专利名称：：消炎用药程式的制作方法
技术领域：
：本发明涉及某种异类黄烷酮化合物、包含所述化合物的组合物以及所述化合物和/或组合物在治疗，具体是炎症和疾病中的应用。炎症包括应激性肠道病(IBD)例如溃疡性结肠炎(UC)、溃疡性直肠炎、末端结肠炎和/或克罗恩病(CD)，以及其它肝肠综合征(hepatointestinalsyndromes)包括原发性硬化性胆管炎(PSC)、原发性胆汁性肝硬化(PBC)、自身免疫性肝炎(AIH)和应激性肠道综合征(IBS)。
背景技术：
：UC引起大肠(结肠和直肠)内壁炎症。CD引起肠壁全层炎症并可累及从口腔到肛门的消化道任何部分。CD可引起复发性肠梗阻、瘘管、脓肿形成和败血症以及肠外症状如关节炎。IBD常发生于15-30年龄段，大约13，000澳大利亚人患有UC，10，000人患有CD。据美国克罗恩病和结肠炎基金会估计有多达1，000,000的美国人患有IBD，其每年的直接和间接的花费约为5520亿美元。而且，有研究提示患IBD的人更可能发生结肠癌。IBD的病因还未知。然而，看来这些综合征受免疫介导，炎症过程受环境和遗传因素的影响。医学治疗有助于控制炎症过程，并用于急性和慢性疾病，以及维持疾病的缓解。尚没有完全有效的治疗措施，当前的治疗是用消炎(皮质激素、氨基水杨酸盐)、免疫抑制、免疫治疗或手术来缓解炎症和/或减轻免疫应答。治疗的目的是引起并维持疾病缓解、最大程度降低治疗伴有的副作用。高达80%的UC患者和35%的CD患者在症状缓解后一年内会复发(Podolsky，D.K.(2002)"对炎性肠病今后的理角军(Thecurrentfutureunderstandingofinflammatoryboweldisease)"BestPractice&ResearchinClinicalGastroenterology16(6):933-43)。另夕卜，现有疗法中没有一种不产生副作用。因此，IBD药物开发的'圣杯(holygrail)，是能维持疾病缓解的无毒性成分(Feagan2003"炎性肠病的维持疗法(Maintenancetherapyforinflammatoryboweldisease)，，TheAmericanJournalofGastroenterology98(12,副刊1):S6-S17)。原发性胆汁性肝硬化(PBC)、自身免疫性肝炎(A加和原发性硬化性胆管炎(PSC)的发病机理可能是自身免疫为基础的慢性肝脏疾病。PSC看来与UC相关联。在PSC和PBC中，胆管发炎、结疤并最终阻塞，引起胆汁淤积、肝细胞损伤许多病例引起肝功能衰竭。应激性肠道综合征(IBS)是称为功能性肠胃疾病(包括疾病如非心脏性胸痛、非溃疡性消化不良和慢性便秘或腹泻)的疾病中的一员。这些疾病全部以无法找到组织或生化病因的慢性或复发性胃肠症状为特征。在美国IBS影响了2500-5500万人。在西方国家的普通人群中IBS的流行率为6-22%不等。IBS影响14-24%的妇女和5-19%男性。在高加索裔和非裔美国人中所述流行率相似，但看来在西班牙裔中较低。尽管有几项研究报道老年人中IBS流行率较低，目前的研究还无法明确地得出IBS中是否存在年龄差异的结论。在非西方国家如日本、中国、印度和非洲，IBS也似乎很常见。因此，需要新的方法来治疗炎症和相关疾病以及用于此方法的新的改进的药剂和化合物。本发明人惊奇地发现了式(I)的化合物及其盐特别适合用于治疗炎症和心血管疾病。此式中R1和R2分别为羟基、烷氧基或酰氧基，R3为羟基、烷氧基、烷基或卤素，和X为二0或氢和羟基。优选式(I)化合物中的Rt和R2代表羟基。优选式(工)化合物中的R3代表甲基、溴、氯或羟基。一优选实施方式中，X=0，本发明的化合物是式(Ia)的异黄垸-4-酮:发明概述<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage6</formula>此式中R3是5-垸基、6-卤素或8-卤素，更优选R3是5-甲垸基、6-氯或8-溴。另一优选实施方式中，X是氢和羟基，本发明的化合物是式(Ib)的异黄垸-4-醇:<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage7</formula>此式中R3是8-烷基或8-羟基，更优选，R3是8-甲基、或8-羟基。在还有一优选实施方式中，所述化合物是式(Ic)的8-取代异类黄烷酮化合物及其盐<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage7</formula>此式中R1和R2分别是羟基、垸氧基或酰氧基，R3是羟基、烷基或卤素，和X=0或氢和羟基，更优选R1和R2是羟基，和R3是羟基、甲基或溴。尤其优选式(I)异类黄烷酮化合物及其药学上可接受的盐选自化合物1到5:<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage8</formula>本发明的另一个方面提供一种或多种式(I)化合物作为消炎药剂或心血管药的应用。所述炎症疾病包括炎症相关疼痛、水肿和红斑，一般说，炎症疾病包括骨关节炎、炎性肠病(溃疡性结肠炎和克罗恩症)、溃疡性直肠炎、末端结肠炎、自身免疫疾病(SLE、类风湿性关节炎、肾小球肾炎)、哮喘以及疾病包括肺炎、心血管疾病包括动脉粥样硬化、高血压和脂质疾病以及雌激素受体活化相关疾病。即所述化合物可用于治疗炎症相关的疼痛。一优选实施方式中，此种对炎症疾病的治疗没有心血管副作用、而有心脏保护和/或肠保护作用。本发明另一方面提供血栓烷合酶抑制剂在制备治疗炎症包括炎症相关疼痛的药物中的应用。优选所述治疗具有心脏保护和/或肠保护作用。本发明另一方面提供一种治疗炎症和疾病或作为血栓烷合酶抑制剂的含式(I)化合物的药物制剂。除非内容另有需要，本说明书及其后的权利要求书中所用的术语"包含"或"含有"应理解为指包括所指定的整数或步骤或一组整数或步骤，但不排除任何其它的整数或步骤或一组整数或步骤。附图简述图1显示10uM测试化合物对经LPS刺激的人单核细胞合成PGE2的影响。图2显示10uM测试化合物对经LPS刺激的人单核细胞合成TXB2的影响。图3显示将外来PGH2加入到U937细胞后测试化合物对TXB2合成的影响。图4显示TNFa刺激的THP-1单核细胞/巨噬细胞中NFkB启动子活性受抑制的百分比。图5显示口服剂量lmg/kg化合物1和4对结肠炎症的影响(平均值士SEM)。图6显示口服剂量lmg/kg化合物1和4对结肠长度的影响(平均值士SEM)。图7显示口服剂量lmg/kg的化合物1和4对临床评分的影响。图8显示口服剂量lmg/kg的化合物1和4对体重的影响。图9显示预先口服剂量lmg/kg化合物1和2对结肠炎症的影响(平均值土SEM)。图10显示预先口服剂量为lmg/kg化合物1和2对结肠长度的影响(平均值士SEM)。图11显示预先口服剂量lmg/kg的化合物1和2对临床评分的影响。图12显示预先口服剂量lmg/kg的化合物1和2诱导结肠炎10天对体重的影响。图13显示口服剂量L25mg/kg化合物3a和3b对结肠炎症的影响(平均值士SEM)。图14显示口服剂量1.25mg/kg化合物3a和3b对结肠长度的影响(平均值土SEM)。图15显示口服剂量1.25mg/kg的化合物3a和3b对临床评分的影响。图16显示口服剂量1.25mg/kg的化合物3a和3b对体重的影响。图17显示在无有丝分裂刺激物时培养结肠所产生的PG&和TXB2。