专利名称：：多价病毒样颗粒的生产的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生产和在体外将重组病毒衣壳蛋白组装到病毒样颗粒中。特别地，本发明提供快速的、可扩展的并符合成本效益的生产多价病毒样颗粒的方法，该方法使用了含有不同抗原性肽插入片段的衣壳融合肽的分离群体，这些衣壳融合肽在体外组合以生产多价病毒样颗粒。按照本发明生产的病毒样颗粒可用于在人或动物中诱导免疫反应。
背景技术：
：接种疫苗是保护动物和人类免受病原体因子(pathogenicagents)感染的最有效和效率最高的方式之一。最近，已经检测了含有针对一种以上病原体因子的表位的疫苗接种物的使用效果。这种策略隐含的基本原理包括减少诱导免疫性所需接种物的数量，从而降低了医生拜访的次数，还包括提高与所推荐的疫苗接种方案的相容性。例如，在美国，GlaxoSmithKline已经开发出第一例五价疫苗，商品名为Pediarix，该疫苗可以预防白喉、破伤风、百日咳、脊髓灰质炎和乙肝。其他正被使用或正在开发的疫苗包括Merck生产的Comvax，其将乙肝疫苗和Hib疫苗组合在一个药剂中；Aventis生产的TriHIBit，结合了Hib疫苗和DtaP疫苗；GlaxoSmithKline生产的Twinrix，将甲肝疫苗和乙肝疫苗组合在一个药剂中，并作为一种三剂量系列给予。其他在开发的组合疫苗包括单一接种物，其为丽R疫苗和Varivax疫苗组合；DTaP疫苗和IPV疫苗组合；DTaP疫苗和乙肝疫苗组合；DTaP疫苗、IPV疫苗以及Hib疫苗(Pentavac)组合；DTaP疫苗、乙肝疫苗和Hib疫苗组合；DTaP疫苗、IPV疫苗、Hib疫苗和乙肝疫苗(Hexavac)组合；DTaP疫苗、Hib疫苗、IPV疫苗、甲肝疫苗和乙肝疫苗组合。谅毒微发病毒样颗粒(VLPs)已经作为疫苗试剂被研究。一般地，被包壳的病毒包括一种蛋白外壳或者"衣壳"，它们被组装来包含病毒核酸。许多病毒具有衣壳，无论是在表达衣壳的细胞中("体内组装")，还是在被分离和纯化后的细胞外("体外组装")，衣壳由各自表达的衣壳蛋白"自组装"得到，形成VLPs。病毒样颗粒模拟了病毒颗粒的全部结构，而不需要包含感染性物质。VLPs可以缺少病毒的DNA或RNA基因组，但是保留了真正病毒的三维结构。VLPs能够刺激B细胞介导的反应、CD4增生反应和细胞毒性的T淋巴细胞反应。参见Schirmbeck等人(1996)病毒样颗粒诱导I型MHC限制性T细胞反应"。从乙肝小表面抗原得到的启示.Intervirology39，111-119;Paliard等人(2000)，在恒河猴中施用病毒样颗粒疫苗后，弓1发强烈的、广泛的和长时间的活性I型HIVp55gag-特异性CD8+细胞毒性T细胞反应.AIDSRes.Hum.Retroviruses16，273-282;Mumta等人(2000)，用丙肝病毒样颗粒免疫保护小鼠免受重组的丙肝病毒-牛痘病毒的感染.PNASOUSA100，6753-6758。已经生产了30种以上感染人和其他动物的病毒的VLPs，包括诺沃克病毒、乙肝病毒和丙肝病毒、乳头瘤病毒、细小病毒和A型流感病毒，目前正在进行大量在人身上使用VLPs的临床实验。参见Koutsky等人(2002)，"人16型乳头瘤病毒疫苗的控制实验"，NEJM347:1645-1651;Pinto等人(2003)"用重组HPV-16LI病毒样颗粒免疫点健康自愿者中产生对人乳头瘤病毒(HPV)-16LI的细胞免疫反应"，J.Infect.Dis188:327-338;Tacket等人(2003)，"口服诺沃克病毒样颗粒在自愿者中产生体液的、粘膜的和细胞的反应"，Clin.Immunol.108:241—247。病毒样颗粒可被加工来作为载体分子，用于从其他病原体中呈递表位。参见，Noad等人(2003)，"病毒样颗粒作为免疫原"，TrendsinMicrobiology11(9)，438-444;Sadeyen等人(2003)，"在人16型乳头瘤病毒的衣壳表面环上插入外源序列，降低其诱导中和抗体的能力并描绘了构象消除的表位"，Virology309:32-40;W02005/005614;美国专利公开US2004/0033585和US2005/0048082;美国专利US6，448，070;US6，110，466;US6，171，591;Brinkman等人(20(M)，"重组鼠多瘤病毒样颗粒诱导保护性的抗肿瘤免疫"，Lett.DrugDes.&Disc.1:137-147。修饰衣壳蛋白，使其含有抗原性肽，生成重组病毒衣壳蛋白-抗原性肽融合物。然后在宿主细胞中表达这种融合的衣壳蛋白-抗原性肽产物，在体内或体外组装成重组的病毒颗粒或病毒样颗粒，施用给宿主以引发免疫反应。K仏游主产理想的多价VLP生产方法能够快速、灵活且可控制地组装同质的VLPs群体，该VLPs含有来自不同病原体因子的多种抗原性肽插入片段，而不含有临时的(extemporaneous)感染性病毒核酸。构建多价VLPs的当前方法受到限制i)在体内生成VLPs缺少灵活性，并且不能进行控制，由于衣壳蛋白插入能力固有的局限性，这降低了抗原性插入片段可能组合的数量，或者ii)由于先前组装的含有不同插入片段的VLP群体在体外简单混合，生成了非同质的VLPs群体。
发明内容本发明提供可扩展的病毒样颗粒(VLP)的体外组装方法，使用含有抗原性肽插入片段而重组病毒的衣壳蛋白，并且缺少全长的感染性病毒核酸基因组。该方法包括将含有抗原性插入片段的病毒衣壳蛋白组装成VLPs，该VLPs缺少全长的感染性病毒核酸基因组。特别的，该方法包括将第一种含有至少一种抗原性肽插入片段的病毒衣壳蛋白与至少第二种含有至少一种抗原性肽插入片段的病毒衣壳蛋白在体外混合，其中第二种衣壳融合肽的至少一种抗原性肽插入片段来源于与第一种衣壳融合肽的至少一种抗原性肽插入片段不同的抗原性肽序列或者不同病原体因子，在适当条件下体外组装衣壳蛋白，生成病毒样颗粒。所组装的病毒样颗粒包含至少两种不同的抗原性序列，提供一种多价病毒样颗粒。在一些具体实施方式中，控制含有不同抗原性肽插入片段的重组衣壳融合肽的混合，使得在所组装的病毒样颗粒中具有特定比例的目的抗原性肽。在其他具体实施方式中，按照本发明组装的VLP不含有全长的感染性病毒核酸。在其他具体实施方式中，按照本发明组装的VLP不含有病毒核酸。该方法使得可以灵活地生产含有多种抗原性肽组合的病毒样颗粒。这些多价的VLPs可用于许多应用中，包括疫苗接种策略，在动物中引发免疫反应。本方法利用含有抗原性肽插入片段的重组衣壳融合肽的混合物，组装单一的不需要感染性病毒核酸的多价VLPs群体。由于该VLP是在体外用含有不同抗原性肽的衣壳蛋白组装的，可以控制VLP中含有期望比例的抗原。使用这种技术，大量组合和各种比例的含有不同抗原性肽的衣壳蛋白被混合，并迅速组装生成多价VLPs。这种策略使得能够快速调整VLP的构成，以得到期望的抗原性组成。本发明可以使用来自任何来源的重组衣壳融合蛋白。例如，含有插入片段的重组衣壳蛋白可来自先前组装的病毒样颗粒。例如，这种病毒样颗粒可以在体内或体外组装。可替代地，先前未被组装成VLPs的重组衣壳蛋白也可以被使用。此外，来自先前组装的VLPs的重组衣壳蛋白与先前未被组装成VLPs的重组衣壳蛋白混合，生成多价VLPs。用于本发明的重组衣壳蛋白可在任何能够生产这种肽的宿主表达系统中生成，其中包括但是不限于细菌、酵母、昆虫、哺乳动物和植物宿主细胞系统。在某些具体实施方式中，在原核宿主细胞中表达衣壳蛋白。在一种具体实施方式中，原核宿主细胞是细菌宿主细胞。在一些具体实施方式中，衣壳融合肽被生产成可溶的衣壳蛋白或者不溶的包涵体。在某些具体实施方式中，重组的衣壳蛋白以可溶的衣壳融合蛋白或者不溶的包涵体在荧光假单胞菌细胞中被表达。在另一个具体实施方式中，在真核宿主细胞中生产衣壳蛋白。在某些具体实施方式中，真核宿主细胞是植物细胞。在另一个具体实施方式中，在全植物中生产衣壳融合肽。本发明提供不同类型的重组衣壳融合肽的混合，其中被选择用于混合的衣壳融合肽含有至少一种抗原性肽，该抗原性肽不存在于与所选择的衣壳融合肽混合的其他衣壳融合肽中。抗原性肽可来自相同或不同的病原体因子。在某些具体实施方式中，被选择用于混合的衣壳融合肽含有来自不同病原体因子的抗原性肽。在某些具体实施方式中，该混合物含有至少两种重组衣壳融合肽群体，其中各个重组衣壳融合肽群体含有至少一种不存在于任何其他与之混合的重组抗原性肽中的、来自不同病原体因子的不同抗原性肽。在另一个具体实施方式中，混合物含有两种以上的重组衣壳融合肽群体，其中各个重组衣壳融合肽群体含有至少一种来自至少一种不同病原体因子的不同抗原性肽。在一些具体实施方式中，衣壳融合肽含有多种抗原性肽插入片段。在一些具体实施方式中，衣壳融合肽含有耙向特定类型的免疫效应细胞的抗原性肽，包括但是不限于定向T细胞、B细胞和CTL细胞的表位。在其他具体实施方式中，该混合物还含有野生型衣壳蛋白。用于本发明中的病毒衣壳蛋白可来自任何种类的能够重新组装成病毒样颗粒的病毒。在某些具体实施方式中，混合并重新组装成VLPs的全部重组病毒衣壳蛋白可来自相同病毒。在其他具体实施方式中，混合并重新组装成VLPs的全部重组病毒衣壳蛋白可来自不同病毒。例如，来自衣壳结构形态相似(即二十面的，螺旋的等等)的不同病毒的重组病毒衣壳蛋白被混合并重新组装成VLPs。本发明能够控制多价疫苗的比例和组成，使得能够有效并灵活地生成多价疫苗。由于本发明提供各个宿主细胞独立生产的含有期望表位的衣壳融合肽在分离和纯化后进行混合，能够实现期望组合的紧密调控。本发明通过调整被添加到混合物中的各种重组衣壳融合肽群体的含量，能够将重组衣壳蛋白重新组装成任何期望的抗原性组成比例。本发明的另一个方面包括将抗原性肽之外的预先确定的功能性氨基酸序列插入到病毒衣壳蛋白中。这些序列具有引发免疫反应之外的功能。这种序列的非限制性例子是靶向氨基酸序列，例如，受体结合位点，该方法包括将含有靶向氨基酸序列的衣壳蛋白与至少一种含有抗原性肽插入片段的衣壳蛋白混合。在一些具体实施方式中，这种靶向氨基酸序列能够引导所组装的颗粒到特定细胞或者能够进入该细胞。本发明的其他方面提供将免疫刺激核酸序列如CpG序列包含在通过本文所述方法生产的组装VLP颗粒中。本发明提供用于提高多价疫苗生产的效率和可扩展性的方法，使用含有来自一种以上病原体因子的抗原性插入片段的病毒样颗粒。本发明还提供生产多价VLPs的方法，该VLPs含有来自一种以上病原体因子(pathogenicagent)的抗原性插入片段，其中能够容易地控制VLP中含有的抗原试剂的比例。