专利名称：：用于止血调节和伤口愈合治疗的无机材料的制作方法
技术领域：
：本发明的公开的内容涉及用于调节凝血级联系统，减少细菌感染危险和促进骨生长的组合物和方法。多孔的和无孔的高表面积小颗粒无机材料己被用来处理外伤损害的组织，其通过在伤口处的快速脱水作用，促进血块形成，与组织介质进行离子交换产生抗菌和治疗活性，并在伤害部位产生可控制的升温而发挥作用。
背景技术：
：授权给Hursey等人的美国专利4,822,349记载了在出血的部位使用一种去水的沸石材料来减少出血。在此方法中，一种LindeType5A型的特别的富含钙的沸石的配方独立外用于外伤创口，通过在伤口部位的脱水作用和诱导产生血块促使止血(Breck,DW等,/^/w.CAem.5bc.78，23(1956)5963)。这种产品的主要缺点是在伤口部位局部产生过量的热，这是由于目前由美国康泊狄格州Wallingford的Z-medica公司供销的商品名为QuikClot⑧的材料产生了大量的水合热的缘故。存在修改和改善的需求，即将去水的沸石的再水化的水合热降到最低。发明概述本发明提供一种包含止血有效量的含硅的氧化物的组合物，该含硅的氧化物能在与血液接触后产生较少的水合热。通常，含硅的氧化物是带负电荷的。通过减少水合热，所述组合物减弱传统的止血剂的组织烧伤副作用，但不会对所述组合物的愈合伤口的性质产生不良影响。在本发明的一个组合物例子中，在与血液接触后，使用热成像测定得到水合热不大于125'C或不大于175'C，或者使用差示扫描量热法(DSC)测定得到水合热不大于680J/g或不大于660J/g。在一个实施例中，使用热成像测定得到水合热不大于67。C。在另一个实施例中，含硅的氧化物产生的水合热在IOOJ/g和650J/g之间。含硅的氧化物典型地选自玻璃珠、陶瓷、硅酸盐、铝硅酸盐、铝磷酸盐、硅藻土、生物活性玻璃、硼硅酸盐生物活性玻璃、二氧化钛和矾土；和任选的，硼硅酸玻璃或石英。所述的含硅的氧化物可以是沸石，单独或与其它含硅的氧化物组合。玻璃或陶瓷珠的直径可以是从大约10nm到大约100(im，或从大约IOOnm到大约100pm，在某些实施例中珠的直径为大约50-200nm。所述的含硅的氧化物可以具有一定范围的孔隙度，包括但不限于，具有直径为2-50nm的小孔的中孔硅酸盐、具有直径为50-100纳米的小孔的微孔(或亚微孔)硅酸盐、具有直径为100-200^m的小孔的大孔硅酸盐、或无孔的含硅的氧化物。所述组合物任选的还包含无机盐，例如二阶阳离子，比如包括但不限于锌、铜、镁、钙和镍。代表性的无机盐包括但不限于CaO、CaCl2、AgN03、Ca(N03)2、Mg(N03)2、Zn(N03)2、NH4N〇3、AgCl、Ag20、醋酸锌、乙酸镁、柠檬酸钙、柠檬酸锌、柠檬酸镁、乙酸钙和磷酸钙。在一个实施例中，通过离子交换提供AgN03，典型的装载最少大约0.2%原子数的Ag+，如通过X射线光电子光谱法所测定的。在另一个实施例中，通过固态混合提供AgNCb，典型地的装载最少大约0.01X重量的AgNO3。所述组合物可以包含铝硅酸盐，所述铝硅酸盐的硅元素比铝元素的比例是1.01或更大、32比1或更大，或者在某些实施例中、IOO比I或更大、或者1000比1或更大。其它的减少水合热的手段包括提供一种组合物，其中被水合的含硅的氧化物的重量在0.1%和25%之间、在0.1%和5%之间、或典型地在1%和5%之间。在一个实施例中，如使用BET氮气吸附法测定的，所述含硅的氧化物每克有在1和1000之间、或高达1500平方米的内表面积。本发明进一步提供了一种生产调节止血作用的组合物的方法；以及一种调节止血作用的方法，该方法包括使本发明的组合物与血液接触。在某些实施例中，所述的调节包括减少血液凝固时间。在某个实施例中，使用凝血弹性描记器⑧(thrombodastograph)测定的凝血开始时间(R)小于2分钟。在另外一个实施例中，使用凝血弹性描记器⑧测定的凝固速度(a)大于50°、或大于65°。在另一个实施例中，使用凝血弹性描记器⑧测定的凝血产生的最大凝结强度(MA)大于55mm，典型地在大约65和80mm之间。或者，所述调节包括增加、而不是减少血液凝固时间。所述的止血调节能够用于各种期望进行控制止血以增加或减少凝固时间的情况。比如，期望在伤口修复和外科手术环境避免过度失血时促进凝血。然而，在其它环境下，期望减少凝血以避免血栓症。期望控制止血的环境的一个例子是体外循环或者其他血液接触装置。还提供了一种包涂了本发明组合物的医学装置。可以通过组合物粉末形式或使用溶胶-凝胶化学、医生的刮制和焙烧、气溶胶喷涂、浸涂、禾口/或旋转铸造来制备包涂层。图1A显示了QuikClot⑧和一种银离子交换配方的差示扫描量热法(DSC)和热解重量分析(TGA)的结果。图1B显示了QuikClot、一种钡离子交换配方和一种锶离子交换配方的差示扫描量热(DSC)和热解重量分析(TGA)的结果。图2是斜置(tilt)测试试管检测测定的氯化钙和QuikClot⑧的混合物的凝结能力的结果图。图3是羊血和加入了QuikClot⑧的羊血的凝血弹性描记图(TEG)。图4是QuikClot、SBA-15、禾口3-10微米玻璃珠的凝血弹性描记图图5A是QuikClot吸收的水分含量与水合热的关系对比。图5B是加入了银的QuikClot吸收的水分含量与水合热的关系对比。图5C是加入了钡的QuikClot吸收的水分含量与水合热的关系对比。图6是QuikClot⑧的粉末X射线衍射图。三角形标出与沸石LTA-5A相关联的图像。插入图是沸石LTA结构的示意图，其中每个顶点代表交替的硅和铝原子，直线代表桥氧原子。a-结构的直径是11.4A,p-结构的直径是6.6A。ct-结构的小孔孔径的直径是4A。图7A是沸石LTA-5A颗粒的扫描电子显微照片。图7B是磨碎的沸石LTA-5A的扫描电子显微照片。图7C和7D是粘附在沸石LTA-5A结晶上的人血细胞的扫描电子显微照片。图8是沸石LTA-5A和银离子交换的沸石LTA-5A的热解重量分析和差示扫描量热的响应曲线。图9显示使用热成像照相机在体外测量的沸石LTA-5A(上)和银离子交换的沸石LTA-5A(下)的水合作用产生的最高温度。从左至右沸石从画面的顶端倒入有水的皮氏培养皿中。起始图像在左侧，最终图像在右侧。色彩梯度白色代表IO(TC和黑色代表22°C。视野大约是12厘米X12厘米。图10显示凝血弹性描记器⑧测定图。上左沸石LTA-5A的银交换配方。上右是沸石LTA-5A的碱金属交换配方。下沸石LTA-5A的碱土金属离子交换配方。图11显示作为沸石HA释放的水合热(J/g)的函数的体外凝固速率参数oc(°)。垂直的线条代表数据的土一个标准偏差。图12是平均凝结诱导时间R(min)和猪存活率的关系图。水平的线条代表数据的±—个标准偏差。图B是HAs的表面积(m2/g)与猪存活率的关系图。水平的线条代表数据的土一个标准偏差。图14显示绿脓杆菌的细菌生物膜的光学图。上左交叉接种在LB琼脂平板上生长，用于纯度测定和单一的菌落收集。上右沸石LTA-5A颗粒，其中沸石粒子上部长满了细菌生物膜。下左在银离子交换的沸石LTA-5A配方的附近廓清了细菌生物膜的区域。下右在压制成丸的银离子交换的沸石LTA-5A配方粉末的附近清除了细菌生物膜的区域。(在上右和下左图中的白色的划痕是房间光的反射)。图15显示热解重量分析和差示扫描量热计图A)沸石LTA-5A;B)银离子交换沸石LTA-5A;C)钠离子交换沸石LTA-5A;D)钾离子交换沸石LTA-5A;E)锶离子交换沸石LTA-5A;F)钡离子交换沸石LTA-5A。图16显示基于沸石的止血剂(HA)的X射线光电子光谱(XPS)图A)沸石LTA-5A;B)银离子交换沸石LTA-5A;C)钠离子交换沸石LTA-5A;D)钾离子交换沸石LTA-5A;E)锶离子交换沸石LTA-5A;F)钡离子交换沸石LTA-5A。图17的A-F显示止血剂的BETN2吸附等温线。图18显示氧化物凝血弹性描记器⑧的测定图。图19是生物活性玻璃(BG)的Si:Ca与凝结检测时间R(实心的图形)和凝固速度a(空心的图形)两者的关系图。数据是四次试验的平均值。園多孔的生物活性玻璃，參无孔的生物活性玻璃，T球状的生物活性玻璃。图20显示Si:Ca与凝结检测时间R(实心的图形)和凝固速度a(空心的图形)两者的关系图。数据是四次试验的平均值。BSBA-15，參玻璃珠，▲CaO，TCaC03，0羟磷灰石；和B)球形生物活性玻璃的透射电子显微镜图(TEM)。