诱导人类免疫缺陷病毒的中和抗体的方法

专利名称：：诱导人类免疫缺陷病毒的中和抗体的方法
技术领域：
：本发明大体上涉及人类免疫缺陷病毒(HIV)，具体而言，涉及诱导HIV中和抗体的方法以及适用于所述方法的化合物和组合物。
背景技术：
：在急性HIV-1感染中产生的第一抗体是抗以下位点的CD4结合位点(Mooreetal,J.Virol.68(8)5142(1994))、CCR5共受体结合位点(Choeetal,Cell114(2):161-170(2003))和V3环(Mooreetal,J.Acquir.Immun.Def.Syn.7(4):332(1994》。然而，这些抗体不能控制HIV-1并易被其逃脱(Burtonetal,NatureImmun.5:233-236(2004),Weietal，Nature422(6929):307-312(2003))。抗自体病毒的中和抗体在感染后五十六十天产生，但能中和异源HIV-1株的抗体直到感染第一年之后才产生(Richmanetal，Proc,Natl.Acad.Sci.USA100(7):4144-4149(2003),Weietal,Nature422(6929):307-312(2003》。mv-i包膜上与罕见的广泛反应性中和抗体相结合的四个表位是CD4结合位点(CD4BS)(mab(单克隆抗体)IgGlbl2)(Zwicketal,J.Virol.77(10):5863-5876(2003》、由人类mab2F5和4E10定义的膜近外侧区域(membraneproximalexternalregion,MPER)表位(Armbrusteretal，J.Antimicrob.Chemother.54:915-920(2004),Stiegler禾卩Katinger，J.Antimicrob.Chemother.51:757-759(2003)，Zwicketal,JournalofVirology79:1252-1261(2005),Purtscheretal,AIDS10:587(1996))(图l)和由人类mab2G12定义的甘露聚糖表位(Scanlanetal,Adv.Exper.Med.Biol.535:205-218(2003))。这四个罕见的人类mab均是不寻常的两个是IgG3(2F5和4E10),—个具有独特的Ig二聚体结构(2G12)，一个具有非常疏水的CDR3(2F5)(Ofeketal,J.Virol.198:10724(2004))，并且在所有四个抗体里面，CDR3异乎寻常的长(Burtonetal，NatureImmunol.5(3):233-236(2004),Kunertetal，AIDSRes.Hum.Retroviruses20(7):755-762(2004),Zwicketal,J.Virol.78(6):3155-3161(2004),Cardosoetal，Immunity22:163-172(2005))。其中，类似2F5和4E10的人类mab是非常罕见的。急性HIV-l患者不产生抗MPER或2G12表位的抗体(Robinson,未发表(2005),Shaw,未发表(2005))，MPER可由HIV包膜的氨基酸652683所限定(Cardosoetal,Immunity22:163-173(2005)(例如，QQEKNEQELLELDKWASLWNWFDITNWLWYIK)。CD4结合位点(BS)抗体通常在HIV-l感染早期产生，但这些抗体通常不具有mabIgGlbl2所表现出的广谱中和性(Burtonetal，Nat.Immunol.5(3):233-236(2004))。己显示许多HIV-l包膜的表位与宿主组织交叉反应(Pintoetal,AIDSRes.Hum.Retrov.10:823-828(1994)，Douvasetal，AIDSRes.Hum.Retrov.10:253-262(1994),Douvasetal，AIDSRes.Hum.Retrov.12:1509-1517(1996))，并且已显示自身免疫患者产生与HIV蛋白具有交叉反应性的抗体(Pintoetal,AIDSRes.Hum.Retrov.10:823-828(1994),Douvasetal,AIDSRes.Hum.Retrov.10:253-262(1994)，Douvasetal,AIDSRes.Hum-Retrov.12:1509-1517(1996)，Bartheletal,Semin.Arthr.Rheum.23:1-7(1993))。类似地，已提示对自身表位的免疫应答的诱导是自身免疫异常禾口AIDS中T细胞缺失的原因(Douvasetal，AIDSRes.Hum.Retrov.12:1509-1517(1996)，Ziegleretal，Clin.Immunol.Immunopath.41:305-313(1986))。已制造了2F5mab的高亲和性肽配体，其诱导高水平的抗所述肽的抗体，但没有广泛地中和HIV-l原初分离物(McGaugheyetal，Biochemistry42(11):3214画3223(2003);Zhangetal，J.Virol.78(15):8342-8348(2004);Zwicketal，J.Virol.79:1252-1261(2005)中的综述)。经解释这些结果意味着所述2F5的肽配体未具有合适的构象以诱导抗-MPER抗体(Burtonetal,NatureImmunology5(3):233画236(2004),Zwicketal,J.Virol.79:1252-1261(2005))。已制造一系列高度受限的HIV-1Env免疫原(其中稳定表达IgGlbl2、2G12、2F5和4E10表位)，并且已证明这些免疫原在豚鼠或兔子中不诱导广泛反应性中和抗体，具体而言，不产生针对MPER表位的中和抗体(Liaoetal，J.Virol.78(10):5270-5278(2004);Haynes,未发表(2005))。这些结果已提出这样的问题在正常动物和人类中不产生针对HIV-1包膜的广泛反应性抗体是否是因为不能产生所述广泛反应性抗体。由于长的疏水CDR3区是天然的多反应性自身抗体所特有的(Meffreetal，J.Clin.Invest.108:879-886(2001),Ramslandetal，Exp.Clin.Immun.18:176-198(2001))，以及HIV-1感染的患者的B淋巴细胞经多克隆马区使产生心磷月旨抗"i本(Weissetal，Clin.Immunol.Immunopathol.77:69-74(1995),Gr画waldetal,Clin.Exp.Immunol.15:464-71(1999》，已进行研究分析这些以及其他对于心磷脂的抗-HIV-lmab和其他自身抗原反应性。本发明至少部分来自于以下认识，即两个广泛反应性HIV-1包膜gp41人类mab(2F5和4E10)是与心磷脂具有反应性的多特异性自身抗体。
