通过口粘膜施用变态反应疫苗预防性治疗变态反应的方法

专利名称：通过口粘膜施用变态反应疫苗预防性治疗变态反应的方法
技术领域：
本发明涉及一种预防性治疗对象中对变应原的变态反应的方法。
背景技术：
变态反应是适应西方生活方式国家中的重要健康问题。而且，变 应性疾病的患病率在这些国家日益增加。尽管通常不认为变态反应是
威胁生命的疾病，但哮喘每年导致相当大数量的死亡。青少年中约30% 的异常患病率导致生活质量、工作日和金钱的重大损失，并使其被归 类为西方世界的主要健康问题。
变态反应是一种复杂的疾病。许多因素促成了致敏事件。这些中 有由尚不充分理解的几个基因之间的相互作用限定的个体易感性。另 一个重要的因素是变应原暴露超过特定阈值。在致敏过程中，几个环 境因素可能是重要的，包括污染，孩童时期的感染，寄生虫感染，肠 微生物等。 一旦个体致敏并建立了变应性免疫应答，只需微量变应原 的存在就能有效地转变成症状。
变应性疾病的自然病程通常伴随在两个水平上的加重恶化。首先， 症状和疾病严重性的进展，以及疾病进展，例如从花粉热变成哮喘。 其次，侵犯变应原的播散时常发生，导致变应性多重反应性。'隄性炎 症导致粘膜防御机制的全面削弱，导致非特异性的刺激并最终^C坏粘
膜组织。嬰儿可能主要对食物即奶变得敏感，导致湿疹或胃肠道病症； 然而，他们常常自发地不再有这些症状。这些嬰儿在他们日后的生命 中处于发生吸入变态反应的风险中。
在我们呼吸的空气中特定大小的最普遍颗粒中发现了最重要的变 应原来源。这些来源非常普遍并包括草花粉和屋尘螨排泄物颗粒，它 们总共引起了全部变态反应的约50%。全球重要的还有动物毛发皮屑，
即猫和狗的毛发皮屑，其他花粉，如艾蒿花粉，和微真菌，如链格孢 属。以地域性为基础，还有其他花粉可能是占优势的，如北欧和中欧 的桦树花粉，美国东部和中部的豚草，和日本的日本杉花粉。昆虫即
蜜蜂和胡蜂毒液以及食物各自占全部变态反应的约2%。
变态反应，即I型超敏反应，由对外来非致病物质不适当的免疫 反应引起。变态反应的重要临床表现包括哞喘，花粉热，湿渗和胃肠 道病症。变态反应是特异性的，理解为特定个体对特定变应原敏感，
应。变态反应表型的特征在于靶器官粘膜的明显炎症和循环中以及肥 大细胞和嗜碱细胞表面上IgE类变应原特异性抗体的存在。
当抗体结合肥大细胞和嗜碱细胞表面上的高亲和性IgE特异性受 体时，外来变应原和变应原特异性IgE抗体的反应启动变应性性攻击。 肥大细胞和嗜碱细胞含有预先形成的介质，即組胺、类胰蛋白酶和其 他物质，它们在两个或多个受体结合的IgE抗体交联时得到释放。IgE 抗体通过同时结合一个变应原分子而交联。肥大细胞表面上受体结合 的IgE的交联还导致信号分子的释放，这些信号分子引起嗜曙红细胞、 变应原特异性的T细胞和其他类型的细胞吸引至变应性应答的位点。 这些细胞与变应原、IgE和效应细胞相互作用，导致遭遇变应原后 12-24小时发生的症状的重新闪现(晚期反应)。
变应性疾病控制包括诊断和治疗，包括预防性治疗。变态反应的 诊断涉及变应原特异性IgE的证实和变应原来源的鉴定。许多情况中， 仔细的既往病史可足以用于变态反应的诊断和对侵犯变应原来源物质 的鉴定。然而，常见的是，通过客观测量来支持诊断，如皮肤单刺试 验，验血或激发试验。
治疗选择落入三个主要的种类。第一种机会是避免变应原或减少 暴露。尽管避免变应原是显而易见的，例如在食物变应原的情况中， 但这可能是困难的或昂贵的，如对于屋尘螨变应原，或可能是不可能 的，如对于花粉变应原。笫二种和最广泛使用的治疗选择是开处经典 症状药物，如抗组胺药和类固醇。症状药物是安全而有效的；然而，
它们不改变疾病的自然病因，也不控制疾病播散。第三种治疗可替换 方案是特异性的变态反应疫苗接种，其在大多数情况中减轻或緩解了 由问题变应原引起的变态反应症状。
常规特异性变态反应疫苗接种是对变应性疾病的病因治疗。其干 预基础免疫学机制，导致患者免疫状态持久改善。因此，与症状药物 治疗相比，特异性变态反应疫苗接种的保护性效果延长超过治疗阶段。 一些接受治疗的患者得以治愈，此外，大部分患者会有疾病严重程度 和所经历症状的緩解，或至少疾病恶化的停止。因此，特异性变态反 应疫苗接种具有预防性效果，降低了花粉热发展成哮喘的风险，并降 低了产生新敏感性的风险。
成功的变态反应疫苗接种潜在的免疫学机制具体不得而知。特异 性免疫应答，如对抗特定病原体抗体的产生，称为适应性免疫应答。 这种应答可区别于先天性免疫应答，后者是针对病原体的非特异性反 应。变态反应疫苗旨在致力于适应性免疫应答，其包括具有抗原特异
性的细胞和分子，如T细胞和产生抗体的B细胞。没有相应特异性T 细胞的帮助，B细胞不能成熟为产生抗体的细胞。参与变应性免疫应 答刺激的T细胞主要是Th2型。已经提出Thl和Th2细胞之间新平衡