图18显示在存在ConA时培养结肠所产生的PG&和TXB2。图19显示去甲基肾上腺素收縮反应受抑制百分比。图20显示口服给予11天高剂量化合物1后大鼠的体重变化。图21显示每天口服给予5mg/kg化合物2或运载体后的体重变化。图22显示每天口服给予20mg/kg化合物3a和3b的混合物后的体重变化(得自各小鼠的数据组，各组平均值以粗体标出)。图23显示每天口服给予5mg/kg化合物4或运载体后的体重变化。发明详述术语"烷基"包括1-6个碳原子的直链和支链饱和烷基组，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基等。所述垸基更优选包括含1到4个碳原子的烷基，尤其是甲基、乙基、丙基或异丙基。本发明的化合物包括其所有的盐，例如酸加成盐、阴离子盐和两性离子盐，特别包括本领域技术人员已知的药学上可接受的盐。术语"药学上可接受的盐"指带电荷能与药物制剂联用的有机或无机部分，例如，盐中的反阳离子或反阴离子。药学上可接受的阳离子是本领域技术人员已知的，包括但不限于钠离子、钾离子、钙离子、锌离子和季胺离子。药学上可接受的阴离子是本领域技术人员已知的，包括但不限于氯离子、醋酸根离子、甲苯磺酸根离子、柠檬酸根离子、碳酸氢根离子和碳酸根离子。药学上可接受的盐包括从以下酸形成的盐乙酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯甲酸、苯磺酸、柠檬酸、肉桂酸、乙磺酸、延胡索酸、谷氨酸、戊二酸、葡糖酸、盐酸、氢溴酸、乳酸、马来酸、苹果酸、甲磺酸、萘甲酸、羟基萘甲酸、萘磺酸、萘二磺酸、萘丙烯酸、油酸、草酸、草酰乙酸、磷酸、丙酮酸、对甲苯磺酸、酒石酸、三氟乙酸、三苯基乙酸、丙三羧酸、水杨酸、硫酸、氨基磺酸、磺胺酸和琥珀酸。术语"药学上可接受的衍生物"或"药物前体"指给予受者后能直接或间接提供母体化合物或代谢物的活性，或显示自身活性的化合物衍生物，包括例如磷酸酯衍生物和磺酸酯衍生物。因此，衍生物包括溶剂化物、药学上的活性酯、药物前体等。本发明的优选化合物还包括所有含生理可切断(cleavable)的离去基团的衍生物，它们可在体内被切断从而提供本发明化合物或它们的活性部分。离去基团可包括酰基、磷酸酯(基团)、硫酸酯(基团)、磺酸酯(基团)，优选单、二和全酰氧基取代的化合物，其中一个或多个侧羟基(pendanthydroxy)用酰基，优选乙酰基保护。本发明的典型酰氧基被取代的化合物易于被切断成为相应的羟基取代的化合物。本发明还提供一种含式(I)化合物和至少一种药学上可接受赋形剂的药物组合物，尤其适用于治疗或制备药剂，例如，用于治疗炎性肠病(IBD)如溃疡性结肠炎(UC)、溃疡性直肠炎、末端结肠炎和/或克罗恩病(CD)，以及其它肝肠综合征(h印atointestinalsyndromes)包括原发性硬化性胆管炎(PSC)、原发性胆汁性肝硬化(PBC)、自身免疫性肝炎(AIH)和应激性肠道综合征(IBS)。本申请全文中，基本纯指例如用HPLC分析方法评估为90。/。纯，或更高如95%纯，尤其是98%纯，特别是99%纯。本文描述了本发明的各种方面中，本发明还采用至少两种式(I)化合物。药物制剂包括适合于口服、肠胃道外(包括皮下、皮内、肌肉内、静脉内和关节内)、吸入(包括计量的加压喷雾、气雾器或吹入器)、直肠和局部(包括皮肤、颊、舌下和眼内)给药的那些制剂。最适合的途径取决于例如接受者的状况和疾病。可将所述制剂配成单位剂量提供，，可用制药领域公知的任何方法制备。所有方法均包括将所述活性成分与包含一种或多种辅助成分的运载体相混合的步骤。通常都要将活性成分均匀紧密地与液体运载体或细分固体运载体或两者混合来而制备所述制剂，然后，如果需要，可将产物制成所需要的制剂形状。提供的本发明适合于口服给药的制剂可以是分离的单位，例如包含预先确定量活性成分的胶囊(如明胶胶囊或HPMC胶囊)、扁胶囊或片剂；如粉剂或颗粒剂；如用含水液体或无水液体配的溶液或悬液；或水包油乳液或油包水乳液。活性成分也可以软膏形式提供。当将式(I)化合物制成胶囊时，优选所述化合物与一种或多种药学上可接受的运载体如淀粉、乳糖、微晶纤维素、二氧化硅和/或环状寡糖如环糊精共同配制。辅助成分可包括润滑剂如硬脂酸镁和/或硬脂酸钙。合适的环糊精包括a-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、去甲基-β-环糊精、2-羟基乙基-β-环糊精、2-羟基丙基-环糊精、3-羟基丙基-β-环糊精和三甲基-β-环糊精。更优选所述环糊精为羟基丙基-β-环糊精。可通过压縮或模塑，任选地与一种或多种辅助成分一同制备片剂。可在合适的机器中加压自由流动形态的化合物，例如任选与黏合剂、润滑剂(如硬脂酸镁或硬脂酸钙)、惰性稀释剂或表面活性剂/分散剂混合的粉末或颗粒来制备压縮片剂。可在合适的机器中模塑用惰性液体稀释剂润湿的粉末化合物来制作模塑片剂。所述片剂可任选地(例如)用肠衣包裹，可制成能提供缓释或控制其中活性成分的剂型。肠道外给药的制剂包括水和无水无菌注射溶液，可包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和赋予制剂与接受者血液等滲的溶质，还可包含悬浮剂和增稠剂。优选肠胃道外制剂包含环状寡糖例如羟基丙基-3-环糊精。所述制剂可以装有单剂量或多剂量的容器提供，例如密封的安瓿和小瓶，可以冻干(冷冻干燥的)状态贮存，使用前刻，仅需加入无菌液态运载体例如盐水或注射用水。可用以上描述的无菌粉末、颗粒和片剂类来制备临用时的注射溶液和悬液。可将通过吸入向肺局部递送干粉组合物，例如装在明胶胶囊和药筒中、或例如层状铝箔小泡中，采用吸入器或吹入器递送。通常制剂包含可吸入的本发明的一种或多种化合物的粉末混合物以及合适的粉末基质(运载体)如乳糖或淀粉。优选采用乳糖。通常每个胶囊或药筒含20ixg-10mg的式(I)化合物，任选与另一治疗活性成分混合。或者，本发明的化合物可不加赋形剂。制剂的包装可用于单剂量或多剂量递送。可将通过吸入向肺局部递送喷雾组合物，例如采用适当的液体雾化推进剂配制成用加压袋如计量雾化剂递送的水溶液或悬液或气雾化悬液或溶液。合适的喷雾推进剂包括碳氟化合物或含氢的氯氟烃或其混合物，尤其是氢氟代烷，如二氯二氟甲烷、三氯氟甲垸、二氯四氟乙烷，尤其是1，1，1，2-四氟乙垸、1，1，1，2，3，3，3-七氟正丙烷或它们的混合物。二氧化碳或其它合适的气体也可用作喷雾推进剂。所述气雾组合物可不含赋形剂或可任选含有本领域公知的其它赋形剂，例如表面活性剂油酸或卵磷脂和共溶剂如乙醇。通常将加压制剂存放于有阀门(如金属阀门)的密封金属罐(如铝罐)内与提供管嘴的促动器相配。吸入给药的药物宜具有控制的颗粒大小。用于吸入支气管系统的最佳颗粒大小通常为卜10um，优选2-5um。20um以上的颗粒太大吸入时不能到达小气道。当赋形剂为乳糖时通常以研碎的乳糖粉提供，其中不超过85%的乳糖颗粒为60-90iiraMMD并且不小于15%的丽D小于15pm。直肠给药制剂可以是带有运载体如可可脂或聚乙二醇的栓剂，或为运载体为等滲液如盐水的灌肠剂。该制剂的附加组分可包括环寡糖，例如上述环糊精，如羟丙基-e-环糊精，一种或多种表面活性剂，缓冲盐或调节pH的酸或碱，等滲调节剂和/或抗氧化剂。应理解除了上面特别提到的成分，考虑到讨论的制剂的类型，本发明的制剂可包含本领域的其它常规制剂，例如那些适合口服给药的制剂可包含调味剂。本发明的化合物和药物制剂可联用或包含一种或多种其它治疗药物，例如消炎药、抗胆碱药(特别是M,、M2、M,/M2或M3受体拮抗剂)、32-肾上腺素受体拮抗剂、抗感染制剂(如抗生物素、抗病毒等)、或抗组胺剂。