发明内容本发明大体上涉及人类HIV。更具体地说，本发明涉及一种诱导HIV中和抗体的方法以及适用于所述方法的化合物和组合物。在具体的实施方式中，本发明提供了在其天然膜结合环境中呈递MPER表位的免疫原，以及使用所述免疫原破坏耐受性的免疫方法。由以下描述可清楚了解本发明的目的和优点。图1:广泛中和抗体(2F5、4E10)与位于靠近宿主膜的表位结合。2F5和4E1mAb均是IgG3，具有长CDR3，并与位于HIV-1gp41(aa660-683)膜近外侧区域(MPER)内的表位结合。图2A2D:2F5、4E10、IgGlbl2Mab与人类Hep-2上皮细胞的反应性。图2A显示Mab2F5与Hep-2细胞以弥散细胞质和细胞核方式反应，图2B显示Mab4E10与HEp-2细胞以与2F5相似的方式反应。图2C显示MabIgGlbl2与Hep-2细胞以弥散细胞质方式反应，在细胞核中具有核仁反应性。图2C插入图显示更高倍率放大的细胞，其中显示IgGlb12的核仁反应性(箭头)。图2D显示Mab1.9F对Hep-2细胞为负反应性。在图2A2D中所检测的每个载玻片上的抗体量为每载玻片上3.75pg的Mab。Mab2F5在每个载玻片上0.125吗(5jig/ml)时对HEp-2细胞为阳性。Mab4E10在每个载玻片上0.125吗(5pg/ml)时对HEp-2为阳性。IgGlbl2在每个载玻片上1.25pg(50pg/ml)时为阳性。所有图均放大200倍，图2C插入图放大400倍。所示图像来自于所进行的三次试验中的代表性试验。图3A3D:Mab2F5和4E10抗脂质以及结合特异性的分析。图3A显示MAb4E10(实心柱)和2F5(空心柱)对心磷脂(CL)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)和鞘磷脂(SM)的ELISA活性。尽管4E10和2F5均与心磷脂反应，但仅有4E10与所测试的其他脂质反应。对照人类抗CCR5结合位点MAb1.7b的反应性为阴性(数据未示出)。MAb对空白包被板的反应性也相似地为阴性(未示出)。为显示MAb2F5对心磷脂的结合特异性，使用150吗/ml300吗/ml的2F5和1000吗/ml的抗2F5独特型鼠类MAb3H6，所述MAb3H6阻断MAb2F5对HIV-1的中和。(Kunertetal,AIDS16:667(2002))。在3次独立的试验中，所述2F5抗独特型以70%方式明显地阻断MAb2F5与心磷脂的结合(p0.03)(图3B)。在独立的ELISA中，MAb2F5以660nM的半数最大(EC50)应答与心磷脂相结合(未示出)。图3C显示4E10MAb与心磷脂结合的剂量应答曲线。所述4E10结合的半数最大(EC50)应答(80nM)由四个参数S形曲线拟合分析计算所得。结合数据获自4E10MAb(0.5nM1000nM)与包被在ELISA板上的心磷脂(1.35lag/孔)结合的ELISA。图3D显示表达所述4E10表位的可溶性HIV-1Envgpl40寡聚体(CON-S)抑制4E10MAb与心磷脂的结合。4E10与心磷脂结合的抑制作用的IC50经计算为145nM。使用各种浓度的gpl40(19.25nM1230nM)进行所述抑制分析，所述各种浓度的gpl40与10吗/ml的4E10MAb混合，然后加入到含有1.35吗心磷脂的孔中。MAb3H6(1mg/ml)(但不是对照MAb)也阻断MAb2F5与SSA/Ro、着丝粒B和组蛋白的结合(未示出)。图3A3D中的所有数据代表至少两次所进行的试验。图4A和4B:CON-SEnvgpl60的氨基酸(图4A)和核酸(图4B)序列。在实施例2中使用图4A的蛋白质的CFI形式。(gpM0CFI指以下HIV-l包膜设计，其中删除了切割位点(C)、融合位点(F)和gp41免疫显性区(I)，以及删除了跨膜域和胞质域。)图5:在免疫方案中使用的磷脂的结构以及所得的中和滴度。图6A和6B:在生成肽-脂质体偶联物中用到的肽序列。MAb2F5和4E10结合表位的标称表位分别包括序列ELDKWAS和WFNITNW，并标以下划线。V3序列来自于HIV-1MN株的gpl20，并用作对照构建体。错义序列(scrambledsequence)用作对照。图7:MPERgp41构建体的多种设计的示意性表示图。在每个示意性构建体的上方标出功能性区域。在每个示意性构建体的下方标出氨基酸序列。初始和成熟信号序列以蓝色突出显示；免疫显性区以黑体突出显示；MPER区以棕色突出显示以及GTH1区以红色突出显示，而跨膜域标以下划线。组氨酸标签(His-tag)加到所述构建体的C-端以易于纯化，并以绿色突出显示。图8:mAb4E10与肽-脂质体偶联物的结合。BIAcore结合曲线显示mAb4E10与GTH1-4E10脂质体的特异性、明显更强的结合。也检测到与GTH1-2F5脂质体的具有快速动力学的低水平结合。图9:2F5mAb与肽-脂质体的结合。mAb2F5特异性地与GTH1-2F5脂质体结合，并显示出不与GTH1-4E10脂质体结合。图10:A32mAb与肽-脂质体结合。对照抗gpl20Mab(即A32)显9示不与任何脂质体偶联物相结合。17b，一种CD4诱导性mAb也显示不与上述脂质体偶联物相结合(数据未示出)。图11:偶联荧光素的肽-脂质体的生成。通过在脂质组合物中加入荧光素-POPE将肽-脂质体与荧光素标签偶联。结合试验显示在偶联荧光素的脂质体中保留了mAb4E10结合的特异性。荧光素偶联的GTH1-2F5脂质体给出类似结果。图12:已免疫的豚鼠血清与4E10肽的反应性。