图21是一种喷雾热解机构的示意图。图22显示多孔生物活性玻璃的X射线光电子光谱测量扫描图。图23显示无孔生物活性玻璃的X射线光电子光谱测量扫描图。图24显示球形生物活性玻璃的X射线光电子光谱测量扫描图。图25显示不同的止血剂的钙二价键(Ca2p)的结合能的高解析度的X射线光电子光谱测量扫描图。图26是凝血弹性描记器⑧样品杯的示意图。图27是生物活性玻璃止血剂的凝血弹性描记器⑧测定图。两个图中的内部凝血弹性描记图是没有加入止血剂的羊血。图28显示饱和的生物活性玻璃样品的水解吸过程的热解重量分析(黑)和差示扫描量热分析(灰色)图A)多孔的生物活性玻璃80;B)多孔的生物活性玻璃80;C)无孔的生物活性玻璃60;D)无孔的生物活性玻璃80;E)SBA-15;F)QuikClot⑧。图29显示作为沸石的离子交换配方中银含量的函数的抗菌活性。图30显示作为沸石的固体状态混合配方中银含量的函数的抗菌活性。图31显示在细菌生长的第1、2和3天观察到的每个银-沸石小丸大小的廓清区域的大小。图32是凝血弹性描记器⑧测定的硅藻土的止血活性图。内曲线是没有加入任何试剂的羊血(正方形)，第二条曲线是20mg的硅藻土样品(PAW)(菱形)，最外面的曲线是20mg硅藻土样品(512)(三角形)。
发明内容本发明是基于下述发现，可以通过改变无机材料的水合作用和/或离子含量来控制止血剂的热量释放。另外，能够通过材料改变凝血和抗凝效果来适应特定的应用目的。本发明进一步提供能适用于不同环境(例如手术或外伤)制备组合物的替代方法。该无机材料包括含硅的氧化物，例如沸石、分子筛、陶瓷、纳米陶瓷、中孔硅酸盐和脱水状态下混合在一起的无机盐，该无机材料可以在医学使用前密封在聚酯薄膜袋中。颗粒大小、孔结构、水合状态、酸碱性质、孔大小和表面积能够综合地影响用作止血剂的每种材料。组合特定的陶瓷和氧化物，并加工成特定的大小能够调节各种通路的血液凝固级联反应。在本发明中描述的止血剂能够固定血液成分、浓縮凝血因子、控制局部的电解质浓度、和在损害部位产生可预测的热量。在本申请中很多示范的实施例使用沸石。当然其他的含硅的氧化物也能代替或和沸石一起使用作为分子筛。某些所述的替换的具体的实施例在下面进行详细的描述。定义除非另作说明，本申请使用的全部的科学和技术术语具备本在本领域中使用的通常含义。在本申请中，以下词或短语具有指定的含义。在本申请中使用的，"止血有效量"表示足以在2分钟内启动可检测的血液凝固(R)、禾口/或达到50°或更高的凝结速率(a)、禾口/或达到>50的凝结强度(MA)的量，如使用凝血弹性描记器⑧所测得的。测定止血有效性的检测在本领域中是已知的，并将在下面的实施例中进一步描述。在本申请中使用的，"凝血弹性描记器"检测指通常将大约5—30mg材料与340微升柠檬酸盐稳定的血液混合而进行的测量。在测量之前向柠檬酸盐稳定的血液中再补充钙离子以替代由柠檬酸盐螯合的钙离子。在本发明中，"差示扫描量热法"或"DSC"通过下述方法实现，首先在用KBr饱和水溶液来保持湿度为80X的封闭容器中使原料水合。然后测量作为温度的函数的与饱和材料中水解除吸附相关的差示扫描量热计响应值。总的"水合热"通过积分计算水解吸温度范围上的差示扫描量热计的响应值来得到。在本发明中，除非清楚的指出，"一种"或"一"意味着至少一个。基于沸石的实施例的综述沸石是高表面积多孔铝硅酸盐。所述氧化物结构骨架是由通过共用氧原子连接在一起的Si04和A104四面体单位构成的。在氧化物骨架中每个铝位点诱生一个负电荷，其能被存在于开放的多孔网络中通过库仑力结合在氧化物骨架上的相反的阳离子平衡。当沸石被尽量的干燥后，它们能够迅速地吸收达30重量％的水。沸石的再水化是一个发热或放热反应、并且能够可预测性地使己知体积的液体变暖。另外，沸石具有进一步的性质，即沸石内的阳离子能与和沸石接触的溶液进行离子交换。部分地由于上述性质，本发明中的LindeA型沸石型能够促使在流出的血液中产生血块，并暂时稳定病人以防过量失血死亡。在一个实施例中，本发明提供了一种加入了钙的LindeA型沸石，其是与碱金属、碱土金属、和/或过渡金属阳离子的水溶液进行离子交换得到的特异的离子配方。所述的离子交换沸石能够与中性无机盐，如氯化l丐、硫酸铝、和硝酸银混合，并干燥脱水。干燥的无机材料能够密封在聚酯薄膜袋中防止再水化，直到需要医学用药之前。在医学用药的时候，打开聚酯薄膜包将无机内容物倒入外伤损害部位。下文描述了对沸石(QuikClot)进行的三种不同的改良。每种改良为特定的应用提供了优点。1.离子交换沸石QuikClot,用钙做为主要存在的阳离子制得，与碱金属、碱土金属、和过渡金属的水溶液进行离子交换。通过在0.1M到1M的氯化锂、氯化钠、氯化钾、硝酸锶、硝酸钡、氯化铵、或硝酸银的水溶液中浸渍QuikClot三个三十分钟间隔来获得的。在各连续洗涤之间除去交换溶液。最后使用去离子水冲洗三次，完全去除没有掺入沸石材料中的任何可溶解的离子。离子交换材料在真空(10—3toir)加热到至少10(TC12小时，以去除沸石内部结合的水分。然后将材料封闭在聚酯薄膜袋中直到医学用药。2.沸石与无机盐的复合材料复合材料由在干燥状态混合在一起的QmkClot⑧和无机盐组成，所述无机盐包括但不限于氯化钙、硫酸铝、和硝酸银。所述无机盐在复合材料中按重量计在0.001%和50%之间。复合材料在真空(l(T3torr)加热到至少100。C12小时，以去除沸石内部结合的水分。然后将材料封闭在聚酯薄膜袋中直到医学用药。3.部分水合的沸石部分预水合的QuikClot⑧能够显著地减少再水化时的总热量。QidkCiot⑧可以贮存在一个固有湿度调节为0-80X(相对于纯相水)的湿度室中1天到2个星期。通过设置储藏条件的持续时间和湿度来控制水化程度。然后将部分水合的沸石封闭在聚酯薄膜袋中直到医学用药。预先水合也可以通过在密封容器中混合已知量的水和沸石来实现。所述密闭容器能够加热到至少6(TC，并慢慢地重新冷却使水均匀地分配到沸石粒子中间。填充了陶瓷和玻璃的效果在某些实施例中，本发明提供了一种组合物，该组合物包括止血有效量的含硅的氧化物、陶瓷、或纳米陶瓷。所述的含硅的氧化物、陶瓷、或纳米陶瓷选自玻璃珠、硅酸盐、中孔的硅酸盐、铝硅酸盐、铝磷酸盐、生物活性玻璃、二氧化钛、矾土、硼硅酸玻璃和石英。选择适合于用药目的的含硅的氧化物的大小和孔隙率。颗粒大小可以从纳米级到微米级，在某些实施例中优选使用从2-15纳米到IO微米，在另外一些实施例中，范围是2-50纳米。孔隙率可以是从纳米孔到大孔性的范围，在某些实施例中优先使用中孔的材料。当粒度减少时，总表面积将增加。已经证明有效的表面积的量是控制血块形成的关键参数。在某些实施例中，制备组合物以便调节止血。在某些实施例中，期望的调节包括增加止血作用，但是在另外一些实施例中，期望的调节包括降低止血作用或延长血液凝固的时间。这种的组合物能用于包涂医疗卫生器材，例如人工脏器、支架、泵、传感器和导管，也可以是接触到血液的容器和通路的内部。当装置包涂了本发明的组合物时，其表面诱导的凝血将减少或消除。抗菌活性在某些实施例中，组合物包括与银或其它具有抗菌作用的离子结合的含硅的氧化物。另外，可通过供给钙离子促进止血。在某些实施例中，本发明提供了一种能够控制成分例如抗菌素或其它治疗剂的释放的材料。所述的高表面积材料包括纳米颗粒、多孔颗粒和多孔纳米颗粒，颗粒如玻璃珠和A1P04(磷酸铝)斯定特样粒子(stint-like)、细粒、分子筛或中孔材料、具有不同的孔隙大小的双模态或多模态孔结构材料。混合送递平台包括由嵌段共聚物/无机复合材料、或有机-无机骨架结构(例如有机桥接二甲硅醚壁结构和Kuroda-Shimojima多孔硅石结构)组成(Shimojima,A和Kuroda,K.J，wC7謂./"/.显42,34,4057-4060)。所述的抗菌剂范围包括药物抗菌素、抗菌蛋白质或治疗剂和抗菌剂的组合。本发明所述的多孔材料可以具有如下结构孔径的大小在较宽范围内变化，容易地足够大以包容抗菌蛋白或其它的大分子，及小分子治疗剂或离子物质，并能按程序控制的释放送递药剂。这可通过将分子单元掺入孔壁并与之结合以限定所需药剂的程序化释放而得以实现。氧化物表面改良可以选择和设计粒子形态以使能够释放或螯合电解质和水。另外，材料能够通过附着生物活性剂，例如重组因子VII、银离子、热休克蛋白(HSP)进行改良。也有各种产生高表面积止血剂的方法。其中之一能够增加内表面积，可通过BETN2吸附进行测量该内表面积。