时，随后与在TBS中稀释成1∶1000的抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物保温1小时。然后将与GFAP-、MAC-1-或MHC II-特异性抗体一同保温的切片用0.05％DAB、0.01％过氧化氢、0.04％氯化镍、TBS液分别在室温下处理4和11分钟，使它们显色。
将免疫标记的切片在载玻片(VMR Superfrost玻片)上制作成标本，空气干燥过夜，在ProPar(Anatech)中浸渍，然后加盖玻片覆盖，用Permount(Fisher)作为标本介质封固。
为了复染色Aβ斑，将GFAP-阳性切片亚组在免疫组织化学处理后置于Superfrost载玻片上制作成标本，在1％硫黄素S(Thioflavin S)(Sigma)水溶液中保持7分钟。然后使切片脱水，在Propar中使其清晰，然后加盖玻片覆盖，用Permount封固。
G.成像分析通过CCD摄像机和索尼特丽珑监示器连接于尼康Microphot FX显微镜的Videometric 150型图像分析系统(Oncor，Inc.，Gaithersburg，MD)被用来定量免疫反应切片。切片的图像储存于影象缓冲区中，确定基于颜色和饱和度的阈值以选择和计算免疫标记结构物所占据的总像素面积。对于每个切片，人工描绘出海马区轮廓，计算海马区占据的总像素面积。如下测定淀粉样沉积百分率(含与mAb 3D6具有免疫反应性的Aβ沉积物的海马区面积的分数)×100。同样，神经炎性沉积的百分率如下测定(含与单克隆抗体8E5具有反应性的营养不良性神经突的海马区面积的分数)×100。运行Simple 32软件应用程序的C-成像系统(Compix，Inc.，Cranberry Township，PA)通过Optronics照相机连接于Nikon Microphot FX显微镜，用于定量GFAP-阳性星形胶质细胞和MAC-1和MHC II-阳性小胶质细胞占据的夹肌后(retrospenial)皮层的百分率。免疫反应切片的图像储存于显影缓冲区中，确定单色阈值，以选择和计算免疫标记细胞占据的总像素面积。对于每个切片，手工绘制除夹肌后皮层(RSC)的轮廓，然后计算RSC占据的总像素面积。星形胶质细胞增多(astrocytosis)百分率如下确定(GFAP-反应性星形胶质细胞占据的RSC的分数)×100。同样，小胶质细胞增多(microgliosis)百分率如下确定(MAC-1或MHC II-反应性小胶质细胞占据的RSC的分数)×100。对于所有的图像分析，定量每个动物的背侧海马水平上的六个切片(彼此连续以240μm的间隔分隔)。在所有的情况下，动物的治疗状况对于观察者都是未知的。
尽管为了便于清楚理解，前面已经详细描述了本发明，但显然可以在权利要求范围内进行某些改动。本文为各种目的引证的所有出版物和专利文献以及附图和序列表所示的文本以其全文内容引入作为参考。
根据前文，显然本发明提供了多种用途。例如，本发明提供了以上所述的Aβ抗体在致淀粉样病的治疗、预防或诊断中的应用，或在用于相同疾病的药物或诊断组合物制备中的应用。
序列表<110>神经实验室有限公司(Neuralab Limited)<120>识别β淀粉样肽的人源化抗体(Humanized Antibodies that RecognizeBeta-Amyloid Peptide)<130>SPI064969-47<150>60/251,892<151>2000-12-06<160>63<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>396<212>DNA<213>Mus musculus<220>
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<221>CDS<222>(1)...(426)<221>sig_peptide<222>(1)...(57)<400>15atg gac agg ctt act tcc tca ttc ctg ctg ctg att gtc cct gca tat48Met Asp Arg Leu Thr Ser Ser Phe Leu Leu Leu Ile Val Pro Ala Tyr-15 -10-5gtc ctg tcc cag gct act ctg aaa gag tct ggc cct gga ata ttg cag96Val Leu Ser Gln Ala Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln1 510tcc tcc cag acc ctc agt ctg act tgt tct ttc tct ggg ttt tca ctg144Ser Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu15 20 25agc act tct ggt atg gga gtg agc tgg att cgt cag cct tca gga aag192Ser Thr Ser Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys30 35 40 45ggt ctg gag tgg ctg gca cac att tac tgg gat gatgac aag cgc tat 240Gly Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr50 55 60aac cca tcc ctg aag agc cgg ctc aca atc tcc aag gat acc tcc aga288Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Arg65 70 75aag cag gta ttc ctc aag atc acc agt gtg gac cct gca gat act gcc336Lys Gln Val Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Pro Ala Asp Thr Ala80 8590
aca tac tac tgt gtt cga agg ccc att act ccg gta cta gtc gat gct384Thr Tyr Tyr Cys Val Arg Arg Pro Ile Thr Pro Val Leu Val Asp Ala95 100 105atg gac tac tgg ggt caa gga acc tca gtc acc gtc tcc tca426Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser110 115 120<210>16<211>142<212>PRT<213>Mus musculus<220>