优选包含式(I)化合物或药学上可接受的盐、溶剂合物或其生理功能衍生物以及皮质类激素、和/或抗胆碱能药、禾口/或PDE-4抑制剂。合适的消炎药包括皮质类激素和NSAID。适合与本发明化合物联用的合适皮质类激素是具有消炎活性的可口服和吸入皮质类激素及其前药。例子包括甲基强的松龙、强的松龙、地塞米松、丙酸氟替卡松、6a，9a-二氟-17a-[(2-呋喃基羰基)氧]-ll13-羟基-16a-甲基-3-氧代-雄甾垸-l，4-双烯-17e-卡比吗唑酸S-氟甲基酯、6a，9a-二氟-11P-羟基-16a-甲基—3—氧代—17a-丙酰氧-雄甾垸-1，4-双烯-173-卡比吗唑酸S-(2-氧代-四氢化呋喃-3S基)酯、倍氯米松酯(如17-丙酸酯或17，21-二丙酸酯)、布地奈德、氟尼縮松、莫米松酯(如安特酰胺酯)、曲安奈德、罗氟奈德、环索奈德和丙酸布替可特。优选的皮质类激素包括氟替卡松和6d，9ct-二氟-17a-[(2-呋喃基羰基)氧]-113-羟基-16a-甲基-3-氧代-雄甾垸-1，4-双烯-17P-卡比吗唑酸S-氟甲基酯，更优选6a，9a-二氟-17a-[(2_呋喃基羰基)氧]-11P-羟基-16a-甲基-3-氧代-雄甾垸-1，4-双烯-17e-卡比吗唑酸S-氟甲基酯。合适的NSAID包括色甘酸钠、萘多罗米钠、磷酸二酯酶(PDE)抑制剂(如茶碱、PDE4抑制剂或PDE3/PDE4混合抑制剂)、白细胞三烯拮抗剂、白细胞三烯合成抑制剂、iN0S抑制剂、类胰蛋白酶和弹性蛋白酶抑制剂、0-2-整联蛋白拮抗剂和腺苷受体激动剂或拮抗剂(如腺甘2a激动剂)、细胞因子拮抗剂(如趋化因子拮抗剂)或细胞因子合成抑制剂。活性成分的联用可以同时或顺次给予。同时给药可以是以同样单位剂量或单独和各自的单位剂量同时或在类似时间给予所述化合物。顺次给药可以按所需的顺序给予，在需要累积或协同效应时，当给予第二次或后续活性药物时通常第一次或前一次给予的活性药物还在发挥生理作用D优选所述制剂为口服制剂，更优选为胶囊制剂。优选所述胶囊制剂必须包含式(工)化合物和二氧化硅或由其组成。优选所述胶囊为HPMC胶囊。在另一实施方式中，所述制剂为栓剂或灌肠剂，可用于将活性成分引导到更接近身体的患病区域。优选本发明的口服组合物或其它含5mg/kg或更少，例如0.01-4mg/kg如0.5-3mg/kg患者体重的式(I)化合物。例如，每单位剂量制剂可含50-500mg式(I)化合物，更优选含200-400mg，如250mg。因此本发明提供一种或多种式(I)化合物和/或含所述化合物的组合物，用于治疗或制备药物。本发明还提供一种治疗方法，包括给予需要的患者治疗有效量的一种或多种式(I)化合物或含所述化合物的组合物。这些方法对上面列出的疾病特别有效。优选用本发明的化合物和组合物治疗IBD，例如结肠炎如溃疡性结肠炎、溃疡性直肠炎、末端结肠炎；克罗恩病和/或预防结肠癌。另一优选方面，本发明的化合物和组合物可用于维持所述疾病尤其是IBD的缓解。最后，所述剂量和所述剂量的给药间隔时间将由患者的主治医师仔细考虑。式(I)化合物给药的剂量范围是例如50-500mg每天1到4次如每天1或2次。含所述式(I)化合物的化合物和组合物具有令人惊奇的低毒性。并且，它们的优点与类似结构的化合物相比，它们的选择性更好、毒性较低和/或例如减少临床症状如体重减轻、胃肠道溃疡等方面更有效。不希望受理论的束缚，认为本发明的化合物是选择性血栓烷合酶的抑制剂。血栓烷(TX)在IBD中起主要致病作用。克罗恩病时不仅炎性肠粘膜过量生产TX，而且分离的肠内和外周血单核细胞以及未发炎的肠中也过量产生TX。这些异黄院-4-酮和异黄垸-4-醇及其衍生物用本领域已知的标准方法不难获得。发表的国际专利申请W098/08503、W000/49009和WOO1/17986(均为NovogenResearchPtyLtd),以及本发明引用的参考文献(其公开说明书纳入本文中作为参考)，也提供了生产作为原材料的单体的异黄酮、异黄烷酮、异黄垸-4-醇和相关的异类黄垸酮的有用的合成方法。一种代表性的通用合成方案见以下方案1所示。<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage14</formula>方案l通过选择相应取代的R5-R8苯酚和R2-R4苯酚醋酸原材料在异黄烷-4-醇的苯并吡喃环和悬垂苯环周围实现了各种模式的取代。常规采用本领域技术人员已知的Rl取代的甲基磺酰氯试剂进行所述环的环化反应。在氢存在时用醇溶剂配制的Pd-C或Pd-铝成功进行了此还原反应。该反应公式给出了还原反应的终产物。本领域技术人员明白可适当采用其它烷基化、环化、氢化和/或还原的标准方法。对本发明化合物和衍生物上的功能基团的保护可通过本领域公知的方法实现，例如见T.W.Greene,ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis(有机合成中的保护性基团)，JohnWiley&Sons,纽约，1981中所述。羟基的保护基团包括但不限于羧酸酯如醋酸酯、芳香酯如苯甲酸酯、乙縮醛/縮酮如丙缩酮化合物和苯亚甲基化合物、醚如正苯甲酰醚和对甲氧苯甲酰基醚、四氢吡喃基醚和硅烷基醚如四丁二甲基硅垸基醚。这种保护基团可通过例如酸或碱催化的水解或还原去除，例如加氢去除。硅烷基醚可能需要用氟化氢或四丁铵切断。具体说，式(I)化合物可通过以下方法制备。本发明另一优选的实施方式是8取代的化合物，然而，应理解，通过改变原材料不难获得不同的其它实施方式。异黄垸酮和异黄垸-4-醇不难通过选择性还原异黄酮来获得(见NovogenW000/49009)。还原剂是本领域技术人员所公知的来源，并可包括氢化物如硼氢化物和碱土金属硼氢化物，但在催化加氢时可采用合适的催化剂如碳载钯或氧化铂来加氢。其它合适的氢化物源包括三乙氟硼氢化钠和氰基硼氢化钠。优选来氢化还原双键。优选采用的催化剂为碳载钯或氧化钼。间苯二酚是上述方案1的关键原材料。取代的间苯二酚不难获得或可按需要合成。例如，可通过在合适溶剂中用卤化剂处理间苯二酚将间苯二酚甲基化或卣化。合适的卤化剂包括碘、溴、氯或氟。可能必需在还原温度，例如0'C下进行卣化步骤。也可加工本发明各方面的式(I)化合物和所有中间化合物来制备本文所述的所有化合物。化合物3，4-环氧-4'，7-二羟基异黄烷也显示具有消炎活性。它是通过(PA)4'，7-二羟基异黄烷-4-醇脱水得到4'，7-二羟基异黄烷-3-烯而获得。双键的环氧化(,CPBA)提供了环氧化物。本发明人发现通过选择性或非选择性抑制血栓垸合酶(TXS)而抑制类花生酸血栓烷(TX)，具有以下多效功能1、消炎活性，表现为典型临床症状如疼痛、红斑和肿胀的缓解，以及2、心脑保护活性，通过缓解高血压、减轻血脂和/或具有抗动脉粥样硬化活性或者消除或减轻C0X-2抑制导致的增加心血管风险的血栓前体形成作用。3、肠保护作用，通过对前列腺素产生增加或减少的抑制避免了NSAID的副作用。消炎活性前列腺素如PG&和PGl2和血栓垸(TX)如TXA2是称为类花生酸的脂肪酸衍生物家族成员(Penglis等2000)。它们参与正常生理反应和炎症反应，但对细胞因子释放和血小板凝聚等具有相反作用。膜磷脂释放的花生四烯酸(AA)提供了类花生酸合成的主要底物。不论其同种型，环氧合酶(C0X)的活化可引起PGE2、PGl2和TXA2的共同前体，中间产物前列腺素PGH2的合成。本发明人发现抑制血栓烷本身就是一种消炎策略。