可替代地，本发明提供不含有全长的感染性病毒核酸基因组的多价VLPs。图1是来自荧光假单胞菌(i^ewJowo"^yMomscera)MB214宿主细胞的不溶蛋白部分的western印迹，宿主细胞具有CCMV衣壳融合肽，并被工程化以在不溶部分中表达PA1、PA2、PA3和PA4肽插入片段。在第0、12和44小时时裂解细胞。嵌合的衣壳融合肽用箭头指示。图2是来自荧光假单胞菌MB214宿主细胞的可溶蛋白部分的western印迹，宿主细胞具有CCMV衣壳融合肽，并被工程化以在可溶部分中表达PA1、PA2、PA3和PA4肽插入片段。在第0、12和44小时时裂解细胞。MA是蔗糖密度梯度的图片，显示对有RNA和无RNA的CCMV-PA3VLPs的分离。a^是从蔗糖密度梯度中分离的有RNA和无RNA的CCMV-PA1和CCMV-PA2VLP的SDS-PAGE凝胶电泳条带。图5是在无RNA时由CCMV-PA4组装的VLPs的电子显微图。图6是含有多种保护性抗原("PA")表位的多价VLPs的表达和组装的图。图7是说明在组装反应过程中CpGs被包装到VLPs中的图。图8是各个VLP生产阶段的HPLC分析。图8A说明对植物生产的CCMV病毒颗粒的SEC-HPLC分析。图8B说明植物生产的CCMV病毒颗粒被分解成二聚体。图8C显示分离的CCMV二聚体重新组装成VLPs。to是对纯化的分解的CCMV二聚体和含有包囊的CpG寡核苷酸的重新组装的CCMVVLP进行SEC-HPLC分析。图IO显示用EtBr染色(上面)和蛋白质染色(下面)的CCMVVLPs的1.2%琼脂糖凝胶图片，该VLPs含有被包囊的标准CpG寡核苷酸或者骨架被保护的CpGs。具体实施例方式I.重组病毒衣壳蛋白谅毒波壳本发明的具体实施方式提供多价病毒样颗粒的生产，包括体外混合含有至少一种抗原性肽的重组衣壳融合肽的群体，其中各个重组衣壳融合肽群体含有至少一种不包含在与之混合的衣壳融合肽中的抗原性肽，在体外以预定比例重新组装所混合的重组衣壳融合肽，形成多价病毒样颗粒。在某些具体实施方式中，在生成的VLPs中含有的抗原性肽可来自不同的病原体因子。术语"多价的"用于此是指在重新组装的病毒样颗粒中存在至少两种不同的抗原性肽序列。,絲本发明不依赖于用于产生衣壳蛋白的病毒的类型。在插入抗原性肽后，任何能够重新组装成病毒样颗粒或者笼性结构的病毒衣壳蛋白可用于本发明中。在本发明的具体实施方式中，衣壳的氨基酸序列选自被划分为具有任何形态学的病毒的衣壳，包括二十面体的(包括正确二十面体的(icosahedralproper)、等轴的、准等轴的，以及有芽的或"成对的(twirmed)")、多面体的(包括球形的、卵形的和柠檬状的)、杆状的(包括棒状的(rhabdo-)或者弹头状的，以及纺锭状或雪茄形的)，以及螺旋状的(包括棍棒状、圆柱形和丝状的)；这些形状的任何一种可以被加尾和/或含有表面芽枝，例如突起或瘤突出物(knobs)。在本发明的具体实施方式中，衣壳氨基酸序列可选自螺旋状实体的衣壳。在其他具体实施方式中，衣壳氨基酸序列可选自二十面体实体的衣壳。在某些具体实施方式中，衣壳氨基酸序列可选自具有正确二十面体的实体的衣壳。在某些具体实施方式中，衣壳氨基酸序列选自二十面体病毒的衣壳。在某些具体实施方式中，衣壳氨基酸序列选自二十面体的植物病毒的衣壳。然而，在其他具体实施方式中，病毒衣壳来自不感染植物的二十面体病毒。例如，在一种具体实施方式中，病毒是感染哺乳动物的病毒。一般地，二十面体病毒的病毒衣壳由大量以二十面(立方体)对称排列的蛋白亚单位组成。可以构建天然的二十面体衣壳，例如，用3个亚单位构成衣壳的各个三角形表面，结果60个亚单位构成完整的衣壳。这种小的病毒结构的典型代表是如噬菌体0X174。许多二十面体病毒衣壳含有超过60个亚单位。许多二十面体病毒的衣壳含有反平行的、八链3桶折叠基序。该基序具有一个楔形的区域，在一侧有四条P链(命名为BIDG)和在另一侧也有四条3链(命名为CHEF)。还具有两个保守的a螺旋(命名为A和B)，一个在PC和eD之间，另一个在PE禾口PF之间。病毒分类学公认如下的包壳颗粒实体的分类I组病毒，即dsDNA病毒;II组病毒，即ssDNA病毒；，ni组病毒，即dsRNA病毒；IV组病毒，即无DNA阶段的ssRNA(+)-链病毒；V组病毒，即ssRNA(-)-链病毒；.VI组病毒，即RNA类反转录(retroid)病毒，其是ssRNA反转录病毒；.VII组病毒，即DNA类反转录病毒，其是dsDNA反转录病毒；S病毒；*类病毒；以及卫星噬菌体和卫星病毒，不包括卫星核酸和朊病毒。这些分类的成员是本领域技术人员熟知的，在H.V.VanRegenmortel等人(编辑)，病毒分类学国际病毒分类委员会第七次报告(2000)(AcademicPress/Elsevier，BurlingtonMass.，美国)；英国莱斯特大学微生物和免疫学学院的病毒分类网页，网址为http://wwwmicro.msb.le.ac.uk/3035/Virusgro叩s.html;以及美国健康和公共事务部(美国华盛顿地区)的美国国立卫生研究院的国家医学图书馆的国立生物技术信息中心(NCBI)的在线分类浏览器的"病毒"禾口"类病毒，，部分，网址为http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/tax.html。衣壳氨基酸序列可以选自这些分类任何一种的任何成员的衣壳。这些分类成员的衣壳的氨基酸序列可从多种来源获得，包括但是不限于，例如NCBI提供的在线PubMed搜索工具的"核苷酸"(Genbank)、"蛋白质"和"结构"部分，网址为http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query,fcgi。本发明的具体实施方式包括，其中衣壳氨基酸序列选自特异于至少如下宿主之一的分类成员包括酵母的真菌类、植物、包括藻类的原生生物、无脊椎动物、脊椎动物和人。在其他具体实施方式中，衣壳氨基酸序列选自如下分类的任何一种的成员I组、II组、III组、iv组、'v组、vn组、类病毒和卫星病毒。在某些具体实施方式中，衣壳氨基酸序列选自特异于至少六种上述宿主类型之一的七种分类的任何一种的成员。在某些具体实施方式中，衣壳氨基酸序列选自n组、ni组、iv组、vn组和卫星病毒的任何一种的成员；或者选自n组、iv组、vn组和卫星病毒的任何一种的成员。在一种具体实施方式中，病毒衣壳选自iv组、vn组。在某些具体实施方式中，病毒衣壳选自iv组病毒。病毒衣壳序列来自一种病毒，对于生产衣壳融合肽的细胞来说，该病毒不是一种天然的感染性物质。本发明的具体实施方式包括，其中细胞不包括期望的二十面体衣壳之外的来自特别选定的病毒的病毒蛋白。在某些具体实施方式中，病毒衣壳来自一种病毒，该病毒对除了生产衣壳融合肽的宿主细胞外的不同科的生物体具有向性。在其他具体实施方式中，病毒的衣壳来自来自一种病毒，该病毒对除了生产衣壳肽的宿主细胞外的不同属的生物体具有向性。在其他具体实施方式中，病毒的衣壳来自来自一种病毒，该病毒对除了生产衣壳融合肽的宿主细胞外的不同种的生物体具有向性。本发明的具体实施方式包括，其中病毒的衣壳选自二十面体病毒。该二十面体病毒可以选自乳头瘤病毒科(尸s/w'Woffl3W'2^/3e)、单组分双链RNA球状真菌病毒科(7b^Vi7^/se)，双顺反子病毒科("icis^Y7W'rjWse)，口耆月干DNA病毒禾斗(//e;aQ^aKJ'i^Vae)，矛皮月莫病毒科(7bga7J'i^Vise)，多瘤病毒禾斗(尸o7j^zai^'ric/iae)，野田村病毒禾斗(tVoA)，复层噬菌体科(TecO'wh't/ae)，轻小噬菌体科(Zeri^z'ric/se),微小噬菌体禾斗d'c2wj'2^Vae)，57p。pa."Wae，野田村病毒科(Abc/sWi^z'c/se)，小RNA病毒科(尸icoraop^rA/ae)，细小病毒禾斗(尸ark。"r汤e)，杯状病毒禾斗(Cs2ci)，四病毒禾斗(7e^<3W>^/ae)，和卫星病毒的任何一种的成员。在本发明的某些具体实施方式中，该序列选自特异于至少一种植物宿主的病毒分类的任何一种的成员。在某些具体实施方式中，二十面体植物病毒种类可以是感染植物的病毒种类，其是布尼亚病毒科(W〃/7ysi^ric/ae)，呼肠孑瓜病毒禾斗(yeo^'i^Vse)，弹状病毒禾斗(7/aZGbpa'rYo^e)，黄症病毒禾斗(Zi/fe。7J'ric/se)，矮缩病毒禾斗(A^winVae)，双组分双链RNA球状真菌病毒科(尸sr""w'nWae)，欧防风黄点病毒科(^^iWriVae)，芜菁黄花叶病毒科(7y^^inWae)，欧尔密病毒科(<9i/r/^<37i>"s)，烟草坏死卫星病毒(7b力accoAfecro5^'s「/r〃515"ate77iYe)，花祸卩菜花口十病毒禾斗(Cs〃h'衡^zWt/ae)，联体病毒禾斗(6^i/7jVj>_zW<3e)，豇豆花叶病毒禾斗(Cc^orj'7"iflfee)，南方菜豆花卩十病毒(5b^e/z7。i^ras0，番莉丛矮病毒科(7b/z7ZwswhVae)，或者雀麦花叶病毒科(5r，owhVae)分类的任何一种的成员。在一些具体实施方式中，二十面体植物病毒种类是感染植物的病毒种类，其是黄症病毒科，矮縮病毒科，双组分双链RNA球状真菌病毒科，欧防风黄点病毒科，芜菁黄花叶病毒科，欧尔密病毒科，烟草坏死卫星病毒，花椰菜花叶病毒科，联体病毒科，豇豆花叶病毒科，南方菜豆花叶病毒，番茄丛矮病毒科或者雀麦花叶病毒科分类的任何一种的成员。在某些具体实施方式中，二十面体植物病毒种类是植物感染性病毒种类，其是花椰菜花叶病毒科，联体病毒科，豇豆花叶病毒科，南方菜豆花叶病毒，番茄丛矮病毒科或者雀麦花叶病毒科的任何一种的成员。在其他具体实施方式中，二十面体植物病毒种类是植物感染性病毒种类其是豇豆花叶病毒科，南方菜豆花叶病毒，番茄丛矮病毒科或者雀麦花叶病毒科的任何一种的成员。在还有其他具体实施方式中，二十面体植物病毒种类是植物感染性病毒种类，其是豇豆花叶病毒科或者雀麦花叶病毒科家族的任何一种的成员。在某些具体实施方式中病毒的衣壳来自雀麦花叶病毒科分类。在其他具体实施方式中，衣壳来自等轴不稳环斑病毒(/h/^iTYA)或者苜蓿花叶病毒C4//flWOV/n)。