<221>SIGNAL<222>(1)...(19)<400>16Met Asp Arg Leu Thr Ser Ser Phe Leu Leu Leu Ile Val Pro Ala Tyr-15 -10 -5Val Leu Ser Gln Ala Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln15 10Ser Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu15 20 25Ser Thr Ser Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys30 35 40 45Gly Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr50 5560Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Arg65 70 75Lys Gln Val Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Pro Ala Asp Thr Ala80 85 90Thr Tyr Tyr Cys Val Arg Arg Pro Ile Thr Pro Val Leu Val Asp Ala95 100 105Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser110 115 120<210>17<211>136<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer<400>17tccgcaagct tgccgccacc atggacatgc gcgtgcccgc ccagctgctg ggcctgctga 60tgctgtgggt gtccggctcc tccggctacg tggtgatgac ccagtccccc ctgtccctgc 120ccgtgacccc cggcga 136<210>18<211>131<212>DNA<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Primer<400>18ctggggggac tggccgggct tctgcagcag ccagttcagg taggtcttgc cgtcggagtc 60cagcagggac tgggaggact tgcaggagat ggaggcgggc tcgccggggg tcacgggcag 120ggacaggggg g 131<210>19<211>146<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer<400>19acctgaactg gctgctgcag aagcccggcc agtcccccca gcgcctgatc tacctggtgt 60ccaagctgga ctccggcgtg cccgaccgct tctccggctc cggctccggc accgacttca 120ccctgaagat ctcccgcgtg gaggcc 146<210>20<211>142<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer<400>20aattctagga tccactcacg cttgatctcc accttggtgc cctggccgaa ggtgcggggg 60aagtgggtgc cctgccagca gtagtacacg cccacgtcct cggcctccac gcgggagatc 120ttcagggtga agtcggtgcc gg 142<210>21<211>16<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer<400>21ctggggggac tggccg 16<210>22<211>22<212>DNA<<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer<400>22acctgaactg gctgctgcag aa 22<210>23<211>138<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer<400>23acagaaagct tgccgccacc atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtggctattt 60taaaaggtgt ccagtgtgag gtgcagctgc tggagtccgg cggcggcctg gtgcagcccg 120gcggctccct gcgcctgt138<210>24<211>135<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer<400>24gccgccggag cggatggagg ccacccactc caggcccttg ccgggggcct ggcgcaccca 60ggacatgccg tagttggaga aggtgaagcc ggaggcggcg caggacaggc gcagggagcc 120gccgggctgc accag 135<210>25<211>142<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer<400>25ctggagtggg tggcctccat ccgctccggc ggcggccgca cctactactc cgacaacgtg 60aagggccgct tcaccatctc ccgcgacaac gccaagaact ccctgtacct gcagatgaac 120tccctgcgcg ccgaggacac cg 142<210>26<211>144<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer<400>26ctgcaaggat ccactcaccg gaggacacgg tcaccagggt gccctggccc cagtagtcgg 60aggagccgga gtagtggtcg tagcgcacgc agtagtacag ggcggtgtcc tcggcgcgca 120gggagttcat ctgcaggtac aggg 144<210>27<211>16<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer<400>27gccgccggag cggatg 16<210>28<211>20<212>DNA<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Primer<400>28ctggagtggg tggcctccat20<210>29<211>19<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer<400>29tccgcaagcttgccgccac 19<210>30<211>29<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer<400>30aattctagga tccactcacg cttgatctc 29<210>31<211>23<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer<400>31acagaaagct tgccgccacc atg 23<210>32<211>22<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer<400>32ctgcaaggat ccactcaccg ga 22<210>33<211>10<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>internal peptide<400>33Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr15 10