的建立对于特异性变态反应疫苗接种的免疫学机制是有益的和重要 的。这是由Th2细胞减少，Th2至Thl细胞的转换，或是Thl细胞上 调而引起的是有争议的。最近，已经提出调节T-细胞对于变态反应疫 苗接种的机制是重要的。根据该模式，调节T细胞，即Th3或Trl细 胞，下调相应抗原特异性的Thl和Th2细胞。尽管这些不明确性，通 常认为活性疫苗必须具有刺激变应原特异性T细胞优选TH1细胞的能 力。
特异性变态反应疫苗接种(SAV)，先前称为特异性免疫治疗或脱 敏作用，自从本世纪初就已经被用于治疗l型IgE介导的变应性疾病。
通过SAV获得的总体益处是a )减轻变态反应症状和减少药物消 耗，b)提高眼睛、鼻子和肺对变应原的耐受性，和c)减轻皮肤反应 性(早期和晚期反应)。
在SAV获得的改善背后的基本机制还不清楚，但是从过去数十年 中所进行的众多SAV研究中可以提炼出多个普遍的特征l)在治疗期 间总IgE的量没有变化，2)在剂量增加期间变应原特异性IgE的量短 暂增加，然后其回落到最初(治疗前)的水平，3)IgE的表位特异性 和亲和力保持无变化，4)变应原特异性IgG，特别是IgG4，在SAV 期间急剧增加，5)明显触发了新的Th0/1/Reg应答，以及6)Th2应 答似乎没有变化。在SAV诱导的作用和特异性IgG的出现之间没有关 联。
SAV诱导了新的免疫应答，其在治疗期间成熟(募集了 ThO/1 T 细胞，触发了变应原特异性IgX (X可以是Al、 A2、 Gl、 G2、 G3、 G4、 M或D))。因为新的抗体应答IgX的亲和力(或量/亲和力)已经成 熟，IgX可以与IgE有效地竟争变应原，抑制以肥大细胞和嗜碱性粒 细胞表面上受体结合的IgE的交联为特征的"正常的"基于Th2的变 应性应答。因此，可以逐渐地减轻临床症状。
尽管其功效，特异性变态反应疫苗接种没有广泛使用，主要是因 为两个原因。 一个原因是与传统接种疫苗程序相关的不方便性，包括 重复接种，特别是在几个月内重复注射。另一个原因更重要，是变应 性副反应的风险。对抗感染因子的普通接种使用单个或几个高剂量免 疫来有效进行。然而，该策略不能用于变态反应疫苗接种，因为病理
性免疫应答已在进行中。
因此使用在延长的时间段内应用的多次皮下免疫来进行常规特异 性变态反应疫苗接种。该过程分成两个阶段，上调给药剂量和维持阶 段。在上调给药剂量阶段中，应用提高的剂量，通常历经16周的时间， 开始于微量。当达到推荐的维持剂量时，对于维持阶段应用该剂量， 通常每六周进行注射。每次注射后，由于过敏性副反应的风险，患者 必须处于医疗监护之下30分钟，尽管其原则上极为罕见但仍可危及生 命。此外，必须将诊所装备起来以支持紧急治疗。毫无疑问的是基于 不同给药途径的疫苗将消除或减少目前基于皮下疫苗固有的过敏性副 反应的风险，以及将促进更广泛的使用，甚至可能能在家里自己接种
疫苗。
对于改进用于特异性变态反应疫苗接种的疫苗的尝试已经进行了
30多年，其包括多种多样的途径。 一些途径已经通过修饰IgE反应性 立足于变应原本身。
Holt等("Suppression of IgE responses following inhalation of antigen" ， Immunology Today, vol. 8， No. 1， 1987 )提及了 以下事实，即作为暴露于吸入和口鼻滴入的变应原的应答，在上呼吸 道中诱导出了耐受性，这与通过食物性抗原在胃肠道中诱导出的耐受 性相应。
Holt等("Sublingual allergen administration. I. Selective suppression of IgE production in rats by high allergen doses"， Clinical Allergy, 1988， Volume 18， pages 229-234 )涉及给首次 用于试验的幼稚大鼠舌下施用变应原(卵白蛋白)连续7天，之后在 末次舌下剂量后5天用卵白蛋白进行肠外攻击。结果显示选择性地抑 制了特异于卵白蛋白的IgE。推测治疗机制涉及刺激变应原特异性抑 制细胞。还提到所提出的治疗涉及首次用于试验的幼稚动物，并且应 与舌下脱敏过程区分开。
W0 95/17208公开了一种预防变应性疾病的方法，包括给先前未 致敏的对象施用变应原，变应原的剂量有效诱导建立稳定的变应原特 异性T辅助1样记忆淋巴细胞群，其能够抑制变应原特异性T辅助2 样淋巴细胞的活性。待治疗的对象优选地是3个月到7岁之间。作为 变应原，提到了例如房尘螨、草花粉和树花粉。可以通过口服、鼻内、 口鼻、直肠、皮内、肌肉内和皮下途径施用变应原。
主页爾.immunetolerance. org ( 2004年10月11曰)公开了例
如对没有对吸入物致敏的儿童的预防性治疗的计划临床研究，其中给 儿童施用含有变应原(房尘螨、梯牧草和猫)的舌下滴液，并且其中 随诊这些儿童是否发生变态反应持续三年。该研究所募集的儿童具有 特应性皮炎或食物变态反应病史，且他们的生物学母亲或父亲或一个 同胞具有特异性变态反应的病史。