在某些具体实施方式中，病毒的衣壳来自豇豆花叶病毒(CowpeaMcwa/cKn^)或者豇豆褪绿斑驳病毒(C/2/oraricMo"/e巧V^)。在其他具体实施方式中，衣壳来自烟草线条病毒(7b6accov,ms1)，雀麦花叶病毒(Sra膨woy"/cv/my)或者紫花苜蓿花叶病毒(辟,mo湖'cv/ras)(AMV)。II.抗原性肽插入片段本发明的具体实施方式包括，其中可操作地连接到病毒衣壳序列上的抗原性肽或蛋白质含有至少两个氨基酸。抗原性肽足够大，使得以有效量施用给动物时能够产生免疫反应。该肽长为至少2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，10个，11个，12个，13个，14个，15个，16个，17个，18个，19个，20个，30个，45个，50个，60个，65个，75个，85个，95个，96个，99个或更多个氨基酸。本发明的具体实施方式包括，其中重组衣壳融合肽含有至少一种抗原性肽。在一种可替代的具体实施方式中，重组衣壳融合肽含有一种以上的抗原性肽。在某些具体实施方式中，抗原性肽由至少两种，至少5种，至少10种，至少15种或至少20种分离的抗原性肽。在还有另一种具体实施方式中，抗原性肽被插入到病毒衣壳蛋白中，使得当衣壳蛋白重新组装来形成病毒样颗粒时，该抗原性肽被暴露到至少一个表面环上。叛纖嚴用于本发明中的抗原性肽是能够产生免疫反应的任何肽序列。例如，抗原性肽可以是肽表位、半抗原或者相关的肽(例如，抗原性病毒的肽；病毒的相关肽，例如，HIV-相关肽，肝炎相关肽；抗体个体基因型的(idiotypic)结构域、细胞表面肽；人、动物、原生生物、植物、真菌、细菌和/或古细菌的抗原性肽；引起过敏症的肽和过敏原脱敏肽)。抗原性肽选自人或动物的病原体因子的抗原性肽，包括传染物质、寄生虫、癌细胞和其他病原体因子。这种病原体因子还包括毒力因子和致病因子，例如，外毒素、内毒素等。病原体因子具有任何的毒力水平，即它们可以是例如，有毒的、无毒的、假毒性的、半毒性的等等。在某些具体实施方式中，抗原性肽含有来自病原体因子的表位氨基酸序列。在其他具体实施方式中，表位氨基酸序列包括至少一种这种物质的表面肽的至少一部分。选择一种以上的抗原性肽，插入到单个衣壳蛋白中，在这种情形下，生成的病毒样颗粒能够展现多种来自多种不同衣壳融合肽的不同抗原性肽。在多种抗原性肽形式的一些具体实施方式中，各种抗原性肽可以都选自来自同一病原体因子的多种表位。在多种抗原性肽形式的其他具体实施方式中，各种抗原性肽可以都选自来自密切相关的病原体因子的多种表位，例如不同菌株，亚种，相同种类的或者相同属的不同种类的生物变型、致病变型、血清变型或者基因变型。在可替代的具体实施方式中，插入到衣壳融合肽的抗原性肽可来自不相关的病原体因子。本发明的具体实施方式包括其中病原体因子属于至少如下组之一细菌和支原体，包括但是不限于致病性的杆菌属(S^///^^^.)，例如，炭疽杆菌(Sac/〃M(3"/Zzrac&);巴通体属(S"Wowe〃fls/p.)，例如，五曰热巴通体(及^//"to，)；布鲁氏菌属(Sn/ce〃ai^p.);伯克霍尔德菌属(Swr狄o/cfer/avp.)，例如，类鼻疽伯克霍尔德氏菌(及/weW(ioma〃e/);弯曲菌属(Campy/o/)acters，.)；梭菌属(C7o欲/(i/讓W/.)，例如，破伤风梭菌(C.tetom')，肉毒梭菌(C.6Ww//nwm);柯克斯体属(Cox/e//as;p.)，例如，贝氏柯克斯体(C.^m幼'i);爱德华氏菌属(五dHW^zW/a^/.)，例如，迟缓爱德华氏菌(EtoWa);肠杆菌属(五"feraZ^cterwp.)，例如，阴沟肠杆菌(￡.c/oac^);肠球菌属(五"teracoccwss，.)，例如，粪肠球菌(五.y2^cfl//5)，屎肠球菌(￡.y^ec/画)；埃希氏菌属(^Esc/en'c/n.as早)，例如，大肠杆菌(￡co/0;朗西斯菌属(Fra"c/se〃as/p.)，例如，土拉弗朗西斯菌(i^w/we"^);嗜血杆菌(//(3纖0//2z7mSS，.)，例如，流感嗜血杆菌(i/.f"y/we打zae);克雷伯氏菌属(《/efo/e//a)，例如，肺炎克雷伯氏菌(KP"gMWO"/"g);军团菌属(丄eg7'0"g〃"j;李斯牛寺菌属(丄/Wen'(35/5/3.)，例如，产单核细胞李斯特菌(Z.mo"oqytoge"es);脑膜炎双球菌(7We"/wgococc/)禾口钟木J求菌(GomcoccO，例如，奈瑟氏菌属(iVe/Men'as，)；莫拉菌属(M9raxe〃as，.)；分支杆菌属(綺co6ac妙/画)，例如，麻风菌(M/eprae)，结核分枝杆菌(M^Z^cw/o^);肺炎链J求菌(尸/ew/77(9C(9ccj')，例如，月市炎7又歧杆菌(/V/7/ococciA//e〃/w/7ise);假单胞菌属(尸sei^o附o"asspp.)，例如，铜绿假单胞菌(aen^/ww");立克次体属(i/cfeto/aspp.)，例如，普氏立克次体(i.pravrazeh'"立氏立克次体(兄r/cfeto")，伤寒立克次体(尺沙门氏菌属(Sa/mo"e〃"^>/7.)，例如，伤寒沙门氏菌(S.(v/^');葡萄状球菌属(Sto//^/ococcws^p.)，例如，金黄色葡萄i求菌(51.aw^旭)；l连球菌属)，包括A组链球菌(Gkwpj&reptococc/)和溶血性链球菌(te附o/少"c5Vre/tococc/)，例如，月巿炎链球菌(《S.pwewwo"/fle)，化脓链球菌》_yoge"es);链霉菌属(5^e尸tomyc"5pp.);志贺菌(幼/ge〃a);弧菌属(W6n'o)，例如，霍乱弧菌(Kc/w/erae);和耶尔森氏菌属(;Te"/m'as/^.)，例如，鼠疫耶尔森菌0:;es^)，小肠结肠炎耶尔森菌(Kwferaco//^^)。真菌和酵母包括但是不限于，致病的交奄连包属(J//er"ar/a^p.);曲霉属(^s/erg/〃^);子囊酵母菌属(B/ostow,a^/p.)，例如，马皮疽芽生菌(B.dermatiditis);假丝酵母属(Om^/a^p.)，例如，白色假丝酵母(C.a版c朋s);枝子包属(C7a<iaspon'wm);孢子菌属(CocczWod^yspp.)，例如，粗球孢子菌(C./ww/^);隐球酵母属(Oy;toco"Mss;/0，例如，新型隐球菌(C.wo/o，fl^);组织胞浆菌属(//^top/aswas/p.)，例如，荚膜组织胞浆菌ca;w/"^/m);以及孢子丝菌属(SporaA^cs/取)，例如，申克孢子丝菌(51."/^打c&')。本发明的具体实施方式包括其中病原体来自原生生物，包括到但是不限于，致病的变形虫，包括棘阿米巴属(JcawA"moek^/^.)，阿米巴属"mo&awp.)，原发性阿米巴属(A^eg/er&^p.A阿米巴属(五wtowoeZ^^;.)，例如，溶组织阿米巴(￡./^to/,'ca);隐孢子虫属(C>>^toypor/<i/Mw^p/.)，例如，微小隐孢子虫(C./arvww^;f包子虫属(Cyc/oypora5/p,);月亩炎原虫属(￡>7cep/Mf//tozoo"s尸/.)，例如，肠气肿脑炎原虫(￡./"feW"ato);肠胞虫属(&z&raqytozoo"^;.);贾第鞭毛虫属(G/ar^fl^;.)，例如，蓝氏贾第鞭毛虫(G/awMfl);球虫属(/sasporas早)；微孢子虫属(Mfcra^orW画);疫原虫属(/Vow2od/wmw;.)，例如，恶性症原虫(^P/a/">aram)，三日症原虫應/an'"e)，卵开維原虫(Pova/e)，P.vivax;弓开独属(r。，/os扁W/.)，例如，刚地弓形虫(rgo"A7);以及弓形虫属(7)jpa"osowa)，例如，布氏锥虫(7:^wce/.)。本发明的具体实施方式包括其中病原体来自寄生虫(例如，力e7肌'/7Z^ic包括但是不限于，致病的蛔虫属(Jscan:sspp.)，例如，人虫回虫(A/ww6n'co/des);线虫属fZ)racw"cm/^s/p.)，例如，麦地那龙线虫(Z).膨d/"画-s);丝虫属(O"cZzoce腦卿.)，例如，盘尾丝虫(aw/vw/i^);血吸虫属(Sc/^toSOmas/p.);旋毛虫属(7Hc/."e〃as，.)，例如，方定毛虫(s//rafo);禾口鞭虫属(7Hc/z鹏^)，例如，鞭虫(rfn'c/7/wra入'在其他具体实施方式中，病原体因子来自病毒，包括但是不限于，致病的月泉病毒(^JewoWr^eO;沙粒病毒(Jre"crv/nay)，例如，拉沙热病毒(丄as5aFeverv/msesO;撤销星状病毒(^y加v/mses);布尼亚病毒(J5w/^av/rw化s)，例如，汉坦病毒(//a"tov/n^&y)，裂谷热病毒J^t〃e_yFeverWmses);冠状病毒(Corawav/mses)，S病毒(De/Z謂Vw愿)；细胞巨化病毒(Cyto膨ga/謂Vusey)，EB病毒(五/他/w-S(3tv/mses)，抱疫病毒(//e/pesv/rns^)，水痕病毒(f^r/ce〃av/n^as);丝状病毒(W/ov/n^es)，例如，埃博拉病毒vzVwses入马尔堡病毒病毒(Afar6wrgv/n"es);黄病毒(F/aWn/ses)，例如，登革热病毒v/msesJ，西尼罗河热病毒(股WM7ei^verv/n/ses)，黄关惑病病毒(R〃cwFeverv/rwses);月干炎病毒(//e/a份/sWrws&s);f荒感病毒(/"/7we"z謂'rw篇)；慢病毒(丄e""v/myey)，T-细胞淋巴腺病毒)，其他白血病病毒；诺沃克病毒(A^rvra汉);乳头瘤病毒(/^戸7/owav/n^")，其他肿瘤病毒；副粘液病毒(户aramyxov/n^es)，例如，麻疹病毒(Afezs/asvzVwas)，月思腺炎病毒(A/wm/wv/rases)，晶'j流感病毒(尸"ra/wy7Me"zav/rasas)，月巿炎病毒(尸we画ov/myas)，仙台病毒(5^w血'W/^es1);细小病毒(户arvov/rwsas);小核糖核酸病毒(P/co脂W潛as)，例如，心病毒(Gm&Wr匿s)，柯萨奇病毒(Coxsach'ev/nas)，艾柯病毒(五c/20v/ms&sO，小儿麻瘦症病毒(/W/omF/Zfev/mey)，鼻病毒(朋/"ov/ms&sO，其他月汤道病毒；瘦病毒(ParWrMses1)，例如，天花病毒(Ksrr/o/av/rasey)，牛痘病毒(f^tcc/m'av/rwsey)，痕病毒(尸araporvzVM5as);呼吸道肠道病毒(T^ovzVz^es)，例如，Co11i病毒(Cb/"Wrwses)，环状病毒((9rZ/vzV^es1)、轮状病毒(Aoto由篇)；棒状病毒(倫油Wr證s)，例如，狂犬病病毒(丄戸(3v/myes)，水泡性口炎病毒(P^S7'CM/orStow加tov/nas);禾口囊膜病毒(7bgm;/mses)，例如，风疹病毒(iw^〃a)，辛德毕斯病毒(5V"必/sv/nesO，西方脑炎病毒(,他m五"ce//2a/他v/mses义本发明的具体实施方式包括，其中抗原性肽选自由犬细小病毒肽，炭疽杆菌保护性抗原(PA)的抗原性肽，以及东方马脑炎病毒抗原性肽组成的组。