1、类前列腺素通过与发炎器官中的白细胞和薄壁细胞发生复杂的相互作用在免疫应答中起着重要的调节作用。取决于炎性刺激、产生的主要类前列腺素、以及类前列腺素受体表达情况，它们能够产生促炎作用和消炎作用(Tilley等2001)。2、血栓烷TXA2是一种类前列腺素，其作用看来主要是促炎(Thomas等2003)。TX产生的增加涉及各种免疫介导疾病如狼疮性肾炎的发病。3、根据各种动物模型中的新的和选择性作用模式，本发明人证明本发明的异类黄垸酮化合物和TXS抑制剂具有显著的消炎活性。4、血栓烷在炎症性肠病(IBD)中起着重要的致病作用。不仅发炎的肠粘膜，而且克罗恩病的未发炎大肠和分离的小肠内以及外周血单核细胞都过量产生TX。其细胞源可能包括血小板、中性粒细胞、内皮及上皮细胞以及单核细胞(Hawkey等1985;Rampton和Collins1993;McCartney等1999;Carty等2000;Carty等2002)。TX的促炎症作用有直接作用(血细胞滲出和中性粒细胞活化、粘膜溃疡、抑制T细胞活性的减弱)和间接作用(血管收縮、血小板活化)。认为PG对胃肠粘膜具有保护性(Carty等2000)。经常给药治疗慢性IBD的化合物磺胺水杨嗪，以及其主要代谢产物之一的磺胺吡啶，经证明能分别增强PGF2。或PGE2的合成同时抑制TXB2的合成(Hawkey等1985)。换句话说，它们看来具有某种水平的TX合酶抑制作用。5、TX合酶的抑制可导致TX形成减少，因为PG合酶的底物PGH2利用度增加，引起PG的合成增加(Carty等2000;Penglis等2000)。PGE2的增加能产生消炎作用。例如a.据报道，PGE2能减弱某些急性炎症反应，尤其是由肥大细胞脱颗粒引起的反应(Raud等1988)。b.PGE2抑制，而TXA2提高了TNF。和IL-10的产生(Caughey等1997)。对TXA2的抑制是抑制炎性细胞因子产生尤其是TNF产生的一种潜在方法。目前，抑制TNF水平的生物学疗法(抗体或可溶性TNF受体)已成功用于治疗难治的或对其它疗法不再有反应的类风湿性关节炎。抑制TNF产生的可口服化学药物已取得很大的进展。抑制TXA2形成即意味着抑制TNF(—种参与关节炎体症和症状，表现为软骨降解、关节腔縮小和最终关节功能失调的关节炎症性长期降解阶段的细胞因子)的产生。c.PGE2可抑制广泛的T和B细胞功能包括抑制T淋巴细胞的活化和增殖以及Ig产生(Tilley等2001)。相反，TX&可促进T细胞活化和增殖及促进溶细胞性T效应细胞(CTL)的产生。改变这种平衡帮助PG产生能促使"淬灭"自身免疫疾病中的不良免疫应答。d.哮喘中，PGE2促进血管舒张增加血管通透性(Tilley等2001)。随着炎症发展，由于C0X-2和PGE合酶的表达增加，巨噬细胞的PGE2合成增强。PGE2抑制淋巴细胞活化并促进支气管舒张。已开发了TXA2合酶抑制剂和血栓院类前列腺素受体拮抗剂作为抗哮喘药物(Shi等1998)。e.肾小球肾炎中，PG和TX合成的AAC0X通路以及白细胞三烯合成的脂加氧酶通路同时活化。TXA2是肾小球肾炎中合成最丰富的类花生酸，TXA2合酶抑制剂(如Dazmegrel)目前已用于治疗肾小球肾炎。在肾炎大鼠模型中，Dazmegrel能增加PGE2的合成，在肾小球肾炎中可与PGE2—样用于保护肾脏功能(Lianos和Bresnahan1999)。f.C0X-2衍生的前列腺素与炎症消退相关。炎症损伤产生的PG类型在炎症发展过程中从PGE2占优势的促炎作用改变为炎症消退过程中环戊烯酮(cyPG)占优势的消炎作用(Gilroy等1999)。心脏保护活性与利用cox抑制的其它消炎药物不同，抑制血栓垸本身是一种心脏保护策略。1.PG与TX的比率取决于存在的COX同工型(C0X-1或C0X-2)(Caughey等2001)。TXA2是主要的C0X-1衍生产物，但引入C0X-2可导致优先提高PG&和PGL的合成。相反地，当C0X-2受抑制时，TX的合成增加。2.TXA2为血小板凝聚的强效诱导剂。罗非考昔(Vioxx)病例的心血管风险升高是由于对C0X-2的选择性抑制引起TX合成增加从而导致促血栓形成后果。非选择性抑制C0X也可引起某些心血管风险，这是因为TX和PG的底物PGH2受COX-1或-2的抑制。3.因此，如果像特异性抑制TXS时发生炎症介质即TXA2受抑制那样从消炎'等式'中完全除去对COX的抑制，则不会增加心血管风险。4.TXA2也有血管收縮作用，所以对它的抑制可能使这些化合物具有抗高血压的效果。在心血管功能中血管紧张素II和TXA2之间有联系(Dogne等2004)。例如，TXA2和PGH2通过刺激血管平滑肌收縮参与了血管紧张素II依赖的高血压。而且，一些常用的血管紧张素II抑制剂也是抑制血小板凝聚的血栓烷受体(TP)拮抗剂。胃肠保护活性由于抑制TXS可提高PG酶底物PGH2的利用度，有可能PGE2的增加或如果不增加受抑制的程度至少不会像COX受抑制的程度。由于对PGE2的抑制，采用能抑制C0X的NSAID与胃肠道溃疡、穿孔和出血相关。虽然，PG包括在介导发炎标志(疼痛、肿胀和红斑)的类花生酸列表中，但它们在保护胃粘膜不受其产生的盐酸伤害上有益(Vane和Botting2003)。这以各种方式发生1.外源给予PG能防止胃粘膜屏障破坏，增强胃粘膜血流并刺激粘液和碳酸氢盐分泌(Miller1983)。2.在体内，抑制PGE2将减少胃粘膜细胞的增殖(Levi等1990)。因此，可推导PGE2对维持粘膜完整性至关重要。3.内源PG通过温和刺激在胃部引起的适应性细胞保护中起重要作用(Robert等1979)。用PGE2预处理培养的胃粘膜细胞能减轻乙醇引起的细胞伤害(Sakamoto等1993)。而用非选择性C0X抑制剂卩引哚美辛预处理胃粘膜细胞增强了乙醇导致的伤害，提示内源PGE2参与了细胞保护。受PGE2活化的受体在药学上可分成至少4种亚型(EP,、EP2、Eh和EP4)，而体内的适应性胃细胞保护作用由活化的EP,受体介导(Takeuchi等2001)。4.PGE2的保护性作用还包括调节胃粘膜的微循环。认为血管舒张剂如PGEz与血管收縮介质如内皮衍生肽内皮素-l(ET-l)局部释放之间的平衡的破坏涉及到粘膜受损的病理机制(Whittle和Lopez-Belmonte1993)。PGE2能减少辐射诱导的小鼠小肠细胞凋亡，内源PGE2能增加小辐射后上皮隐窝的存活率(Cohn等1997)。该效应由通过EP2、AKT磷酸化和6s义易位抑制的信号传递通路所介导(Tessner等2004)。同样令人惊奇的是，认为本发明的化合物是化疗增敏剂，即它们能增加共同给予的一种或多种抗癌药物的细胞毒性，和/或辐射增敏剂，意味着这些化合物可降低杀死癌细胞所需的Y射线量，或可使癌细胞从辐射抗性转变为辐射敏感状态。此外，本发明的化合物可用于治疗和预防许多重要的人类疾病，包括癌症、炎症、自身免疫疾病、心血管疾病和与雌激素受体活化相关的疾病。本发明通过一下非限制性实施例及附图作进一步阐述。实施例取代的异黄烷酮和异黄垸-4-醇的合成方法2－溴代间苯二酚与4－羟苯乙酸得缩合－合成1－(3－溴代－2，4－二羟苯基)－2－(4－羟苯基)-乙酮<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage19</formula>在配有冷凝器和磁力搅拌器圆底烧瓶内的2-溴代间苯二酚(5.0g，26毫摩尔)和4-羟苯乙酸(3.0g，26毫摩尔)的混合物中加入三氟化硼二乙基醚合物(30ml)。