用于治疗和预防血栓形成疾病的香叶木素衍生物的制作方法

专利名称：：用于治疗和预防血栓形成疾病的香叶木素衍生物的制作方法用于治疗和预防血栓形成疾病的香叶木素衍生物本发明涉及香叶木素化合物在获得旨在预防和/或治疗血栓形成疾病，以及具有血栓形成风险的疾病的药物组合物中的应用。本发明具体涉及香叶木素化合物6，8-二烯丙基-5，7-二羟基-2-(2-烯丙基-3-羟基-4-甲氧基苯基)-411-1-苯并吡喃-4-酮，在获得旨在预防和/或治疗血栓形成疾病的药物组合物中的应用。淤血的生理过程是由于偶然原因或更复杂的病理原因，由血管内皮细胞的不利改变而触发的。其目的是通过彼此不同但又彼此相关并依赖的两个步骤阻断和阻止血液逸出初级淤血和血浆凝固。初级淤血是应急机制，涉及粘附于内皮形成白色血栓或血小板栓的循环血小板。其次，血小板栓通过形成血纤蛋白网而得到加强，所述的血纤蛋白在其网眼中包裹着聚集的血小板。不溶性的血纤蛋白从可溶性血浆蛋白质一——血纤蛋白原开始，在凝固系统的酶促活化级^i^应的终产物凝血酶的作用下产生。最后，血纤蛋白/血小板血栓通过血纤蛋白溶解现象被再吸收。实际上，由于其降低血管循环中血纤蛋白的量的能力，血纤蛋白溶解使机体能够抵抗血栓形成并且破坏最初阻止出血的血栓。血纤蛋白溶解主要涉及纤溶酶，其为一种将多聚血纤蛋白长链分解成D-二聚体的蛋白7jC解酶。该酶以酶原形式(纤溶酶原)存在于血浆中，所述为纤溶酶。这些丝氨酸蛋白酶具体地是，组织型纤溶酶原激活物(t-PA)，其基本是由活化的内皮细胞所释放，和尿激酶型纤溶酶原激活物(u-PA)，其以尿激酶前体形式的释放更为普遍。血纤蛋白溶解通过三成分系统进行自身负调节，所述三成分系统包含纤溶酶抑制物(ot2-抗纤溶酶和(Xr巨球蛋白)、纤溶酶原激活抑制物(PAI-1或1型纤溶酶原激活物抑制物；PAI-2)和凝血酶激活的血纤蛋白溶解抑制物(TAFI)。主要的纤溶酶原激活物抑制物是PAI-1。PAI-1蛋白属于丝氨酸蛋白酶抑制蛋白(丝氨酸蛋白酶抑制物)超家族，是379个IL^酸的糖蛋白(47kDa)，缺乏半胱氨酸但却富含甲硫氨酸残基。PAI-1蛋白质存在于血浆和血小板中，可由多种类型的细胞例如内皮细胞、单核细胞、肝细胞、成纤维细胞、脂肪细胞和巨核细胞产生。PAI-1的活性部位位于蛋白质C-末端的(Arg^-MetS")处，作用类似于组织型纤溶酶原激活物的假底物。因此PAI-1主要的靶蛋白是t-PA和u-PA。从机体作为一个整体的角度来考虑调节於血和血纤蛋白溶解的机制，PAI-1水平升高与静脉和动脉形成血栓的风险增加之间呈正相关。这种正相关被报道过，特别在源于静脉或动脉血栓形成的疾病病例中，例如心肌梗死(Hamsten等人,Plasminogenactivatorinhibitorinplasma:riskfactorforrecurrentmyocardialinfarction,1987，Lancet2，3画9)、绞痛(Wieczorek等人，Tissue-typeplasminogenactivatorandtissueplasminogenactivatorinhibitoractivitiesaspredictorofadverseeventsinunstableangina,1994，AmJCardiol,24，424-429)、间歇性跛行、脑卒中综合征、深静脉血栓形成(Schulman等人，Thesignificanceofhypofibrinolysisfortheriskofrecurrenceofvenousthromboembolism,1996，ThrombHaemose，75,307-611)、肺栓塞，以及血栓形成风险提高的疾病，例如高血压、高胆固醇血症、糖尿病、肥胖症、血液凝固的遗传性异常或血液凝固的获得性异常。