在其他具体实施方式中，抗原性肽是犬细小病毒来源的肽。在其他具体实施方式中，抗原性肽是炭疽杆菌保护性抗原(PA)的抗原性肽，其具有SEQ.ID.N0s:4、6、8或10的氨基酸序列的任何一种。在还有其他具体实施方式中，抗原性肽是东方马脑炎病毒抗原性肽，具有SEQ.ID.N0s:11或13之一的氨基酸序列。将抗原性肽或感兴趣的肽的编码序列插入到病毒衣壳或外壳蛋白的编码序列的预定位点上。在一些具体实施方式中，将肽插入到编码衣壳的序列上，以在VLP形成过程种作为一个环表达。可以将肽插入到衣壳中的一个以上的插入位点中。因此，可以将肽插入到衣壳的一个以上表面环基序中；还可以将肽插入到特定环基序的多个位点上。各种感兴趣的功能性的和/或结构性的肽，禾n/或完整的肽插入片段通过裂解位点分开，即在该位点上，裂解或水解蛋白质的试剂起作用来将肽与衣壳结构或组装物的剩余物分开。将肽插入到朝外的环和/或朝内的环中，即插入到分别朝远离衣壳中心的方向或朝向衣壳中心的衣壳的环中。衣壳表面环中的任何氨基酸或者肽键可作为肽的插入物。典型地，插入位点可选择在环中心附近，即在远离折叠的衣壳肽的三级结构中心的最末端的位置上。编码肽的序列可操作地插入到对应于所选择的环的近似中心的衣壳编码序列的位置中。这包括保留阅读框，在该阅读框中，衣壳的部分肽序列在肽插入位点的下游被合成。在其他具体实施方式中，将肽插入到衣壳的氨基末端。通过一种或多种接头序列将肽连接到衣壳上。在一些其他具体实施方式中，将肽插入到衣壳的羧基末端。通过一种或多种接头将肽连接到羧基末端，该接头可通过化学的或酶促的水解反应裂解。在其他具体实施方式中，肽序列被连接到氨基末端和羧基末端上，或连接到一个末端和至少一个中间位置上，例如该位置被表达在衣壳三维构象的表面上。对于本发明的其他具体实施方式，至少一种抗原性肽被表达在至少一个中间环中，或者至少在VLP的一个外表面环上。对病毒衣壳的多个环进行修饰。在一些具体实施方式中，抗原性肽暴露在病毒样颗粒的至少两个表面环上。在其他具体实施方式中，至少两种抗原性肽被插入到衣壳蛋白中，暴露在病毒衣壳、笼形结构或病毒样颗粒的至少两个表面环上。在另一个具体实施方式中，至少三种抗原性肽被插入到衣壳蛋白上，并暴露在病毒样颗粒的至少三个表面环上。表面环上的重组肽具有相同的氨基酸序列。在其他具体实施方式中，表面环上的重组肽的氨基酸序列是不同的。对编码病毒衣壳或蛋白的核酸序列进行修饰来改变VLPs的构象(参见，例如Brumfield等人(2004)J.Gen.Virol.85:1049-1053)。例如，最通常发生三种常规修饰来改进VLP的组装。这些修饰被设计来改变所组装的蛋白质笼形结构中的内部、外部或者邻近亚单位之间的表面。为了完成该目的，使用突变引物来(i)通过用酸性谷氨酸替换N—末端的碱性残基(例如K，R)来改变病毒核酸结合区的内表面电荷(Douglas等人，2002b);(ii)从N—末端删除内部残基(在CCMV中，通常是残基4—37);(iii)将编码11个氨基酸的肽的细胞耙向序列的cDNA(Graf等人，1987)插入到表面暴露环上；以及(iv)通过改变金属结合位点(在CCMV中，残基81/148突变)来改变病毒亚单位之间的相互作用。本发明的具体实施方式包括，其中将抗原性肽插入到来自豇豆褪绿斑驳病毒(CCMV)的衣壳。在一些具体实施方式中，将肽插入到CCMV病毒的氨基酸129上。在另一个具体实施方式中，将肽序列插入到CCMV病毒的氨基酸60，61，62或63上。在还有另一个具体实施方式中，将肽插入到的CCMV病毒的氨基酸129和氨基酸60—63上。本发明的具体实施方式包括，其中还包括与感兴趣的抗原性肽临近的或连接到病毒衣壳蛋白的一部分上的标记序列。在本发明的具体实施方式中，该标记序列使得可以纯化重组衣壳蛋白融合肽。标记序列可以是亲合标记，例如，六组氨酸亲合标记。在另一个具体实施方式中，亲合标记是谷胱甘肽-s-转移酶分子。标记还可以是荧光分子，例如YFP或GFP，或者这些荧光蛋白的类似物。标记还可以是抗体分子，或者己知抗原或已知用于纯化的结合配偶体的配体的一部分。III.重组衣壳蛋白融合肽的生产本发明包括使用合成系统或任何类型的生物学表达系统，生产用于随后的多价VLPs组装的重组衣壳融合肽。当前用于表达衣壳蛋白的方法包括昆虫细胞表达系统，细菌细胞表达系统例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和荧光假单胞菌，植物和植物细胞培养表达系统，酵母表达系统例如酿酒酵母和毕赤酵母，以及哺乳动物表达系统。本发明的具体实施方式包括其中在植物细胞和全植物中生产重组衣壳融合肽。在某些具体实施方式中，衣壳融合肽以可溶蛋白的形式被生产。在另一个具体实施方式中，衣壳融合肽被组装成感染性病毒颗粒。在一种可替代的具体实施方式中，衣壳融合肽被组装成VLPs。本发明的具体实施方式包括，其中在细菌细胞培养物中生产重组衣壳蛋白融合肽。在具体实施方式中，重组衣壳融合肽在宿主细胞中聚集成不溶的包涵体。在一种可替代的具体实施方式中，衣壳蛋白融合肽作为可溶分子在宿主细胞中生产。在其他具体实施方式中，在假单胞菌宿主细胞中生产重组衣壳融合肽，包括荧光假单胞菌细胞。用本领域的已知技术，在生物表达系统生产用于本发明中的重组衣壳蛋白融合肽。例如，编码将可操作地连接到至少一种抗原性肽上的病毒衣壳蛋白融合肽的核酸构建物插入到宿主细胞中，并被表达。转录和翻译调控元件，如转录增强序列，翻译增强序列，启动子，核糖体进入位点，包括内部核糖体进入位点、激活子、翻译起始和终止信号，转录终止子，顺反子调控子，多顺反子调控子，标记序列，例如核苷酸序列"标记"或"标记"肽编码序列，这些标记序列便于所表达的重组衣壳蛋白融合肽的鉴定、分开、纯化或者分离，包括His-丰示i己，Flag—t示"i己，T7—牛示i己，S—禾示i己，HSV—木示i己，B—牛示i己，Strep—丰示记，多聚精氨酸，多聚半胱氨酸，多聚苯丙氨酸，多聚天冬氨酸，(Ala-Trp-Trp-Pro)n，硫氧还蛋白，P-半乳糖苷酶，氯霉素乙酰转移酶，环麦芽糖糊精葡萄糖基转移酶，CTP:CMP-3-脱氧-D-甘露-辛酮酸胞苷酰基转移酶(octulosonatecytidyltransferase),trpE或trpLE，抗生物素蛋白，链霉抗生物素，T7基因10，T4gp55，葡萄球菌蛋白A，链球菌蛋白G，GST，DHFR，CBP，MBP，半乳糖结合结构域，钙调蛋白结合结构域，KS工，c-myc，ompT，ompA，pelB，NusA，泛素，六组氨酸，谷胱甘肽-S-转移酶，GFP，YFP或者这些荧光蛋白的类似物，抗体分子，hemosylinA，或者已知抗原或己知用于纯化的结合配偶体的配体，将调控序列共价连接到期望序列上，使得通过宿主细胞的作用，调控序列能够引导重组衣壳蛋白融合肽的表达。在发酵程序中，一旦诱导表达重组衣壳融合肽，理想的是进行高水平的生产，使得衣壳融合肽的生产效率最大化。IV.重组衣壳蛋白融合肽的纯化一旦生成重组衣壳蛋白融合肽、病毒样颗粒或者笼状结构，通过本领域熟知的标准方法来分离并纯化到基本上纯。分离和纯化技术取决于用于生产衣壳蛋白融合肽的宿主细胞。这种技术包括，但是不限于，PEG、硫酸铵或乙醇沉淀，酸提取，阴离子或阳离子交换层析，磷酸纤维素层析，疏水性互作层析，亲合层析，镍层析，羟基磷灰石层析，反相层析，凝集素层析，预备电泳，去垢剂溶解，用如柱层析进行选择性沉淀，免疫纯化方法，大小排阻层析，免疫纯化方法，离心，超速离心，密度梯度离心(例如，在蔗糖或氯化铯(CsCl)梯度上)，通过大小排阻滤膜进行超滤，以及本领域知晓的任何其他蛋白分离方法。例如，已经确定分子粘附特性的衣壳蛋白融合肽被可逆地融合到一种配体上。使用适当的配体，衣壳蛋白融合肽被选择性地吸附到纯化柱上，然后以相对纯的形式从柱上释放出来。然后通过酶促活动来去除衣壳蛋白。此外，用免疫亲合柱或者Ni-NTA柱来纯化衣壳蛋白融合肽。常规技术还被描述在例如，R.Scopes,肽纯化原理与实践，Springer-Verlag:纽约(1982);Deutscher，肽纯化指南，AcademicPress(1990);美国专利No.4，511，503;S.Roe，肽纯化技术一种应用方法(PracticalApproachSeries)，OxfordPress(2001);D.Bollag等人，肽方法，Wiley-Lisa,Inc.(1996);AKPatra等人，P印tideExprPurif，18(2):p/182-192(2000);以及R.Mukhija等人，Gene165(2):303-6(1995)。还可以参见，例如，Ausubel等人(1987以及定期副刊)；Deutscher(1990)，"肽纯化指南"，MethodsinEnzymology第182巻，以及该系列中的其他巻；Coligan等人(1996以及定期副刊)肽科学中的当前方法，Wiley/Greene，纽约；以及生产商关于肽纯化产品用途的文献，例如，Pharmacia,Piscataway，N.J.，或者Bio-Rad，Richmond,Calif.结合使用重组技术使得与适当片段融合，例如与能够通过一种可用蛋白酶去除的序列融合的FLAG序列或者等价物融合。还参见，例如，Hochuli(1989)ChemischeIndustrie12:69-70;Hochuli(1990)"用金属螯合吸收剂纯化重组肽"在Setlow(编辑)，遗传工程，原理和方法，12:87-98，PlenumPress,纽约；以及Crowe等人(1992)QIAexpress:TheHighLevelExpression&PeptidePurificationSystemQIAGEN，Inc.，Chatsworth，Calif。