本发明的目的是提供一种对个体(特别是儿童)的预防性治疗的 改进方法。
发明概述
本发明实现了这个目的，所述发明涉及一种预防性治疗对象中对
变应原的变态反应的方法，包括
a )经口粘膜(oromucosal)途径给对象施用含有该变应原作为活 性物质的变态反应疫苗；
b) 其中待治疗的对象是未致敏的，含义即没有表现出特异于该变 应原的IgE应答；
c) 其中待治疗的对象没有任何变态反应的临床症状；和
d) 其中预防性治疗的目标是预防或减轻与该变应原相关的变态反 应并发的临床症状。
本发明基于惊人的发现，即其中经口粘膜途径实施施用的预防性 治疗的效果远比其中经其他粘膜途径实施施用的预防性治疗更为有 效。
相信预防变态反应所涉及的机制是诱导口耐受性，相应于通过食 物抗原在胃肠道中诱导的耐受性。还相信当在致敏之前实施预防性治 疗是最为有效的，即在免疫系统应答开始朝向变应性Th2细胞应答转 换之前。换句话说，治疗尽可能年幼的儿童通常是有利的，即儿童年 龄越小，其尚未暴露于变应原的机会就越高。也相信因为这种早期预 防性治疗的有效性，与对已出现临床症状的成人的特异性变态反应疫 苗接种相比较，以更小的剂量、更少的施用次数和/和更短的治疗期就 可能实现治疗作用。因为这种预防性治疗方案的温和性，其适用于对 所有儿童或大群选定儿童的普遍疫苗接种程序。
本发明还涉及变应原用于生产用于预防性治疗对象的变态反应的 疫苗的用途，
a) 其中该疫苗适合于经口粘膜途径施用；
b) 其中待治疗的对象是未致敏的，含义即没有表现出特异于该
变应原的IgE应答；
c)其中待治疗的对象没有任何变态反应的临床症状；和
d )其中预防性治疗的目标是预防或减轻与该变应原相关的变态
反应并发的临床症状。
附图简述


图1A-C显示了经SLIT治疗6周的小鼠体内的Phl p特异性总IgG、 IgGl和IgG2a的血清水平。
图1D-F显示了在接受相同的SLIT施用以及随后一次Phl p提取 物(5kSQ/明矾)的i.p.免疫接种的小鼠体内的Phl p特异性总IgG、 IgGl和IgG2a的血清水平。
图2A显示了经SLIT治疗6周的小鼠体内的Phl p特异性IgE的 血清水平。
图2B显示了经SLIT治疗以及随后一次Phl p提取物i.p.免疫接 种的小鼠体内的Phl p特异性IgE的血清水平。
图3显示了经SLIT治疗的小鼠(阴影线)和经緩沖液处理的对照 小鼠(实线)的血清中的Phl p特异性IgE水平。
图4显示了经SLIT治疗的小鼠和经緩沖液处理的对照小鼠的BAL 中的Phl p特异性IgA水平。
图5显示了来自经Phl p SLIT治疗的小鼠的脾细胞的增殖。
图6A和6B分别显示了来自经Phl p SLIT治疗以及随后接受1
次免疫接种的小鼠的脾细胞的增殖和细胞因子产生。
图7A和7B分别显示来自经Phl p SLIT治疗3周和6周以及随后
接受1次免疫接种的小鼠的脾细胞的增殖。
图8显示了来自经不同剂量的Phl p SLIT治疗以及随后接受1 次免疫接种的小鼠的脾细胞的增殖。
发明详述 变应原
本发明的制剂中的变应原可以是已经报道的重复暴露于个体时能
诱导变应性即IgE介导的反应的任何天然存在的蛋白质。天然存在的 变应原的实例包括花粉变应原(树-，草本植物(herb)-，杂草-和草 -花粉变应原)，昆虫变应原(吸入物，唾液和毒液变应原，例如螨变 应原，蟑螂和蠓变应原，hymenopthera毒液变应原)，动物毛发和皮 屑变应原(来自例如狗，猫，马，大鼠，小鼠等)和食物变应原。来 自树，草和草本植物的重要花粉变应原是来自分类学目山毛榉目， Oleales，松目和悬铃木料，包括，特别是，桦树(桦属)，桤木(桤 木属)，榛树(榛属)，鵝耳枥(鹅耳枥属)和橄榄树(齐墩果属)， 雪松(柳杉属和桧属)，悬铃木(悬铃木属)，Poales目，包括特别 是黑麦草属，梯牧草属，早熟禾属，狗牙根属，Dactylis，绒毛草属， Phalaris，黑麦属和高梁属的草，Asterales和Urticales目，包括 特别是豚草属，蒿属和Parietaria属的草本植物。其他重要的吸入变 应原是来自表皮螨属和Euroglyphus属的屋尘螨，存储螨，例如 Lepidoglyphys,甜食螨属和食酪螨属，来自蟑螂、蠓和跳蚤的那些， 例如小蠊属，大蠊属，摇蚊和Ctenocepphalides，和来自哺乳动物如 猫、狗和马的那些，毒液变应原包括源自有针剌的昆虫或叮咬昆虫， 如来自分类学膜翅目的那些，包括蜜蜂(总科蜜蜂科)，黄峰(总科 胡蜂科)和蚂蚁(总科蚁总科) 来自真菌的重要吸入变应原特别是 源自链格孢属和枝孢菌属的这些。