事实上，在30%患静脉血栓栓塞的患者中血浆PAI-1水平增高(Tabernero等人Incidenceofincreasedplasminogenactivatiorinhibitorinpatientswithdeepvenousthrombosisand/orpulmonaryembolism,1989:ThrombRes，f^，565-570)。其结果是血纤蛋白溶解系统的全面功能异常，特别是t-PA降低，在患肺动脉高压(并发栓塞)患者中同样观察到(Huber等人，Fibrinogen,t國PAandPAI醫1plasmalevelsinpatientswithprimarypulmonaryhypertension,1994，AmJCritCareMed，雄，929-933)。在此特别病例中，PAI-1水平的升高是由于位于血栓形成区域的内皮细胞，其表现出与凝血酶或血小板释放的介体诱导相关的PAI-1释放增加。假如PAI-1的水平升高在心血管综合征的背景中是有害的，认为恢复正常的血纤蛋白溶解活性将预防有风险的患者中血栓形成事件的发生。因此，血纤蛋白溶解过程的控制构成了医学心血管疾病的中心问题。抗凝剂和抗血小板剂在大范围的心血管疾病中成为常规治疗。它们在预防心血管意外的背景中的价值并且还有对于心血管急症的价值已经在流行病学研究中得到证实。但是，风险/利益的比例必须经常衡量，因为与抗凝剂和抗血小板剂有关的出血意外是占主导的，所述出血会产生功能性的或致命的预后问题。事实上，抗凝剂和抗血小板剂治疗的主要并发症是出血。通过肠胃外途径给药的抗凝剂具体是未分级肝素(NFH)、分级肝素(LMWH)和醋硝香豆素(Sintrom⑧)。流行病学研究已显示在血栓栓塞发作的治疗背景中分级肝素和未分级肝素治疗类型在0到7%的病例中引起严重出血，致死率范围从0到2%。在血栓栓塞症状的预防和治疗性治疗中开发的抗凝剂Sintrom⑧在高达2.2%的病例中也会引起威胁生命的严重出血事件。考虑到在Sintrom⑧与抗血小板剂如阿司匹林的组合中出血风险严重升高，在作出治疗选择时必须不能低估该组合的风险/利益的比例。更多近来的具有血纤蛋白溶解或栓溶作用的治疗已被开发；它们通过促进无活性的纤溶酶原转化成有活性的纤溶酶来加速血管内凝块的溶解(MarderVJ.Thrombolytictherapy:foundationsandclinicalresultsin《HaemostasisandThrombosis》，第四版，2001，编者ColmanRW等人)。这些纤溶剂或溶栓剂通过肠胃外途径单独给药，所述途径可以通过普通的静脉内途径灌注或作为丸剂给药，或通过局部例如冠状动脉内或动J3^内的途径给药。此外这些药物组合物必须在血栓形成后尽可能早的给药以试图溶解它并由此除去血管中的阻塞。这些新溶栓剂因此由組织纤溶酶原激活物或t-PA的类似物组成，例如通过遗传工程获得且与t-PA完全相同的组织血纤蛋白溶原酶激活剂；人t-PA的简单类似物瑞替普酶;或替耐普酶，其为类似于内源t-PA的重组蛋白质且对于血栓的血纤蛋白具有更高的亲和力。这些纤溶剂^f艮快显示出其在急救医院用途方面的局限性和它们的给药问题，例如将导管引入到栓塞的动脉。已经设想了其他潜在的疗法来改变PAI-1的水平，所述PAI-1水平增加与血栓栓塞意外相关。具体而言，已经开发了单克隆抗体作为PAI-1活性的抑制物。MAI12是人PAI-1特异性的鼠抗体，其不干涉PAI-2,或t-PA，或oc2-抗纤溶酶。