ELISA结合试验显示来自用GTH1-4E10脂质体免疫的两只豚鼠的血清与4E10肽的强阳性反应性。所有的预先取血血清均给出背景结合，而在来自于用4E10肽免疫的动物的血清中仅观察到低水平的结合。两只来自于经肽-脂质体免疫的动物的阳性血清均显示出中和活性(表2)。一个血清(1102)显示出MN和SS1196株的中和，抗体滴度分别为1:209和1:32。第二个血清(1103)仅有效抗MN病毒(1:60)。具体实施例方式本发明至少部分来自于表明某些广泛中和HIV-1抗体是自身抗体的研究。大量HIV+患者短暂地产生低水平的所述抗体，然而，此处描述的研究也指出gp41表位并不诱导这些抗体特异性，而是交叉反应性自身抗原(包括心磷脂)是启动抗原。本发明提供了一种诱导能中和HIV的抗体的方法。所述方法包括向有需要的患者施用一定量的至少一种足以实现所述诱导的异源(例如非人类)或同源(例如人类)交叉反应性自身抗原。适用于本发明的交叉反应性自身抗原包括心磷脂、SS-A/RO、来自细菌或哺乳动物细胞的dsDNA、着丝粒B蛋白和RiBo核蛋白(RNP)。合适的自身抗原也包括除心磷脂之外的磷脂，诸如磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇或鞘磷脂，及它们的衍生物，例如l-棕榈酰-2-油酰，-甘油基-3-[二氧磷基-L-丝氨酸](POPS)、1-棕榈酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(POPE)和二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)。采用磷脂的六角II相可以是有利的，并且优选易于形成所述六角II管状相(例如在生理条件下)的六角堆积柱的磷脂，正如能以六角II相稳定的磷脂。(参见Rauchetal,Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:4112-4114(1990);Aguilaretal，J.Biol.Chem.274:25193-25196(1999》。也可以采用包含所述交叉反应性表位的所述自身抗原的片段。可在例如初免加强方案中使用自身抗原或其片段，所述初免加强方案可容易地被本领域技术人员优化(所述方案的编码蛋白质性组分的DNA序列可在使得在体内制造所述蛋白质性组分的条件下施用)。通过实施例的方式，可以将交叉反应性自身抗原用作第一初免疫苗以加强天然自身抗体(例如类似于抗心磷脂4E10和2F5抗体)。或者是自身抗原(例如心磷脂(或其片段))，或者是含有交叉反应性表位的HIV包膜蛋白/多肽/肽能用作加强物，所述交叉反应性表位诸如2F5禾Q/或4E10表位(所述表位能至少分别包括序列ELDKWA禾口NWFDIT)(参见在PCT/US04/30397中披露的序列)(应当注意的是HIV-包膜不是自身抗原)。所述自身抗原和/或HIV-蛋白/多肽/肽，或者编码序列的施用模式随免疫原、患者以及所要得到的效果而变化，施用剂量也与此类似。最优的剂量方案可由本领域技术人员很容易确定。通常，施用为皮下、肌肉内、静脉内、鼻内或口服施用。免疫原性物质可与佐剂组合施用。尽管有多种佐剂可供使用，但优选的佐剂包括CpG寡核苷酸或者其他能破坏对自身抗原的耐受性而不诱导自身免疫疾病的物质(例如TRL9激动剂)(Tranetal,Clin.Immunol.109:278-287(2003);美国专利申请20030181406、20040006242、20040006032、20040092472、20040067905、20040053880、20040152649、20040171086、20040198680、200500059619)。本发明包括适用于本发明方法中使用的组合物，包括含有所述自身抗原，和/或HIV蛋白/多肽/肽(其中包含一个或多个交叉反应性表位(例如4E10禾卩/或2F5表位))，或4E10或2F5表位模拟物和载体的组合物。当可使用DNA初免物或加强物时，合适的制剂包括DNA初免物和重组腺病毒加强物以及DNA初免物和重组分枝杆菌加强物，其中所述DNA或所述载体，例如，或者对HIV包膜或者对自身抗原蛋白如SS-A/Ro进行编码。其他这些载体的组合能用作初免物或加强物，或者伴随或者未伴随HIV蛋白/多肽/肽和/或自身抗原。所述组合物可例如以适用于注射或者鼻内施用的形式存在。有利的是，所述组合物是无菌的。所述组合物可以以剂量单元形式存在。本发明还涉及被动免疫疗法，其中将来源于以下患者的B细胞用于制造交叉反应性抗体(包括除4E10和2F5之外的单克隆抗体)，所述患者为患有原发性自身免疫疾病如系统性红斑狼疮(SLE)或抗磷脂抗体综合征的患者或者患有梅毒、利什曼病和麻风等感染性疾病的患者。即，本发明包括来源于SLE患者以及患有其他免疫调节紊乱的患者(即患有能产生与HIV包膜具有交叉反应性的自身抗体的原发性自身免疫疾病，或非-HIV感染等诸如上述的患者)的B细胞在制造永生细胞系中的用途，所述永生细胞系提供了与HIV包膜具有交叉反应性的抗体(例如，类似2F5或者4E10的抗体)源(参见Stiegleretal,AIDSRes.Hum.Retroviruses17:1757-1765(2001),Armbrusteretal,J.Antimicrob.Chemother.54:915-920(2004)，USP5,831,034)。有利的是，B细胞来自受HIV感染的患者或者接受基于包膜的HIV疫苗的SLE患者(或患有另外的原发性自身免疫疾病的患者)(虽然不愿意受到理论的约束，但HIV感染或者接种可用于"加强"致敏的Bl细胞(例如心磷脂致敏的Bl细胞)以产生类似2F5和/或4E10的抗体并避免缺失(这会发生在正常受试者中)——所述"加强"可诱发体细胞超变因此所得Ig基因编码以下抗体，该抗体适合于类似2F5和/或4E10的表位——或者适合于其他能诱导广泛中和抗体但在正常个体中缺失的gpl60表位)。可使用本领域内公知的多种技术中的任一技术实现由B细胞制造永生细胞系，所述公知技术包括但不局限于将诸如B细胞与骨髓瘤细胞融合以制造杂交瘤。