在本发明的特定实施方式中，变应原是Betvl， Alngl， Cora l和Car b 1， Que a 1， Cry j 1， Cry j 2， Cup a 1， Cup s 1， Jun a 1, Jun a 2， jun a 3， Ole e 1， Lig v 1， Pla 1 1， Pla a 2, Amb a 1， Amb a 2， Amb t 5， Art v 1, Art v 2, Par j 1， Par j 2， Par j 3， Sal k 1， Ave e 1， Cyn d 1， Cyn d 7, Dac g 1， Fes p 1， Hoi 11， Ul p 1和5， Pha a 1, Pas n 1， Phi p 1， Phi p 5， Phi p 6， Poa p 1, Poa p 5， Sec c 1, Sec c 5, Sor h 1, Der f 1， Der f 2， Der p 1， Der p 2, Der p 7, Der m 1， Eur m 2， Gly d 1, Up d 2， Bio t 1， Tyr p 2, Bla g 1， Bla g 2, Per a 1， Fel d 1，Can f 1, Can f 2， Bos d 2， Equ c 1, Equ c 2， Equ c 3， Mus m 1， Rat n 1, Apis m 1， Api m 2， Ves v 1, Ves v 2, Ves v 5， Dol m 1， Dil m 2， Dol m 5, Pol a 1, Pol a 2， Pol a 5， Sol i 1， Sol i 2， Sol i 3和So1 i 4， Alt a 1， Cla h 1， Asp f 1， Bos d 4， Mai d 1， Gly m 1， Gly m 2, Gly m 3， Ara h 1， Ara h 2， Ara h 3， Ara h 4， Ara h 5或这些中任何变应原分子育种的改组杂交体。
在本发明的优选的实施方式中，变应原选自由树花粉变应原、草 花粉变应原、尘螨变应原、草本植物(herb)变应原和动物变应原组 成的组。优选地，变应原选自由草花粉变应原、尘螨变应原、豚草变 应原、雪松花粉、猫变应原和白桦变应原组成的组。
在本发明的另一个实施方式中，制剂包括至少两种不同类型的变 应原，所述变应原源自相同的变应原来源或者源自不同的变应原来源， 例如分别来自不同的螨和草物种的草组1和草组5变应原或螨组1和 组2变应原，杂草抗原例如短或巨豚草变应原，不同的真菌变应原例 如链格孢菌和枝孢属，树变应原例如白桦、榛、鵝耳枥、橡树和桤木 属变应原，食物变应原例如花生、大豆和牛奶变应原。
掺入制剂中的变应原可以是提取物、纯化变应原、修饰变应原、 重组变应原或重组变应原突变体的形式。变应原提取物可以天然地含 有相同变应原的一种或多种同种型，而重组变应原通常只表示变应原 的一种同种型。在优选的实施方式中，变应原是提取物形式。在另一 个实施方式中，变应原是重组变应原。在仍优选的实施方式中，变应 原是天然存在的低IgE结合性突变体或重组低IgE结合性突变体。
变应原可以以等摩尔量存在，或者存在的变应原的比例可以不同， 优选地最大到1:20。
在本发明的另一个实施方式中，低IgE结合性变应原是W0 99/47680、 W0 02/40676或W0 03/096869 A2所述的变应原。
预防性治疗
还没有完全探明或了解本发明所实施的预防性治疗的机制。
推测经粘膜进行粘膜施用疫苗是优选的，因为其天然暴露于抗原 剂。因此，对于空气传播的粘膜抗原剂的变态反应，优选地利用经呼 吸系统的施用，优选地是口粘膜施用。
口粘膜施用包括口腔和舌下施用。利用任一可获得的口粘膜施用 制剂可以实施口粘膜施用，包括喷雾剂、气雾剂、混合物、悬浮液、 分散剂、乳剂、凝胶、糊剂、糖浆、乳骨、软骨、溶液、快速分散剂 型、滴剂和锭剂。
在本发明的一个优选的实施方式中，使用舌下免疫治疗(SLIT)， 其中快速分散剂型、滴剂和锭剂是优选的制剂。
快速分散剂型的实例是在US-A-5, 648， 093、 WO 00/51568、 WO 02/13858、 W099/21579、 WO 00/44351、 US-A-4, 371， 516和EP-278 877、 以及以ALK-Abell 6 A/S为转让人名提交的待审的DK PA 2003 00279 和DK PA 2003 00318中所述的那些。优选的快速分散剂型是经冷冻干 燥生成的那些。优选的基质形成剂是鱼明胶和变性淀粉。
在本发明中可以使用经典的渐增剂量脱敏法，其中快速分散固体 剂型形式的变应原的剂量被增加到某个最大值。剂型的单位剂量的优 选效力是从150到1000000 SQ-u/剂型，更优选地效力是从500到 500000 SQ-u/剂型，以及更优选地效力是从1000到250000 SQ-u/剂 型，甚至更优选地是从1500到125000 SQ-u/剂型，最优选地是从UOO 到75000 SQ-u/剂型。