内表面积能够通过优化孔隙率和/或使用纳米颗粒进行控制。为在本发明中的组合物中使用，可以将多孔材料制成具有在I-IOOOm"g之间的表面积、或达1500mVg的表面积。包括在本发明制剂中的是纳米孔、中孔、大孔和微孔(或亚微孔)。典型的孔径大小例子包括直径2-50nm、直径50-100nm、100-200nm、和直径达100-200um。具有大表面积的止血剂的纳米颗粒可使用本领域已知的方法生产。还可以增加止血剂的生物学上可用的表面积和实际表面积，使其更易被大的生物学反应物、蛋白质、细胞等等接近。例如，可以使用有机硅烷、氨基酸、羧酸、和Z或磷酸基使氧化物表面功能化，以促进凝结促进反应物的附着。方法本发明提供了一种生产调节止血作用的组合物的方法,以及一种包括使用本发明的组合物与血液接触来调节止血作用的方法。可以通过下面实施例中描述的方法制备具有调节止血作用且不产生过量热的组合物，包括预水合、离子交换和使用溶胶-凝胶化学方法。溶胶-凝胶化学能被用于生产生物活性玻璃。通过把溶胶-凝胶喷雾到热的(如，40(TC)熔炉中，可产生球形的生物活性玻璃颗粒。所述的生物活性玻璃颗粒可以小到直径10-50nm，或更小，或大到大约100nm或更大。在一个实施例中，颗粒的直径为50-200nm。在某些实施例中，调节止血的方法包括减少血液凝固时间。在某个实施例中，使用凝血弹性描记器⑧测定的可检测的凝血开始时间(R)小于2分钟，和可小于1.8分钟。在另一个实施例中，使用凝血弹性描记器⑧测定的凝固速度(a)大于50°。已获得超过55°,甚至超过65。的凝固速率。在进一步的实施例中，使用凝血弹性描记器⑧测定的代表凝血结果的最大凝结强度(MA)是55到100mm，和可小于75nm。或者，调节包括增加血液凝固时间。增加凝固时间是合乎需要的，例如，在凝结对于患者来说是一种健康威胁时。除调节止血之外，本发明的组合物可用于调节骨生长的方法中。在一个实施例中，该方法包括使用本发明的组合物接触骨来促进骨生长。还提供了一种使用本发明组合物包涂的医疗卫生器材及包涂医疗卫生器材的方法。包涂层可以采用粉末状的组合物或使用溶胶-凝胶化学、并使用本领域己知的常用方法制备。在一个实施例中，所述包涂层减少了与所述器材接触的血液的凝固。实施例以下的实施例用于阐述本发明，并帮助本领域普通技术人员制造和使用本发明。这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。实施例l:用于伤口愈合治疗的多孔无机材料配方本实施例描述了能减少5到40X水合热的QuikClot⑧的离子交换配方。图1A-1B显示的差示扫描量热曲线图表明该离子交换配方减少了水合热。配方包括离子交换LindeA型沸石和无机盐的混合物，所述无机盐包括但不限于氯化钙(CaCl2)、硫酸铝(A12(S04)3)和硝酸银(AgN03)。沸石的水合热与存在于沸石中的阳离子有关(Yu,BL等，J7z园oc/n7m.c""a，200(1992)299-308;Drebushchak，VAJ77謹a"加/Ca/or/mery58(1999)653-662;Mizota，T等，TTzermoc/^mZca爿cfa266(1995)331-341)。一般地，较大的和较低电荷的阳离子趋向于具有较低的水合热。另外，已发现相对于被吸附的水的量的沸石的水合热会随吸水增加而减少。这意味着在干燥沸石中的首先吸附水的位点具有最大的相关水合热，而最后吸附水的位点具有最小的相关水合热(associatedhydrationenthalpy)。沸石能用作硬水软化剂是由于其优先吸附特定的阳离子而不是其它离子，从而使阴性的铝硅酸盐骨架结构的电荷平衡。LindeA型沸石具有己知的阳离子选择性，可以使用各种离子的配方制备。可设计所述配方，以用于与血液交换离子，并用作对血液凝结机制起决定作用的离子的送递剂。还可以将沸石制成用于从血液中螯合离子，因此减少所接触血液的凝结活性。在本文列出的材料已经进行了优化，以吸收必要量的水分和进行离子交换以促进外伤损害伤口部位的血块迅速形成。除可直接地从沸石材料本身交换的离子之外,还可以与沸石共同混合少量的中性无机盐用于可溶性地释放到伤口部位。尤其是，但不限于这些例子,氯化钙、氯化镁、硫酸铝和硝酸银是与QuikClot⑧的离子交换制品共同混合，用于送递促进治疗性和抗菌性伤口愈合的离子。钙离子在凝血级联反应中扮演了普遍存在的角色(Davie,EW等，Aoc/^m/^^30,43,(1991)10363)。己经发现额外存在的钙离子和镁离子可以减少血块形成的时间(Sekiya，F等，所o/.C/7e,w.，271,No.15,8541-8544)。溶于水溶液的硫酸铝释放高电荷的离子物质。这些离子可以促使血液组份胶体沉淀，并进一步帮助血块迅速形成。低浓度的银离子已经被证明是有效的抗菌剂。将硝酸银盐掺入沸石A中可以产生增加的抗菌活性，这促进了积极的伤口愈合效果。向QuikClot⑧中添加干燥的氯化钙能够减少血块形成时间。其已经使用斜置测试试管分析测定(也可以通过血栓弹性描记法(TEG))。图2是血块形成动力学图。我们进一步证实在凝结过程中加入钙离子能显著地增加血液凝结强度。实施例2:玻璃和预水合的止血效果抗菌活性。本实施例描述了一种新的材料(含硅的氧化物和陶瓷)种类，其能够与QuikClot⑧共同配方使用或直接单独应用产生止血效果。另外,我们证实了QuikClot对典型的革兰氏阴性细菌的抗菌响应。将包含干燥沸石的QuikClot⑧应用于创伤血管出血的部位。在与血液接触的时候,在沸石吸附和螯合血液基质中的流动相组份的同时产生了大量的热。在我们的实验室还观察到，除脱水作用和发热之外、在沸石表面存在对血液组份的选择吸收以及局部电解质浓度的破坏。我们初步了解了以下四个参数之间的相互作用止血剂水合后释放的热量、止血剂的脱水容量、对血液组份的选择性表面吸收、和局部电解质浓度的控制，这让我们能鉴别出一类以前没有鉴别过的可用作止血剂的材料。这些材料是玻璃和相关的氧化物材料，其利用在血液和含硅的氧化物之间的固有的相互作用。无机氧化物固有地携带一种阳性或者阴性的表面电荷。沸石和分子筛，以及许多玻璃、硅酸盐、和各种的氧化物显著带电，并在与血液接触时与其中的带相反电荷的组份结合。我们给出核磁共振(NMR)光谱证据和凝血弹性描记器⑧曲线图以证实带电荷的氧化物固定了血液组份，并参与启动了血液凝固事件。核磁共振(NMR)光谱学是一种根据分子受到强磁场作用激发核跃迁产生的能量来鉴别分子的技术。比较羊血接触QuikClot⑧前后的'HNMR光谱，显示主要变化出现在通常与烷基质子有关的区域中。离心分离之后，血液将分成两个主要的部分。离心分离之后,血浆相(上部相)将存在于包含红血球及其他大的固体沉淀的相之上。使用这种分离方法，我们能够鉴别大部分与存在于血浆、或离心分离后的上部相中的分子有关的光谱改变。已经观察到感兴趣的两个主峰。当血液的上部相与QuikClot⑧.接触时，在5=2.5ppm出现一个峰。只有当没有被离心的全血接触QuikClot⑧时，才会在5=1.7ppm观察到第二个峰。在文献中存在先例将在S=2.5ppm的峰归因于在血浆或离心分离之后的血液上部相中发现的磷脂(即鞘磷脂和磷脂酰胆碱)中的烷基部位(Murphy等，说oc/em^o;39No.32(2000)9763;Yang等，^wa/.AocAem&^y324,(2004)29)。在S二2.5ppm的峰上观察到化学位移各向异性(CSA)。当样品以较高速度旋转时，S-2.5ppm的峰变得更加对称，且强度增加。这表明与所述峰有关的分子相对于周围分子是固定的。"p光谱还提示它是一种一旦暴露于沸石就变成固定的含磷的化合物。我们目前认为，此系统涉及选择性地将血液中的至少某些磷脂吸收到具有电荷的氧化物上。凝血弹性描记器⑧是一种能够测量作为时间的函数的的凝结过程中血液粘度改变的仪器。图3显示了羊血和暴露于QuikClot⑧的羊血的凝结曲线图。各种参数，包括图形分离的时间、图形上升的角度和图形全部分离，表现出不同的血液凝固现象。我们己经证明，正如在图4中描绘的，许多氧化物,包括常见的实验室玻璃珠、中孔的硅酸盐如SBA-15(Huo等，胸,368,(1994)317)，多孔、和无孔的硅酸盐以类似QuikCio惚的方式促使血液凝固。这些材料和相关的硅酸盐、铝硅酸盐、铝磷酸盐、陶瓷、纳米陶瓷、和氧化物能够与QuikClot⑧制成共同混合物作为止血剂使用或者自身即可作为止血剂使用。