<210>34<211>402<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>h3D6 version 1 VL<400>34atggacatgc gcgtgcccgc ccagctgctg ggcctgctga tgctgtgggt gtccggctcc 60tccggctacg tggtgatgac ccagtccccc ctgtccctgc ccgtgacccc cggcgagccc 120gcctccatct cctgcaagtc ctcccagtcc ctgctggact ccgacggcaa gacctacctg 180aactggctgc tgcagaagcc cggccagtcc ccccagcgcc tgatctacct ggtgtccaag 240ctggactccg gcgtgcccga ccgcttctcc ggctccggct ccggcaccga cttcaccctg 300aagatctccc gcgtggaggc cgaggacgtg ggcgtgtact actgctggca gggcacccac 360ttcccccgca ccttcggcca gggcaccaag gtggagatca ag 402<210>35<211>402<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>h3D6 version 2 VL<400>35atggacatgc gcgtgcccgc ccagctgctg ggcctgctga tgctgtgggt gtccggctcc 60tccggcgacg tggtgatgac ccagtccccc ctgtccctgc ccgtgacccc cggcgagccc 120gcctccatct cctgcaagtc ctcccagtcc ctgctggact ccgacggcaa gacctacctg 180aactggctgc tgcagaagcc cggccagtcc ccccagcgcc tgatctacct ggtgtccaag 240ctggactccg gcgtgcccga ccgcttctcc ggctccggct ccggcaccga cttcaccctg 300aagatctccc gcgtggaggc cgaggacgtg ggcgtgtact actgctggca gggcacccac 360ttcccccgca ccttcggcca gggcaccaag gtggagatca ag 402<210>36<211>414<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>h3D6 version 1 VH<400>36atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtggctattt taaaaggtgt ccagtgtgag 60gtgcagctgc tggagtccgg cggcggcctg gtgcagcccg gcggctccct gcgcctgtcc 120tgcgccgcct ccggcttcac cttctccaac tacggcatgt cctgggtgcg ccaggccccc 180ggcaagggcc tggagtgggt ggcctccatc cgctccggcg gcggccgcac ctactactcc 240gacaacgtga agggccgctt caccatctcc cgcgacaacg ccaagaactc cctgtacctg 300cagatgaact ccctgcgcgc cgaggacacc gccctgtact actgcgtgcg ctacgaccac 360tactccggct cctccgacta ctggggccag ggcaccctgg tgaccgtgtc ctcc414<210>37<211>414<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>h3D6 version 2 VH<400>37
atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtggctattt taaaaggtgt ccagtgtgag 60gtgcagctgc tggagtccgg cggcggcctg gtgcagcccg gcggctccct gcgcctgtcc 120tgcgccgcct ccggcttcac cttctccaac tacggcatgt cctgggtgcg ccaggccccc 180ggcaagggcc tggagtgggt ggcctccatc cgctccggcg gcggccgcac ctactactcc 240gacaacgtga agggccgctt caccatctcc cgcgacaact ccaagaacac cctgtacctg 300cagatgaact ccctgcgcgc cgaggacacc gccgtgtact actgcgtgcg ctacgaccac 360tactccggct cctccgacta ctggggccag ggcaccctgg tgaccgtgtc<210>38<211>770<212>PRT<213>Homo Sapiens<400>38Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg1510 15Ala Leu Glu Val Pro Thr Asp Gly Asn Ala Gly Leu Leu Ala Glu Pro20 25 30Gln Ile Ala Met Phe Cys Gly Arg Leu Asn Met His Met Asn Val Gln35 40 45Asn Gly Lys Trp Asp Ser Asp Pro Ser Gly Thr Lys Thr Cys Ile Asp50 55 60Thr Lys Glu Gly Ile Leu Gln Tyr Cys Gln Glu Val Tyr Pro Glu Leu65 70 75 80Gln Ile Thr Asn Val Val Glu Ala Asn Gln Pro Val Thr Ile Gln Asn85 9095Trp Cys Lys Arg Gly Arg Lys Gln Cys Lys Thr His Pro His Phe Val100 105 110Ile Pro Tyr Arg Cys Leu Val Gly Glu Phe Val Ser Asp Ala Leu Leu115 120 125Val Pro Asp Lys Cys Lys Phe Leu His Gln Glu Arg Met Asp Val Cys130 135 140Glu Thr His Leu His Trp His Thr Val Ala Lys Glu Thr Cys Ser Glu145 150 155 160Lys Ser Thr Asn Leu His Asp Tyr Gly Met Leu Leu Pro Cys GlyIle165 170 175Asp Lys Phe Arg Gly Val Glu Phe Val Cys Cys Pro Leu Ala Glu Glu180 185 190Ser Asp Asn Val Asp Ser Ala Asp Ala Glu Glu Asp Asp Ser Asp Val195 200 205Trp Trp Gly Gly Ala Asp Thr Asp Tyr Ala Asp Gly Ser Glu Asp Lys210 215 220Val Val Glu Val Ala Glu Glu Glu Glu Val Ala Glu Val Glu Glu Glu225 230 235 240Glu Ala