一旦选定，编码所述交叉反应性抗体(或其结合性片段)的序列可以被克隆和扩增(参见例如Huseetal,Science246:1275-1281(1989)，以及如在WO91/17271，WO92/01047，USP5,877,218、5,871,907、5,858,657、5,837,242、5,733,743和5,565,332中描述的噬菌体展示技术)。可采用本领域公知技术设计和制造用于治疗的可溶性抗体(Stiegleretal,AIDSRes.Hum.Retroviruses17:1757-1765(2001)，Armbrusteretal，J.Antimicrob.Chemother.54:915-920(2004》。依照该方法，所述抗体(或其结合性片段)可以以约10mg/剂100mg/剂，优选25mg/剂的剂量范围施用。剂量和频率可随抗体(或其结合性片段)、患者和所要得到的效果而变化(参见Armbrusteretal,J.Antimicrob.Chemother.54:915-920(2004))。上述抗体可以进行预防性或治疗性应用。所述抗体(或其结合性片段)，或者编码所述抗体或结合性片段的DNA可与载体(例如药用载体)一起配制并通过例如肠道外、静脉内、皮下、肌肉内或鼻内途径进行施用。最后，动物物种诸如骆驼(Ramslandetal,Exp.Clin.Immunogenet.18:176-198(2001),Litmanetal,A匪.Rev.Immunol.7:109-147(1999))，牛(Ramslandetal，Exp.Clin.Immunogenet.18:176-198(2001)，Litmanetal,Annu.Rev.Immunol.7:109-147(1999))和鳘鱼(Ramslandetal,Exp.Clin.Immunogenet.18:176-198(2001)，Litmanetal,Annu.Rev.Immunol.7:109-147(1999)，Hohmanetal,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.90:9882-9886(1993》具有非常长的CDR3长度，并且其抗体显示出多反应性。这些工程化的对HIV包膜显示出多反应性的CDR3可用于制造有效的针对HIV以及很多感染物的治疗抗体(例如单克隆抗体，包括例如嵌合和人源化抗体，以及其抗原结合片段)。在具体实施方式中，本发明进一步涉及合成脂质体-肽偶联物以及使用其作为免疫原用于产生抗HIV-1的广泛中和抗体的方法。本发明的该实施方式提供将与HIV-1gp41的MPER相结合的广泛中和抗体的标称表位肽包埋在合成脂质体中的组合物和方法。还提供的是用于产生抗HIV-1中和抗体和用于检测抗原特异性B细胞应答的免疫策略和方案。依照本发明的该实施方式，包含广泛中和抗HIV抗体的标称表位和疏水接头如GTH1(序列参见图6)的肽序列包埋在合成脂质体中。在一个优选方面，所述标称表位是mAb2F5(ELDKWAS)或4E10(WFNITNW)的标称表位，如上所述其位于HIV-1包膜gp41的MPER中。所述表位可存在于所述肽中使其特异性抗体能相对不受限制地靠近，或者作为另外一种选择，所述表位能够与所述疏水接头相比存在于肽中以模拟所述MPER区的天然取向。适合用于本发明的肽序列的具体实例列在图6中。此外，所述MPERgp41区可在人类细胞表达系统中表达为在重组痘苗病毒中的重组蛋白，并在所述gp41组分的N端或C端形成两性(x-螺旋以易于和脂质体相结合(图7)。适用于本发明的脂质体包括但不局限于含有POPC、POPE、DMPA(或鞘磷脂(SM))和胆固醇(Ch)的脂质体。尽管最佳比例可由本领域技术人员确定，但实例包括POPC:POPE:SM:Ch或POPC:POPE:DMPA:Ch的比例为45:25:20:10。可以使用的脂质体替代制剂包括以9:7.5:1的摩尔比例配制的DMPC(l，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱)、胆固醇(Ch)和DMPG(1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-二氧磷基-rac-(l-甘油)(Wassefetal,ImmunoMethods4:217-222(1994);Alvingetal，G.Gregoriadis(ed.)，Liposometechnology第二片反,vol.IllCRCPress,Inc.,BocaRaton,FL(1993);Richardsetal,Infect.Immun.66(6):285902865(1998》。肽与总脂质的最佳比例可例如根据所述肽和脂质体而变化。对于实施例3的肽，1:420的比例是有利的。可采用标准技术制备脂质体-肽偶联物(也可参见以下实施例3)。本发明的所述肽-脂质体免疫原可与有助于加强抗体应答的佐剂(如脂质A、oCpG、TRL4激动剂或TLR7激动齐lj)一同配制禾口/或施用(Raoetal,Immunobiol.CellBiol.82(5):523(2004))。其他可以使用的佐剂包括明矾(alum)和Q521(其不破坏已存在的B细胞耐受性)。优选的制剂含有经设计破坏B细胞耐受性形式的佐剂，例如在油乳剂如Emulsigen(水包油乳剂)中的oCpG(Tranetal，Clin.Immunol.109(3):278-287(2003))。其他合适的佐剂包括在2005年12月14号递交的11/302,505中描述的佐剂，包括其中披露的TRL激动剂。所述肽-脂质体免疫原可例如通过静脉内(IV)、鼻内、皮下、腹膜腔、阴道内或者直肠内施用。施用途径可例如根据患者、偶联物和/或所要得到的效果而变化，剂量方案也是如此。所述肽-脂质体免疫原优选为预防性使用，然而，对已感染个体进行施用也可降低病毒负载。如以下实施例3所描述，所述肽-脂质体偶联物可用作检测MPER-特异性B细胞应答的试剂。例如，所述肽-脂质体构建体可以与可检测标记(例如荧光标记如荧光素)相偶联。所述偶联荧光素的脂质体可用在流式细胞计数分析中作为检测宿主中的抗-MPER特异性B细胞应答的试剂，所述宿主已用呈递暴露的MPER区域的HIV-1Env蛋白进行免疫过。这些试剂可用于外周血B细胞的研究，以通过测量免疫后循环记忆B细胞的数量来确定抗MPER抗体诱导的免疫有效性。