通过阻断PAI-1与t-PA的相互作用，该单克隆抗体增加了体夕卜和体内的血纤蛋白溶解(Levi等人，Inhibitionofplasminogenactivatorinhibitor-1activityresultsinpromotionofendogenousthrombolysisandinhibitionofthrombusextensioninmodelsofexperimentalthrombolysis,1992，Circulation,85，305-312)。在单克隆抗体CLB-2C的情况下，该抗体与玻连蛋白的M酸序列的第128位和笫145位之间结合，并因此阻止蛋白质PAI-1与之结合，所以加速其失活。无论这些单克隆抗体在体外和体内模型中的功效如何，因为与缺少抗体人源化相关的困难、免疫原性的风险以及开发的费用，这些特异性的PAI-1抑制物无法从医学角度进行开发。因此本发明旨在对已经可用的调节血纤蛋白溶解的机制提出一种备选的方案，用于对血栓形成疾病的预防和治疗性目的，从而至少部分的克服血栓栓塞意外已知治疗的缺点。该备选方案基于PAI-1基因表达的抑制。为此效果，本发明提出了香叶木素化合物在获取旨在预防和/或治疗血栓形成疾病的药物组合物中的应用。本发明的香叶木素化合物是通式(I)的化合物、其非对映异构体和对映异构体，以及其与可药用酸或碱的加成盐。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>其中，-Ri代表氢原子、丙基或烯丙基；誦R2代表氩原子或丙基、烯丙基、2，3画二羟基丙基、(2,2-二甲基-1，3-间二氧杂环戊烯-4-基)甲基或3-乙酰l^-2-羟丙基基团；-议3代表氢原子、丙基或烯丙基；-R4代表氢原子或甲基、丙基、烯丙基、2，3-二羟基丙基或(2，2-二甲基-1，3-间二氧杂环戊烯-4-基)甲基或式-<:011'4的基团，其中R、代表直链或支链(d-Cs)烷基或苯基；-Rs代表氢原子、丙基或烯丙基，以及-R6代表氢原子或甲基、丙基、烯丙基、2，3-二羟基丙基或(2,2-二甲基-1，3-间二氧杂环戊烯-4-基)甲基、式-COR'6的基团(其中R，6代表直链或支链(d-Cs)烷基或苯基)，或式(T)基团<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>糾是-基团Ri、R2、R3、R4、Rs和R6中至少一个不是氬原子，并且-如果RpR2和R3各自同时代表氢原子，那么Rt也代表氬原子。通式(I)的化合物的制备在EP0709383专利说明书中描述。更具体地，本发明使用的香草木素化合物是指在EP0709383专利说明书中描述的下列式(II)至式(XVII)的化合物(II)7-烯丙氧基-5-羟基-2-(3-羟基-4-甲H^苯基)-4H-l-苯并吡喃-4-酮(III)5，7-二羟基-2-3-(2，3-二羟基丙氧基)-4-甲氧基苯基I-4H-l-苯并吡喃-4-酮<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>(IV)(R，S)-5-羟基-2-(3-羟基-4-甲氧基苯基)-7-(2，3-二羟基丙氧基)-4H-l-苯并吡喃-4-酮OCH,(V)5，7-喃-4-酮<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>(|V)(2，3-二羟基丙猛)-2-(3-羟基-4-甲絲苯基)-4H-l-苯并吡(VI)5-羟基-2-(4-甲氧基-3-新戊酰氧基苯基)-7-(2，3-二羟基丙氧基)-4H-l-苯并吡喃-4-酮<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>(VII)5-烯丙氧基-2-(3-烯丙氧基-4-甲氧基苯基)-7-(2，3-二鞋