Asp Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Gly Asp Glu Val Glu Glu245 250 255Glu Ala Glu Glu Pro Tyr Glu Glu Ala Thr Glu Arg Thr Thr Ser Ile260 265 270Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Glu Ser Val Glu Glu Val Val Arg275 280 285Glu Val Cys Ser Glu Gln Ala Glu Thr Gly Pro Cys Arg Ala Met Ile290 295 300Ser Arg Trp Tyr Phe Asp Val Thr Glu Gly Lys Cys Ala Pro Phe Phe305 310 315 320Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Arg Asn Asn Phe Asp Thr Glu Glu Tyr325 330 335Cys Met Ala Val Cys Gly Ser Ala Met Ser Gln Ser Leu Leu Lys Thr340 345 350Thr Gln Glu Pro Leu Ala Arg Asp Pro Val Lys Leu Pro Thr Thr Ala355 360 365Ala Ser Thr Pro Asp Ala Val Asp Lys Tyr Leu Glu Thr Pro Gly Asp
370 375 380Glu Asn Glu His Ala His Phe Gln Lys Ala Lys Glu Arg Leu Glu Ala385 390 395 400Lys His Arg Glu Arg Met Ser Gln Val Met Arg Glu Trp Glu Glu Ala405 410 415Glu Arg Gln Ala Lys Asn Leu Pro Lys Ala Asp Lys Lys Ala Val Ile420 425 430Gln His Phe Gln Glu Lys Val Glu Ser Leu Glu Gln Glu Ala Ala Asn435 440 445Glu Arg Gln Gln Leu Val Glu Thr His Met Ala Arg Val Glu Ala Met450 455 460Leu Asn Asp Arg Arg Arg Leu Ala Leu Glu Asn Tyr Ile Thr Ala Leu465 470 475 480Gln Ala Val Pro Pro Arg Pro Arg His Val Phe Asn Met Leu Lys Lys485 490 495Tyr Val Arg Ala Glu Gln Lys Asp Arg Gln His Thr Leu Lys His Phe500 505510Glu His Val Arg Met Val Asp Pro Lys Lys Ala Ala Gln Ile Arg Ser515 520 525Gln Val Met Thr His Leu Arg Val Ile Tyr Glu Arg Met Asn Gln Ser530 535 540Leu Ser Leu Leu Tyr Asn Val Pro Ala Val Ala Glu Glu Ile Gln Asp545 550 555 560Glu Val Asp Glu Leu Leu Gln Lys Glu Gln Asn Tyr Ser Asp Asp Val565 570 575Leu Ala Asn Met Ile Ser Glu Pro Arg Ile Ser Tyr Gly Asn Asp Ala580 585 590Leu Met Pro Ser Leu Thr Glu Thr Lys Thr Thr Val Glu Leu Leu Pro595 600 605Val Asn Gly Glu Phe Ser Leu Asp Asp Leu Gln Pro Trp His Ser Phe610 615 620Gly Ala Asp Ser Val Pro Ala Asn Thr Glu Asn Glu Val Glu Pro Val625 630 635 640Asp Ala Arg Pro Ala Ala Asp Arg Gly Leu Thr Thr Arg Pro Gly Ser645 650 655Gly Leu Thr Asn Ile Lys Thr Glu Glu Ile Ser Glu Val Lys Met Asp660 665 670Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu675 680 685Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly690695 700Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Val Ile Thr Leu705 710 715 720Val Met Leu Lys Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Ile His His Gly Val Val725 730 735
Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg His Leu Ser Lys Met740 745750Gln Gln Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys Phe Phe Glu Gln Met755 760 765Gln Asn770<210>39<211>15<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primers<400>39acttatatct gtttt15<210>40<211>15<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primers<400>40acttatacac tttgt 15<210>41<211>15<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primers<400>41acttatgttc attst15<210>42<211>16<212>DNA<213><213>Artificial Sequence<220>
<223>Primers<400>42acttatgccc attgtt 16<210>43<211>15<212>DNA<213><213>Artificial Sequence<220>
<223>Primers<400>43
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<223>Primers<400>44acttatgkyy attg 14<210>45<211>15<212>DNA<213><213>Artificial Sequence<220>
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<223>Primers<400>48acttatatgt tctc14<210>49<211>14<212>DNA<213><213>Artificial Sequence