所述混合物搅拌加热至100-11(TC1.5个小时。然后将混合物冷却到室温放入冰箱过夜。过滤得到沉淀的固体进行用乙醇重结晶获得米色晶体状的脱氧苯偶姻。然后收集晶体在干燥器中千燥。lHNMR(CDC!3):S4.16(s，2H,CH2),6.61(d,1H,J9.0ArH),6.80(d,2H,J8.6Hz，ArH)，7.12(d,1H,J8.6Hz,ArH)，7.75(d,1H,J9,0Hz,ArH).产率5.2g，69%环化1-(3-溴代-2，4-二羟苯基)-2-(4-羟苯基)-乙酮-合成3-(4-羟苯基)-7-羟基-8-溴代-苯并吡喃-4-酮<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage19</formula>在50。C保温的1-(3-溴代-2,4-二羟苯基)-2-(4-羟苯基)-乙酮(2.5g)的无水二甲基甲酰胺(20ml)溶液中滴加三氟化硼二乙基醚合物(6ral)。然后在该溶液中加入甲硫酰氯(3.3ml)并加热混合物至ll(TCl个小时。冷却至室温后，在反应混合物中缓慢加入盐酸(2M,120ml)。过滤、用水彻底洗涤并干燥得到黄色沉淀。〗HNMR(d6-DMSO):S6,79(d，2H，J8,7Hz,ArH),7.08(d,1H,J8.7Hz，H6),7.36(d,2H，JS.7Ife,A邻，7.94(d，1H，J8.7Hz,H5),8.39(s,1H，H2).产率2.35g粗产物无需进一步纯化即可用于下一步骤。乙酰化3-(4-羟苯基)-7-羟基-8-溴代-苯并吡喃-4-酮-合成3-(4-乙酰氧基苯基)-7-乙酰氧基-8-溴代-苯并吡喃-4-酮<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage20</formula>往配有冷凝器和磁力搅拌器的圆底烧瓶内的3-(4-羟苯基)-7-羟基-8-溴代-苯并吡喃-4-酮(2.35g)中添加乙酸酐(15ml)和吡啶(2.5ral)。加热所述混合物至ll(TCl个小时。然后冷却置于冷藏箱内结晶。过滤得到白色晶状固体用水洗涤。粗产物用乙醇重结晶得到白色针状晶状的3-(4-乙酰氧基苯基)-7-乙酰氧基-8-溴代-苯并吡喃-4-酮。'HNMR(CDCl3):52.32,2.42(各s,3H，OCOCH3,7.17-7.22(m，3H,ArH),7.58(d，2H,J8.7Hz，ArH)，8.1(s,1H，H2),8.29(d，1H,J9.0Hz,H5).产率1.5g氢化3-(4-乙酰氧基苯基)-7-乙酰氧基-8-溴代-苯并吡喃-4-酮-合成3-(4-乙酰氧基苯基)-7-乙酰氧基-4-羟基-8-修带-苯并二氢吡喃-4-酮和3(4-乙酰氧基苯基)-7-乙酰氧基-4-羟基-8-修带-苯并二氢吡喃-4-醇<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage20</formula>将装有3-(4-乙酰氧基苯基)-7-乙酰氧基-8-溴代-苯并吡喃-4-酮(0.3g)的乙酸乙酯(80ml)悬液的250ml圆底烧瓶抽除空气后充入氩气以提供惰性气体环境。在该混合物中快速加入氧化铂(67mg)轻柔搅拌所述混合物以保证催化剂完全被乙酸乙酯包裹。在室温下标准条件下氢化所述混合物3天。用次乙酰塑料垫(padofCelite)过滤溶液除去催化剂抽真空蒸发所述溶液得到无色油。所述油的tic分析表明它是苯并二氢吡喃-4-酮和苯并二氢吡喃-4-醇的混合物。所述粗产物在硅胶柱上进行层析，采用二氯甲酸/乙酸乙酯(98:2)作为洗脱液。3-(4-乙酰氧基苯基)-7-乙酰氧基-4-羟基-8-溴代-苯并二氢吡喃-4-醇产量lOOmgiHNMR(CDCl3):□2.30，2.35(各s，3H，OCOCH3),3.32(dt,1H，J3.4Hz,J11.7Hz,H3),4.48(m，1H,H2);4.65(dd，1H，J10.5Hz,11.7Hz,H2)，4.78(bs,1H,H4),6.75(d，1H,J8.3Hz,H6),7.10(d,2H,J8.3Hz，ArH),7.25(d,1H,J8.3Hz，H5)，7,30(d,2H,J8.3Hz,A邻.3-(4-乙酰氧基苯基)-7-乙酰氧基-8-溴代-苯并二氢吡喃-4-酮产量170ragNMR(CDCl3):2.29，2.38(各s，3H,OCOCH3),4.02(dd,1H，J5.7和8.7Hz，H3),4.60(m,2H,H2),6.88(d，1H，J8.6Hz，H6),7.09(d，2H，J8.7Hz,ArH)，7.29(d,2H,J8.7Hz,H2),7.96(d，1H,J8.6Hz，H5).3-(4-羟苯基)-7-羟基-8-溴代-苯并二氢吡喃-4-酮<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage21</formula>往3-(4-乙酰氧基苯基)-7-乙酰氧基-8-溴代-苯并二氢吡喃-4-酮(0.17)的无水乙醇(7.0ml)的悬液中添加咪唑(0.50g)，在氩气中回流所述混合物1小时。减压浓縮所述溶液并往残液中添加蒸馏水(5ml)和盐酸(lM，5ml)。所述混合物在冷藏器中留置过夜，过滤、用水彻底洗涤并在真空干燥器中干燥得到的霜状白色固体。产量130mg'H"NMR(d6陽丙酮)□3.93(t1H,J6.8Hz,H3),4.60(d,2H,J7.2Hz，H2),6.75-6,81(m，3H，ArH),7.13(d，2H,J8.7Hz，ArH)，7.72(d,1H,J8.6Hz,H5)，8.44(bs，1H,OH),10.2(bs,1H，OH).对乙酰氧基异黄烷-4-酮进行类似的脱保护产生相应的羟基化合物。通过改变原材料间苯二酚的取代模式，合成本发明的其它化合物。所有合成化合物均显示与给定结构一致的光谱数据。化合物2的合成以4-羟苯乙酸与连苯三酚的縮合开始。进行上述反应得到化合物2。化合物3、4和5分别以2-甲基间苯二酚、4-氯代间苯二酚和5-甲基间苯二酚开始。消炎活性抑制人单核细胞诱生的类花生酸分离全血离心产生的棕黄层中单核细胞，方法是用淋巴细胞分离梯度液分离人外周血单核细胞，然后用反流离心淘洗(来自三个不同个体)(Demasi等2000)。将测试化合物溶于DMSO后加入到新鲜单核细胞中至0、10和100uM浓度。30分钟后，加入脂多糖(LPS)至终浓度200ng/mL。在5%C02中37°〇培育18个小时后，除去上清液用放射免疫试验(RIA)测定PGE2和TXB2(TXA2的稳定水解产物)产物。除化合物4只检测过一次外，每种化合物用三种不同的试验检测。用AN0VA然后用Newraan-Keuls比较检验来检测剂量和对照值之间的差异。用0.05表示与对照值的差异具有统计学显著水平(用星号(*)标示)。浓度为10uM时所得结果见图1(PGE2)和图2(TXB2)。由于测试化合物以剂量反应方式诱生PGE2或者对PGE2的作用很小，而通常抑制TXB2，因此这些结果可提示所述测试化合物是血栓烷(TX)合酶的抑制剂。为了直接检测测试化合物对TX合酶(TXS)的作用，可采用不同的试验系统。花生四烯酸(AA)是COX的底物，PG&是TX合酶的底物。为了直接检测这些化合物对TXS的作用，将外源性PGH2添加到试验系统中。Ecosatioid合成如下所示<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage22</formula>将0uM、1uM、10yM和100iiM(DMSO中)的测试化合物与未分化的U937细胞(6X106/ml)37。