在一些具体实施方式中，在宿主细胞特别是在细菌宿主细胞中，表达衣壳蛋白融合肽，形成不溶的聚集体("包涵体")。多种方法适合用于从包涵体中纯化肽。例如，对包涵体的纯化通常包括破坏宿主细胞，提取、分离和/或纯化包涵体，例如，通过在含有50mMTRIS/HCLpH7.5，50mMNaCl，5mMMgCl2，1mMDTT，0.1mMATP禾卩1mMPMSF的缓冲液中进行培养。通常以通过FrenchPress处理2-3次来裂解细胞悬浮物。还可以用Polyt皿(Brink腦histr騰nts)或者在冰上进行超声波处理来匀质化细胞悬浮物。裂解细菌的可替代方法对于本领域技术人员来说是显然的(参见，例如，Sambrook等人，同上文；Ausubel等人，同上文)。如果需要，可以溶解包涵体，并且通常离心被裂解的细胞悬浮物来去除不想要的不溶物质。用相容的缓冲液进行稀释或者透析，使得形成包涵体的衣壳蛋白融合肽复性。合适的溶剂包括但是不限于尿素(从约4M到约8M)，甲酰胺(至少约80%，以体积/体积计算)，以及盐酸胍(从约4M到约8M)。虽然盐酸胍和类似试剂是变性剂，这种变性不是不可逆的，在去除(例如通过透析)或稀释变性剂后能够复性。其他合适的缓冲液是本领域技术人员知晓的。可替代地，可能从宿主外周胞质中纯化重组衣壳蛋白融合肽、病毒样颗粒或者笼形结构。当重组肽被输出到宿主细胞的外周胞质时，在裂解宿主细胞后，除了本领域技术人员知晓的其他方法之外，通过冷渗透休克来分离细菌的外周胞质部分。为了从外周胞质中分离重组肽，离心细菌细胞来产生沉淀。将沉淀重新悬浮到含有20%蔗糖的缓冲液中。为了裂解细胞，对细菌进行离心并将沉淀重新悬浮到5mM冰冷MgS04中，并在冰浴中保持约10分钟。离心细胞悬浮液，轻轻倒出上清液并保存。通过本领域技术人员熟知的标准分离技术，从宿主肽中分离存在于上清液中的重组肽。初步的盐分级分离能够从感兴趣的重组衣壳蛋白融合肽中分离出许多不想要的宿主细胞肽(或者来自细胞培养液的肽)。一个这种例子是硫酸铵。硫酸铵通过有效地降低肽混合物中的水含量来沉淀肽。然后肽基于它们的溶解度而沉淀。肽的疏水性越强，其在较低硫酸铵浓度下沉淀的可能性越大。典型操作包括将硫酸铵饱和溶液添加到肽溶液中，使硫酸铵浓度在20-30%之间。该浓度能够沉淀疏水性最强的肽。然后弃去沉淀(除非感兴趣的肽是疏水的)并将硫酸铵加到上清液中，达到已知能够沉淀感兴趣衣壳蛋白融合肽的浓度。然后将沉淀溶解在缓冲液中，如果需要，通过透析或渗滤去除过量的盐。其他方法依赖于肽的溶解度，例如冷乙醇沉淀，是本领域技术人员熟知的，可被用于分馏复杂的衣壳蛋白融合肽混合物。利用重组衣壳蛋白融合肽的分子量，将其从更大和更小的肽中分离，使用不同孔径的膜(例如，Amicon或者Millipore膜)进行超滤。第一步，将衣壳蛋白融合肽混合物超滤通过具有比感兴趣的重组衣壳融合肽的分子量更小的分子量截留(cutoff)的孔径的膜。然后将超滤的截留物用具有比感兴趣的重组衣壳融合肽的分子量更大的分子量分离点的孔径的膜进行超滤。重组衣壳蛋白融合肽通过该膜进入滤出液中。按如下所述，对滤出液进行层析。还可以基于大小、表面净电荷、疏水性以及对配体的亲合性，从其他肽中分离重组衣壳蛋白融合肽。此外，将抗衣壳蛋白的抗体偶联到柱基质上，免疫纯化衣壳蛋白。所有这些方法是本领域熟知的。本领域技术人员显然知晓层析技术可以在任何标准下进行，并且可以使用来自许多不同生产商的设备(例如，PharmaciaBiotech)。V.组装病毒样颗粒的分解在本发明的一个方面，先前己经被组装到病毒样颗粒中的重组衣壳蛋白融合肽可被用于本发明，其中病毒样颗粒被分解，病毒样颗粒的重组衣壳蛋白融合肽被分离和纯化，并随后用于构成多价病毒样颗粒。分解处理在本领域是熟知的。例如，含有Tris，EGTA，DTT和NaCl的分解缓冲液被用于分解先前组装的病毒样颗粒。参见，例如，Brady等人(1977)"钙离子螯合分裂多瘤病毒与纯化的病毒粒子相关"，J.Virology23(3):717-724。此外，延长暴露在高浓度的巯基还原剂中，如3-巯基乙醇、谷胱甘肽、二硫苏糖醇，二硫赤藓糖醇，半胱氨酸，氢化硫，和它们的混合物，能够分解先前组装的VLPs。参见，例如，美国专利No.6，146,945。例如实施例中描述的那些分解方法可用于本发明中。VI.VLPs的重新组装含有抗原性肽插入片段的不同重组衣壳融合肽群体在体外混合，并重新组装成病毒样颗粒。在本发明的一个方面，含有抗原性肽插入片段的病毒衣壳蛋白被重新组装成缺少全长感染性病毒核酸基因组的VLP。全长的感染性病毒核酸是含有病毒在细胞中复制的所有核酸序列的病毒的基因组核酸。这些元件包括(i)编码区，(ii)非编码区，以及(iii)调控区。病毒基因组核酸可以是RNA或DNA。非编码区位于病毒核酸的5'端和3'端，或者在编码区之间。编码区是重叠的或不重叠的，并且是多功能的。非编码区和编码区都具有调控功能，并且含有调控元件，如病毒复制、翻译或者包壳或病毒颗粒形成所需的序列。在其他具体实施方式中，VLP在存在病毒的RNA时被重新组装。在另一个具体实施方式中，VLP是在缺少病毒核酸时被重新组装。在另一个具体实施方式中，VLP是在存在非病毒核酸时被重新组装。在另一个具体实施方式中，VLP是在存在免疫刺激核酸序列如CpG序列时被重新组装。在本发明的一个方面，各个含有不同抗原性肽插入片段的重组衣壳融合肽的群体在体外混合，并组装成多价病毒样颗粒。各个群体各自含有至少一种不存在于与之混合的任何其他重组衣壳融合肽中的抗原性肽插入片段。在一个具体实施方式中，重组衣壳融合物以相同比例混合，例如1:1，1:1:1。在另一个具体实施方式中，重组衣壳融合物以不同比例混合，例如1:2，1:3，1:2:1，2:1:3:1。比例可以通过混合物中包括不同种类的含有抗原性插入片段的衣壳融合肽的数量来确定。在一些具体实施方式中，重组衣壳融合肽的混合物含有至少第一种含有至少一种抗原性肽插入片段的病毒衣壳蛋白，和第二种含有至少一种抗原性肽的病毒衣壳蛋白，其中第二种衣壳融合肽的至少一种抗原性肽插入片段来自与第一种衣壳融合肽的至少一种抗原性肽插入片段不同的抗原性肽序列或不同的病原体因子。在本发明的一些具体实施方式中，至少两种含有来自抗原性肽的插入片段的重组衣壳融合肽群体被混合，其中各个群体含有至少一种不存在于与之混合的衣壳融合肽中的抗原性肽插入片段。抗原性肽插入片段可以来自相同的或不同的病原体因子。在一些具体实施方式中，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，10个，11个，12个，15个，18个，20个，或者20个以上的重组衣壳融合肽群体被混合，其中各个群体含有至少一种不存在于与之混合的任何其他重组衣壳融合肽群体中的抗原性肽插入片段。在本发明的其他具体实施方式中，含有非抗原性肽插入片段的衣壳蛋白也被包括在混合物中。这种非抗原性肽插入片段包括，但是不限于，靶向肽，作为免疫系统调节物的肽，例如细胞因子和趋化因子，以及来自合成途径的作为佐剂的肽。此外，将非病毒的核酸序列添加到混合物中，例如免疫刺激序列，其可用于增强对VLPS中含有的抗原性肽的免疫反应。免疫刺激核酸例如CpG序列，是短的寡核苷酸，其模拟对微生物DNA的先天性免疫反应。CpGs含有一条或多条含有胞嘧啶磷酸鸟嘌呤(CpG)二核苷的基序，该基序具有未甲基化的胞嘧啶残基。含有未甲基化的CpG基序的DNA普遍存在于细菌DNA中，但是不存在于哺乳动物DNA中，已经被证明在体外和体内诱导强烈的TH1极化免疫反应。尽管不期望受单一理论的约束，一般认为，TH1反应的诱导是由于含有CpG(CpG寡脱氧核苷酸)的免疫刺激序列能够通过巨噬细胞和树突细胞诱导IL-12和IL-18的活化和分泌的能力的结果。然后这些细胞因子协同诱导天然杀死细胞和T细胞生成IFN-y。此外，CpGs引起未成熟的树突细胞成熟为专门的抗原呈递细胞，其能够激活抗原反应天然T细胞。CpGs还能够直接推进B淋巴细胞进行增生，引发免疫球蛋白的生产。在一个具体实施方式中，重新组装的VLP在回文六聚物中包括未甲基化的CpG序列，该六聚物在通式5'-R'R2CGYY-3'(SEQIDNO.19)之后，其中R'是嘌呤(优选为G)，R2是嘌呤或T，而Y'和f是嘧啶。在一个具体实施方式中，VLP包括CpG序列，该序列选.自由5'-GACGTC-3'(SEQIDN0:20)，5'-AGCGCT-3，(SEQIDN0:21)和5'-AACGTT-3'(SEQIDN0:22)或者它们的组合组成的组。在一个具体实施方式中，VLP包括CpG序列，其包括5'TCCATGACGTTCCTGACGTT3'(SEQIDN0:23)。在另一个具体实施方式中，CpG寡核苷酸序列是AACGTTCG(SEQIDNO:24)。如上所述，生成的病毒样颗粒或者笼形结构是在混合的重组衣壳融合肽群体重新组装后形成的，含有至少与所混合群体相同数量的不同抗原性肽。例如，如果混合两个重组衣壳融合肽群体，每个群体含有至少一种不存在于另一个群体中的抗原性肽，然后生成的病毒样颗粒含有至少两种不同的抗原性肽插入片段。在本发明的另一个方面，各个含有至少一种抗原性肽插入片段的重组衣壳融合肽群体在体外混合，形成VLPs，其中各个被混合的重组衣壳融合肽群体含有至少一种来自不同于任何其他与之混合的重组衣壳融合肽的不同病毒的衣壳蛋白。在其他具体实施方式中，重组衣壳融合肽混合物含有至少第一种含有至少一种抗原性肽插入片段的病毒衣壳蛋白，以及第二种含有至少一种抗原性肽插入片段的病毒衣壳蛋白，其中在来自不同病毒的第一种病毒衣壳蛋白的衣壳蛋白不同于第二种病毒衣壳蛋白的衣壳蛋白。在其他具体实施方式中，抗原性肽插入片段可以是相同的或不同的肽序列。在还有其他的具体实施方式中，抗原性肽插入片段来自相同或不同的病原体因子。在一些具体实施例方式中，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，10个，11个，12个，15个，18个，20个或者超过20个重组衣壳融合肽群体被混合，其中各个群体含有不存在于与之混合的任何其他重组衣壳融合肽群体中的病毒衣壳蛋白。在其他本发明的具体实施方式，如上所述，混合物中包括含有非抗原性肽插入片段的衣壳蛋白。此外，将非病毒核酸序列添加到混合物中，例如CpG序列，其被用于增强对VLPs中含有的抗原性肽插入片段的免疫反应。本发明的具体实施方式包括，其中不含有肽插入片段的衣壳融合蛋白(野生型衣壳蛋白)也被添加到上述混合物中。