由阅读前文应当理解的是，如果HIV己进化至不能被免疫系统发现而逃避宿主的免疫应答，其他感染物也可能已发生类似的进化。§卩，这将代表一种普遍的逃避机制。在如此的情况下，可以推想与此处描述相当的方法对于这样的其他物质的治疗也有用。在以下的非限制性实施例中将更详细地描述本发明的某些方面(也可参见Maksyutovetal,J.Clin.Virol.Dec;31Suppl1:S26-38(2004)，美国申请号20040161429，禾卩Haynesetal,Science308:1906(2005》。实施例1设计能诱导广泛反应性屮和抗体的HIV-1免疫原是HIV-1疫苗开发的主要目的。尽管存在能广泛中和HIV-1的罕见人类mab，但是HIV-1包膜免疫原并不诱导这些抗体特异性。在本研究中，己证明两种最具有广泛反应性的HIV-1包膜gp41人类mab(2F5和4E10)是对心磷脂有反应性的多特异性自身抗体。因此，由于自身抗体的gp41膜近表位模拟性的缘故，目前的HIV-1疫苗不能诱导抗膜近gp41表位的抗体。实验细节单克隆抗体。如所述制造Mab2F5、2G12和4E10(Steigleretal，AIDRes.HumanRetroviruses17:1757(2001),Purtscheretal，AIDS10:587(1996),Trkolaetal，J.Virol.70:1100(1996))。IgGlbl2(Burtonetal，Science266:1024-1027(1994))是DennisBurton,ScrippsInstitute,LaJolla,CA慷慨赠送的礼物。Mab447-52D(Zolla-Pazneretal,AIDSRes.HumanRetroviral.20:1254(2004))获自AIDSReagentRepository,NIAID,NIH。表1中其余mab由感染HIV-1的受试者产生并根据描述进行使用。(Robinsonetal,AIDSRes.HumanRetroviral.6:567(1990),Binleyetal,J.Virol.78:13232(2004))。自身抗体分析。如所述使用抗-心磷脂ELISA(DeRoeetal,J.Obstet.Gynecol.NeonatalNurs.5:207(1985)，Harrisetal，Clin.Exp.Immunol.68:215(1987))。类似的ELISA经改进以适应分析mab对磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和鞘磷脂(均购自于Sigma,St.Louis,MO.)的反应性。将LuminexAtheNAMulti-LyteANA观lR式(WampoleLaboratories,Princeton,NJ)用于检测mab对于SS-A/Ro、SS-B/La、Sm、核蛋白(RNP)、Scl-70、Jo-l、双链(ds)DNA、着丝粒B和组蛋白的反应性。Mab的分析浓度为150吗/ml、50吗/ml、15吗/ml和5)ig/ml。10(il的每种浓度(每个分析中分别为0.15(ig、0.05叱、0.015昭和0.005jig)与Luminex荧光小球一起温育，并按照制造商说明书进行测试。表1中的值是每个测试加入0.15吗所得分析结果的值。此外，用于SS-A/Ro(ImmunoVision,Springdale,AR)禾口dsDNA(InovaDiagnostics,SanDiego,CA)的ELISA也用于确认这些自身抗原的特异性。采用埃文斯蓝(作为复染剂)和FITC-偶联山羊抗人IgG(ZeusScientific,RaritanN丄)，使用在Hep-2载玻片上进行的间接免疫荧光来确定对人类上皮Hep-2细胞的反应性。在NikonOptiphot荧光显微镜上对载玻片进行照相。用浊度法(DadeBehring,Inc(Newark,DE))测量类风湿因子。根据描述用活化的部分促凝血酶原激酶(aPTT)和稀释的拉塞尔蝰蛇毒测试进行狼疮抗凝血剂分析(Moll和Ortel，Ann.Int.Med.127:177(1997))。40)il的1mg/ml的2F5、4E10和对照mab加入到混合的正常血浆中(最终mab浓度，200(ig/ml)用于狼疮抗凝血剂分析。抗(32糖蛋白-1分析采用ELISA进行(InovaDiagnostics,Inc.)。针对dsDNA、SS-A/Ro、SS-B/La、Sm、RNP和组蛋白的血清抗体在SLE患者中出现；针对着丝粒B和scl-70沐扑异构酶I)的血清抗体在全身性硬化症患者中发现；发现针对Jo-l的抗体与多肌炎相关(Rose和MacKay，TheAutoimmuneDiseases,第三版.AcademicPress,SandDiego,CA(1998》。结果己测定mab2F5和4E10,其它两种罕见广泛反应性中和mab(2G12和IgGlbl2)以及31种普通抗HIV-lEnv人类mab与心磷脂的反应性(Robinsonetal，AIDSRes.HumanRetroviral.6:567(1990))(表1)。2F5和4E10均与心磷脂反应，而所有33种其他mab为阴性。Mab2F5也与SS-A/Ro、组蛋白和着丝粒B自身抗原反应，而mab4E10与系统性红斑狼疮(SLE)自身抗原、SS-A/Ro反应。2F5和4E10均与Hep-2人类上皮细胞以弥散细胞质和细胞核方式反应(Robinsonetal,AIDSRes.HumanRetroviral.6:567(1990))(图2)。因此，2F5和4E10均具有多特异性自身反应性的特征。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>除了Ku32mab与Sm反应外，所有的Mab在与La(SSB)、Sm、Scl-70和Jo-l的反应性分析中均为阴性。Ro(SSA)、dsDNA、着丝粒B、组蛋白和心磷脂抗体的数值为基于标准曲线的相对单位。-=阴性在两种其他的罕见中和mab中，一种单克隆抗体，即2G12，不是自身反应性的，而另一种抗CD4结合位点的mab，即IgGlbl2(Stiegleretal，AIDSRes.Hum.Retroviruses17:1757(2001))与核蛋白、dsDNA和着丝粒B以及Hep-2细胞以细胞质和细胞核方式反应(表1和图2)。