基丙氧基)-4H-l-苯并吡喃-4-酮<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>(VII)(VIII)6-烯丙基-5-羟基-2-(2-烯丙基-3-羟基-5-甲IL^苯基)-7-(2，3-二羟基丙氧基)-4H-l-苯并吡喃-4-酮OHHO、(IX)5-羟基-2-(3-羟基-4-甲猛-2-丙基苯基)-6-丙基-7-(2，3-二羟基丙氧基)-4H-l-苯并吡喃-4-酮(X)(1^)-5-羟基-2-(3-羟基-4-甲氧基-2-丙基苯基)-7-(2，3-二羟基丙氧基)-4H-l-苯并吡喃-4-酮(XI)(R)-5-羟基-2-(3-羟基-4-曱氧基-2-丙基苯基)-7-(2，3-二羟基丙氧基)-4H-l-苯并吡喃-4-酮(XII)。)-5-羟基-2-(3-羟基-4-甲氧基-2-丙基苯基)-7-(2，3-二羟基丙氧基)-4H-l-苯并吡喃-4-酮(XIII)(R，S)-5-羟基-2-(3-羟基-4-甲氧基-2-丙基苯基)-7-(3-乙酰氧基-2-羟基丙Hi0-4H-l-苯并吡喃-4-酮(XIV)5-羟基-2-4-甲氧基-2-丙基-3-(6-羧基-3，4，5-三羟基-四氢吡喃-2-基-狄)-苯基-7-(2，3-二羟基丙狄)-4H-l-苯并吡喃-4-酮<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>(XV)5-羟基-2-4-甲氧基-3-(2，3-二羟基丙氧基)-苯基-7-(2，3-二羟基丙氧基)-4H-l-苯并吡喃-4-酮(XVI)5，7-二羟基-2-(3-羟基-4-甲氧基-2-丙基苯基)-6，8-二丙基-4H-l-苯并吡喃_4-酮<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>更为有利的是，本发明优选的式(I)化合物是式(XVII)的6，8-二烯丙基.5,7-二羟基-2-(2-烯丙基-3-羟基-4-甲緣苯基)-4H-l-苯并吡喃-4-酮<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>因此本发明涉及式(I)香叶木素化合物、其非对映异构体和对映异构体,以及其与可药用酸或碱的加成盐在获取旨在预防和/或治疗血栓形成疾病的药物组合物中的用途。其中，-Ri代表氢原子、丙基或烯丙基；-R2代表氢原子或丙基、烯丙基、2，3-二羟基丙基、(2，2-二甲基-1，3-间二氧杂环戊烯-4-基)甲基或3-乙酰HJ^-2-羟丙基；-R3代表氢原子、丙基或烯丙基；-R4代表氢原子或甲基、丙基、烯丙基、2，3-二羟基丙基或(2，2-二甲基-l，3-间二氧杂环戊烯-4-基)甲基或式-COR，4基团，其中R、代表直链或支链(d-Cs)烷基或苯基；國Rs代表氢原子、丙基或烯丙基，以及-R6代表氢原子或曱基、丙基、烯丙基、2，3-二羟基丙基或(2，2-二曱基-1，3-间二氧杂环戊烯-4-基)甲基、式-COR'6基团(其中R'6代表直链或支链(d-Cs)烷基或苯基)或式(I')基团-基团Ri、R2、R3、R4、Rs和R6中至少一个不是氢原子，并且-如果R^R2和R3各自同时代表氢原子，那么Rj也代表氢原子。与本发明框架中的通常含义一致，"血栓形成疾病"的表达定义为在心血管系统(静脉、动脉、心脏、微循环)中血栓形成引起的任何疾病。由凝块导致的血管局部阻塞或凝块栓化导致的远距离部位阻塞是引起血栓形成疾病临M征的原因。深静脉血栓形成基本上出现在腿部；如果它们栓化到肺部将会引起肺栓塞。动脉血栓形成最经常伴随有血管疾病发生，最常见的是动脉粥样硬化。