野生型病毒衣壳蛋白可来源于任何病毒，包括与用于产生含有抗原性肽插入片段的衣壳融合肽的病毒相同或不同的病毒衣壳融合肽重新组装，能够生成病毒样颗粒或笼形结构。在一些具体实施方式中，VLP或笼形结构是混合衣壳的多聚组装，包括来自3个到约1000个或更多个的衣壳。在其他具体实施方式中，VLP或笼形结构包括至少30个，至少50个，至少60个种，至少90个，至少120个衣壳，或至少200个衣壳。在另一个具体实施方式中，各个VLP或笼形结构包括至少150个衣壳，至少160个，至少170个，至少180个衣壳。本发明的具体实施方式包括，其中VLP被重新组装成二十面体结构。在另一个具体实施方式中，VLP被重新组装成具有与衣壳序列来源的天然病毒相同的几何学。然而，在各个具体实施方式中，VLP不具有与天然病毒相同的几何学。在一些具体实施方式中，例如，该结构是由多种衣壳形成的颗粒，而不形成天然的VLP结构。例如，可以形成由三个病毒衣壳构成的笼形结构。在各个具体实施方式中，可以形成约6个，9个，12个，15个，18个，21个，24个，27个，30个，33个，36个，39个，42个，45个，48个，51个，54个，57个或60个衣壳构成的笼形结构。在一些方面，本发明能够在混合阶段控制和引导重新组装的VLP中的抗原性肽插入片段的比例。通过组装前添加到混合物中的含量，可以调节VLP中含有的抗原性肽插入片段的比例。与VLP在体内组装所能够达到的程度相比，通过这种方式，本发明使得能够更紧密地调节和控制相同的抗原性肽在重新组装的VLP中的含量。例如，这种控制可用于使用VLP的疫苗接种策略，该VLP含有被用作第一次用于动物中的接种物的一种抗原性肽，以及被用作"加强剂"的第二种抗原性肽，第二种抗原性肽先前被用作动物中的接种物。在这种情形下，"增强剂"抗原性肽以低于其他抗原性肽的含量存在，并且使用目前的方法，含有"增强剂"抗原性肽的重组衣壳融合肽群体以少于含有其他抗原性肽插入片段的群体的含量添加到混合物中。在其他具体实施方式中，至少重新组装的VLP结构之一包括至少一种来自各个被添加到混合物中的群体的衣壳融合肽。在其他具体实施方式中，重新组装的VLP结构粗略地包括等比例的来自各个被添加到混合物中的群体的各种衣壳融合肽。可替代地，可以按期望调节该比例，其中得到不成比例的混合物。病毒样颗粒组装需要正确折叠的衣壳蛋白。然而，还存在显著影响VLP形成和稳定性的其他因素，其中包括pH、离子强度，二硫键、二价阳离子键。参见，例如，Brady等人(1977)，"钙离子螯合分裂多瘤病毒与纯化的病毒粒子相关"，J.Virol.23(3):717-724;Gajardo等人(1997)，"两个脯氨酸残基对轮状病毒VP7衣壳蛋白的钙结合活性是重要的"J.Virol.，71:2211-2216;Walter等人(1975)，"分子间二硫键多瘤病毒衣壳的重要结构特征"，ColdSpringHar.Symp.Quant.Biol.，39:255-257(1975);Christansen等人(1977)，"通过碱破坏猿病毒40所释放得组分的特征"，JVirol.，21:1079-1084;Salunke等人(1986)，"纯化的多瘤病毒衣壳蛋白VP1的自组装"Cell46:895-904;Salunke等人(1989)，"多瘤病毒衣壳蛋白VP组装中的多形性"，Biophys.J.，56:887-900;Garcea等人(1983)，"多瘤病毒的宿主范围转化基因在病毒组装中起主要作用"，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80:3613-3617;Xi等人(1991)，"Baculo病毒表达人乳头瘤病毒16型衣壳蛋白检测L1_L2蛋白复合体"，J.Gen.Virol.，72:2981-2988。用于重新组装的技术在本领域是熟知的，包括但是不限于实施例中描述的技术。衣壳融合肽重新组装，生成病毒样颗粒或者笼形结构。在其他具体实施方式中，VLP或笼形结构是混合的衣壳融合肽的多聚体组装，包括从3个到约1000个或者更多个衣壳。在其他具体实施方式中，VLP或者笼形结构包括至少30个，至少50个，至少60个，至少90个，至少120个衣壳，或者至少200个衣壳。在另一个具体实施方式中，各个VLP或者笼形结构包括至少150个衣壳，至少160个，至少170个，或者至少180个衣壳。本发明的具体实施方式包括，其中VLP被重新组装成二十面体结构。在其他具体实施方式中，VLP被重新组装成具有与衣壳序列来源的天然病毒相同的几何形状。在其他具体实施方式中，VLP不具有与天然病毒相同的几何学。在一些具体实施方式中，例如，该结构被制备成由多种衣壳构成的颗粒，而不形成天然形式的VLP结构。例如，可以形成少至3个病毒衣壳的笼形结构。在各个具体实施方式中，形成由约6个，9个，12个，15个，18个，21个，24个，27个，30个，33个，36个，39个，42个，45个，48个，51个，54个，57个或60个衣壳组成的笼形结构。VI.接种疫苗在本发明的一些方面，重新组装的多价VLPs可被用于在动物或人中诱导免疫反应的策略中。本发明的具体实施方式包括，其中用于衣壳融合肽中的病毒衣壳蛋白来自CCMV病毒。在一些具体实施方式中，VLPs中含有的抗原性插入片段包括来自炭疽杆菌的"保护性抗原"，或者，可替代地，东方马脑炎的E2糖蛋白。总之，将有效量的VLP施用给动物或人，这足以诱导免疫反应。施用来诱导这种反应的含量可以通过本领域通常知晓的技术来确定。在一些具体实施方式中，VLP的施用量有利地在每个动物或人为10_500ixg之间。VLP的施用量可能随着施用路径和个体体重而改变。含有VLP的疫苗可通过药学上可接受的载体施用。药学上可接受的载体可以是本领域技术人员知晓的可用于配置药物的任何药学上可接受的载体。在一些具体实施方式中，药学载体是一种液体，含有VLP的疫苗可以是溶液形式。在还有更多具体实施方式中，药物载体是凝胶，含有VLP的疫苗是栓剂或者乳剂形式。在还有更多具体实施方式中，含有VLP的疫苗被配置成药学上可接受的透皮贴剂的一部分。液体载体被用于预备溶液、悬浮液、乳液、糖浆、酏剂和加压组合物(pressurizedcomposition)中。将VLP悬浮在药学上可接受的液体载体中，如水、有机溶剂、水与有机溶剂的混合物或者药学上可接受的油或脂。液体载体含有其他合适当药物添加剂，例如增溶剂、乳化剂、缓冲液、防腐剂、甜味剂、调味剂、悬浮剂、增稠剂、着色剂、粘度调节剂、稳定剂或者渗透压调节剂。用于口服和胃肠外施用的液体载体的合适例子包括水(部分含有上述的添加剂，例如纤维素衍生物、羧甲基纤维素钠溶液)、醇(包括一羟基乙醇和多元醇，例如乙二醇)以及它们的衍生物，和油(例如分馏的椰子油和花生油)。对于胃肠外施用，载体可以是一种油酯，例如油酸乙酯、异丙基十四烷酸酯。灭菌的液体载体被用于灭菌的胃肠外施用的液体形式组合物中。用于加压组合物中的液体载体可以是卤代烃或者其他药学上可接受到推进剂。通常，液体载体不妨碍重新组装的VLP的折叠。含有VLP的疫苗可用本领域目前所用的任何技术来施用，包括，例如，口服的、粘膜的、静脉内的、肌肉内的、鞘膜内的，硬脑膜外的，腹膜内的或者皮下的。在某些具体实施方式中，通过鼻腔或口腔经过粘膜呈递VLP。在其他具体实施方式中，重新组装的VLP由来自CCMV的衣壳蛋白组成，并经过粘膜呈递。实施例在这些实施例中，豇豆褪绿斑驳病毒(CCMV)被用作肽载体，荧光假单胞菌被用作表达宿主。CCMV是雀麦花叶病毒科的雀麦花叶病毒属的成员。雀麦花叶病毒科是直径为25-28nm的二十面体病毒，具有四个组分、正链、单链RNA基因组。RNA1和RNA2编码复制酶。RNA3编码参与病毒在植物宿主中运动的蛋白。RNA4(来源于RNA3的亚基因组RNA)，即sgRNA4，编码20kDa的衣壳蛋白(CP)，SEQIDN0:1。由sgRNA4编码的野生型CCMV外壳蛋白(SEQIDN0:1)MetSerThrValGlyThrGlyLysLeuThrArgAlaGinArgArgAlaAlaAlaArgLysAsnLysArgAsnThrArgValValGinProVallieValGluProlieAlaSerGlyGinGlyLysAlalieLysAlaTrpThrGlyTyrSerValSerLysTrpThrAlaSerCysAlaAlaAlaGluAlaLysValThrSerAlalieThrlieSerProAsnGluLeuSerSerGluArgAsnLysGinLeuLysValGlyArgValLeuLeuTrpLeuGlyLeuLeuProSerValSerGlyThrValLysSerCysValThrGluThrGinThrThrAlaAlaAlaSerPheGinValAlaLeuAlaValAlaAspAsnSerLysAspValValAlaAlaMetTyrProGluAlaPheLysGlylieThrLeuGluGinLeuThrAlaAspLeuThrlieTyrLeuTyrSerSerAlaAlaLeuThrGluGlyAspVallieValHisLeuGluValGluHisValArgProThrPheAspAspSerPheThrProValTyr各个CCMV颗粒含有多达约180拷贝的CCMVCP。编码CCMVCP的示例性DNA序列示于SEQIDNO.2.'编码CCMVCP的示例性DNA序列(SEQIDNO:2)atggetgcgattgtaaccggtget3肪tecgaagggttgacgcaggacaacggtataageagtgagcatCCMV的晶体结构已经被揭示。Cg￡l￡iggcctgttgcatgggccgaaetatcgtggcttgaggtggcctttaagttgtacgaggtttattag该结构较为清楚地说明了外壳蛋白tctgtcggaacagggaagttaactcgtcaagcccgt鄉aa_caageggaacactcgtgtggtccaacccategetteaggcc犯ggcgetattaaatacagegt￡ltcg犯gtgga_ccgcctcttgcgcggccgt￡ltcggetataactatetctetccctaatgagagg肪c￡l￡lgetc皿ggt￡iggt卿gttttattacttcccgttagtggcgtgtectgtgttactactgetgetgcctectttC￡iggtggCElttagettcgaaagatgttgtcgetgetatgtacCCCgaggcgacccttg朋caaetc3CCgcgg3tttaacgatetacgcggetetcactgagggcg￡iCgtcategtgcatttggtccctacgtttgacgactctttcactccggtg的相互作用，这些相互作用对于颗粒的稳定性和动力学来说是关键的，也有助于引导合理地设计插入位点。