在所研究的31种较为常见的抗HIV-lmab中，只有两个mab特异性地在靠近CD4结合位点处结合(A32、1.4G)，以及一种非中和gp41表位的mab(2.2B)显示出多反应性的迹象(表l)。为确证2F5和4E10是否与在SLE相关的抗磷脂综合征中发现的促血栓形成的抗心磷脂抗体(Burtonetal，Science266:1024-1027(1994))相似，测试两种mab的狼疮抗凝活性，以及与凝血酶原(prothombin,PT)、(32糖蛋白-1、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)和鞘磷脂(SM)结合的能力(Robinsonetal，AIDSRes.HumanRetroviral.6:567(1990))。然而2F5对于这些反应性为阴性；4E10具有狼疮抗凝活性，并与PS、PC、PE呈强反应，与SM和PT呈弱反应，而与(32糖蛋白-l的反应呈阴性(参见图3)。可在由于自身免疫疾病或感染导致的免疫调节混乱的患者中发现抗心磷脂抗体(Burtonetal，Science266:1024-1027(1994))。抗心磷脂自身抗体可由梅毒、麻风、利什曼病、EB病毒和HIV-1所诱导(Burtonetal,Science266:1024-1027(1994))。与在SLE中发现的抗心磷脂抗体不同，"感染性(infectious)"抗心磷脂抗体几乎不是促血栓形成的，并且是暂时的。因此4E10与自身免疫疾病中的抗心磷脂抗体类似，2F5与感染性疾病中的抗心磷脂抗体类似。具有长CDR3长度的自身反应性B细胞克隆通常被删除或者使之对自身抗原产生耐受性((Zolla-Pazneretal,AIDSRes.HumanRetroviral.20:1254(2004))。因此，HIV-1可能已进化至通过具有保守的中和表位作为自身抗体表位的模拟物从而逃避膜近抗体应答。这些数据指出目前的HIV-1疫苗不能常规诱导强的膜近抗包膜中和抗体，这是因为耙向这些表位的抗体源自于以下自身反应性B细胞克隆，该自身反应性B细胞克隆通常被删除或者使之对HIV-1Env引起的抗原刺激有耐受性。这些观察结果也可以解释在不能删除这些克隆的SLE患者中几乎不出现HIV-l(Foxetal,Arth.Rh腿.40:1168(1997》。实施例2对本发明的自身抗原诱导中和抗体产生的能力进行研究，其中采用心磷脂(层状相和六角相)、l-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油基-3-[二氧磷基-L-丝氨酸](POPS)(层状相和六角相)、l-棕榈酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(POPE)(层状相)和二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)(六角相)作为自身抗原。用在10叱的oCpG中的磷脂(心磷脂层状相、心磷脂六角相、POPS层状相、POPS六角相、POPE层状相或者DOPE六角相)对豚鼠(每组4只)进行4次免疫，每次免疫之间间隔2周。在所述四次磷脂免疫之后，用10吗oCpG禾n100吗M组共有Env，CON-Sgpl40CFI寡聚体(即，在图4A中显示的蛋白的CFI形式)通过腹膜内(IP)进行最后一次免疫。采用在TMZ细胞中的Env假模拟本中和分析进行中和分析(Weietal，Nature422:307-312(2003),Derdeynetal,JVirol74:8358-8367(2000)，Weietal,AntimicrobAgentsChemother46:1896-1905(2002)，Piattetal,JVirol72:2855-2864(1998),Mascolaetal，J.Virol,79:10103-10107(2005》，描述如下细胞培养TZM-bl是粘附细胞系并保存在T-75培养瓶中。完全生长培养基(GM)由补充有10。/。胎牛血清(FBS，热失活)和庆大霉素(50fig/ml)的D-MEM构成。使用胰蛋白酶/EDTA处理来破坏并移除细胞单层破坏TZM-bl细胞单层的胰蛋白酶-EDTA处理当为常规保存拆分细胞时以及当为分析准备细胞时，采用胰蛋白酶/EDTA处理来破坏和移除保存在T-75培养瓶中汇合成片时的细胞单层。1.轻轻倒出培养基，通过使用6ml的无菌PBS冲洗单层移除残留的血清。2.缓慢加入2.5ml的0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液以覆盖所述细胞单层。在室温温育3045秒。轻轻倒出所述胰蛋白酶溶液并在37t:温育4分钟。在等待细胞分离时不要通过碰击或者晃动烧瓶来搅动细胞。3.加入10ml的GM并通过轻柔的吸打动作(pipetaction)使细胞悬浮。对细胞进行计数。4.用15ml的GM中的约106个细胞在新的T-75培养瓶中接种。培养物在37°C，5%002/95%空气环境中温育。应当约每3天拆分一次细胞。病毒存样可在PBMC或者T细胞系中制备未克隆病毒的存样。可通过在合适的细胞类型，如293T细胞中进行转染来制造假病毒。通过低速离心和过滤(0.45微米)使所有病毒存样不含有细胞并在-8(TC保存在含有20%FBS的GM中。TCID50测量在进行中和试验前，必须确定每个病毒存样在TZM-bl细胞中的单循环感染试验(2天温育)中的TCID50。当在TCID50试验中定量阳性感染时，采用2.5倍背景RLU作为截留值。在中和试验中过多的病毒可导致很强的病毒诱导的细胞病变效应，这将干扰准确的测量。大多数病毒存样必须稀释至少IO倍以避免杀死细胞。选择200TCID50的标准接种物用于所述中和试验以使病毒诱导细胞病变效应最小，同时保持测量病毒感染性的2-log减少的能力。应当注意的是不同菌株之间的致细胞病变性差异巨大。可在光学显微镜下视觉观察合胞体的形成来监测病毒诱导的细胞病变效应。也可在TCID50试验中在高病毒剂量下由发光减少来观察到细胞病变效应。