它们通过阻止血液在动脉中流动从而导致组织缺血，例如由于冠状动脉血栓形成或栓化后微循环远端血栓形成的情糾是:形中的心肌梗死，或在例如心内或颈总动脉血栓栓化后产生的脑卒中综合征(CVA)。最终，微循环栓塞通常是弥散性血管内凝血(其中孩ibfe栓产生缺血性坏死)的并发症。才艮据本发明，术语"预防"对应于预防性目的的治疗，其具有在易感背景例如动脉粥样硬化疾病、糖尿病或代谢综合征中降低血栓形成发展的风险的目的。此外，术语"预防，，可理解为旨在通过减少疾病的发展和持续期来降低患病数的二级预防。二级预防是在心血管意外和脑卒中综合征之后为降低复发危险所必需的。"治疗，，理解成为了治疗栓塞并发或未并发的血栓形成目的的治愈性目的的治疗。本发明优选涉及式(XVII)的6，8-二烯丙基-5，7-二羟基-2-(2-烯丙基-3-羟基-4-甲氧基苯基)-4H-l-苯并吡喃-4-酮在获得旨在预防和/或治疗血栓形成疾病的药物组合物中的应用此外本发明涉及香叶木素化合物在获得旨在预防和/或治疗具有血栓形成风险的疾病的药物组合物中的应用。"具有血栓形成风险的疾病"理解为在其过程中发生在血栓形成事件的任何疾病。加重动脉粥样硬化的疾病例如高胆固醇血症、糖尿病、高血压、肥胖症、吸烟以及还有心房纤维性颤动，是具有动脉血栓形成风险的主要疾病。遗传性或获得性凝固蛋白质异常和矫形外科是具有静脉血栓形成风险的主要疾病，但是也要提;sj巴胖症、某些激素治疗、某些癌症及其治疗、怀孕和长期缺少运动的原因。最后，败血症性休克是具有微:循环血栓形成风险的主要疾病。例如，在高胆固醇血症中甘油三酯水平升高一般是心血管风险特别加重的标记，特别是血栓形成特别加重的标记。在VLDL水平升高与肝细胞和内皮细胞释放的PAI-1水平升高相关(Allison等人，Effectsofnativetriglyceride陽enrichedandoxidativelymodifledLDLonplasminogenactivatorinhibitor-1expressioninhumanendothelialcells,1999,ArteriosclerThrombVaseBio，1￡，1354-1360)(Mussoni，等人Hypertriglyceridemiaandregulationoffibinolyticactivity,1992，ArteriosclerThromb，12，19-27)。本发明还涉及香叶木素化合物作为活性成份与一种或多种可药用赋形剂组合，在获得旨在预防和/或治疗血栓形成疾病，或具有血栓形成风险的疾病的药物组合物中的应用。本发明优选涉及包含本发明的香叶木素化合物与一种或多种可药用赋形剂组合的药物组合物，该组合物旨在预防和/或治疗血栓形成疾病或具有血栓形成风险的疾病。"活性成分"理解为引起药物组合物药效或治疗性质的任何物质。在本发明的背景中，"赋形剂"理解为药物活性成分所掺入其中，以帮助其制备和给药，以及改善其稠度、形状和体积的任何物质.此外旨在预防和/或治疗血栓形成疾病，或具有血栓形成风险的疾病的药物组合物是适于口服的、肠胃外的、鼻的、经皮或透皮的、直肠的、经舌的、眼的或呼吸给药的形式，特别是片剂或糖锭剂、舌下片剂、药嚢剂(sachet)、paquet、胶嚢剂、舌下或直肠给药剂型(glossette)、锭剂、栓剂、乳骨剂、软骨剂、皮肤凝胶剂(dermalgel)和可饮用或可注射的安瓿剂。根据本发明的香叶木素化合物优选用于获得旨在预防和/或治疗血栓形成疾病，或具有血栓形成风险的疾病的口服给药药物组合物。由于病人用药简单，用于血栓形成疾病或具有血栓形成风险的疾病的药物组合物通过口服途径给药特别适于具有预防目的的治疗。最后，有效剂量根据性别、年龄和患者重量、给药途径、治疗指征的特点和任何相关治疗而变化，范围从0.1mg至lg，每24小时一次或多次给药。