<220>
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<223>Primers<400>50ggacggttgg g 11<210>51<211>14<212>DNA<213><213>Artificial Sequence<220>
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<223>Primers<400>54acttatatgt gtt 13<210>55
<211>15<212>DNA<213><213>Artificial Sequence<220>
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<223>Primers
<400>60acttatggtc tctt14<210>61<211>14<212>DNA<213><213>Artificial Sequence<220>
<223>Primers<400>61acttatatgt tttt14<210>62<211>14<212>DNA<213><213>Artificial Sequence<220>
<223>Primers<400>62acttattttg ttat 14<210>63<211>11<212>DNA<213><213>Artificial Sequence<220>
<223>Primers<400>63ggacgggaca g
权利要求
1.一种人源化免疫球蛋白轻链，其含有(i)至少一个来自3D6免疫球蛋白轻链可变区序列SEQ ID NO2的互补决定区(CDR)，和(ii)来自人受体免疫球蛋白轻链序列的可变构架区，其中所述轻链包含(a)至少一个替换的规范的构架残基；和(b)至少一个替换的链间包装构架残基；以及任选(c)至少一个替换的游标区构架残基，或至少一个替换的稀有构架残基，其中替换采用来自小鼠3D6轻链可变区序列的相应氨基酸残基。
2.权利要求1的轻链，其包括至少一个替换的游标区构架残基或至少一个替换的稀有构架残基。
3.权利要求1或2的轻链，其包括至少一个替换的游标区构架残基。
4.权利要求1或2的轻链，其包括至少一个替换的稀有构架残基。
5.前述权利要求任一项的轻链，其中规范的构架残基选自L2，L48，L64和L71(Kabat规则)。
6.前述权利要求任一项的轻链，其中链间包装构架残基选自L36，L38，L44，L46，L87和L98(Kabat规则)。
7.前述权利要求任一项的轻链，其中游标区构架残基选自L4，L35，L47，L49，L66，L68和L69(Kabat规则)。
8.前述权利要求任一项的轻链，其中稀有构架残基选自L1，L15，L83和L85(Kabat规则)。
9.前述权利要求任一项的轻链，其包括3个来自3D6免疫球蛋白轻链可变区序列的互补决定区(CDRs 1-3)。
10.前述权利要求任一项的轻链，其包括(a)L2规范的构架残基(Kabat规则)的替换，(b)L36和L46链间包装构架残基(Kabat规则)的替换，(c)L1稀有构架残基(Kabat规则)的替换，其中替换采用来自小鼠3D6轻链可变区序列的相应氨基酸残基，以及其中轻链的其余部分来自人免疫球蛋白。
11.前述权利要求任一项的轻链，其包括(a)L2规范的构架残基(Kabat规则)的替换，和(b)L36和L46链间包装构架残基(Kabat规则)的替换，其中替换采用来自小鼠3D6轻链可变区序列的相应氨基酸残基，以及其中轻链的其余部分来自人免疫球蛋白。
12.前述权利要求任一项的轻链，其中人免疫球蛋白受体轻链序列属于亚型кII(Kabat规则)。
13.权利要求12的轻链，其中人受体免疫球蛋白轻链序列选自Kabat ID 019230、Kabat ID 005131、Kabat ID 005058、Kabat ID 005057、Kabat ID 005059、Kabat ID U21040和Kabat ID U41645。
14.前述权利要求任一项的轻链，其中轻链的至少一个稀有构架残基用人可变轻链序列的普通氨基酸残基在该位置进行取代。
15.前述权利要求任一项的轻链，其中轻链的至少一个稀有构架残基用来自种系可变轻链序列的相应氨基酸残基进行取代。
16.权利要求15的轻链，其中种系可变轻链序列选自A1，A17，A18，A2和A19。
17.权利要求14-16任一项的轻链，其中轻链的稀有构架残基选择基于轻链可变区亚组中的人轻链可变区序列在该位置的出现小于10％，而普通残基选择基于轻链可变区亚组中的人轻链可变区序列在该位置的出现超过50％。
18.一种人源化免疫球蛋白重链，其含有(i)至少一个来自3D6免疫球蛋白重链可变区序列SEQ ID NO4的互补决定区(CDR)，和(ii)来自人受体免疫球蛋白重链序列的可变构架区，其中重链包括(a)至少一个替换的规范的构架残基，(b)至少一个替换的链间包装构架残基，和(c)至少一个替换的游标区构架残基，或至少一个替换的稀有构架残基，其中替换采用来自小鼠3D6重链可变区序列的相应氨基酸残基。
19.权利要求18的重链，其包括至少一个替换的游标区构架残基。
20.权利要求18的重链，其包括至少一个替换的稀有构架残基。
21.权利要求18的重链，其中规范的构架残基选自H24，H26，H27，H29，H71和H94(Kabat规则)。
22.权利要求18或19的重链，其中链间包装构架残基选自H37，H39，H45，H47，H91，H93和H103(Kabat规则)。
23.权利要求18-20任一项的重链，其中游标区构架残基选自H2，H28，H30，H48，H49，H67，H69和H80(Kabat规则)。
24.权利要求18-23任一项的重链，其中稀有构架残基选自H40和H42(Kabat规则)。
25.权利要求18-24任一项的重链，其包括3个来自3D6免疫球蛋白重链可变区序列的互补决定区(CDRs 1-3)。
26.权利要求18-25任一项的重链，其包括(a)H94规范的构架残基(Kabat规则)的替换，(b)H93链间包装构架残基(Kabat规则)的替换，和(c)H49游标区构架残基(Kabat规则)的替换，其中替换采用来自小鼠3D6重链可变区序列的相应氨基酸残基，以及其中重链的其余部分来自人免疫球蛋白。
27.权利要求18-26任一项的重链，其中人免疫球蛋白受体重链序列属于亚型III(Kabat规则)。
28.权利要求27的重链，其中的人受体重链序列选自Kabat ID045919、Kabat ID 000459、Kabat ID 000553、Kabat ID 000386和KabatID M23691。
29.权利要求18-28任一项的重链，其中重链的至少一个稀有构架残基用人可变重链序列的普通氨基酸残基在该位置进行取代。
30.权利要求18-29任一项的重链，其中重链的至少一个稀有构架残基用来自种系可变重链序列的相应氨基酸残基进行取代。
31.权利要求30的重链，其中种系可变重链序列选自VH3-48、VH3-23、VH3-7、VH3-21和VH3-11。
32.权利要求29-31任一项的重链，其中重链的稀有构架残基选择基于重链可变区亚组中的人重链可变区序列在该位置的出现小于10％，而普通残基选择基于重链可变区亚组中的人重链可变区序列在该位置的出现超过50％。
33.人源化免疫球蛋白，其特异性结合到β淀粉样肽(Aβ)，包括权利要求1-17任一项的轻链和权利要求18-32任一项的重链，或所述免疫球蛋白的抗原结合片段。