C培育30分钟，然后加入PGH2(5uM)。培育10分钟后，离心终止反应收集上清液用RIA—次三份测定产生的TXB2。用ANOVA然后用Newman-Keuls多重比较检验来检测剂量与对照值之间的差异。用0.05表示与对照值的差异具有统计学显著水平(用星号(*)标示)。结果如图3所示。由于在初步试验中这些化合物中没有一种能抑制PGE2，可以认为这些试验中显示的抑制作用对TXS具有特异性。这些结果表明化合物1、2、4和5是选择性血栓垸合酶的抑制剂，而化合物3显示的对血栓垸合酶的活性特异性较差。抑制NFkB核因子kB(NFkB)是一种可调节重要的调控炎症和各种自身免疫疾病以及细胞凋亡、病毒复制和肿瘤生成的大量基因(包括COX-2)的表达的核转录因子。NFkB可因各种剌激包括生长因子、细胞因子、淋巴细胞、UV射线、药物刺激和应激而活化。其测试化合物能抑制NFkB，提示所述化合物在体内具有消炎活性。将经过修饰的包含e内酰胺酶报道基因的人巨噬THP-1细胞接种入存在RPMI1640培养液(70u1)的96孔板孔(50乂103细胞/孔)。往各孔添加TNFa(7.5ng/ml)和人血清(终浓度为20%)。37匸培育板5小时让NFKB刺激P内酰胺酶产生。然后添加LiveBLAzerTMFRETB/G底物(CCF4-AM)检测P内酰胺酶的活性。一旦CCFA-AM进入细胞，被内源性酯酶转变为带负电荷的CCF4。所述底物受409nm光激发在香豆素和荧光素部分之间产生有效的FRET，导致产生530nm的可检测绿色荧光。P内酰胺酶的存在引起CCF4断裂并导致FRET丧失，产生460nm可检测的蓝色强荧光信号。因此，测到的e内酰胺酶(NFKB启动子活性的标记)活性为产物与底物的比率(蓝色/绿色荧光比率460nra/530nm)。如图4所示，与运载体对照相比，化合物2、3和5显著地(p〈0.001)抑制了NFkB。抑制一氧化氮一氧化氮(NO)在各种炎症中起着重要的调节/调控作用(Blantz和Munger2002)。大量的NO通过在浸润淋巴细胞和活化的常驻组织细胞中均存在的诱导一氧化氮合成酶(iNOS)的作用在炎症部位产生(Evans1995)。它可以是血管舒张性的并干扰黏附分子而防止嗜中性粒细胞粘附。NO释放也可引起形成高活性物质如过氧化亚硝酸盐和稳定的亚硝基硫醇，并可导致线粒体损伤和蛋白质酪氨酸残基的硝化。在各种炎症和自身免疫疾病包括系统性红斑狼疮(SLE)、斯耶格伦(Sj5gren)综合征(SS)、血管炎、类风湿性关节炎和骨关节炎病程中会产生过量的NO(Clancy等1998)。因此认为对它的抑制是一种消炎策略。各种细胞接触细菌LPS和促炎细胞因子时会诱生iNOS进而产生NO。可通过测量一种N0的稳定分解产物亚硝酸盐(N02-)来直接定量N0产物。在添加有FCS、2mM谷氨酰胺和50U/ml盘尼西林/链霉素的DMEM中培养小鼠巨噬细胞系RAW264.7。用10uM(于0.125。/。DMS0中)测试化合物或单用空运载体与10ng/ralLPS—起处理细胞。培育24小时后，收集培养液立即用Griess反应分析NO浓度(Eigler等1995)。10uM化合物1、3a和3b抑制了N0合成而化合物2和4却诱导其合成。化合物5未检测。表1.测试化合物对NO合成的影响complextabelseeoriginaldocumentpage20这些结果表明这些化合物消炎的另一种机理。对鼠耳炎症的消炎活性检验化合物能否抑制周部施涂花生四烯酸(AA)所引起的小鼠耳肿胀。AA即类花生酸的直接前体可通过环氧合酶(COX)和脂氧合酶(LOX)通路形成AA代谢产物诱导炎症反应(Young等1984)。AA诱导PGE2和LTC4合成增加继而导致耳厚度增加(Opas等1985;Chang等1986)。将AA涂于耳部之前30分钟或恰好在这之前，将剂量25rag/kg用聚乙二醇(PEG)400:盐酸缓冲生理盐水(PBS)1:1配的化合物2经腹膜内(i/p)注射重15-21g的雌性BALB/c小鼠(ARC、WA、澳大利亚)中。用异氟垸麻醉小鼠并用弹簧微米计测量双耳的基线厚度。给每只小鼠每一耳廓的内和外表面施涂总量为20"L的AA乙醇(50mg/nil)溶液(g卩，每只耳朵0.5mgAA)。施涂AA后1小时再次麻醉小鼠测量耳厚度。计算每只耳朵施涂AA前后耳朵肿胀的差异，计算每只小鼠双耳平均值。用双尾不配对t检验(Prism4,GraphPad软件)计算各实验组与单用空运载体的组相比的平均肿胀的差异。所有化合物均减轻了AA诱导的耳炎。用化合物2、3a和3b处理的耳厚度显著小于单用运载体处理组。表2.对施涂AA反应的耳厚度变化_</column></row><row><column>化合物</column><column>耳厚度的增加(平均值土SD，xO.Olmm)</column><column>试验组和运载体之间的差^</column></row><row><column>运载体</column><column>14.5±4.7</column><column></column></row><row><column>化合物1</column><column>9.5±2.3</column><column>p=3221</column></row><row><column>化合物2</column><column>6.5±2.9</column><column>p=0.0440</column></row><row><column>化合物3a</column><column>6.7士2.1</column><column>p=O.0362</column></row><row><column>化合物3b</column><column>7.1±3.0</column><column>p=O.0268</column></row><row><column>化合物4</column><column>9.2±3.6</column><column>p=0.3381这些数据证明测试化合物在体内具有消炎活性。在UV射线诱导的皮肤水肿小鼠模型中的抗消炎活性将哺乳动物皮肤急性暴露于UV射线引起红斑和水肿的炎症反应。该反应部分受促炎前列腺素(PGD2、PGE2、PGF2a和可能的PGl2)和白细胞三烯、以其产生的反应性自由基和反应性氧所介导(Sondergaard等1985;Go腿lez和Pathak1996;Widyarini等2001)。用1x3MEdD(最小致水肿剂量)的模拟日光UV射线(SSUV)照射各组4-5只雌性Skh:hr-l白化病小鼠。模拟日光紫外线照射(SSUV)由一平排6个UVA管(Hitachi40WF40T10/BL,黑色)和1个UVB管(PhilipsTL40W/12RS)提供，射线滤过0.125mm乙酸纤维素片层(EastmanChemical产品，Kingport，田纳西州，美国)发出2.96xl(TW/cn^UVA和1.59xlO-5W/cra2UVB。照射过程中，将鼠笼在光线下转动以减轻不同位置处射线密度不同带来的差异。照射后30分钟、2小时和4小时将测试化合物(0.2ml的20yM溶液)或运载体(丙二醇/乙醇/水l:2:l)施涂到经照射的背侧皮肤。在暴露UV之前和之后24小时和48小时用弹簧微米计测量背侧皮肤褶皱。计算每只小鼠暴露UVR前后皮肤厚度的差异，用不配对双尾t检验来检测试验化合物和运载体对照之间的差异。