在本发明的另一个实施方式中，剂型是重复的单剂量，优选地是 在1500到75000 SQ-u/剂型的范围之内。
在本发明的一个实施方式中，对象接受疫苗接种方案，包括每曰 施用疫苗。在本发明的另一个实施方式中，疫苗接种方案包括每两天、 每三天或每四天施用疫苗。例如，疫苗接种方案包括施用疫苗超过4 周时间，优选地超过8周，更优选地超过12周，更优选地超过16周， 更优选地超过20周，更优选地超过24周，更优选地超过30周以及最 优选地超过36周。
施用期可以是一个连续期。或者，施用期可以是被一个或多个非
施用期中断的不连续期。优选地，非施用的(总)时间要比施用的(总) 时间短。
在本发明的另一个实施方式中，每日给对象施用疫苗1次。或者， 每日给对象施用疫苗两次。疫苗可以是单剂量疫苗。
待治疗的对象是需要预防性治疗的哺乳动物，优选地是选自由人、 猫和狗组成的组中的哺乳动物，特别是人。
致敏作用
待治疗的对象是未致敏的，含义即没有表现出特异于所施用的变
应原的IgE应答。在本发明中，表述"没有表现出特异于该变应原的 IgE应答"意思是在常规免疫测定中检测不到变应原特异性IgE抗体 的水平。利用任何常规免疫测定，例如在WO"/ll 34和W0 99/617642 中所述的那些，以及在本发明的实施例1中所述的IgE免疫测定，可 以确定出变应原特异性IgE抗体的水平。
在本发明的特定实施方式中，对象是未致敏的，含义即没有表现 出特异于该变应原的Th2细胞应答。
在本发明的特定实施方式中，对象是未致敏的，含义即在皮肤单 刺试验(SPT)中没有表现出阳性的变应原特异性应答。
在本发明的另 一个实施方式中，对象对任何变应原都是未致敏的。
在本发明的另一个特定实施方式中，对象的年龄小于"岁，优选 地小于30岁，更优选地小于20岁以及最优选地是在1/2到IO岁之间。 优选地，在所述对象第一次暴露于变应原之前(例如第一个花粉季节 之前)治疗对象，以便消除对象被致敏的危险。
如上面所提及的，治疗尽可能年幼的儿童通常是有利的，含义即 儿童越年幼，还没有暴露于变应原的机会就越高。但是，应当选择待 治疗的儿童的年龄，适当考虑以下事实，即在非常早的婴儿期暴露于 变应原确实涉及到引发儿童随后的致病性T细胞反应性的危险(与诱 导保护性耐受相反)。这与存在早期对变应性致敏的高危相一致，可 能是因为儿童免疫系统的延迟的出生后成熟。与此相应的是，已知经
常在儿童生命头io年中观察到的特征性序列的表现包括l)特应性皮 炎，其在生命的头数个月内表现出来，并且可以持续数月、数年或数
十年；2)嬰儿喘鸣，其可发展成支气管哮喘；和3)间歇性或持续性 变应性鼻炎，其在生命的头2年内是极为罕见的，但是从笫三年开始 其患病率增加，到头IO年末增加到超过20%。
临床症状
待治疗的对象没有任何变态反应的临床症状，即与任何变应原相 关的变态反应的临床症状。
变态反应的临床症状可以是任何常规症状，包括鼻炎、结膜炎、 鼻漏、鼻塞、鼻窦炎、喷嚏、特应性皮炎、瘙痒症、泪溢、鼻液溢(watery nose)、喘鸣和皮肤刺激。
多种因素指示在生命中后来会发生具有显现的临床症状的变态反 应。 一种这样的指示因素是父母亲或祖父母中一个或两个或一个或多 个同胞中存在一种或多种变态反应。本发明的预防性治疗特别适合于 表现出所述指示因素的对象。但是，待治疗的对象也可以是不表现出 所述指示因素的对象。
变态反应疫苗的制剂
本发明的方法所用的变态反应疫苗可以是任何适合于施用到口粘 膜表面的制剂形式，包括选自由喷雾剂、气雾剂、混合物、片剂、胶 嚢(硬和软胶嚢)、悬浮剂、分散剂、颗粒、粉末、溶液、乳剂、咀 嚼片、滴剂、凝胶、糊剂、糖浆、乳骨、锭剂(粉末、颗粒、片剂)、 快速分散剂型、气体、蒸气、软骨和棒条组成的组中的制剂。
要明白本发明的疫苗还可以包含附加的佐剂和其他适合于该制剂 类型的赋形剂。这些附加的佐剂和赋形剂对于本领域技术人员是公知 的，特别包括溶剂、乳化剂、湿润剂、增塑剂、着色物质、填充剂、 防腐剂、粘度调节剂、緩沖剂、粘膜附着物质等。配制策略的实例对 于本领域技术人员是公知的。
佐剂
粘膜变态反应疫苗可以包含佐剂，其可以是任何常规佐剂，包括
含氧金属盐、不耐热的肠毒素(LT)、霍乱毒素(CT)、霍乱毒素B 亚基(CTB)、聚合的脂质体、突变体毒素例如LTK63和LTR72、微胶 嚢、白介素(例如IL-ip、 IL-2、 IL-7、 IL-12、 INFy) 、 GM-CSF、 MDF 衍生物、CpG寡核苷酸、LPS、 MPL、 phosphorphazenes、 Adju-Phos⑧、 葡聚糖、抗原制剂、脂质体、DDE、 DHEA、 DMPC、 DMPG、 D0C/明讽复合 物、弗氏不完全佐剂、ISC0Ms⑧、LT Oral佐剂、胞壁酰二肽、单砩 酰脂质A、胞壁酰三肽、和磷脂酰乙醇胺。
含氧金属盐可以是提供所需作用的任何含氧金属盐。在一个优选 的实施方式中，含氧金属盐的阳离子选自Al、 K、 Ca、 Mg、 Zn、 Ba、