34.人源化免疫球蛋白，或其抗原结合片段，其以至少107M-1的结合亲合力特异性结合到β淀粉样肽(Aβ)，包括(i)轻链，其包括至少一个来自3D6免疫球蛋白轻链可变区序列SEQ ID NO2的互补决定区(CDR)，和来自人受体免疫球蛋白轻链序列的可变构架区，和(ii)重链，其包括至少一个来自3D6免疫球蛋白重链可变区序列SEQ ID NO4的互补决定区(CDR)，和来自人受体免疫球蛋白重链序列的可变构架区，条件是所述人源化免疫球蛋白，或其抗原结合片段包括(a)至少一个替换的规范的构架残基，选自L2，L48，L64，L71，H24，H26，H27，H29，H71和H94(Kabat规则)，(b)至少一个替换的链间包装构架残基，选自L36，L38，L44，L46，L87，L98，H37，H39，H45，H47，H91，H93和H103(Kabat规则)，和(c)至少一个替换的游标区构架残基，选自L4，L35，L47，L49，L66，L68，L69，H2，H28，H30，H48，H49，H67，H69和H80(Kabat规则)，或至少一个替换的稀有构架残基，选自L1，L15，L83，L85，H40和H42(Kabat规则)，其中替换采用来自小鼠3D6轻链区序列或小鼠3D6重链可变区序列的相应氨基酸残基。
35.权利要求34的人源化免疫球蛋白或其抗原结合片段，包括至少一个替换的游标区构架残基，选自L4，L35，L47，L49，L66，L68，L69，H2，H28，H30，H48，H49，H67，H69和H80。
36.权利要求34的人源化免疫球蛋白或其抗原结合片段，包括至少一个替换的稀有构架残基，选自L1，L15，L83，L85，H40和H42。
37.权利要求34的人源化免疫球蛋白或其抗原结合片段，其中轻链包括3个来自3D6免疫球蛋白轻链可变区序列的互补决定区(CDRs1-3)。
38.权利要求28或35的人源化免疫球蛋白或其抗原结合片段，其中重链包括3个来自3D6免疫球蛋白重链可变区序列的互补决定区(CDRs 1-3)。
39.权利要求36-38任一项的人源化免疫球蛋白或其抗原结合片段，其中轻链包括3个来自3D6免疫球蛋白轻链可变区序列的互补决定区(CDRs 1-3)，而重链包括3个来自3D6免疫球蛋白重链可变区序列的互补决定区(CDRs 1-3)。
40.权利要求36-39任一项的人源化免疫球蛋白或其抗原结合片段，包括(i)至少一个替换的游标区构架残基，选自L4，L35，L47，L49，L66，L68，L69，H2，H28，H30，H48，H49，H67，H69和H80(Kabat规则)，和(ii)至少一个替换的稀有构架残基，选自L1，L15，L83，L85，H40和H42(Kabat规则)。
41.权利要求36-40任一项的人源化免疫球蛋白或其抗原结合片段，其中人受体免疫球蛋白轻链属于亚型кII(Kabat规则)。
42.权利要求36-41任一项的人源化免疫球蛋白或其抗原结合片段，其中人受体免疫球蛋白重链序列属于亚型III(Kabat规则)。
43.权利要求41的人源化免疫球蛋白或其抗原结合片段，其中人受体免疫球蛋白轻链序列选自Kabat ID 019230、Kabat ID 005131、Kabat ID 005058、Kabat ID 005057、Kabat ID 005059、Kabat ID U21040和Kabat ID U41645。
44.权利要求36-43任一项的人源化免疫球蛋白或其抗原结合片段，其中轻链的至少一个稀有构架残基用人可变轻链序列的普通氨基酸残基在该位置进行取代。
45.权利要求36-44任一项的人源化免疫球蛋白或其抗原结合片段，其中轻链的至少一个稀有人构架残基用来自种系可变轻链序列的相应氨基酸残基进行取代。
46.权利要求45的人源化免疫球蛋白或其抗原结合片段，其中种系可变轻链序列选自A1，A17，A18，A2和A19。
47.权利要求44-46任一项的人源化免疫球蛋白或其抗原结合片段，其中轻链的稀有构架残基选择基于轻链可变区亚组中的人轻链可变区序列在该位置的出现小于10％，而普通残基选择基于轻链可变区亚组中的人轻链可变区序列在该位置的出现超过50％。
48.权利要求36-47任一项的人源化免疫球蛋白或其抗原结合片段，其中人受体重链选自Kabat ID 045919、Kabat ID 000459、Kabat ID000553、Kabat ID 000386和Kabat ID M23691。
49.权利要求36-48任一项的人源化免疫球蛋白或其抗原结合片段，其中重链的至少一个稀有构架残基用人可变重链序列的普通氨基酸残基在该位置进行取代。
50.权利要求36-49任一项的人源化免疫球蛋白或其抗原结合片段，其中重链的至少一个稀有人构架残基用来自种系可变重链序列的相应氨基酸残基进行取代。
51.权利要求42的人源化免疫球蛋白或其抗原结合片段，其中种系可变重链序列选自VH3-48、VH3-23、VH3-7、VH3-21和VH3-11。
52.权利要求49-51任一项的人源化免疫球蛋白或其抗原结合片段，其中重链的稀有构架残基选择基于重链可变区亚组中的人重链可变区序列在该位置的出现小于10％，而普通残基选择基于重链可变区亚组中的人重链可变区序列在该位置的出现超过50％。
53.权利要求33-52任一项的人源化免疫球蛋白或其抗原结合片段，其中人源化免疫球蛋白或其抗原结合片段以至少108M-1的结合亲合力特异性结合到β淀粉样肽(Aβ)。
54.权利要求33-52任一项的人源化免疫球蛋白或其抗原结合片段，其中人源化免疫球蛋白或其抗原结合片段以至少109M-1的结合亲合力特异性结合到β淀粉样肽(Aβ)。
55.权利要求33-54任一项的人源化免疫球蛋白或其抗原结合片段，其结合至可溶性β淀粉样肽(Aβ)和聚集的Aβ。
56.权利要求55的人源化免疫球蛋白或其抗原结合片段，其中可溶性β淀粉样肽(Aβ)是非聚集的Aβ。
57.权利要求33-56任一项的人源化免疫球蛋白或抗原结合片段，其介导β淀粉样肽(Aβ)的吞噬作用。
58.权利要求33-57任一项的人源化免疫球蛋白或抗原结合片段，其在受试者中越过血脑屏障。
59.权利要求33-58任一项的人源化免疫球蛋白或抗原结合片段，其减少受试者的β淀粉样肽(Aβ)沉积和神经炎性营养不良。
60.权利要求33-59任一项的人源化免疫球蛋白或其抗原结合片段，其中所述片段选自Fab、Fab′、Fabc、Fv和F(ab′)2片段。
61.药物组合物，其含有权利要求33-60任一项的人源化免疫球蛋白或其抗原结合片段和药用载体。
62.试剂盒，其含有权利要求33-61任一项的人源化免疫球蛋白或其抗原结合片段以及使用说明书。
63.权利要求34-61任一项的人源化免疫球蛋白或其抗原结合片段用作药物。
64.权利要求34-61任一项的人源化免疫球蛋白或其抗原结合片段，通过给药有效剂量的所述免疫球蛋白或其抗原结合片段，用于预防或治疗患者的致淀粉样疾病。
65.权利要求34-61任一项的人源化免疫球蛋白或其抗原结合片段，通过给药有效剂量的所述免疫球蛋白或其抗原结合片段，用于预防或治疗患者的阿耳茨海默氏病。
66.权利要求64或65的人源化免疫球蛋白或其抗原结合片段，其中有效剂量为1mg/kg体重。
67.权利要求64或65的人源化免疫球蛋白或其抗原结合片段，其中有效剂量为10mg/kg体重。
68.权利要求34-61任一项的人源化免疫球蛋白或其抗原结合片段在制备用于预防或治疗患者的致淀粉样疾病的药物中的应用。
69.权利要求34-61任一项的人源化免疫球蛋白或其抗原结合片段在制备用于预防或治疗患者的阿耳茨海默氏病的药物中的应用。
70.一种分离的核酸分子，其编码权利要求1-17任一项的轻链。
71.一种分离的核酸分子，其编码权利要求18-32任一项的重链。
72.一种载体，其含有权利要求70或71的核酸分子。
73.一种宿主细胞，其含有权利要求70或71的核酸分子。
74.一种宿主细胞，其含有权利要求72的载体。
75.一种制备抗体或其片段的方法，其包括在使得抗体或片段能够产生的条件下培养权利要求73或74的宿主细胞并从宿主细胞或培养物中分离所述的抗体。