这些材料的优点是它们与原来的QuikClot⑧配方相比具有相当低的水合热。预先水合预先水合QuikClot⑧可用于淬灭首先吸收水的部位，因此在止血用药时能大幅度地减少水合热的总量。在本实施例中，包括了与作为所吸收的水量的函数的释放的热量相关的详细信息，用于产生QuikClot⑧的不同离子配方的最佳水合配方。差示扫描量热法已经用于测量水从水合形式的QuikClot以及QuikClot⑧的水合离子交换配方中解吸所产生的热量。假设其是一种可逆的交互作用,就可以测定所吸附的一定量的水所放出的热量(Drebushchak，V.A.J.rAermfl/J/^/j;5&Ca/on'me^y,58,(1999),653)。图5显示了吸收一定数量的水放出的热量。很明显吸水后水合热稳定地减少。根据这个现象,理想的是把QuikClot⑧干燥到低于最大脱水容量的某个点。通过保留某些残余水在材料中，最热的首先吸附水的位点将被猝灭。在不显著影响材料止血效力的情况下，可预先饱和少量的水。抗菌活性一种加入了银的QuikClot配方被证明对绿脓杆菌(Aewc^mowwJen^/mwa)(—种典型的革兰氏阴性菌)有抗菌活性。加入了银的QuikClot⑧配方向磷酸盐缓冲盐水溶液中释放浓度为百万分之三的银离子。这正好在之前报告的抗菌浓度之上，并进一步支持了观测到的对革兰氏阴性菌的抗菌性。加入了银的QuikClot被添加到琼脂平板中的琼脂上的几个部位。在QuikClot⑧沉积的位置上被廓清的区域相当明显。这些结果在下一个实施例所述的进一步研究中被进一步证实。实施例3:用于促使创伤止血和治疗愈合的主-客复合材料(host-guestcomposite)本实施例描述和定量表述了用于减少基于沸石的止血剂(HA)在用药的时候所释放的大量热的两个策略1)离子交换和2)预先水合。制备了原止血剂的五种离子交换衍生物，并使用两种方法分析了止血有效性，所述方法为在体外使用血栓弹性描记器(TEG)和在体内使用临床猪试验。发现接触激活凝固速率(x随止血剂释放的热量增加。体外凝结诱导时间R和止血剂的表面积已经确定为是体内止血的效果的预报因子。一个建议是根据这些参数来选择止血剂的材料，这或许可以减少测试一种新的止血剂所需的涉及动物的实验的数量，和相关的劳动和资金成本。已经描述和证实了一种用于把抗革兰氏阴性的绿脓杆菌的抗菌活性掺入到LTA-5A沸石的银交换配方的方法。体外凝血弹性描记器⑧分析从动物组织的许可供应商处获得柠檬酸盐稳定的羊血(Hemostat,Davis,California;QuadFive,Ryegate,Montana)。本研究被力口禾ll福尼亚州圣巴巴拉市加利福尼亚圣巴巴拉大学的动物关心和使用委员会批准。临床研究发表在另外一处的临床研究的猪生存率将仅为讨论目的而加以参考，并为本报告中的数据提供了参考。马里兰州贝塞斯达的军队卫生服务大学(USUHS)的有关动物关心和使用的实验动物审查委员会批准了本研究。全部的研究都遵照动物福利法案及其他的与动物和涉及动物的实验有关的联邦法和规章来进行。本研究遵守国家研究委员会1996版的实验动物的关心和使用的国家指导原则。材料制备按照计划交换的离子类型，Linde5A型沸石止血剂与NaCl、KC1、Ba(N03)2、Sr(N03)2、或AgN03的水溶液进行离子交换。300gLinde5A型沸石止血剂浸入lL0.1M的LiBr、NaCl、KC1、Ba(N03)2、Sr(N03)2、或AgN03水溶液中2个小时。Linde5A型沸石由Z-Medica,Inc.赠与。倾析上层清液，用新制备的盐溶液重复此过程三次。使用1L的去离子水冲洗离子交换产品三次，去除未缔合的离子。在真空为3X10、tm下以5t7min的速度加热到30(TC的真空烘箱的浅床上干燥离子交换产品。每种离子交换止血剂的经验式通过X射线光电子光谱法(XPS)测定。每种Linde5A型沸石的离子交换配方的经验式都通过对从KmtosAxisUltmXPS分光计上采集的测量扫描值进行积分来计算。所有的研究材料在分析之前都在60。C的真空下贮藏12小时。研碎的粉末被压制成片附着于双侧铜带上，并使用铜带的另一侧附着于样品座上。图15包含所有分析的止血剂的热解重量分析法和差示扫描量热法的曲线图。通过X射线粉末衍射(XRD)鉴别结晶相。X射线粉末衍射图是通过使用单色CuKcc辐射的ScintagX2仪器采集得到的。样品在衍射分析之前使用研钵和研棒磨碎。图16包含每个止血剂的X射线光电子光谱图，用于计算经验式。表面积通过BETN2吸附测定。每种材料的表面积分析是使用MicromeriticsTriStar3000来完成的。80-150mg的每种基于沸石的止血剂被放置于BET样品管中，并通过流过20(TC的N2l2小时进行干燥。使用BET模型计算表面积。图17A-17F包含止血剂的BET表面积分析。扫描电子显微镜(SEM)使用FEIXL40SirionFEG显微镜获得扫描电子显微镜图像。样品放置在铝台上，并使用Au/Pt合金进行溅射。图像在加速电压范围为2-5kV时采集。沸石粒子被浸入一小摊新鲜取得的人血中，所述人血通过微针穿刺指尖获得。在成像之前，粒子使用磷酸盐缓冲盐水溶液洗涤以去除未完全地粘附的材料。热解重量分析(TGA)和差示扫描量热法(DSC)测定沸石水合热的标准方法是测量水从水合沸石解吸产生的热，并假定其是一个可逆的水合反应(Drebushchak,V.A.J.7T^〃wa/J加/"^C"/on'we//7,58(1999)653)。离子交换沸石止血剂在一个密闭容器中贮存了2个星期，悬吊在一个包含KBr饱和水溶液的平皿上，其保持相对湿度为80%。使用NetzchSTA409C定量测定与水从沸石解吸相关的热量。10-15mg每种水合沸石被放置于带有松弛附装的铝盖的铝坩埚中；一个空的铝柑埚和盖用作参比池。每一样品以l(TC/min的速度从2(rC加热到35(rC。通过热解重量分析(TGA)分析水分流失而测定每种止血剂的水合容量，同时积分采集到的差示扫描量热(DSC)曲线以获得脱水反应的总热量(见图15)。热成像使用SantaBarbaraFocalPlane液氮冷却的ImagIRLC摄影机进行热成像，直接测定使用止血剂时的体外温度增加。热成像摄影机在2CTC到IO(TC范围内校准。上述方法也可以用于体内应用。使用28Hz的帧速率拍摄试验。在摄像机上安装了JanosTechnology的一种ISO25mmF/2.3MWIR聚焦透镜。促使凝结形成的血栓弹性描记器(TEG)分析使用血栓弹性描记器Haemoscopemodel5000获得暴露于待测试的止血材料的柠檬酸钠(4%v/v)稳定的羊血的体外凝结参数(血液从QuadFive:Ryegate,Montana处获得)。在加入止血剂之前，20pL的0.2MCaCl2水溶液被加入到340(aL稳定的羊血中以补充被柠檬酸盐螯合的Ca"离子和修复血液的凝结活性。在分析之前止血剂被干燥并保存在氩气氛中。20mg基于沸石的止血剂直接加入含有羊血的凝血弹性描记器⑧样品杯中，并再供给(^2+离子。样品杯依悬浮在旋转的样品中间的扭丝旋转大约±5°。当变硬的血块拉到扭丝上时，作为时间函数的粘弹性凝结强度(切变模量(sheerelasticity))的变化就被监测到(参见图IO)。直到凝结强度的曲线图分裂的时间被称为R时间，代表开始检测到凝结形成。在上升的曲线的切线和水平线之间的角度被称为ot参数，a参数与凝固速度有关。粘度曲线分裂的最大幅度被称为MA参数，代表最大凝结强度。获自待测止血剂的一系列凝血弹性描记参数列表于下(见表3)。抗菌分析来自于编档保存(-80°(:)的原种培养的绿脓杆菌？0201(UrsOschner,科罗拉多大学)在Luria-Bertani(LB)琼脂上30。C过夜培养。在检査纯度之后，将一个单独的菌落分散于2mL无菌0.9。/。NaCl纳滤(nanopure)的水溶液中。使用100jiL悬浮液制备涂布(LB琼脂)平皿。待测材料的杀菌活性通过在涂布平板上沉积止血剂的颗粒和压丸，并在3(TC培养平板24小时来评估。相对杀菌活性通过测量在小丸周围没有生长的区域(廓清区域)来评价(见表4)。测量5个相同样品在lcm的小丸周围没有生长的区域的垂直和水平的尺寸，并对测量结果进行平均。猪体内分析模型在马里兰州贝塞斯达的军队卫生服务大学分析了离子交换止血剂的体内效果。详细描述将改良止血剂临床应用于一个致命性的猪腹股沟创伤的报告将发表在Ahuja等，/rrawm,2006中。