皮肤褶皱厚度在UV照射后24小时出现而在最后测量时间点48小时时最明显。即使UV照射后仅施用3次试验化合物，且在首次测量到皮肤褶皱之前20小时剂量已用完，大多数的化合物仍然具有减轻UV诱导的炎症的活性，如下表和下图中所示。局部施用所有化合物证实了其减轻UV诱导的炎症的趋势。化合物3a在两个时间点均显著抑制皮肤水肿。化合物1和2在第48小时显著抑制。表3.照射24小时后背侧皮肤褶皱厚度的变化_化合物皮肤厚度的增加(平均值士SD，x0.01mm)试验组和运载体之间的M^运载体78±231化合物154±20;^0.0579化合物268±24f0.4275化合物3a32±18;^0.0023化合物3b56±14尸O.0671化合物463±22f0.2407表4.照射48小时后背侧皮肤褶皱厚度的变化_化合物~~皮肤厚度的增加(平均值士SD，x0.Olmm)试验组和运载体之间的差异运载体化合物1化合物2化合物3a化合物3b147±37-91±7.60041105±22p=0.029969±24/=0.0011113±25f0.0746化合物4145±11p=O.9055这些结果清楚地证明了化合物1、2和3a的消炎活性。即使是在炎症发生后短时间内局部施用，它们的效果在48小时以后仍然明显。在大鼠气囊试验中的消炎活性可用来测定消炎效果的另一种试验为气囊模型，其包括反复皮下注射空气到大鼠背部，24小时之后，往气囊内注射炎性刺激物(Gilroy等1998)。气囊隆起于约7周大的雌性DarkAgouti大鼠的背部。在初次注射空气后第2和第5天通过再次充气维持气囊以促进每一气囊内侧形成内层细胞膜衬层。进行再次充气时，将2mL无菌空气充入气囊前，先对气囊抽气以保证针头的位置正确。采用这种方法，使气囊维持充气状态直到要用的第7天时被注射入0.5ml100"M试验化合物或运载体对照。15分钟后，往气囊内注射血清处理过的酵母聚糖(STZ-500iig)。4小时时灌洗气囊(4x2ml灌洗)并进行白细胞计数，之后将大鼠处死，切下气囊置于福尔马林中作组织学研究。计数人员对该切片情况完全无知。采用100格量板和40x物镜，对气囊内衬层10个不同的非毗邻位置的多形性细胞进行计数。每组5-6只大鼠。采用不配对t检验分析各实验数据有无统计学显著性。总体上，对炎性细胞渗出程度的两次不同测定(灌洗液中的白细胞数目和组织切片中的多形性细胞)相一致。对测试化合物的效果的两次测定结果也相一致，其加强了各数据组的有效性。大多数测试化合物显示具有消炎活性。lmM用量时，所有化合物(除了化合物1和3a夕卜)显著抑制了灌洗液中的白细胞数。化合物2、3a和4抑制了组织切片中多形性细胞数。表5.将测试化合物滴入发炎大鼠气囊中的效果灌洗液中的白细胞组织切片中的多形性细胞(xl(T)(每100格)化合物l运载体0.89±0.4231.0±7.250.87±0.2831.1±10.9f0.9181/=0.9921化合物2运载体a0.68±0.3614.3±5.71.41±0.2528.9±6.6/=0.002b风002化合物3a运载体0.47±0.417.9±14,21.72±1.327.0±17.9f0.1124风2196化合物3b0.66±0.23<table>complextableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>a对照是DMS0/PBS，测试化合物的运载体。DMS0/PBS的比为1:100。b不配对t检验；2尾(除非另有说明)这些结果清楚地证明化合物2、3a、3b和4具有体内消炎活性。在DSS-诱导结肠炎小鼠小鼠模型中的消炎活性方法在实验工作开始之前，饲养6-7周龄的雌性BALB/c小鼠至少1周。每天通过饮用水新鲜给予浓度为4.5-5。/。的硫酸葡聚糖钠(DSS-分子量为40kD，TdBConsultancyAB，Uppsala，瑞典(Dieleman等1994))5天以诱导结肠炎(0kayasu等1990)，此后，仅给予清水。该方法诱导轻度结肠炎，症状为腹泻和直肠出血(对其严重程度评分)以及结肠长度缩短。组织学上，结肠炎表现为溃疡和中性粒细胞渗入粘膜，也对此评分。结肠炎的全身性影响引起体重减轻，也对其进行监测。结果一系列实验中，口服给予化合物l、化合物2、化合物3a、化合物3b或化合物4减轻了结肠炎症。重要的是，这些化合物具有活性的剂量较低-每天一次口服剂量为1.0-1.25mg/kg。实验1在整个实验中，给予lmg/kg剂量的运载体(PEG400:PBS1:1)、化合物1或4直到第17天处死小鼠。两种化合物均减轻了结肠炎。此试验中，化合物l的消炎活性比化合物2更佳(结肠渍疡减轻、临床症状出现延迟、临床评分降低、临床症状的发生和严重性减轻、体重减轻减少和恢复时间减少)。平均组织学评分如图5所示，表明用化合物1和4治疗的小鼠结肠炎较轻。给予化合物1的小鼠比只给予运载体的小鼠结肠上皮溃疡的减轻具有统计学显著性0^=0.0135)。由摄食DSS诱导的结肠炎可引起结肠縮短，测试药物给予的此种保护作用得到结肠縮短减少的证明。给予化合物1(p=0.1922)或化合物2(p=0.0542)的小鼠结肠倾向于比只给予运载体的小鼠更长。见图6。被给予运载体组中的多个小鼠第5天出现临床症状，但被给予化合物1和4的组直到第6天仍无症状，提示那些化合物能延迟结肠炎的发生。到第11天，给予化合物1或4的组平均临床评分显著(f0.017和；7=0.043)低于只给予运载体的组。这些结果提示化合物1和化合物2均具有消炎性。见图7。化合物4的最大平均体重减轻仅为1%，化合物1为％，而只给予运载体的组为5%。特定组的平均体重减轻转变为平均体重增加，部分提示了该组发生了结肠炎消退。这在给予化合物1的组中发生于第10天，化合物4发生于第12天，而运载体直到第15天仍未发生。见图8。实验2在饮水中加入DSS诱导结肠炎之前连续10天给予剂量lmg/kg的化合物1和2或运载体，之后停用测试化合物。给予DSS5天并在8天后(第23天)处死小鼠。即使只在诱导之前而非诱导期间服用了两种化合物，仍能减轻炎症。见图9。粘膜溃疡的量和严重性比运载体治疗组要好，但并不显著。同时有一种趋势，就是结肠长度在试验组和运载体组之间不存在显著差异。结肠长度在未被给予DSS的小鼠和运载体组之间具有显著差异G^0.0414)。然而，化合物1治疗组的结肠与对照组的结肠在长度上不具有显著差异提示化合物1仅在一定程度上保护不受摄食DSS带来的炎症的影响。见图10。在运载体处理的组中有一只小鼠在第18天死亡，而治疗组均未有小鼠死亡。尽管当与运载体治疗组比较时没有统计学显著性差异，但有可靠证据表明该两组治疗组减轻结肠炎的临床表征。见图ll。施用化合物2和化合物l(效力程度较轻)减少DSS诱导的结肠炎相关的体重减轻。第22天，接受化合物2的小鼠比接受运载体的那些显著更重G^0.0291)。见图12。实验3在整个实验过程中服用1.25mg/kg化合物3的顺式或反式异构体(分别为化合物3a和化合物3b)或运载体，直到第17天小鼠被杀死。根据临床指标、结肠长度和组织学变化判断给予化合物3a以及给予化合物3b(效力程度较轻)能够减轻结肠炎症并促进其消退。在给予化合物3a的组中未见后部结肠溃疡，而在给予化合物3b的小鼠中仅见到1/8。然而，在给予空运载体的小鼠中减到3/8的溃疡。给予化合物3a的小鼠的粘膜损伤程度显著(f0.018)低于运载体治疗组。见图13。给予化合物3a的组的小鼠结肠显著(尸0.039)长于给予空运载体的组的结肠。28见图14。