76.人源化免疫球蛋白或其抗原结合片段，其以至少107M-1的结合亲合力特异性结合到β淀粉样肽(Aβ)，其中人源化抗体包括(a)轻链，其包括的可变轻链区含有来自3D6免疫球蛋白轻链可变区序列SEQ ID NO2的互补决定区(CDRs)和至少一个选自L1，L2，L4，L15，L35，L36，L38，L44，L46，L47，L48，L49，L64，L66，L68，L69，L71，L83，L85，L87和L98(Kabat规则)的可变轻链构架残基，其中可变轻链区的其余部分来自人受体免疫球蛋白轻链，和(b)重链，其包括的可变重链区具有SEQ ID NO8或SEQ IDNO12中第1-119位残基所述的序列。
77.人源化免疫球蛋白或其抗原结合片段，其以至少107M-1的结合亲合力特异性结合到β淀粉样肽(Aβ)，其中人源化抗体包括(a)重链，其包括的可变重链区含有来自3D6免疫球蛋白重链可变区序列SEQ ID NO4的互补决定区(CDRs)和至少一个选自H2，H24，H26，H27，H28，H29，H30，H37，H39，H40，H42，H45，H47，H48，H49，H67，H69，H71，H80，H91，H93，H94和H103(Kabat规则)的可变重链构架残基，其中可变重链区的其余部分来自人受体免疫球蛋白重链，和(b)轻链，其包括的可变轻链区具有SEQ ID NO5或SEQ IDNO11中第1-112位残基所述的序列。
78.权利要求76的人源化免疫球蛋白，其中至少3个可变轻链构架残基选自L1，L2，L4，L15，L35，L36，L38，L44，L46，L47，L48，L49，L64，L66，L68，L69，L71，L83，L85，L87和L98(Kabat规则)
79.权利要求77的人源化免疫球蛋白，其中至少3个可变重链构架残基选自H2，H24，H26，H27，H28，H29，H30，H37，H39，H40，H42，H45，H47，H48，H49，H67，H69，H71，H80，H91，H93，H94和H103(Kabat规则)。
80.人源化免疫球蛋白或其抗原结合片段，其以至少107M-1的结合亲合力特异性结合到β淀粉样肽(Aβ)，其中人源化抗体包括(i)轻链，其包括的可变轻链区含有(a)来自3D6免疫球蛋白轻链可变区序列SEQ ID NO2的互补决定区(CDRs)；(b)至少一个选自SEQ ID NO2的L2，L48，L64和L71(Kabat规则)的可变轻链规范的构架残基；和(c)至少一个选自SEQ ID NO2的L36，L38，L44，L46，L87和L98(Kabat规则)的可变轻链链间包装构架残基；以及任选(d)至少一个选自SEQ ID NO2的L4，L35，L47，L49，L66，L68和L69(Kabat规则)的可变轻链游标区构架残基，或至少一个选自SEQ ID NO2的L1，L15，L83和L85(Kabat规则)的可变轻链稀有构架残基；其中可变轻链区的其余部分来自人受体免疫球蛋白轻链；以及(ii)重链，其包括的可变重链区具有SEQ ID NO8或SEQ IDNO12中第1-119位残基所述的序列。
81.人源化免疫球蛋白或其抗原结合片段，其以至少107M-1的结合亲合力特异性结合到β淀粉样肽(Aβ)，其中人源化抗体包括(i)重链，其包括的可变重链区含有(a)来自3D6免疫球蛋白重链可变区序列SEQ ID NO4的互补决定区(CDRs)；(b)至少一个选自SEQ ID NO4的H24，H26，H27，H29，H71和H94(Kabat规则)的可变重链规范的构架残基；(c)至少一个选自SEQ ID NO4的H37，H39，H45，H47，H91，H93和H103(Kabat规则)的可变重链链间包装构架残基；以及(d)至少一个选自SEQ ID NO4的H2，H28，H30，H48，H49，H67，H69和H80(Kabat规则)的可变重链游标区构架残基，或至少一个选自SEQ ID NO4的H40和H42(Kabat规则)的可变重链稀有构架残基；其中可变重链区的其余部分来自人受体免疫球蛋白重链；以及(ii)轻链，其包括的可变轻链区具有SEQ ID NO5或SEQ IDNO11中第1-112位残基所述的序列。
82.权利要求80的人源化免疫球蛋白或其抗原结合片段，其中轻链包括至少一个替换的游标区构架残基，选自L4，L35，L47，L49，L66，L68和L69(Kabat规则)。
83.权利要求80的人源化免疫球蛋白或其抗原结合片段，其中轻链包括至少一个替换的稀有构架残基，选自L1，L15，L83和L85(Kabat规则)。
84.权利要求81的人源化免疫球蛋白或其抗原结合片段，其中重链包括至少一个替换的游标区构架残基，选自H2，H28，H30，H48，H49，H67，H69和H80(Kabat规则)。
85.权利要求81的人源化免疫球蛋白或其抗原结合片段，其中重链包括至少一个替换的稀有构架残基，选自H40和H42(Kabat规则)。
86.人源化免疫球蛋白或其抗原结合片段，其以至少107M-1的结合亲合力特异性结合到β淀粉样肽(Aβ)，其中人源化抗体包括(a)轻链，其包括的可变轻链区含有来自3D6免疫球蛋白轻链可变区序列SEQ ID NO2的互补决定区(CDRs)和至少一个选自L1，L2，L36和L46(Kabat规则)的可变轻链构架残基，其中可变构架区的其余部分来自人受体免疫球蛋白轻链；以及(b)重链，其包括的可变重链区具有SEQ ID NO8或SEQ IDNO12中第1-119位残基所述的序列。
87.人源化免疫球蛋白或其抗原结合片段，其以至少107M-1的结合亲合力特异性结合到β淀粉样肽(Aβ)，其中人源化抗体包括(a)重链，其包括的可变重链区含有来自3D6免疫球蛋白重链可变区序列SEQ ID NO4的互补决定区(CDRs)和至少一个选自H49，H93和H94(Kabat规则)的可变重链构架残基，其中可变构架区的其余部分来自人受体免疫球蛋白重链；以及(b)轻链，其包括的可变轻链区具有SEQ ID NO5或SEQ IDNO11中第1-112位残基所述的序列。
88.人源化免疫球蛋白或其抗原结合片段，其以至少107M-1的结合亲合力特异性结合到β淀粉样肽(Aβ)，其中人源化抗体包括(a)轻链，其包括的可变轻链区含有来自3D6免疫球蛋白轻链可变区序列SEQ ID NO2的互补决定区(CDRs)和可变构架残基L2，L36和L46(Kabat规则)，其中可变轻链区的其余部分来自人受体免疫球蛋白轻链；以及(b)重链，其包括的可变重链区具有SEQ ID NO8或SEQ IDNO12中第1-119位残基所述的序列。
89.人源化免疫球蛋白或其抗原结合片段，其以至少107M-1的结合亲合力特异性结合到β淀粉样肽(Aβ)，其中人源化抗体包括(a)重链，其包括的可变重链区含有来自3D6免疫球蛋白重链可变区序列SEQ ID NO4的互补决定区(CDRs)和可变构架残基H49，H93和H94(Kabat规则)，其中可变重链区的其余部分来自人受体免疫球蛋白重链；以及(b)轻链，其包括的可变轻链区具有SEQ ID NO5或SEQ IDNO11中第1-112位残基所述的序列。
90.人源化免疫球蛋白或其抗原结合片段，其以至少107M-1的结合亲合力特异性结合到β淀粉样肽(Aβ)，其中人源化抗体包括(a)轻链，其包括的可变轻链区含有来自3D6免疫球蛋白轻链可变区序列SEQ ID NO2的互补决定区(CDRs)和可变构架残基L1，L2，L36和L46(Kabat规则)，其中可变轻链区的其余部分来自人受体免疫球蛋白轻链；以及(b)重链，其包括的可变重链区具有SEQ ID NO8或SEQ IDNO12中第1-119位残基所述的序列。
91.权利要求76，78，80，82，83，86，88和90任一项的免疫球蛋白，其中人受体轻链属于亚型кII(Kabat规则)。