由这些试验获得的的猪存活率己在最近的军队医学的研究会议上被讨论(AlamHasanB.，沸石止血勇夂料战场应用(ZeoliteHemostaticDressing:BattlefieldUse)Wvawcec/7fec/mo/ogy^4，//caWow/orComi^Owwfl/(yCare(ATACCC);2005年8月15-17日；St.Petersburg,FL.;2005)。这些存活率包括在本文之中，以为体外体外凝血弹性描记器⑧分析和材料特征提供参考。在临床猪试验之前进行测试无机止血剂的体外凝血弹性描记方法，其包括使用可以认为是体外血液动力学的研究中最广泛使用的羊血。通过确定与体内猪存活率相关的重要的体外凝血弹性描记器⑧的凝结参数和材料性质，应能不用每个新配方都实施大规模地动物试验而更好地预测下一代止血剂的效果。基于沸石的止血剂的体内效果的测试方法已在现有技术中描述过(AlamHB,KheirabadiBS,J7>awma2005;59(1):34-35;AlamHB等，Jrrawma2003;54(6):1077-1082)。简要地说，通过横切大腿近侧的软组织(皮肤、四头肌、闭壳肌)和完全分离在腹股沟韧带下的股动脉和静脉，在麻醉的约克夏(Yorkshire)猪(40-55公斤)上产生一个致命性的腹股沟创伤。失血3分钟之后，由医师直接将离子交换止血剂应用到出血伤口，并施加外压。研究完全结束之前实施本试验的医师不知道他们测试的是哪种止血剂。基于沸石的止血剂的组成和结构QuikClot⑧的X射线衍射图(图6)证实主要的活性组分是通常被认为是钙-A的Linde5A型沸石。Si:Al的比例是l，和当完全水合时经验式通过X射线衍射、热解重量分析和X射线光电子光谱法鉴别是Na0.5Ca5.75(SiO2)12(AlO2)1227H20(图6,8,16)。带阳电荷的Ca"和Na+阳离子存在于两个内部的多孔的栅中。大的称为a栅，直径为11.4A。小的称为P栅，直径为6.6A。(x栅的可吸附的分子能够通过进入的小孔孔径的直径为4A。这些孔径的意义在于最有可能进入沸石的多孔结晶主体(bulk)的血液成分是小的物质，例如水和电解质(例如Na+、Ca2+)。沸石对水的亲和力很高，因此当将沸石应用于血液时会选择性脱水血液，从而对血浆产生浓縮的效果。所述对水的亲和力的结果是在水合时放出明显的能量。QuikClot⑧做为直径为大约600i^n的颗粒包装。这些颗粒由结晶组分和无定形粘合剂组成。沸石LTA-5A的接触血液前后的扫描电子显微照片(图7)表明血细胞附着于止血剂并被脱水，导致细胞形态学的改变。还值得注意的是，沸石结晶的尺寸与血细胞处于同一级数，分别是l一2pm禾卩5pm。水合热本研究的主要目的是确定在对伤口愈合的性质没有不利影响的情况下减少止血剂用药产生的过量热的策略。通过TGA和DSC分析减弱止血剂的水合热的两个方法1)离子交换和2)预先水合。TGA用于测量作为温度函数的饱和沸石中的水质量损失，DSC用于定量测定与此方法相关的热量。通过积分DSC响应值来计算每种止血剂的可逆的水合热。原始的止血剂能够吸收按重量计接近于20%的水和每克沸石水合时释放680焦耳的能量。在用Ag+离子交换原始止血剂中的C^+和Na+离子之后(Ag3.26Ca4.3Q(Si02)12(A102)12.xH20)，加入了银的沸石吸收12重量％的水和释放420J/g沸石。当原始的止血剂与Ag+离子进行了离子交换时，DSC曲线最低点位移到较低的温度，表明与C^+离子存在于原始止血剂配方比较，吸附的水分子和银离子改良沸石之间的吸引能量降低了(图8)。除Ag+离子交换配方之外,制备了一系列的碱金属和碱土金属离子交换配方。每个配方的经验式、水合容量和水合热都列在下面(表l，见图15的每种离子交换止血剂的TGA和DSC图)。类似于库仑定律(E吸引力oc(Q,*Q2)/r，其中Q是电荷的数量，r是相互作用的距离)，在极性水分子和单价离子之间的吸引能量往往比同样大小的二价离子低，而且较大的阳离子也往往低于相同化合价的较小离子。尽管沸石LTA-5A对每种离子的不同的选择性限制了离子负荷量，但是原始止血剂中一部分C^+离子被Na+、K+、Sr2+、Ba2+、或Ag+离子置换仍导致水合热减少。表l:沸石LTA的一系列离子交换配方的水合容量。/。W)和水合热(J/g)<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>第二个策略，除离子交换之外，在医学使用之前预先水合止血剂以减少原始止血剂的水合热。在沸石水合的时候产生的热量大部分是在再水合开始时，当初始的吸附点饱和时，水合热随着吸附水的增加而不断地减少。因此止血剂的"最热"的吸附点是与水结合的最初的位点。通过预先水合原始的沸石LTA-5A1重量％，有可能减少大约2/5的产生的总热量(表2)。通过预先水合银离子交换的止血剂1%，产生的总热量能够减少1/2。虽然这种降低热量的策略已经被确定和定量，但是预先水合的沸石的凝结性质还没有在本报告中论述。预先水合的策略仅仅用于强度同样达到减少水合热的替换方法。表2:应用是否预先水合的止血剂产生(计算)的总热量(J/g)样品△H水合0%预先水合△H水合1%预先水合AH水合3%预先水合沸石LTA-5A680J/g415J/g253J/g银交换沸石LTA-5A420J/g212J/gUlJ/g热成像DSC对于定量脱水沸石水合释放的热量(即Q)是必需的，但是单单这一种测量方法还不足以预测止血剂应用于出血伤口所加热到的实际温度。与热量流动相关的物质温度改变是AT^Q/(m-Cp)，其中AT是温度的变化，Q是热量，m是物质的质量，Cp是物质的热容。热成像能够动态地监察体外升温，该升温是吸水量、吸收率和伤口几何形状的函数。热成像是一种不会引入可能影响热响应的外来杂物、获得水合止血剂的热传播和最终温度的3维图像的非侵入方法。这种方法可以精确地测量无法使用温度计提供材料的热容量和温度的快速变化的小规模实验的温度。在将5g沸石止血剂注入含有5ml水的盘子中时记录每个影像。从热成像影像中选择的当将干燥沸石注入到含有水的容器中的帧证明了能够达到的温度范围(图9)。这个方法还可以直接地用于体内监测血栓形成和血栓溶解的热量效果。沸石对水的亲合力是非常大的以至于止血剂材料在接触下方的含水的碟之前，向下划过空气时就通过吸附空气中的水而被加热。在完全水合之后，原始的止血剂配方被加热到95。C，而银交换配方被加热到38。C。银离子交换止血剂的加热温度高于人体(37°C)不多,然而原始的止血剂按同样的方式使用可能会导致严重的生物组织烧伤。促使血栓形成的血栓弹性描记器(TEG)分析凝血弹性描记器⑧是测量止血材料促使血栓形成效果的标准方法，能定量凝血幵始时间R(min)、凝固速度a(。)和最大凝结强度(MA)(mm)。添加0.2M的CaCl2(/JO溶液至羊血中，用于补充与拧檬酸稳定分子螯合的C^+离子之后立刻加入沸石止血剂。凝血弹性描记器⑧数据和列出的基于沸石的止血剂的凝结参数列在下面(图10、表3)。不加入任何无机试剂，羊血开始凝结的时间平均是R-10.9min,a参数为50.2。。与单独的羊血相比，所有的沸石止血剂都在更短的时间内开始凝血，R《2.2min和具有增加的凝固速度ot》52。。在止血剂放热和促使凝血的速度之间有一个明确的关系(图11)。加入了止血剂后对最终的凝结强度MA没有显著的影响。表3:体外凝血弹性描记器⑧测定的凝结参数。列出了平均值和标准差。也列出了离子交换沸石LTA-5A的猪的存活率。<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>通过鉴别决定性的体外参数预测体内存活率分析离子交换配方的体内存活率。在这些试验中，完全切断和猪的腹股沟韧带水平的股动脉和静脉来模拟一个普通的致命性的战场创伤。在流血3分钟后使用基于沸石的止血剂来控制受伤动物的出血。观察到沸石LTA-5A的银交换配方和钡交换配方能产生最高的存活率，其中75%(8只里的6只)动物存活。钠交换配方的结果是外伤性创伤的猪超过半数存活，57%(7只里的4只)。锶交换和钾交换的配方导致最低的存活率，在股动脉创伤后所有的猪均死亡了(2只里的0只存活)。虽然与单独的羊血相比，体内试验测试的所有离子交换止血剂表现了促进体外凝结的特征，但是仅有具有体外平均凝结诱导时间R《1.8的药剂与75%猪存活率相互关联(图12)。在止血剂的表面积和猪的存活率之间也有正向的关系。