先前的研究已经证明，CCMV外壳蛋白被遗传修饰来携带异源肽，而不会影响它们形成颗粒的能力。大量合适当插入位点已经被鉴定。一般认为，如果使用CCMVCP中的单个插入位点，总共多达约180个拷贝的异源肽单位(无论是单个肽或者多联体)可被插入到CCMV颗粒中。迄今鉴定的CCMVCP中的插入位点能够容纳各种长度的肽。此外，可将多聚体形式的肽插入到插入位点中。此外，在同一时间内可以使用多个插入位点，在同一颗粒中表达相同或不同的肽。肽插入片段长约200个氨基酸残基或者更短，更典型地，长达或者约180个，更典型地长达或约150个，还更典型地长达或约120个，还更典型地长达或约100个氨基酸。在一些具体实施方式中，肽插入片段长约5个或更多个氨基酸残基。在其他具体实施方式中，肽插入片段长达约5个到约200个，约5个到约150个，约5个到约120个，更典型地长达约5个到约IOO个氨基酸残基。除非另有说明，分子生物学领域中已知的标准技术、载体、控制序列元件和其他表达系统元件被用于操作、转化和表达核酸。已知的标准技术、载体和元件可见于，例如，Ausubel等人(编辑)，分子生物学中的当前方法(1995)(JohnWiley&Sons);Sambrook，Fritsch，&Maniatis(编辑)，分子克隆(1989)(ColdSpringHarborLaboratoryPress,纽约)；Berger&Kimmel，酶学中的方法152:分子克隆技术的指南(1987)(AcademicPress);和Bukhari等人(编辑)，DNA插入元件，质粒禾口游离体(1977)(ColdSpringHarborLaboratoryPress,纽约)。构建质粒图谱所有质粒图谱用VECTORNTI(InforMaxInc.，Frederick,MD，美国)构建。DNA提取使用购自Qiagen(Germany)的mini,midi和maxi试剂盒，按照生产商的推荐，提取所有来自大肠杆菌的质粒DNA。实验策略按照如下程序进行。用编码病毒外壳蛋白一目标肽插入片段嵌合融合物的表达质粒转化荧光假单胞菌宿主细胞。被转化的细胞生长到期望密度，并被诱导表达病毒外壳蛋白一目标肽插入片段嵌合融合物。然后裂解细胞，并分析其内容物。实施例1-肽合成并克隆到CCMVCP中l.A.保护性抗原的克隆四种不同炭疽杆菌保护性抗原("PA")肽(PA1-PA4)被独立地表达在CCMVVLPs中。通过合成寡核苷酸的SOE(通过重叠延伸拼接)，合成编码PA1-PA4的核酸。用下述热循环程序重叠DNA寡聚物，合成各个插入片段。PCR程序<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>自InvitrogenCorp，Carlsbad，CA，美国，下文称作"Invitrogen，，)生成的核酸含有识别位点末端。编码这些PA肽的核苷序列及其氨基酸序列分别如下1)PA1，SEQIDN0s:3和4;2)PA2，SEQIDNO:5禾口6;3)PA3，SEQIDNO:7禾卩8;4)PA4，SEQIDNO:9和10。生成的核酸用及^HI消化，产生用于克隆到穿梭载体中的粘性末端。将各个生成的PA插入片段在CCMV129CDS的及^m位点上克隆到pESC-CCMV129BamHI穿梭质粒上。各种生成的穿梭质粒用^el和限制性酶消化。各个期望的嵌合CCMV129-PA-编码片段通过凝胶纯化分离。PA1<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>PA2<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>PA3<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>PA4<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>然后，将各个生成的嵌合CCMV129-PA多核苷酸插入到pMYC1803表达质粒中，替代buibui编码序列，可操作地连接tac启动子。用5zel和i7o1限制性消化检测是否存在插入物来对生成的表达质粒进行筛选。1.B.东方马脑炎的E2糖蛋白两种不同EEE肽(EEE-1-25和EEE-238-262)被独立地表达在CCMVVLPs中，表示为东方马脑炎病毒的E2糖蛋白的25个氨基酸肽。EEE-1-25的肽序列DLDTHFTQYKLARPYIADCPNCGHS(SEQ.ID.NO:11)EEE-1-25的核酸序列5'-gacctggacacccacttcacccagtacaagctggcccgcccgtacatcgccgactgcccgaactgcggccacagc-3'(SEQ.ID.NO:12)EEE-238-262的肽序列GRLPRGEGDTFKGKLHVPFVPVKAK(SEQ.ID.NO:13)EEE-238-262的核酸序列5'ggccgcctgccgcgcggcgaaggcgacaccttcaagggcaagctgcacgtgccgttcgtgccggtgaaggccaag-3'(SEQIDNO:14)通过合成寡核苷酸的S0E，合成编码EEE-1-25和EEE-238-262的核酸。生成的核酸中含有I识别位点末端。用于合成插入片段的有义和反义寡核苷酸包括AsMn识别位点，如下EEE1.S:5'-cggggatectggacctggacacccactteacccagtacaagetggcccgeccgtac_3'(SEQIDNO:15)EEE1.AS:5'-cgcaggateccgctgtggccgcagttcgggcagteggcgatgtacgggegggecage_3，(SEQIDNO:16)EEE2.S:5'-cggggatcctgggccgcctgccgcgcggcgaaggcgacacctteaagggcaage-3，(SEQIDNO:17)EEE2.AS:5'-cgcaggatecccttggccttcaccggcacgaacggcacgtgcagettgcccttg-3'(SEQIDNO:18)生成的核酸用消化，产生用于克隆到pESC-CCMV1295a;zHI穿梭载体中的粘性末端。将各个生成的EEE插入片段克隆到pESC-CCMV129^3/dH穿梭质粒中，位于CCMV129CDS的及Min位点上。各个生成的穿梭质粒用和T力oI限制酶消化。各个期望的嵌合CCMV-129-EEE-编码片段通过凝胶纯化分离。然后将各个生成的嵌合CCMV129-EEE多核苷酸片段插入到用5pel和J力。1限制性消化的pMYC1803表达质粒中，替代buibui编码序列，可操作地连接到tac启动子上。用^el和lol限制性消化，检测是否存在插入物，对生成的表达质粒进行筛选。实施例2-重组CCMV衣壳融合肽的表达按照如下程序，将CCMV129融合肽表达质粒转化到荧光假单胞菌MB214宿主细胞中。在持续放置在冰上的冻存管中逐歩解冻宿主细胞。对于各个转化，将1pL纯化的表达质粒DNA添加到宿主细胞中，生成的混合物用移液器吸头轻轻搅动来混合，然后在冰上孵育30分钟。将混合物转移到一次性的电穿孔小槽中(BioRadGenePulserCuvette，0.2cm电极间距，产品目录号为165-2086)。将小槽放置到预设为2000hms，25微法拉，2.25kV的BioradGenePulser中。对细胞进行短暂的脉冲处理(约l-2秒)。然后立即加入冰冷的LB培养液，得到的悬浮液在3(TC下孵育2小时。然后将细胞铺到LBtetl5(添加四环素的LB培养液)琼脂上，在3(TC下生长过夜。从各个平板中挑取一个克隆，将所挑取得样本接种到装在有挡板的摇瓶中的50mLLB种子培养液中。液体悬浮培养物在3(TC下生长过夜，以250rpm摇动。然后将10mL的各个生成的种子培养液接种到带有挡板的1升摇瓶中的200mL摇瓶培养液(即酵母提取物和微量元素、柠檬酸钠和甘油，pH6.8)中。添加四环素，用于筛选。接种培养物在30。C下生长过夜，以250rpm摇动，并用IPTG诱导CCMV129-融合肽嵌合外壳蛋白的表达。然后离心来自各个摇瓶培养物的lmL等量样本，沉淀细胞。将细胞沉淀悬浮在0.75mL冰冷的50mMTris-HC1，pH8.2中，其中含有2mMEDTA。然后加入0.1%体积的10%TritonX-100去始剂，接着加入溶菌酶，到0.2mg/mL的最终浓度。然后细胞在冰上孵育2小时，在此期间会出现清澈粘稠的细胞裂解产物往细胞裂解产物中加入1/200体积的1MMgCl2，接着加入1/200体积的2mg/mLDNAsel，然后在冰上孵育1小时，在此期间，裂解产物变成较不粘稠的液体。4"C下，经过处理的裂解产物在台式离心机中以最大速度离心30分钟，轻轻地将上清液倒到干净试管中。轻轻倒出的上清液是"可溶的"蛋白质部分。将剩余的沉淀悬浮在0.75mLTE缓冲液中(10mMTris-Cl，pH7.5，1mMEDTA)。重新悬浮的沉淀是"不溶的"部分。然后在NuPAGE4-12y。Bis-Tris凝胶(购自Invitrogen，产品目录号为NP0323)中，按照生产商的说明，对这些"可溶的"和"不溶的"部分进行电泳，该凝胶电泳具有l.OmmX15个孔。5ul的各个部分与5ul的2X还原SDS-PAGE加载缓冲液混合，在凝胶上进行电泳之前，沸煮5分钟。凝月交用SimplyBlueSafeStain(购自Invitrogen，产品目录号为LC6060)染色，并用水处理过夜来脱除染色。使用CCMVIgG(登记号为AS0011，购自德国的DSMZ)和WESTERNBREEZE试剂盒(购自Invitrogen,产品目录号为WB7105)，按照生产商的程序，进行Western印迹检测。图1显示重组CCMV衣壳蛋白的表达，宿主细胞被工程化来在不溶部分中表达PA1、PA2、PA3和PA4肽插入片段。重组衣壳融合肽用箭头指示。图2显示重组CCMV融合肽的表达，宿主细胞被工程化来在可溶部分中表达PA1、PA2、PA3和PA4肽插入片段的。实施例3-VLP的重新组装3.A.