本发明通过下列实施例来说明但并不限于此。实施例1:PAI-1表达的体外抑制1)细胞培养^Mf究在人肝细胞系H印G2(ATCC，编号HB8065)上进行。细胞培养于具有glutamax-l(Gibco口)的MEM培养基(极限必需培养基)中，所述培养基含有10。/。FCS(胎牛血清)、1%非必需氨基酸和1%丙酮酸钠并且补充了青霉素和链霉素。2)PAI-1启动子的克隆a)通过PCR扩增启动子通过PCR扩增并且亚克隆对应于PAI-1启动子的2.5kb的片段，其从第-2442位核苷酸延伸到第+136位核苷酸(Lopez等人，2000,Atherosclerosis,巡，359-366)。在50pl反应终体积中，在300ng人基因组DNA(Clontech)、300jiM的dNTP(三磷酸脱氧核苷酸)(Clontech)、300nM引物存在时，将2.5单位的PlatinumTaqDNAPolymeraseHighFidelity(Invitrogen)置于这样的培养基中，其补加了1.5mMMgCh和不同浓度的PCRxEnhancerSystem(Invitrogen)(促进特别困难的序列(0-4x)扩增)的酶特异性緩冲液。所用的一套引物(Chen等人DifferentialmechanismsofPAI-1geneactivationbytransforminggrowthfactorbetaandtumornecrosisfactoralphainendothelialcells,2001，ThrmbHaemost,丝，1563-72)如下5，-TTACGCGTGGGTTTGGGGCTGGACTTG-3，(SEQIDNo.l)，和5，画CGAGATCTCAGAGGTGCCTTGCGATTGG-3，(SEQIDNo.2)在PerkinElmer2400仪上，该PCR程序包括升温至94。C，2分钟的起始和后续的超过35个循环的扩增。PCR产物接着在7.5M乙酸铵和乙醇存在下于-80。C沉淀一小时。在4。C、14000转/分钟离心后，将沉淀重悬在70%的乙醇中并且再次在4'C，14000转/分钟离心。获得的沉淀接着进行干燥和于水。b)启动子序列的消化扩增的序列继而用限制性酶BglII和MhiI分两步进行消化。扩增的序列在1单位/fd酶和100jig/mlBSA(牛血清白蛋白)存在下37。C消化1小时30分钟。每次消化后，所得产物在MicroBio-Spin层析柱(Bio-Rad)上系统地进行纯化以除去緩冲液中的盐。c)PGL3/PAI-1质粒的构建将含有萤火虫荧光素酶基因的pGL3-Basic质粒(Promega)用限制性酶BglII和MluI按照与插入片段相同的方法进行消化，并接着在1%低熔点琼脂糖凝胶上纯化。pGL3-Basic质粒载体和对应PAI-1启动子的插入片段的连接;l依靠T4DNA连接酶(Promega的LigaFastTMRapidDNALigationSystem)进行的。通常，在连接期间，使用相当于载体量三倍的过量插入片段。另外，由于该插入片段是载体的一半长(2.5kb相对于4.8kb)，维持化学计量平衡需要载体质量加倍。因此37.5ng的插入片段和25ng的pGL3-Basic载体在3个单位的T4连接酶存在时，于环境温度进行反应。3)肝细胞的转染PGL3/PAI-1质粒转染入HepG2细胞。在有50%汇合的细胞、在每孔中沉积了Lipofectin(lmg/ml)和1.5ng的PGL3/PAI-1质粒的平板中进行转染。Lipofectii^在OPTI-MEM培养基(GIBCCF，中活化30分钟，继而与预先用培养基稀释的质粒接触15分钟。细胞在37°C,含有5。/。