具有》634mVg表面积的药剂与75。/。猪存活率相互关联(图13)。抗菌活性以一个常见的条件性病原微生物革兰氏阴性致病菌绿脓杆菌为参照，测试了沸石LTA-5A和离子交换配方的抗菌活性。仅有银交换配方展现了明显的抗菌活性，证据是在银离子交换型沸石颗粒周围出现的细菌生物膜被廓清的区域(图14)。在24小时的培养之后观察到没有细菌生长的区域的平均直径是1.45cm(表4)。相对于lcm的止血剂压丸,没有细菌生长的区域的几何表面积大于小丸表面积的倍数是2.2。加入了银材料的廓清区域随着时间推移而仍保留，证明极少量的释放的银离子是真正的杀菌而不是简单地延缓细菌繁殖。除银交换配方外，原始的止血剂和所有其它的离子交换配方既不具有杀菌性也不抑制细菌绿脓杆菌，在小丸的上面和下面都观察到了细菌生物膜的生长。表4:在止血剂压丸周围没有绿脓杆菌生长的区域。<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>沸石止血剂促使的凝血基于沸石的止血剂是轻的高表面积的材料，它能用于各种外伤性的创伤，在获得更加高级的护理条件之前用来控制出血和使受害者安全。由基于沸石的止血剂诱导的加速的凝血响应是由多种因素导致的，包括血浆代谢物浓縮、血液凝固级联反应的接触激活作用和伤害组织的热升温。沸石能够吸收大量的水(按重量计20%)，这能够浓缩出血血液中的血浆代谢物。沸石的极性铝硅酸盐骨架结构是一个用于激活凝血级联反应的固有途径的理想表面。血液学的研究人员对这个现象非常熟悉，认为是"玻璃效应"，即与低极性得塑料样表面相比在极性玻璃样表面的血液往往凝结得更快。目前的理解是，极性表面参与到凝结因子XII和XI以及前激肽释放酶和辅助因子HWK-激肽原和C^+离子的自催化的激活中。基于沸石的止血剂成为用来处理外伤性的创伤的新例子，部分是由于它们能够促进接触激活作用的能力。因为沸石在医学应用时具有最小的生物吸收，能传递和吸附生理活性离子，并能够调节热升温和局部的生物组织脱水作用，因此它们是理想的设计止血剂的材料平台。虽然原始的止血剂释放的过量热量往往烧伤健康组织，但在血栓形成速度和沸石止血剂的放热之间还是有一定的关系(图ll)。最近的研究也认为凝固速率与温度、浓縮物和局部电解质情况有关(WolbergAS等，J7>flwma2004;56(6):1221-1228)。把伤口加热到一定的程度应能促进凝结的形成，然而，加热到烧伤组织的程度是不必要的。因为沸石的"主-客"特性允许精确的调节它们的化学、物理和热力学性质(HdfferichF.，/而五xc/m"ge.纽约，McGraw-HillBook公司；1962)，可将这些材料配制用于各种伤口愈合情况。可调的热反应基于沸石的材料的主-客特性允许在应用热量和水合容量之间进行可调的响应。本报告集中在两个用于减少原始沸石止血剂热量释放的策略，离子交换和预先水合。通过选择合适的阳离子与原始材料进行离子交换，可以使完全干燥沸石的水合温度在38x:和io(rc之间(图9)。在银离子和水之间的相互作用不如c^+有利，证据是与原始配方相比银交换止血剂的DSC曲线最低点位移到较低的温度。使用其它的离子交换进一步降低水合热是可能的，然而，包含在本报告中的配方是在体外试验中能最快开始血液凝固的配方。未包括在本研究中的某些沸石LTA-5A的离子交换配方能够从伤口吸附钙离子,不管其有多小的水合热这都不利于快速形成凝结。因为水合产生的热量作为吸收水量的函数而减少，就可能通过小心的预先水合止血剂而进一步减少产生的总热量。例如，我们的结果表明通过预先水合银交换沸石1%，淬灭初始吸附位点，使得产生的总热量减少1/2(表2)。通过预先水合样品，可容易获得接近于人体的温度。体外凝结诱导时间R、止血剂的表面积和体内止血效果在人体上测试止血剂之前，必须进行严谨的动物试验方案以确保病人在医学发现研究中不会受到不必要的伤害。动物试验非常昂贵的，更不必提及为关心动物试验前、试验中和试验后的医学专业人员花费的时间。基于其水合时具有减少的热反应的能力以及相对于单独的羊血具有加快的体外凝结响应而选出送去USUHS进行临床试验的材料。在猪试验上分析的所有减少了水合热的配方都符合这个标准，但是它们的体内效果不是仅仅由体外结果代表。通过确定能够预测体内止血有效性的最关键的体外凝结参数，有可能更好地选出用于临床的下一代止血剂。这将可能减少开发改进的止血剂材料而进行的动物试验的总需求。为了稳定一个具有生命威胁的出血的病人的病情，重要的是尽快开始形成血块。在通过凝血弹性描记器⑧测得的凝结形成开始时间和猪的存活率之间存在明显的相关性。平均体外凝结诱导时间11=1.8min或更短与破坏股动脉的猪的75%存活有关联(图12)。平均R参数大于2.1分钟与更多的猪死亡有关联。通过TEG测量的短的开始时间将是任何新设计的止血剂在进行动物试验之前的一个首先考虑的因素。近期的研究表明凝结反应进行的有效表面积是非常重要的(HoffmanM.JrAram677zram幻/"2003;16(1-2):17-20)。主要的蛋白质、碳水化合物、磷脂和离子复合物，包括"tenase"复合物和凝血酶，需要不同的催化表面(即血小板单元的表面)以激活血栓形成。在沸石止血剂的表面积和猪的存活率之间有正的相关性(图13)。具有最高猪存活率的止血剂银交换LTA-5A和钡交换LTA-5A也具有最大的表面积，分别是723mVg和634m2/g。表面积小于457m:g的止血剂导致很多猪死亡。因为沸石的小孔孔径较小(4A),对细胞和大生物分子仅有的可相互作用的有效表面区域是颗粒外周的表面。在内部的多孔结构的大范围的表面积将影响水合的速度，水合容量和离子移动性。因此可合理地得出带有大的内表面积的止血剂适合作为快速凝结剂的结论。抗菌活性浓度为十亿分之几的银离子己知对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌都具有抗菌活性。带有银离子的离子交换LTA沸石的非常好的结果是减少水合热的同时提供抗菌活性。在LB琼脂实验中证明了银交换配方对绿脓杆菌的抗菌活性。在24个小时内保持了一个大约是止血剂尺寸两倍的没有生长的区域。由于容易掺入医学材料中，这种抗菌技术应得到普遍的应用。尽管由于水合放热有潜在的损伤组织的副作用，基于沸石的止血剂在现实世界中治疗危及生命的出血仍表现了高存活率。两个策略，l)离子交换和2)预先水合，己经确定用于减少所述止血剂用药时释放的热。已经制备了原始止血剂的五种不同的离子配方，并描述了它们的材料、热量和体外凝结特征。体外血液凝固参数已经与体内止血效果建立了联系，以确定用于预测止血有效性的最重要的参数。本报告包括无机材料促使血块形成的第一个TEG⑧分析。凝结诱导时间R和止血剂的表面积是影响止血有效性的重要参数。在接触激活凝血速率和止血剂释放的热量之间也存在正的关系。这种趋势将改善选择下一代止血剂的方法，和因此减少不必要涉及试验的动物和相应的劳动和资金。还描述和证实了一种用于在止血原料中结合入抗菌活性的方法，即抗革兰氏阴性绿脓杆菌的沸石LTA-5A的银交换配方。实施例4:氧化物止血活性在本实施例中，通过凝血弹性描记器⑧评价具有可调节的体外止血活性的高表面积生物活性玻璃(BG)，所述的凝血弹性描记器⑧是一个标准的用于定量血液在血栓形成和纤维蛋白溶解过程中的粘弹性变化的医疗设备。记载了与BG有关的止血趋势、和一种新的球形BG的制备、以及类似的含有硅和钙的氧化物，并且描述了与Si:Ca比、Ca2+可获得性和配合环境、孔隙率、AH^和表面积。本报告提供了一个已经作为很好的伤口愈合介质的材料的新的止血用途。血液的接触激活作用通常被称为"玻璃效应"，极性表面通过此过程激活血液凝固级联反应的固有途径，这种作用也是观察到的血液往往在玻璃表面比在塑料表面凝结得更牢固的根本原理。凝结因子XII、XI、前激肽释放酶和高分子量激肽原的自催化激活起源于血液暴露于一个外在的极性表面，自催化激活再依次激活许多负责凝血酶和血纤蛋白聚合的结合(association)的反馈机帝U。用于固定表面依赖性凝结反应的参与物和Ca2+离子的表面区域对上述化学动力学反应是必要的，所述的表面依赖凝结反应的参与物和Ca2+离子是促进定向蛋白装配和血纤蛋白生成酶(例如tenase复合物)的辅助因子。由Hench和其合作者在70年代后期开发的用于骨修复的BG是一种通式为Si02-CaO-P205-MO(M=Na、Mg等)的复合材料(Hench，L丄.