、Ag、 Au和Cr。在一个优选的 实施方式中，含氧金属盐的阴离子选自硫酸根、氢氧化物、磷酸根、 硝酸根、碘酸根、溴酸根、碳酸根、水合物、醋酸根、柠檬酸根、草 酸根、和酒石酸根、以及它们的混合形式。实例是氢氧化铝、磷酸铝、 硫酸铝、硫酸铝钾、磷酸钙、Maalox(氢氧化铝和氢氧化镁的混合物)、 氢氧化铍、氢氧化锌、碳酸锌、氯化锌、和硫酸钡。
水溶液或快速分散性片剂(参见W0 04/047794 )形式的变态反应 疫苗特别适合于口腔和舌下施用。
经肠胃外途径施用
在本发明的优选实施方式中，所述方法包括经肠胃外途径给对象 施用含有该变应原作为活性物质的变态反应疫苗。除了经口粘膜途径 施用外，还进行经肠胃外途径的施用，并作用于提高预防性治疗的作 用。相信通过使用两种不同的施用途径，可获得在增加预防性治疗的 作用方面的增强效应即协同效应。
在本发明的特定实施方式中，在经口粘膜途径的施用之后实施经 肠胃外途径的施用。在本发明的另一个特定实施方式中，在经口粘膜
途径的施用之前实施经肠胃外途径的施用。 定义
在本发明中，使用了下面的定义
术语"口粘膜施用"表示一种施用途径，其中剂型被放置于舌下 或者口腔中的任何其他位置(口腔施用)，以便容许活性组分与患者 的口腔或咽部的粘膜接触，以获得活性成分的局部的或全身的作用。 口粘膜施用途径的一个实例是舌下施用。
术语"舌下施用"表示一种施用途径，其中剂型被放置于舌下， 以获得活性成分的局部的或全身的作用。
术语"SQ-u"表示SQ-单位根据ALK-Abe116 A/S的"SQ生物效 能"标准化方法确定出SQ-单位，其中100, 000 SQ单位等于标准的皮 下维持剂量。lmg提取物正常地含有100， 000到1， 000， 000 SQ-单位， 取决于提取物所来源的变应原来源以及所用的生产方法。通过免疫测 定的方式可以确定出精确的变应原量，即总的主要变应原含量和总的 变应原活性。
实施例
实施例1:小鼠中包括舌下施用和经肠外施用的SAV的预防性治疗
方法
动物
将雌性、6到10周龄的BALB/c小鼠在内部祠养，并供给不含有 与Phl p抗血清交叉反应的组分的确定成分的饮食。每个实验组由8 到10只动物组成。
动物试验
首次用于试验的幼稚小鼠接受舌下免疫治疗(SLIT)，每日口腔 施用Phi p (5 jtl)共2到6周，以三种不同的浓度进行，包括緩冲 液对照。在SLIT治疗之后，小鼠或被处死，或用氢氧化铝吸附的Phl
p腹膜内(i. p.)免疫接种一次、两次或三次(第6-9周)并在末次 免疫接种后IO天处死。在处死之后，收集血液、支气管肺泡液(BAL)、 鼻咽液(NAL)、脾和颈淋巴结进行分析。
利用这个方案，可以看出SLIT治疗是否能激发免疫系统以增加随 后的腹膜内处理的作用。
IgA测定
将与山羊抗小鼠IgA缀合的Estapore磁珠(Estapore IB-MR/0， 86)和BAL或NAL—起温育。然后，进行洗涤以及与生物素化变应原 的温育。然后进行洗涤以及与经链霉抗生物素标记的LITE试剂的温 育，在洗涤之后，用光度计(Magic Lite Analyser EQ)测定出发光 量。
IgE测定
将与抗小鼠IgE A0201缀合的Estapore磁珠(Estapore IB-MR/O, 86)和小鼠血清一起温育。然后，进行洗涤以及与生物素化变应原的 温育。然后进行洗涤以及与经链霉抗生物素标记的LITE试剂的温育， 在洗涤之后，用光度计(Magic Lite Analyser EQ )测定出发光量。
IgG、 IgGl和IgG2a测定
1. 包被。往ELISA板(NUNC Maxisorp 439454 )的孔内加入100 pi Phi p(10 pg/ml)提取物。使板在4-8。C下静置到次日。
2. 洗涤。用緩沖液洗涤经包被的板。
3. 封闭。往每个孔内加入200jil 2 °/。酪蛋白緩冲液，并在摇床 上室温下温育l个小时。在温育之后，去除酪蛋白緩沖液。
4. 血清。稀释血清样品，并往板中的孔内加入lOOpl稀释样品， 在摇床上室温下温育2个小时。
5. 洗涤。
6. 缀合。往每个孔内加入lOOpl稀释于0.5% BSA緩冲液中的
生物素化兔抗小鼠IgG/IgGl/IgG2a，在室温下在摇床上放置l个小时。
7. 洗涤。
8. 往每个孔内加入10(^1稀释于0.5% BSA緩冲液中的链霉抗 生物素-HRP，在室温下在摇床上放置1个小时。
9. 底物往每个孔内加入IOO pl TMP ( 3， 3，， 5， 5，-四甲基联苯 胺，Kem-En-Tec TMB ONE),并温育20分钟。
10. 终止。往每个孔内加入10(V1 0.5 M H2S04终止反应。
11. 测量。将所形成的反应混合物在450nm终点处进行分光光度 仪测量(Bio Kinetics Reader EL-340 )。