中和抗体试验方案注l:除非特别指明，所有温育在湿润的37'C，5%(302温育器中进行。注2:在含有1pM茚地那韦的DEAE-GM中进行具有复制能力的病毒的化验。1.采用96孔平底培养板的形式，将150^的GM放入列l(细胞对照)的所有孔中。将100pl放入列211(列2为病毒对照)的所有孔中。将40^再放入列312，行H的所有孔中(以接受测试样品)。2.将11测试样品加入到列3&4，行H的每个孔中。将11^第二测试样品加入到列5&6，行H的每个孔中。将11^tl第三测试样品加入到列7&8，行H的每个孔中。将11^第四测试样品加入到列9&10，行H的每个孔中。将ll^d第五测试样品加入到列ll&12，行H的每个孔中。混合行H中的样品并转移50^d至行G。重复转移并稀释样品直至行A(这是系列3倍稀释液)。在最终转移和混合完成后，从列312，行A的孔中弃去50pl至消毒剂废物容器中。3.将所需数量的病毒小瓶放置在周围环境温度水浴中解冻。当完全解冻后，在GM中稀释所述病毒以获得4,000TCID5。/ml的浓度。应预先制备不含细胞的病毒存样并冷冻储藏在约1ml工作等分样中。4.向列212，行AH的所有孔中分加50pl的不含细胞的病毒(200TCID5Q)。在每次转移后用通过吸打动作进行混合。在每次转移间在含有40ml无菌PBS的试剂储罐中冲洗移液枪枪头以避免粘附携带至下一次。5.将板覆盖并温育1小时。6.在含有DEAE葡聚糖的GM(37.5ng/ml)中以1X1()5细胞/ml的密度准备TZM-bl细胞的悬浮液(在使用前用胰蛋白酶处理约1015分钟)。向列112，行AH的各孔中分加100|dl的细胞悬浮液(每孔中10,000个细胞)。在每次转移间在装有无菌PBS的试剂储罐中冲洗移液枪枪头以避免粘附携带至下一次。DEAE葡聚糖的最终浓度是15pg/ml。7.将板覆盖并温育48小时。8.从每个孔中移去150^的培养基，留下约100^。向每个孔中分加100pl的BrightGk)TM试剂。在室温下温育2分钟以使细胞裂解完全。通过吸打动作进行混合(至少两下)并转移150^至相应的96孔黑色平板中。立即在照度计下对所述平板进行读数。9.中和百分比可如下确定，即计算测试孔(细胞+血清样品+病毒)和细胞对照孔(仅有细胞，列l)之间的平均RLU的差值，将该结果除以病毒对照(细胞+病毒，列2)和细胞对照孔(列l)之间的平均RLU的差值，将其从1中减去然后乘以100。中和抗体滴度表示为将RLU减少50%所需的血清稀释度的倒数。如图5所示，接受DOPE(六角相)的动物具有170的中和滴度。实施例3免疫原设计分别包含mAb2F5和4E10的标称表位(与疏水接头(GTH1)相连)的肽序列经过合成并包埋在合成脂质体中(图6)。第一代免疫原经设计在所述脂质双层的远端具有2F5和4E10表位序列(图6A)。这些构建体使mAb不受限制地接近其相应的表位。第二代构建体经设计以模拟所述MPER区域的天然取向，其中2F5和4E10mAb表位序列与疏水接头紧邻相连(图6A、6B)。所述合成脂质体的组合物包括以下溶解在氯仿中的磷脂POPC(1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱)、POPE(l-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺)、DMPA(1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸酉旨)和胆固醇(购自AvantiPolarLipids(Alabaster,AL).)。通过在耐氯仿的试管中放入适当摩尔量的磷脂(POPC:POPE:DMPA:Ch:45:25:20:10)制备合成脂质体。通过涡旋来混合所述磷脂，然后在通风橱中平缓的氮气流下干燥所述混合物。在高真空下存放所述脂质(15小时)以除去任何残留的氯仿。加入PBS或者TBS缓冲液(pH7.4)制得磷脂的水性悬浮液，并在37"C温育1030分钟，伴随间歇的猛烈涡旋以使所述磷脂重悬浮。然后在浴式超声波仪(MisonixSonicator3000,MisonixInc.,Farmingdale,NY)中超声波处理磷脂的乳状均匀悬浮液。所述超声波仪经设定运行3个连续循环，在每个循环的总超声处理为45秒。每个循环包括5秒的超声波脉冲(70瓦功率输出)，随后12秒的无脉冲时期。在超声处理结束后，将所述层状脂质体的悬浮液保存在4"C。将HIV-1MPER肽GTH1-2F5和GTH1-4E10(图6)溶解在70%氯仿、30%甲醇中。将脂质的氯仿溶液加入到所述肽溶液中，摩尔比为45:25:20:10(POPC:POPE:DMPA:胆固醇)。每种肽加入的比例为肽:总磷脂=1:420。如上所述将所述混合物涡旋，然后干燥和重悬浮。在BAcoreLl传感器芯片上俘获所述脂质体之后进行结合试验以测试mAb与每种肽-脂质偶联物结合的特异性，所述BAcoreLl传感器芯片借助疏水接头固定脂质双层。将2F5、4E10和对照mAb(A32或17b)注射到或者附有合成脂质体或者附有肽-脂质偶联物的各传感器表面上，并在BIAcore3000仪器上监测所述结合(图8-11)。免疫策略所述免疫策略加入了能暂时破坏耐受性的方案。所述程序涉及使用oCpG(用于破坏小鼠中对于产生抗dsDNA抗体的耐受性的TLR9配体)(Tranetal,Clin.Immunol.109(3):278-287(2003))。所述肽-脂质体偶联物与佐剂(Emulsigen和oCpG)混合(l:l)。通过混合375pl的Emulsigen，250|il的oCpG和625pi的盐水制备混有佐剂(2X)的Emulsigen。以21天的时间间隔，每只豚鼠或者仅用250吗的肽，或者用具有相同量的肽的肽-脂质体偶联物进行免疫。在第一次免疫前以及随后的每次免疫前采集血清样品作为预取血血样。用ELISA试验(图12)分析血清样品与肽表位的结合以及病毒中和试验(表2)。图12中的数据显示来自用GTH1-4E10脂质体免疫的两只豚鼠的血清与4E10肽的强反应性，而在来自于用4E10肽免疫的动物的血清中仅观察到低水平的反应性。两个阳性血清均能中和HIV-1MN株(表2)。表2.