，JJM.Ceram.Soc.1998,81,1705)。我们确定BG是一种理想的无机止血剂，因为BG在水合过程中释放C^+离子，并且由不溶的核心组成，能够为血栓形成提供有效的支撑。我们己制备了一种新的高表面积的多孔BG，并且证明将其浸泡于模拟体液时能促进体外磷灰石发育。我们扩展了溶胶-凝胶合成制备方法，使其包括在管式炉中400。C喷雾热解，以制备新型的球形BG。生物活性玻璃止血剂的合成多孔的生物活性玻璃止血剂通过溶胶-凝胶蒸发促使的自动装配方法制备，该方法使用四乙基原硅酸酯、Ca(N03)2和磷酸三乙酯做为无机前体和三嵌段共聚物聚(环氧乙垸)-聚(环氧丙垸)-聚(环氧乙垸)(PluronicP123,EO20PO70EO20)作为结构指导介质。合成无孔的生物活性玻璃包括同样的合成方法但不掺入P123。首先制备P123的20。/。w/w的乙醇溶液。制备含15%水、5%HC1、40%无机前体和40%w/w乙醇的单独的溶液。所有的生物活性玻璃材料的磷相对于硅和钙的摩尔分数保持在4%。前体溶胶与共聚物溶液按l:l的比例混合在皮氏培养皿中，并在6(TC干燥8h，使无机前体交联。为制备无孔的生物活性玻璃,使用纯乙醇替换P123的20。/。w/w乙醇溶液。产品在空气中550。C焙烧4h用于除去嵌段共聚球形生物活性玻璃通过将如上所述的溶胶-凝胶溶液喷雾入一个加热到40(TC的水平管式炉中而制备。所述的焙烧球形生物活性玻璃被收集在设置在水平管式炉终端的收集阱中的滤纸上。喷雾热解装置的概略显示如下。X射线光电子光谱使用KratosAxisUltraX射线光电子分光计测定在氧化物止血剂的经验式、Si:Ca的比例和Ca2p电子束结合能(electronbindingenergy)。所有的材料在分析之前都在真空6(TC下贮藏12小时。将研碎的粉末压制成片，附着于双侧铜带上，并附着于样品座上。光谱参照285eV的CIs峰。血块形成的凝血弹性描记⑧分析使用凝血弹性描记器⑧HaemoscopeModel5000分析BG止血剂的体外止血活性，方法为把20mg的干燥止血剂(在真空下加热到100。C并保存在氩手套箱中)加入到装有34(^L4。/。v/v柠檬酸盐稳定羊血(血液购自QuadFiveofRyegate，MT)禾口20(iL0.2MCaCl2(水溶液)的聚乙烯样品杯中。将20pL0.2M的CaCl2水溶液加入到稳定的血液中以补充被柠檬酸盐螯合的(^2+离子，所述的柠檬酸是加入到藏血中防止凝血的。血液贮存在8。C。凝血弹性描记器⑧的样品杯沿着一条垂直的悬浮在样品杯中的扭丝<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>表6:凝血弹性描记器⑧测定的氧化物止血剂的凝结性质。<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>热解重量分析(TGA)和差示扫描量热法(DSC)测定多孔氧化物的水合热的标准方法是测定水从水合氧化物的解吸产生的热，并假定其是一个可逆的水合反应。止血剂在一个密闭容器中贮存2个星期，悬吊在一个包含KBr饱和水溶液的皮氏培养皿上，其保持相对湿度为80%。使用NetzcheSTA409C定量测量与水从止血剂解吸相关的热量。10-15mg每种水合止血剂被放置于带有松弛附着的铝盖的铝坩埚中；一个空的铝坩埚和盖用作参比池。每一样品以l(rC/min.的速度从2(TC加热到35(TC。通过分析水分流失的热解重量分析(TGA)测定每种止血剂的水合容量,同时积分采集到的差示扫描量热(DSC)曲线以获得脱水反应的总表7:选择的止血剂的水合容量和AH,w(计算)<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>BET法表面积分析在MicromeriticsTristar3000上进行BET氮吸附-解吸等温线和孔径分布的测量。在BET分析之前样品在流动的N2下在200。C干燥12小时。TEM样品制备球形的BG被粉碎并分散在异丙醇中。将一滴上述浑浊的溶液沉积到一个带状的碳TEM格子中。样品在FEITechnaiG2Sphera中在200kv加速电压下成像。表8:BG的BET法表面积分析<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>凝血弹性描记器⑧是一个通过监视凝结过程中作为时间的函数血液茅占弹性的变化来评价血液病症的仪器(HaemoscopeCorporation,Niles，IL)。装有血液和止血剂的聚乙烯杯围绕一个扭丝旋转士5。。双模对称(bimodally-symmetric)的粘弹性曲线图的振幅达到2mm的时间称为R(min),代表开始检测到凝结形成。在曲线的切线和水平线之间的角度称为oi(。),与凝固速度有关。曲线的最大分离称为MA，代表最大凝结强度(dyn/cm2)。材料研究的代表性凝血弹性描记器⑧曲线图的覆盖图显示如下(图18)。凝结检测时间R随BG中的Si:Ca比例升高而减少(图19)。在研究范围内当Si:Ca比例加倍时R减少了2倍。BG能够起到为血栓形成提供表面区域和Ca"离子供给的双重作用。因此将有一个Si02和C+离子的最适比率产生最快的止血响应，其中Si02和C^+离子是整个凝血级联反应的辅助因子。BG诱发的凝固速率a随Si:Ca比例的增加而增加，并在达到最小的R时间的Si:Ca比例处达到最大(Si:Ca(Rminamax)2.5)。虽然在最终凝结强度和BG中的Si:Ca的比例之间没有关系，但是BG诱发的全部血液凝结比自然的凝结更强(MAbg》62和MA天然=58dyn/cm2)。复合氧化物止血剂的合理设计需要对每种氧化物成分单独的和共同的血栓形成效果进行了解。为了这个目的，我们分析了多孔Si02(SBA-15;ZhaoD.等，丄^m.C/zew.Soc.1998,129,6024)和做为BG的模型组分的CaO，和无孔的Si02玻璃珠(Polyscience,Inc.Cat#07666)、CaC03、和作为相关的Si02禾卩Ca氧化物的羟磷灰石(Ca1()(OH)2P04)6SigmaCat#289396)的体外止血活性。除羟磷灰石外,所述氧化物均在骨中含有，每种氧化物被证明随着向血液中添加更多的材料而产生减少的R时间(图20A)。与向血液添加羟磷灰石有关的凝血速率a和凝结强度MA下降也它具有抗血栓形成的性能的证明。虽然有几篇基于有机材料的抗凝血剂的报道，但羟磷灰石仍代表一种独特的延迟凝血的无机氧化物。尽管凝结开始时间减少，随着更多SBA-15混合到血液中凝结速度和最终凝结强度均减弱。虽然SBA-15是一种接触活化剂，但由于它的羟基化表面和通过脱水作用浓縮血液的能力，，它看起来禁止凝结形成的扩大。当浓縮的血液附近没有足够的C^+时这种浓缩效果可能对凝结扩大是不利的。随着加入更多的能够提供活化的羟基化表面而不使血液脱水的玻璃珠，除产生减少的R之外，这些玻璃珠还产生加速的OC和增加的MA。多孔BG的脱水作用和血液浓缩作用不会不利于凝结扩大，这是因为Ca"离子就存在在浓缩的血液的附近。我们发现在多孔材料中包含C^+离子源有益于快速的凝结形成，和C^+离子是一种辅助因子，通过在两个带负电荷的残基(例如细胞表面和凝结因子)之间充当离子桥而在凝固酶在细胞表面的固定和定位过程中起到了重要的作用。在血栓形成和纤维蛋白溶解过程中当凝血因子XIII通过带负电荷的糖基化残基交联到血纤蛋白时它们被消耗掉。因此有理由认为，由CaO和CaC03两者引起的更快的凝固速度和更强的凝结应当部分归功于这些制剂向血液提供钙的能力。CaO在血液(pH=7.4)中的溶解性远远大于CaC03,并且更大的Ca^离子的总释放量可以认为是在本报告中CaO诱导的凝结比任意其它氧化物引起的凝结强》30%的原因(MAcao二92，MA其它测试的戮化物止血剂《66)。CaO和CaC03之间的溶解度差异对于凝固速度似乎可以忽略。包含在止血剂颗粒中的不溶的钙能够与血液成分相互作用(Jalilehvand,F.等,丄Soc.2001,123，43l);高分辨率X射线光电子光谱分析证明具有更大止血活性的材料有更低的Ca2p电子束结合能。羟磷灰石的Ca2p3,2(349eV)超过BG、CaO、或CaC03(347eV)2eV，与之前的研究一致(Perez-Pariente，J.等，C7zem.Ma&r2000,12,750;Koper,O.等，C/wm.1997,9,2468)。