接受化合物3a的组的平均评分在第8天(f0.0078)、第9天(/=0.0326)、第10天(/=0.0386)和第11天(巧O.0252)始终显著低于运载体组的评分。然而，当运载体处理小鼠中的结肠炎开始消退时，差异较不明显，并且不存在统计学上的显著。然而，在本试验最后几天，接受化合物3a的组的平均临床分数在第15天0=0.0033)和第16天(/7=0.0016)再次显著较低。这提示化合物3a发挥了消炎作用并促进炎症的消退。同样，接受化合物3b的组的平均分数在第8天(p=0.0055)、第9天(f0.0057)和第11天(/K).0252)显著低于运载体组。接受化合物3b的组的平均临床分数在第17天(pi.0177)再次显著较低。这提示口服给予化合物3b也具有消炎效果并促进炎症的消退。见图15。尽管趋势很明显，化合物3的异构体组和给予运载体组之间的体重变化不具有统计学上显著的差异。给予化合物3a的组的最大平均体重减轻小于29&，而给予空运载体组为接近5%。化合物3a相对运载体组较快但并不显著地在第4天发生从平均体重减轻到平均体重增加的变动。见图16。试验4整个试验中，每天给予小鼠组(/7=5)—次lmg/kg化合物1或运载体，并在第6天、第9天或第13天将其杀死。取出结肠，纵向切开并用含有两性霉素B(2.5ug/ml，Invitrogen)的青/链霉素(100U/ml/100Ug/ml,Invitrogen)的PBS洗涤。然后将它们切成小块，并将约lOOmg的结肠放入存在或不存在含有ConA(10ug/ml，Sigma)的lml改良RPMIc(青/链霉素和两性霉素B)的的24孔板的一个孔中18-24小时。收集上清液，离心后于-8(TC保存。用ELISA(CaymanChemical)—式三份测定培养物上清液中的PGE2和TXB2。通过在不存在促有丝分裂刺激物下培养结肠，评估目前产生的炎性介质。接触DSS的小鼠发炎结肠比健康不发炎结肠倾向于产生更多的炎性介质(Dieleman等1998;Tomoyose等1998;Morteau等2000;Micallef等2002)。在此实验中摄食DSS小鼠的结肠比无结肠炎健康小鼠的结肠在第9天(/X0.05)产生了显著更多的PGE2，第6天0X0.05)更多的TXB2。在整个实验过程中，尤其在早期，给予DSS小鼠的结肠倾向于产生更多的PG&和TXB2。通过比较给予DSS并用化合物1治疗的小鼠与给予DSS并只用运载体治疗的小鼠，评估化合物1对减轻这些炎症反应的作用。化合物治疗小鼠的结肠倾向于在第9天和第13天产生较少的PGE2，而在第6天和第9天产生较少的TXB2(p＜0.05)-见图17。在存在促有丝分裂原的条件下培养结肠以评估能否对炎性/促有丝分裂剌激物反应。当摄食DSS时，结肠在第9天(p＜0.05)和第6天对ConA反应中比无结肠炎健康小鼠的结肠产生了显著更多的PGE2。在整个实验中，尤其在早期，给予DSS的小鼠的受刺激的结肠倾向于产生更多PGE2和TXB2。到第13天，健康和发炎的结肠之间已无差异，提示DSS引起的急性炎症开始消退。用化合物l治疗倾向于减轻(尽管不显著)这些反应。见图18。这些结果证明了结肠炎动物模型口服化合物1的消炎作用可能是由于它的作用减弱了炎性结肠合成类花生酸。心脑保护活性大鼠主动脉环试验的血管舒张活性利用大鼠主动脉环离体试验检测测试化合物的血管舒张能力。在试验槽中加入去甲肾上腺素引起主动脉环收縮，如果血管收縮受测试药物的抑制，该药物能拮抗去甲肾上腺素的作用，提示则表明该药物具有血管舒张抗高血压活性。方法用80%C02和20%02将雄性Sprague-Dawley大鼠(250士50g)安乐死。取出胸主动脉并迅速固定在器官槽(Chin-Dusting等2001)中。获得有和没有1μg/ml递送的测试化合物时对去甲肾上腺素(O.lnM-10mM)反应产生的整个浓度-收縮反应曲线。用5只不同动物的n=5个动脉环重复此实验。任何一种测试浓度时只有一种化合物对每只动物的动脉环具有影响。拟合与数据匹配的乙状结肠剂量反应曲线并计算出logEC50(Prism4,GraphPad软件)。用双尾配对t检验计算存在与不存在测试化合物时这些值之间的差异。检测β-雌二醇和单用运载体的作用分别作为阳性和阴性对照。结果本实验检测了化合物l、2、4、5和化合物3的异构体混合物。化合物1和3比只用运载体显著抑制了主动脉环对去甲肾上腺素的收縮性反应(logEC50)这些数据表明这些化合物除具有消炎活性外，还具有心血管活性。见图19。无胃肠毒性化合物l每天口服化合物l，ll天以研究其毒性。4只SpragueDawley大鼠(每种性别2只)口服化合物1的CMC0.1%溶液，高剂量300mg/kg和限制剂量誦mg/kg。第三组服用运载体。见图20。化合物1的CMC0.1%制剂在4'C、25。C和4(TC可稳定经过7天时间。第7天后提供新鲜批次的化合物l。测量给药前刻，然后第8天和挑选的第12天时的体重。整个实验过程中，每天观察所有大鼠有无中毒迹象。尸体解剖时，肉眼检查尸体的外表面，检查所有孔洞和胸腹腔及其内容物。称量肝脏、肾脏、肾上腺、脾和生殖腺重量。检测终末血液学(Terminalhaematology)、血清生物化学和肝、脾和骨髓的组织学。没有发现任何毒性证据，具体是胃肠紊乱、体重减轻、凝血紊乱、贫血或提示胃肠出血的其它血恶液质。化合物2将5mg/kg(/f3)的化合物2或运载体(PEG400:PBS1:1;/=2)通过管饲连续10天给予雌性BALB/c小鼠。没有一组出现不良临床症状，体重变化相似。尸体解剖未发现肉眼可见的病理变化。盲肠和结肠的组织学分析均正常。见图21。化合物3将化合物3a和3b用PEG400:PBS1:1配称非对映异构体混合物通过管饲以每天20mg/kg给予7周龄雌性BALB/c小鼠(/7=8)10天。无用于比较的运载体对照组。然而，此组所有小鼠均维持体重10天后平均比原体重增长5%，这在该年龄小鼠中属于正常。见图22。化合物4将5mg/kg(^3)的化合物4或运载体("=2;PEG:PBS1:1)通过管饲连续10天给予雌性BALB/c小鼠。没有一组出现不良临床症状，体重变化相似。尸体解剖未发现肉眼可见的病理变化。盲肠和结肠的组织学分析均正常。这些数据确证了这些化合物不会引起胃肠毒性，证据是长时间和常以极高剂量接受这些化合物的那些动物的体重增加正常、无临床症状以及无组织病理学改变。本说明书中使用的词语包含的含义，应理解为本发明也可扩展至由所述要素或整数的组合或由其基本组成。本说明书中对任何现有技术的参考并非，或不应该认为是承认或以任何方式暗示该现有技术形成本领域公知技术的一部分。本领域技术人员知道，可对本文描述的本发明具体所述的那些进行其它的改变和修饰。但应该理解，本发明包括所有这类改变和修饰。本发明也包括所有本说明书中以个别或集合方式提到的步骤、特征、组合物和化合物，以及所述这些步骤或特征的任何以及全部组合。参考文献Carty,E.等.(2000)."Ridogrel,adualthromboxanesynthaseinhibitorandreceptorantagonist:anti隱inflammatoryprofileininflammatoryboweldisease(禾!j多瑞尔,双重血栓烷合酶抑制剂和受体拮抗剂:在炎性肠病中的消炎属性)".AlimentaryPharmacology&Therapeutics14(6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