C02和95%02的气氛中培养6小时。吸出转染培养基并用滋养培养基替换过夜以稳定细胞。在无血清的MEM培养基中超过24小时，诱导报道基因的表达。刮下细胞并在裂解緩冲液(0肌1丄11<^6^86@试剂盒，Promega)中裂解，继而放置于-20'C。在TGFpi(lng/ml)存在时，对HepG2细胞的诱导阶段是24小时。在该诱导阶段期间，在TGFpl之前4小时加入PAI-1表达抑制物，且保持与细胞接触直到24小时的诱导阶段结束。4)启动子活性的确定该PAI-1启动子活性通过所产生的荧光素酶活性来定量确定(Dual-Luciferase试剂盒，Promega)。向每孔加入萤火虫荧光素酶的底物——荧光素溶液。这导致发光。因为荧光素酶活性对光敏感，平板在黑暗中温育10分钟，接着开始发光计读数以定量发射的光子(Wallac，PerkinElmer)，获得的结果是在5秒的时期内的平均cpm(每分钟计数)。5)结果将6，8-二烯丙基-5，7-二羟基-2-(2-烯丙基-3-羟基-4-甲氧基苯基)-4H-l-苯并吡喃-4-酮(专指化合物A)和式3(E)-苯亚甲基-4(E)-(3，4，5-三甲氧基苯亚甲基)吡咯烷-2，5-二酮的T686(参照的PAI-1表达抑制物，来自Tanabe)以10jiM的浓度在基础状态的H印G2细胞和TGFpi诱导后的HepG2细胞上进行测试。PAI-1启动子活性在对照条件下和存在抑制物时，在M状态和i秀导状态下测量。以cpm和作为对照观齊(t的百分数表示的活性示于表l。以cpm表示的活性抑制/对照(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>表1:在6，8-二烯丙基-5，7-二羟基-2-(2-烯丙基-3-羟基-4-甲氧基苯基)-4H-l-苯并吡喃-4-酮或T686存在时(24小时)，在^f出条件或TGFpl(1ng/ml)诱导条件下对PAI-1启动子活性的测量。**，相对于在基础状态的对照p〈0.01,。°，相对于在诱导状态的对照p〈0.01。ANOVAl因子，后Duimett，s检验(n-6)。在基础条件和TGF卩1诱导条件下6，8-二烯丙基-5，7-二羟基-2-(2-烯丙基-3-羟基-4-甲HJ^苯基)-4H-l-苯并吡喃-4-酮和T686(10jiM)抑制PAI-1基因表达。6，8-二烯丙基-5，7-二羟基-2-(2-烯丙基-3-羟基-4-甲氧基苯基)-4H-l-苯并吡喃-4-酮(69。/。)在J^出条件下与T686(67。/o)效力相同，而在诱导条件下明显更有效(相对T686的52。/0，为78%抑制作用；p<0.01，ANOVA1因子，后Newman-Keuls检验)。实施例2:香叶木素化合物抗血栓形成活性的体内评估1)动物本研究在重量为250到400g之间的雄性CD大鼠(CharlesRiver实验室)上进行。在6-8只大鼠的几组上进行的实验方法包括将每种测试化合物组与用溶剂处理大鼠的对照组进行比较。这些大鼠用于研究在腹主动脉上FeCl3诱导的动脉血栓形成模型中的抗血栓形成的效果(Tanaka等人，Z國335，anewthromboxaneA2receptorantagonist,preventsarterialthrombosisinducedbyferricchlorideinrats，2000,Eur.J.Pharmacol"401,413-418)。2)诱导的动脉血栓形成模型在大鼠中诱导动脉血栓形成之前，大鼠用测试化合物，例如6，8-二烯丙基-5，7-二羟基-2-(2-烯丙基-3-羟基-4-甲氧基苯基)-4H-l-苯并吡喃-4-酮(30mg/kg/天)通过管饲法口服给药处理5天。通过WI内给药，用50mg/kg戊巴比妥麻醉大鼠并在剖腹后将其腹主动脉暴露。