92.权利要求77，79，81，84，85，87和89任一项的免疫球蛋白，其中人受体重链属于亚型III(Kabat规则)。
93.权利要求89的免疫球蛋白，其中人受体轻链选自Kabat ID019230、Kabat ID 005131、Kabat ID 005058、Kabat ID 005057、Kabat ID005059、Kabat ID U21040和Kabat ID U41645。
94.权利要求89的免疫球蛋白，其中人受体轻链是Kabat ID019230。
95.权利要求90的免疫球蛋白，其中人受体重链选自Kabat ID045919、Kabat ID 000459、Kabat ID 000553、Kabat ID 000386和KabatID M23691。
96.权利要求90的免疫球蛋白，其中人受体重链是Kabat ID045919。
97.权利要求76，78，82，83，86，88，90，91，93和94任一项的免疫球蛋白，其中至少一个稀有人轻链构架残基用人可变轻链序列的普通氨基酸残基在该位置进行取代。
98.权利要求76，78，82，83，86，88，90，91，93和94任一项的免疫球蛋白，其中至少一个稀有人轻链构架残基用来自种系可变轻链序列的相应氨基酸残基进行取代。
99.权利要求98的免疫球蛋白，其中种系可变轻链序列选自A1、A17、A18、A2和A19。
100.权利要求77，79，81，84，85，87，89，92，95和96任一项的免疫球蛋白，其中至少一个稀有人重链构架残基用人可变重链序列的普通氨基酸残基在该位置进行取代。
101.权利要求77，79，81，84，85，87，89，92，95和96任一项的免疫球蛋白，其中至少一个稀有人重链构架残基用来自种系可变重链序列的相应氨基酸残基进行取代。
102.权利要求101的免疫球蛋白，其中种系可变重链序列选自VH3-48、VH3-23、VH3-7、VH3-21和VH3-11。
103.权利要求101的免疫球蛋白，其中种系可变重链序列是VH3-23。
104.权利要求97的免疫球蛋白，其中稀有构架残基选择基于轻链可变区亚组中的人轻链可变区序列在该位置的出现小于10％，而普通残基选择基于轻链可变区亚组中的人轻链可变区序列在该位置的出现超过50％。
105.权利要求100的免疫球蛋白，其中稀有构架残基选择基于重链可变区亚组中的人重链可变区序列在该位置的出现小于10％，而普通残基选择基于重链可变区亚组中的人重链可变区序列在该位置的出现超过50％。
106.权利要求76，78，82，83，86，88，90，91，93和94任一项的人源化免疫球蛋白，其中人轻链可变区构架来自к轻链可变区。
107.权利要求77，79，81，84，85，87，89，92，95和96任一项的人源化免疫球蛋白，其中人重链可变区构架来自IgG1重链可变区。
108.权利要求76-90任一项的人源化免疫球蛋白，其中恒定区来自人IgG1。
109.权利要求76-90任一项的免疫球蛋白，其中恒定区来自人IgG4。
110.权利要求76-90的免疫球蛋白或其抗原结合片段，其以至少108M-1的结合亲合力特异性结合到β淀粉样肽(Aβ)。
11 1.权利要求110的免疫球蛋白或其抗原结合片段，其以至少109M-1的结合亲合力特异性结合到β淀粉样肽(Aβ)。
112.权利要求76-90任一项的免疫球蛋白或其抗原结合片段，其中重链同种型为γ1。
113.权利要求76-90任一项的免疫球蛋白或其抗原结合片段，其结合至可溶性β淀粉样肽(Aβ)和聚集的Aβ。
114.权利要求113的免疫球蛋白，其中可溶性β淀粉样肽(Aβ)是非聚集的Aβ。
115.权利要求76-90任一项的免疫球蛋白或抗原结合片段，其介导β淀粉样肽(Aβ)的吞噬作用。
116.权利要求76-90任一项的免疫球蛋白或抗原结合片段，其在受试者中越过血脑屏障。
117.权利要求76-90任一项的免疫球蛋白或抗原结合片段，其减少受试者的β淀粉样肽(Aβ)沉积和神经炎性营养不良。
118.权利要求76，80，86，88和90任一项的人源化免疫球蛋白，其中可变重链区如SEQ ID NO8中第1-119位残基所述。
119.权利要求76，80，86，88和90任一项的人源化免疫球蛋白，其中可变重链区如SEQ ID NO12中第1-119位残基所述。
120.权利要求77，81，87和89任一项的人源化免疫球蛋白，其中可变轻链区如SEQ ID NO5中第1-112位残基所述。
121.权利要求77，81，87和89任一项的人源化免疫球蛋白，其中可变轻链区如SEQ ID NO11中第1-112位残基所述。
122.以至少107M-1的结合亲合力特异性结合到β淀粉样肽(Aβ)的免疫球蛋白，或其抗原结合片段，包括如SEQ ID NO8中第1-119位残基所述的可变重链区和如SEQ ID NO11中第1-112位残基所述的可变轻链区。
123.以至少107M-1的结合亲合力特异性结合到β淀粉样肽(Aβ)的免疫球蛋白，或其抗原结合片段，包括如SEQ ID NO12中第1-119位残基所述的可变重链区和如SEQ ID NO5中第1-112位残基所述的可变轻链区。
124.以至少107M-1的结合亲合力特异性结合到β淀粉样肽(Aβ)的免疫球蛋白，包括如SEQ ID NO8中第1-119位残基所述的可变重链区，如SEQ ID NO11中第1-112位残基所述的可变轻链区，和来自人IgG1的恒定区。
125.以至少107M-1的结合亲合力特异性结合到β淀粉样肽(Aβ)的免疫球蛋白，包括如SEQ ID NO12中第1-119位残基所述的可变重链区，如SEQ ID NO5第1-112位残基所述的可变轻链区，和来自人IgG1的恒定区。
126.分离的多肽，其包括的氨基酸序列与SEQ ID NO5所示氨基酸序列中的第1-112位残基具有至少95％的序列同一性。
127.分离的多肽，其包括的氨基酸序列与SEQ ID NO8所示氨基酸序列中的第1-119位残基具有至少99％的序列同一性。
128.分离的多肽，其包括的氨基酸序列与SEQ ID NO11所示氨基酸序列中的第1-112位残基具有至少95％的序列同一性。
129.分离的多肽，其包括的氨基酸序列与SEQ ID NO12所示氨基酸序列中的第1-112位残基具有至少99％的序列同一性。
130.分离的多肽，其含有SEQ ID NO11所示氨基酸序列中的第1-112位残基。
131.分离的多肽，其含有SEQ ID NO12所示氨基酸序列中的第1-119位残基。
132.一种多肽变体，其含有SEQ ID NO5或SEQ ID NO11所示氨基酸序列中的第1-112位残基，所述变体包含至少一个保守的氨基酸取代，其中变体保留直接特异性结合于β淀粉样肽(Aβ)的能力，具有至少107M-1的结合亲合力。
133.一种多肽变体，其含有SEQ ID NO8或SEQ ID NO12所示氨基酸序列中的第1-119位残基，所述变体包含至少一个保守的氨基酸取代，其中变体保留特异性结合于β淀粉样肽(Aβ)的能力，具有至少107M-1的结合亲合力。
134.一种分离的多肽，其含有SEQ ID NO8氨基酸序列中的第1-112位残基，或含有SEQ ID NO5氨基酸序列中的第1-119位残基。
135.药物组合物，其包括权利要求76-125任一项的人源化免疫球蛋白或其抗原结合片段和药用载体。
136.试剂盒，其包括权利要求76-125任一项的免疫球蛋白或其抗原结合片段，以及使用说明书。
全文摘要
本发明提供了改进的药剂和方法，用于治疗与患者脑中的Aβ淀粉样沉积物相关的疾病。优选的药剂包括人源化抗体。
文档编号A61K39/00GK101081868SQ20061014328
公开日2007年12月5日 申请日期2001年12月6日 优先权日2000年12月6日
发明者古里奇·巴锡, 乔斯·萨尔达尼亚, 达勒·B·申克 申请人:神经实验室有限公司, 惠氏公司