虽然Ca环境的作用是用于骨产生氧化物(Lu,H.B.等，J腦/.CAem.2000,72,2886)，但是在相关的止血趋势中不是这样的。我们己经观察到结合表面激活和调控局部电解质，通过浓縮血液和局部温热周围组织(与多孔氧化物相同的放热AH^)，多孔无机止血剂对血液凝固具有多种加速作用。虽然美国军队使用的原始的多孔沸石止血剂是一种有效的救生医疗卫生器材,但是产生的过量热量仍会引起人们努力去鉴定应用安全并且有效的新材料。基于沸石的止血剂水合释放热量通常高达700J/g，吸收20^w/w水，和具有高达700mVg的表面积。多孔和无孔的BG水合释放热量高达400J/g，吸收15。/^w/w水,和具有高达400mVg的表面积。与基于沸石止血剂相比，BG止血剂的较低的AH^能够使出血血液局部脱水而不产生会烧伤病人和抑制止血剂合理应用的量过热研究粒子形态获得的初步结果表明，大小和形状是关键的凝结参数。通过喷雾焙烧BG前体溶胶-凝胶,能制得球形的BG(直径=300nm,孔径大小-5nm)(图20B)。给定类似的Si:Ca比,球形BG与不规则的BG相比证明减少的R时间和加快的凝结速度。虽然BG和沸石止血剂两者都具有高表面积，但小孔孔径(分别为5nm，4A)限制了较大的生物学介质只能在颗粒的最外层表面相互作用。与不规则的BG相比，球形BG为血液提供了更多的这类有效表面。研究还在继续，进一步探索增加表面和容积之比的止血效果以及表面糙度和电荷的作用。实施例5:通过离子交换和固态混合制备的加入了银的沸石LT5A的抗菌活性本实施例比较了不同配方的加入了银的沸石的抗菌活性。在方法1中，QuikClot(Linde5A型沸石)与10种不同浓度的AgN03(水溶液)进行离子交换。在方法2中，AgN03:QuikClot⑧的固态混合物通过混合AgN03禾QQuikClot⑧制成，配比是10%wZwAgN03、1%w/wAgNO3、0.02%w/wAgN03,0.01%w/wAgNO3。所有的材料均通过研钵和研棒磨碎，在每厘米6吨的压力下压成小丸。样品在真空条件下加热到25(TC干燥和杀菌。经验式通过X射线光电子光谱(XPS)检测。表9:制备的加入了银的沸石A的XPS特征<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>放置和监察在接种绿脓杆菌后马上把小丸、小球和粉末放置在LB琼脂上。在生长的24、48和72小时进行数字摄影。结果归纳在图29和图30，分别涉及离子交换和固态混合。配方检测(按添加Ag量的成本递减的顺序)Ag6Ca3(Si02)12(Al02)l227H20分子量2655.417g/molAg二5.8原子0/。3.5盎司包装的QuikClot⑧离子交换在不减少24小时后的抗菌效果的条件下最低的抗菌配方Ag0.41Ca5.796(Si02)12(A102)1227H20分子量2135.947g/mol;银的分子量是107.8682g/molAg二0.37原子y。固态混合:在不减少24小时后的抗菌效果的条件下最低抗菌配方1%w/wAgN03w/QuikClot小的颗粒比大的小丸更适合于固态混合。离子交换具有更好的24小时之后的抗菌活性。还在123A珠、123J珠、123A珠粉末、123J珠粉末、QuikClot⑧粉末、123A粉末，123F珠和123J粉末之间进行了比较。粉末比大的珠能更好地和细菌接触。这有利于银离子的扩散和大量传播。在接种绿脓杆菌后马上把各种配方放置在LB琼脂上。在生长的24、48和72小时摄制数字照片。结果归纳在图31中。以下是被检测的配方Ag0.303Na0.226Ga5.740(Si02)12(A102)12H20Ag0.363Na0.365Ca5.636(Si02)12(A102)12H20Ag0.2Na0.2S5Ca5.757(Si02)12(Al〇2)12H20Ag0.l59Na0.266Ca5.788(Si02)12(A102)12H20100%AgN03含10%AgN03的QuikClot含1%AgN03的QuikClot实施例6:硅藻土作为止血剂本实施例描述了使用硅藻土做为止血剂激活凝结。测定作为时间的函数的羊血的粘弹性的凝结强度(杯子转动)，羊血分别是没有止血剂(HA)的羊血和具有20mg两种不同硅藻土样品的羊血。结果显示在图32的凝血弹性描记器⑧曲线图中。这些数据证实硅藻土与本文描述的其它止血剂一样也促进了凝结。从上面的描述可以看出，虽然处于阐述的目的本发明描述了特定的实施例，但是在不偏离本发明的精神和范围的情况下还可实施各种改良。整篇申请中参考了各种出版物。这些出版物的全文纳入作为参考，以便更加完全地描述本发明所属领域的现有技术水平。权利要求1.一种组合物，它含有止血有效量的含硅的氧化物，通过热成像测定，所述含硅的氧化物在与血液接触时产生的水合热不大于75℃。2.如权利要求l所述的组合物，其中通过差示扫描量热法(DSC)测定，含硅的氧化物在与血液接触时产生的水合热不大于660焦耳/克。3.如权利要求2所述的组合物，其中含硅的氧化物产生的水合热在100焦耳/克和650焦耳/克之间。4.如权利要求l所述的组合物，其中含硅的氧化物选自玻璃珠、陶瓷、硅酸盐、铝硅酸盐、硅铝磷酸盐、硼硅酸盐、硅藻土、层状粘土、生物活性玻璃、二氧化钛和矾土。5.如权利要求l所述的组合物，其中含硅的氧化物包括直径从约10nm到约100jLim的玻璃或陶瓷珠。6.如权利要求l所述的组合物，其中含硅的氧化物包括直径约50-200nm的玻璃或陶瓷珠。7.如权利要求l所述的组合物，其中含硅的氧化物具有直径2-100nm的小孔。8.如权利要求l所述的组合物，其中含硅的氧化物具有直径100-200^im的小孔。9.如权利要求l所述的组合物，其中含硅的氧化物包括无孔的含硅材料、硅藻土、生物活性玻璃和/或多孔泡沫。10.如权利要求l所述的组合物，其中，该组合物包括沸石。11.如权利要求l所述的组合物，其中，该组合物还包括无机盐。12.如权利要求ll所述的组合物，其中所述无机盐包括选自锌、铜、镁、钙和镍的二价离子。13.如权利要求1所述的组合物，其中所述无机盐选自CaO、CaCl2、AgN03、Ca(N03)2、Mg(N03)2、Zn(N03)2、NH4N03、AgCl、Ag20、醋酸锌、乙酸镁、拧檬酸钙、拧檬酸锌、柠檬酸镁、乙酸钙和磷酸钙。14.如权利要求13的组合物，其中AgN03通过离子交换提供，通过X射线光电子光谱测定最少加载约0.2原子X的Ag+。15.如权利要求B的组合物，其中AgN03通过固态混合提供，按重量计最少加载约0.0P/。的AgNO3。16.如权利要求3所述的组合物，其中所述铝硅酸盐的硅与铝的比例是1.01或更大。17.如权利要求3所述的组合物，其中所述铝硅酸盐的硅与铝的比例是32比1或更大。18.如权利要求3所述的组合物，其中所述铝硅酸盐的硅与铝的比例是100比1或更大。19.如权利要求l所述的组合物，其中0.1-25%的所述含硅的氧化物被水合。20.如权利要求19所述的组合物，其中0.1-5%的所述含硅的氧化物被水合。21.如权利要求l所述的组合物，其中使用BET氮气吸附法测定，含硅的氧化物每克有在1到1500平方米之间的内表面积。22.—种调节止血的方法，该方法包括将权利要求l的组合物接触血液。23.如权利要求22所述的方法，其中所述的调节包括减少血液凝固时间。24.如权利要求23所述的方法，其中使用凝血弹性描记器⑧测定的凝血开始时间(R)小于2分钟。25.如权利要求23所述的方法，其中使用凝血弹性描记器⑧测定的凝固速率(a)大于65°。26.如权利要求23所述的方法，其中使用凝血弹性描记器⑧测定的凝血结果最大凝结强度(MA)大于65mm。27.如权利要求22所述的方法，其中所述的调节包括增加血液凝固时间。28.—种由权利要求l所述的组合物包涂的医疗卫生器材，其中所述的组合物增加血液凝固时间。全文摘要本发明提供一种组合物、方法和装置，涉及能在与血液接触后产生减少的水合热的含硅的氧化物。通过减少水合热，所述组合物可作为一种能降低传统的止血剂的组织烧伤副作用的止血剂，并且不会对所述组合物的愈合伤口的性质产生不良影响。文档编号A61K33/06GK101151039SQ200680010569公开日2008年3月26日申请日期2006年4月4日优先权日2005年4月4日发明者G·D·斯塔基,P·A·霍顿,P·K·斯托伊蒙诺夫,T·A·奥斯托梅,施奇惠申请人:加利福尼亚大学董事会