一个8mm直径的用氯化铁(FeCb，50%)饱和的小丸作为病原体放置在主动脉中10分钟以破坏内皮并诱导凝块形成。在动脉血栓形成模型建立20分钟后，从主动脉中取出形成的血块并称重。3)结果大鼠腹主动脉上氯化铁诱导的动脉血栓形成模型使得m^本发明的香叶木素化合物并且特别是6，8-二烯丙基-5，7-二羟基-2-(2-烯丙基-3-羟基-4-甲ll^苯基)-4H-l-苯并吡喃-4-酮(化合物A)作为抗血栓形成剂的功效成为可能。6，8-二烯丙基-5，7-二羟基-2-(2-烯丙基-3-羟基-4-甲氧基苯基)-4H-l-苯并吡喃-4-酮的活性作为从主动脉中取出的凝块重量的函数进行评估，凝块重量越小则活性越高。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>表2:相对于对照(无管饲)(11=6),作为凝块重量函数的6，8-二烯丙基-5，7-二羟基-2-(2-烯丙基-3-羟基-4-曱氧基苯基)-4H-l-苯并吡喃-4-酮(化合物A)活性的测量。相对于对照，6，8-二烯丙基-5，7-二羟基-2-(2-烯丙基-3-羟基-4-甲氧基苯基)-4H-l-苯并吡喃-4-酮使得凝块重量明显而显著的减少成为可能，凝块减少达到了30%。权利要求1.式(I)的香叶木素化合物、其非对映异构体和对映异构体以及其与可药用酸或碱的加成盐在获得旨在预防和/或治疗血栓形成疾病的药物组合物中的应用其中，-R1代表氢原子、丙基或烯丙基；-R2代表氢原子或丙基、烯丙基、2，3-二羟基丙基、(2，2-二甲基-1，3-间二氧杂环戊烯-4-基)甲基或3-乙酰氧基-2-羟丙基；-R3代表氢原子、丙基或烯丙基；-R4代表氢原子或甲基、丙基、烯丙基、2，3-二羟基丙基或(2，2-二甲基-1，3-间二氧杂环戊烯-4-基)甲基或式-COR′4基团，其中R′4代表直链或支链(C1-C5)烷基或苯基；-R5代表氢原子、丙基或烯丙基，及-R6代表氢原子或甲基、丙基、烯丙基、2，3-二羟基丙基或(2，2-二甲基-1，3-间二氧杂环戊烯-4-基)甲基、式-COR′6基团(其中R′6代表直链或支链(C1-C5)烷基或苯基)或式(I′)基团条件是-基团R1、R2、R3、R4、R5和R6中至少一个不是氢原子，并且-如果R1、R2和R3各自同时代表氢原子，那么R4也代表氢原子。2.式(XVII)的6，8-二烯丙基-5，7-二羟基-2-(2-烯丙基-3-羟基-4-曱氧基苯基)-4H-l-苯并吡喃-4-酮在获得旨在预防和/或治疗血松形成疾病的药物组合物中的应用3.根据权利要求1或权利要求2的香叶木素化合物在获得旨在预防和/或治疗具有血栓形成风险的疾病的药物组合物中的应用。4.根据权利要求1至3中任一项的香叶木素化合物在获得旨在预防和/或治疗血栓形成疾病，或具有血栓形成风险的疾病的口服给药药物组合物中的应用。5.根据权利要求1至4中任一项的香叶木素化合物与一种或多种可药用赋形剂组合在获得旨在预防和/或治疗血栓形成疾病，或具有血栓形成风险的疾病的药物组合物中的应用。6.药物组合物，其包含与一种或多种可药用赋形剂组合的根据权利要求1至3中任一项的香叶木素化合物，该组合物旨在预防和/或治疗血栓形成疾病，或具有血栓形成风险的疾病。全文摘要本发明涉及香叶木素化合物在获得旨在预防和/或治疗血栓形成疾病和具有血栓形成风险的疾病的药物组合物中的应用。文档编号A61P7/02GK101132788SQ200680006765公开日2008年2月27日申请日期2006年2月28日优先权日2005年3月1日发明者A·吕潘,M·维日比茨基,M-F·鲍萨德,M-O·瓦莱,P·桑塞尔维斯特里-莫雷,T·韦伯朗申请人:瑟维尔实验室