T细胞增殖测定
将脾破碎成单细胞悬浮液，并在培养基中洗涤3次。计数细胞并 调整为1. 67 x 1(^个细胞/mL。往96孔平底培养板的每个孔中加入3 x 105个细胞，并用0、 10和40jig/mL梯牧草(Phleumpratense)提取 物剌激细胞。将细胞在37。C和5%0)2下培养6天。增殖的测定是通过 在培养期的最后18个小时往每个孔中加入0.5 pCi 3H胸苷，之后收 获细胞并计数掺入的放射性标记。
细胞因子测量
将脾破碎成单细胞悬浮液，并在培养基中洗涤3次。计数细胞并 调整为3x 1()6个细胞/mL。往24孔培养板的每个孔中加入2. 5 x 106 个细胞，并用0和40 jig/mL梯牧草提取物刺激细胞。利用Becton Dickinson的细胞计数珠阵列测定分析第3天和第6天收获的上清液 中IL-2、 IL-4、 IL-5、干扰素y和肿瘤坏死因子a的存在。简而言之， 将上面提及的上清液与经细胞因子特异性捕获抗体以及PE缀合的细 胞因子特异性检测抗体包被的荧光珠混合。在洗去未结合的物质之后，
用流式细胞仪获取样品数据。 结果
抗体应答
图1 A-C显示了经SLIT治疗6周的小鼠体内的Phi p特异性总 IgG、 IgGl和IgG2a的血清水平。每组小鼠每日接受5、 25或125kSQ 的SLIT剂量或作为对照的緩沖液。图1 D-F显示了接受相同的SLIT 施用以及随后l次Phl p提取物(5 kSQ/明矾)i.p.免疫接种的小鼠 体内的Phl p特异性总IgG、 IgGl和IgG2a的血清水平。
在没有i.p.注射时，舌下施用Phl p生成了增加水平的Phl p特 异性IgG，与SLIT施用的时间和剂量成比例(图1 A-C)。图D-F显 示SLIT以及随后1次i. p.注射生成的IgG水平比没有i. p.注射增加 了多至40倍，证实了舌下变应原施用的引发或致敏作用。此外，接受 单独緩冲液作为SLIT治疗的小鼠在1次i.p.免疫接种之后没有生成 显著量的抗Phl p抗体。
图2A显示了经SLIT治疗6周的小鼠体内的Phl p特异性IgE的 血清水平。每组小鼠每日接受5、 25或125 kSQ Phlp提取物的SLIT 剂量或作为对照的緩沖液。图2B显示了接受相同的SLIT施用以及随 后1次Phl p提取物(5kSQ/明矾)的i.p.免疫接种的小鼠体内的Phl p特异性IgE的血清水平。(RLU:相对光单位)
在i.p.注射之前，在血清中观察到了与SLIT治疗的剂量和时间 成比例的增加水平的特异性IgE。但是，如同IgG抗体， 一次i.p.注 射在已经接受Phl p-SLIT的小鼠中生成了增加多至"倍的IgE水平 (图13)。同样，对用緩冲液-SLIT处理的小鼠的单次i.p.免疫接种 不生成显著水平的IgE。
图3显示了经SLIT治疗的(25kSQ)小鼠(阴影线)和緩冲液处 理的对照小鼠(实线)的血清中的Phl p特异性IgE水平。在SLIT 治疗之后，用Phl p提取物(25 kSQ/明矾)对小鼠i.p.免疫接种3 次。在每次免疫接种后l周，给小鼠放血，并分析血清的IgE水平。 与对照小鼠相比较，第一次免疫接种使得已经接受Phl p-SLIT的小鼠 生成了高IgE水平。第二次和第三次免疫接种使得对照小鼠生成了增 加水平的特异性IgE抗体，而在接受Phl p-SLIT的小鼠组中观察到了
IgE应答的强烈下调。
口腔施用Phi p提取物致敏或引发了小鼠，因为单次i.p.免疫接 种生成了高的和剂量依赖性的抗体水平。尽管口腔施用Phi p如上所 迷引发了小鼠，但是重复i.p.注射造成IgE水平的降低，表明已经诱 导了对B细胞应答的特异性抑制。
图4显示了 SLIT治疗的(25kSQ)小鼠和緩沖液处理的对照小鼠 的BAL中的Phi p特异性IgA水平。在SLIT治疗之后，用Phlp提取 物(25kSQ/明矾)对小鼠i.p.免疫接种3次。与緩冲液-SLIT治疗的 对照小鼠相比较，Phi p-SLIT治疗的小鼠的BAL中的IgA水平明显更 高(P< 0.05， Mann Whitney检验)。与IgE应答下调相比，在三次 i.p.免疫接种之后，经Phl p-SLIT治疗的小鼠的BAL中的特异性IgA 水平增加了。
T细胞应答
图5显示了来自经PhlpSLIT治疗的小鼠的脾细胞的增殖。对小 鼠舌下给予Phi p ( 25 kSQ) 2、 4或6周。在此之后，分离出脾细胞， 并用所示浓度的Phl p在体外刺激脾细胞。在6天的温育之后测量增 殖。包括来自经免疫接种的小鼠的脾细胞作为对照。每个柱代表6只 个体小鼠的平均值，误差棒表示平均值的标准误。
由图5可见，经体外变应原特异性再激活，施用2、 4或6周的 SLIT不导致脾细胞的活化，因为增殖没有超过背景值。作为阳性对照， 在经0、 10或40 meg Phi p/ ml免疫接种的小鼠中看到了强烈的增殖应答。