在用4E10肽-脂质体免疫的豚鼠中诱导中和抗体<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>肽-脂质体偶联物在检测抗原特异性B细胞应答中的应用上述肽-脂质体偶联物已被用作用于检测MPER特异性B细胞应答的试剂。所述肽-脂质体构建体(2F5和4E10)通过在脂质组合物中加入荧光素-POPE而与荧光素偶联。所述荧光素-POPE与未偶联的POPE以45:55的比例混合，然后按上述的摩尔比例与剩下的脂质混合。在BIAcore结合试验中，荧光素偶联的2F5和4E10-肽-脂质体均保持了它们与其相应的mAb结合的特异性(图11)。所有以上引用的文献和其他信息来源在此以参考的方式整体引入。权利要求1.一种在患者中诱导产生抗人类免疫缺陷病毒(HIV)抗体的方法，该方法包括向有需要的患者施用至少一种与HIV包膜具有交叉反应性的自身抗原，所述自身抗原的施用量足以实现所述诱导。2.如权利要求l所述的方法，其中所述自身抗原是诱导产生所述抗体的心磷脂、SS-A/RO、双链(ds)DNA、着丝粒B蛋白或RiBo核蛋白(RNP)，或它们的片段。3.如权利要求2所述的方法，其中所述自身抗原是诱导产生所述抗体的心磷脂或其片段。4.如权利要求1所述的方法，其中所述抗体与gp41膜近外侧区域(MPER)表位相结合。5.如权利要求4所述的方法，其中所述MPER表位包含序列NWFDIT或ELDKWA。6.如权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括向所述患者施用含有与所述自身抗原具有交叉反应性的表位的HIV包膜蛋白、多肽或肽。7.如权利要求6所述的方法，其中编码所述HIV蛋白、多肽或肽的DNA序列在以下条件下施用，所述条件使得所述DNA序列得以表达并由此在所述患者中产生所述HIV蛋白、多肽或肽。8.如权利要求1所述的方法，该方法进一步包括向所述患者施用破坏对所述自身抗原的耐受性的佐剂。9.如权利要求8所述的方法，其中所述佐剂包含TRL9激动剂。10.如权利要求9所述的方法，其中所述TRL9激动剂包含CpG寡核苷酸。11.一种的组合物，该组合物含有与HIV包膜具有交叉反应性的自身抗原和破坏对所述自身抗原的耐受性的物质。12.如权利要求ll所述的组合物，其中所述自身抗原是含有与HIV包膜具有交叉反应性的表位的心磷脂、SS-A/RO、双链DNA、着丝粒B蛋白或RiB0核蛋白，或它们的片段。13.如权利要求ll所述的方法，其中所述物质是TRL9激动剂。14.如权利要求13所述的方法，其中所述TRL9激动剂包含CpG寡核苷酸。15.—种产生与HIV包膜具有交叉反应性的自身抗体的方法，该方法包括从以下患者分离B细胞，并由其建立产生所述自身抗体的永生细胞系，所述患者为患有原发性自身免疫疾病的患者或者患有选自由梅毒、利什曼病和麻风组成的组中的感染性疾病的非HIV感染患者。16.如权利要求15所述的方法，其中所述患者是HIV感染的或者已接受基于包膜的HIV疫苗的原发性自身免疫患者。17.如权利要求15所述的方法，其中所述B细胞与骨髓瘤细胞融合以形成产生所述自身抗体的杂交瘤。18.如权利要求15所述的方法，其中所述患者是系统性红斑狼疮(SLE)患者、抗磷脂抗体综合征患者或患有选自由梅毒、利什曼病和麻风组成的组中的感染性疾病的非HIV感染患者。19.如权利要求18所述的方法，其中所述患者是HIV感染的或者已接受基于包膜的HIV疫苗的系统性红斑狼疮(SLE)患者，或者所述患者是己接受基于包膜的HIV疫苗的患有选自由梅毒、利什曼病和麻风组成的组巾的感染性疾病的非HIV感染患者。20."种在患者中诱导产生抗HIV抗体的方法，该方法包括向有需要的患者施用至少一种与HIV病毒颗粒具有交叉反应性的自身抗原，所述自身抗原的施用量足以实现所述诱导。21.如权利要求20所述的方法，其中所述自身抗原是磷脂或其衍生22.如权利要求21所述的方法，其中所述磷脂是心磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇或鞘磷脂，或者它们的衍生物。23.如权利要求22所述的方法，其中所述磷脂是二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)(六角相)。24.如权利要求20所述的方法，其中所述自身抗原与HIV包膜具有交叉反应性。25.如权利要求20所述的方法，其中所述自身抗原是含有与HIV病毒颗粒具有交叉反应性的表位的着丝粒F蛋白或其片段。26.如权利要求25所述的方法，其中所述自身抗原与HIV包膜具有交叉反应性。27.—种组合物，该组合物含有与HIV病毒颗粒具有交叉反应性的自身抗原和破坏对所述自身抗原的耐受性的物质。28.如权利要求27所述的组合物，其中所述自身抗原是磷脂或其衍生物。29.如权利要求28所述的组合物，其中所述磷脂是心磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇或鞘磷脂，或者它们的衍生物。30.如权利要求29所述的方法，其中所述磷脂是二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)(六角相)。31.如权利要求27所述的组合物，其中所述自身抗原与HIV包膜具有交叉反应性。32.如权利要求1或20所述的方法，其中所述患者没有感染HIV。33.—种在患者中诱导产生抗HIV抗体的方法，该方法包括向有需要的患者施用其量足以实现所述诱导的至少一种脂质体-肽偶联物，其中所述肽含有膜近外侧区域(MPER)表位。34.如权利要求33所述的方法，其中所述肽包含序列ELDKWAS或WFNITNW。35.如权利要求33所述的方法，其中所述脂质体-肽偶联物包含疏水接头。36.含有包埋在脂质体中的MPER表位的免疫原。37.如权利要求36所述的免疫原，该免疫原与可检测标记结合。全文摘要本发明大体上涉及人类免疫缺陷病毒(HIV)，具体而言，本发明涉及诱导HIV中和抗体的方法以及适用于所述方法的化合物和组合物。文档编号A61K39/385GK101588813SQ200680016184公开日2009年11月25日申请日期2006年4月12日优先权日2005年4月12日发明者巴顿·F·海恩斯,廖化新,穆尼尔·S·阿拉姆申请人:杜克大学