图6显示了来自经Phl pSLIT治疗以及随后一次免疫接种的小鼠 的脾细胞的增殖和细胞因子生成。用Phi p SLIT或緩沖液处理小鼠6 周，随后i. p.注射明矾吸附的Phi p—次。8天后分离出脾细月包，并 在体外用Phi p再刺激。图6A:在温育6天后测量的增殖。图6B:在 第5天收获上清液，并分析TNF-ot、 IFN-Y、 ILH、 IL-S和IL-2。 每条代表8只单个小鼠的平均值。误差棒表示平均值的标准误。
如图6所示，以Phi p进行SLIT治疗导致诱导了抗原特异性全身 耐受，因为来自经Phi p SLIT治疗的小鼠的脾细胞的增殖比仅仅接受 緩冲液的小鼠显著降低。类似地，在经Phi p SLIT治疗的小鼠中，体 外刺激的脾细胞分泌TNF-oc 、 IFN-y 、 IL-4和IL-5也减少了 。在SLIT 和緩沖液处理的小鼠中，IL-2分泌都是低的。
SLIT治疗的持续时间
图7显示了来自经Phl pSLIT治疗以及随后一次免疫接种的小鼠 的脾细胞的增殖。用Phi p SLIT治疗小鼠3周(图7A)或6周(图 7B),随后注射明矾吸附的Phi p—次。IO天后分离出脾细胞，并在 体外用Phi p再刺激。在温育6天后测量增殖。
对于诱导T细胞耐受性而言，SLIT治疗的持续时间似乎是重要的。 由图7可见，与6周SLIT治疗相比较，在免疫接种之前进行SLIT治 疗3周导致对增殖应答的下调的有效性较低。
剂量应答
图8显示了来自经Phl pSLIT治疗以及随后一次免疫接种的小鼠 的脾细胞的增殖。用5000 SQ、 25000 SQ或125000 SQ治疗小鼠6周， 随后用明矾吸附的Phl p免疫一次。IO天后分离出脾细胞，并在体外 用Phl p再刺激。在温育6天后测量增殖。
在5000-125000 SQ的范围内，用作为SLIT治疗的Phl p剂量似 乎对于诱导T细胞耐受性并不是关键的。由图8可见，施用5000 SQ、 25000 SQ和125000 SQ所诱导的对Phl p特异性应答的抑制水平是相 似的，尽管在接受125000 SQ的小鼠中有更有效抑制的趋势。
结论
结果证实了对首次用于试验的幼稚小鼠的SLIT治疗具有预防性 效果，SLIT治疗引发了免疫系统。此外，在重复免疫接种之后对B和 T细胞应答的抑制表明这种引发导致诱导了全身的耐受性。
权利要求
1.一种预防性治疗对象中对变应原的变态反应的方法，包括a)经口粘膜途径给对象施用含有该变应原作为活性物质的变态反应疫苗，b)其中待治疗的对象是未致敏的，含义即没有表现出特异于该变应原的IgE应答，c)其中待治疗的对象没有任何变态反应的临床症状，和d)其中预防性治疗的目标是预防或减轻与该变应原相关的变态反应并发的临床症状。
2. 权利要求l的方法，其中对象是未致敏的，含义即没有表现 出特异于该变应原的Th2细胞应答。
3. 权利要求1或2的方法，其中对象没有鼻炎、结膜炎、鼻漏、 鼻塞、鼻窦炎、喷嚏、特应性皮炎、瘙痒症、泪溢、鼻液溢、喘鸣、 皮肤刺激和食物变态反应的临床症状。
4. 权利要求1到3中任一项的方法，其中对象对任何变应原都 未致敏。
5. 权利要求1到4中任一项的方法，其中对象的年龄小于40 岁，优选地小于30岁，更优选地小于20岁，以及最优选地是在2岁 到10岁之间。
6. 权利要求1到5中任一项的方法，其中变应原选自由吸入变 应原和毒液变应原组成的组。
7. 权利要求6的方法，其中变应原选自由树花粉变应原、草花 粉变应原、尘螨变应原、草本植物变应原和动物变应原组成的组。
8. 权利要求1到7中任一项的方法，包括经肠胃外途径给对象 施用含有该变应原作为活性物质的变态反应疫苗。
9. 权利要求8的方法，其中经肠胃外途径的施用是在经口粘膜 途径的施用之后进行的。
10. 权利要求8的方法，其中经肠胃外途径的施用是在经口粘膜 途径的施用之前进行的。
11.变应原在生产用于预防性治疗对象中变态反应的疫苗中的用途，a) 其中该疫苗适合于经口粘膜途径施用，b) 其中待治疗的对象是未致敏的，含义即没有表现出特异于该变 应原的IgE应答，c) 其中待治疗的对象没有任何变态反应的临床表现，和d) 其中预防性治疗的目标是预防或减轻与该变应原相关的变态反 应并发的临床症状。
全文摘要
本发明涉及一种预防性治疗对象中对变应原的变态反应的方法，包括a)经口粘膜途径给对象施用含有该变应原作为活性物质的变态反应疫苗，b)其中待治疗的对象是未致敏的，含义即没有表现出特异于该变应原的IgE应答，c)其中待治疗的对象没有任何变态反应的临床症状，和d)其中预防性治疗的目标是预防或减轻与该变应原相关的变态反应并发的临床症状。
文档编号A61K39/35GK101098711SQ200680001882
公开日2008年1月2日 申请日期2006年1月5日 优先权日2005年1月7日
发明者J·基尔德斯加德, J·布里莫内斯 申请人:阿尔克-阿贝洛有限公司