无RNA的VLP重新组装为了组装病毒样颗粒，50ml表达重组衣壳融合肽的荧光假单胞菌宿主细胞培养物经过French-press处理，通过离心分离可溶部分和不溶部分。不溶的包涵体被洗涤两次。获得来自不溶部分和可溶部分的样本，保存在-8(TC下。4"C下，不溶部分重悬浮在含有8M尿素的缓冲液B(50mMTrispH7.5，1MNaCl，ImMDTT)过夜。以0.25M的梯度增加缓冲液B，将8M尿素稀释到2.0M尿素的最终浓度。添加聚乙亚胺(PEI)到0.033。/。的最终浓度，溶液在冰上孵育10分钟。用缓冲液B透析上清液过夜(更换缓冲液3次)，以完全去除尿素。以27，000xg速度离心上清液30分钟。为了确定重组CCMV衣壳融合肽的最终产量，通过280nm下的吸收值来分析上清液，对于游离的衣壳蛋白，使用1.20的消光系数，确定溶液中的衣壳融合蛋白的含量。4。C下，用空组装缓冲液(EmptyAssemblyBuffer)(50mM乙酸钠pH5.2，1MNaCl，ImMEDTA，ImMDTT)透析溶于缓冲液B中的10uM衣壳融合肽溶液(每4mL有1mg衣壳融合肽)2小时。使用Centricon-100微量集中器(microconcentrator)，用空组装缓冲液洗涤所组装的颗粒。通过280nm下的吸收值来测定含有所组装的VLPs的样本保留物，确定VLP产量。将样本的一部分加载到蔗糖梯度中，确定VLP的组装，剩余部分在病毒缓冲液(O.1M乙酸钠，pH.5.2)中浓縮，并在SDS-PAGE上进行电泳。3.B有RNA的VLP组装为了组装病毒样颗粒，对50ml表达重组衣壳融合肽到荧光假单胞菌宿主细胞的培养物进行French-press处理，通过离心分离可溶部分和不溶部分。不溶的包涵体被洗涤两次。获取来自可溶部分和不溶部分的样本，并在-8(TC下保存。4'C下，不溶部分在含有8M尿素的缓冲液B(50mMTrispH7.5，1MNaCl，ImMDTT)重新悬浮过夜。以0.25M的梯度增加缓冲液B，将8M尿素稀释到2.0M尿素的最终浓度。添加聚乙亚胺(PEI)到0.033%的最终浓度，溶液在冰上孵育10分钟。以27，OOOxg的速度离心上清液30分钟。用缓冲液B透析上清液过夜(更换缓冲液3次)，以完全去除尿素。为了确定重组CCMV衣壳融合肽的最终产量，通过280nm下的吸收值来分析上清液，对于游离的衣壳蛋白，使用1.20的消光系数，确定溶液中的衣壳融合蛋白的含量。重量比为5:1的衣壳融合肽和CCMVRNA用于组装。RNA的来源是体外转录的CCMVRNA1，RNA2，RNA3，或者亚基因组RNA4或者它们的任何部分。可替代地，从感染了CCMV的植物中分离的CCMV病毒的RNA或者体外或者体内生产的雀麦花叶病毒的RNA都可被使用。可替代地，分离自一种生物体如植物或荧光假单胞菌的随机mRNA可被使用。衣壳融合肽的浓度为10uM(4ml中有lmg)。4。C下，10uM衣壳融合肽和RNA溶液用组装缓冲液(50mMTris-HClpH7.2，50mMNaCl，10mMKC1，5raMMgCl2，lmMDTT)透析2—12小时。使用Centricon-lOO微量集中器，得到的组装颗粒用组装缓冲液洗涤。取出一部分样本剩余物，通过280nm下的吸收值进行测量，确定VLP的产量。将一部分剩余物加载到蔗糖梯度上，确定VLP组装，剩余部分在病毒缓冲液(O.1M乙酸钠，pH.5.2)中浓縮，并在SDS-PAGE上进行电泳。图3显示在蔗糖密度梯度中分离有RNA的和无脂A的CCMV-PA3VLPs。图4显示分离自蔗糖密度梯度的有RNA的和无RNA的CCMV-PA1和CCMV-PA2VLP的SDS-PAGE凝胶电泳条带。图5显示不存在RNA时，由CCMV-PA4衣壳融合肽重新组装的VLPs的电子显微分析。实施例4-含有多种重组CCMV-衣壳融合肽的VLPs的重新组装含有来自相同或不同病原体因子的抗原性肽的重组CCMV衣壳融合肽(如实施例1所述)以包涵体的形式在荧光假单胞菌中生成。分离包涵体，各种重组CCMV-衣壳融合肽如实施例3所述裂解和重新折叠。组装前，含有来自相同或不同病原体因子的抗原性插入片段的CCMV-衣壳融合肽的各种组合以各种比例混合。如实施例3所述，可以在存在或不存在RNA时进行重新组装反应。生成的多价VLPs含有多个含有不同抗原性插入片段的重组CCMV-衣壳融合肽群体。在组装反应之前，调节加入到混合物中的各个含有不同抗原性肽插入片段的重组CCMV-衣壳融合肽群体的含量，以调节抗原性肽的比例。图6显示多价VLPs的表达和重新组装的流程图，该多价VLPs由含有保护性抗原3("PA-3")和PA-4的抗原性肽的各个重组CCMV-衣壳融合肽组成。实施例5-在植物中生产CCMV病毒颗粒，植物生产的CCMV病毒颗粒的分解，以及植物CCMV衣壳蛋白重新组装成VLPs在植物中生产CCMV病毒颗粒CCMVRNA1、RNA2和RNA3的混合物用于感染虹豆。使豆工豆禾中子CowpeaCaliforniaBlackeye#5禾中子(Ferry-MorseSeedCo.KY)发芽，并移植到装有Miracle-Gro培养土(pottingmix)的6英寸小罐中(Miracle-GroLawnProductsOH)。在双叶期(萌芽后约7天)感染豇豆植物。将金刚砂粉末400粗砂(Adustingofcarborundumpowder400grit)(FisherScientific,产品目录号为409-21-2)喷洒到各棵植物的一片叶子上。将RNA混合物应用到金刚砂上。用戴手套的手指轻轻磨擦叶片。在接种后7-14天产生感染。收集叶片组织，并在-8(TC下冷冻直到进一步处理。加入到病毒缓冲液(0.2M乙酸钠pH5.2;10mMEDTA.0)来破坏叶片组织。得到的匀浆通过三层稀纱布，然后在4。C下，以15，OOOxG的速度离心15分钟。去除生成的上清液。往各个上清液中加入PEG8000，最终浓度为10%，溶液在冰上孵育1小时或者在4r下孵育过夜。然后，4'C下，以15，000xG的速度离心溶液10分钟。然后，将沉淀重新悬浮在1/10最初上清液体积的病毒缓冲液中，4卩下，以15，000xG的速度离心重新悬浮的样本10分钟。回收上清液，并进行第二轮的PEG沉淀。加入PEG8000到15%的最终浓度，4r下搅拌2小时。然后，以15，000xG的速度离心溶液10分钟，将沉淀重新悬浮在少量病毒缓冲液中。将重新悬浮的VLP溶液添加到分子量截留量为300K的CentriconPlus-20中，并以4，000xG的速度离心5分钟。然后通过SDS-PAGE分析浓縮的VLP样本，并用抗CCMV的多克隆抗体进行western印迹。可替代地，在蔗糖密度梯度中纯化病毒颗粒。纯化的病毒颗粒通过大小排阻层析(SEC)-HPLC进行分析(图8)。植物生产的CCMV病毒颗粒的分解4。C下，用缓冲液A(50mMTrisHC1pH7.5，500mMCaCl"lmMDTT，0.2mMPMSF)透析16—29小时来分解纯化的CCMV。4。C下，以14，000rpm的速度离心15分钟，离心所分解的病毒，沉淀病毒RNA。4。C下，剩余的上清液用缓冲液B(200mMTrisHC1pH7.5，1MNaCl，lmMDTT，0.2mMPMSF)透析2小时。CCMV被分解成衣壳蛋白二聚体，用FPLCSuperose12大小排阻层析进一步纯化。通过SEC-HPLC分析被分解的CCMV(图8)。CCMVVLPs的组装4'C下，用低盐的组装缓冲液(100mM乙酸钠pH4.8，100mMNaCl，0.2mMPMSF)透析纯化的二聚体过夜来组装CCMVVLPs。通过SEC-HPLC分析重新组装的CCMVVLPs(图8)。实施例6-在各种生物体中生产的VLPs的分解和重新组装先前体外或体内组装的CCMV颗粒含有来自相同或不同病原体因子的各种抗原性插入片段，可以各自在植物和/或荧光假单胞菌中生产。可以在体外分离和分解所组装的VLP颗粒。生成的CCMV-衣壳融合肽含有来自相同或不同病原体因子的抗原性肽，这些融合肽以预定的比例混合，随后如实施例3所述，在存在或缺少RNA时重新组装。生成的多价VLPi由各种重组CCMV-衣壳融合肽组成并且含有多种插入片段。可以在进行组装反应之前调节加入到混合物中的各种含有不同抗原性肽插入片段的重组CCMV-衣壳融合肽群体的含量，来调节抗原性肽的比例。组装前，也可以将野生型衣壳蛋白添加到重新组装混合物中。实施例7-存在CpG时的VLP重新组装如图7所示，存在CpG时可以进行组装反应。生成的多价VLPs由各种重组CCMV-衣壳融合肽组成并含有多种插入片段，进一步将CpG包囊在颗粒中。CpGs作为粘膜佐剂，能够诱导抗共同施用的抗原的Thl免疫反应。用VLPs包囊CpG序列的优点包括降低给药剂量，降低共同施用CpG的副作用，提高CpG和VLP的稳定性。图7显示在组装反应过程中，将CpGs包装到VLPs中。植物生产的CCMV如实施例5所述被分解。缓冲液B中的被分解的CCMV二聚体(0.5mg/ml)与CpG寡核苷酸(120nmol/ml)混合。使用标准寡核苷酸和具有DNase保护骨架的寡核苷酸(IntegratedDNATechnologies,Coralville，IA)。CpG寡核苷酸序列是5，TCCATGACGTTCCTGACGTT3，(SEQIDNO:23)。如实施例3B所述，溶液用组装缓冲液(50mMTris-HClpH7.2，50mMNaCl，10mMKC1，5mMMgCl2，lmMDTT)在4。C下透析2—12小时。使用Centricon-100微集中器，用组装缓冲液洗涤得到的组装颗粒两次，将缓冲液换成病毒缓冲液(O.1M乙酸钠，pH.5.2)。样本在SEC-HPLC上进行电泳(图9)。结果表明，在存在标准寡核苷酸时和在存在具有DNase保护骨架的寡核苷酸时，二聚体都组装到VLPs中。进一步在0.8-1.2%琼脂糖凝胶上分析样本。琼脂糖凝胶用EtBr染色来检测是否存在CpG寡核苷酸，接着通过蛋白质染色来检测是否存在CCMVCP(图10)。结果证实，重新组装的VLPs将CpGs包囊中颗粒中。泳道l是分子量标记，泳道2显示包囊了标准CpGs的CCMVVLP样本，泳道3显示包囊了含有DNase保护骨架的CpGs的CCMVVLP样本。权利要求1、用于生产多价病毒样颗粒的方法，包括a)体外混合i)至少一个第一种病毒衣壳融合肽包括至少一种抗原性肽插入片段；和，ii)至少一个第二种病毒衣壳融合肽包括至少一种抗原性肽插入片段，其中至少一个第二种病毒衣壳融合肽包括至少一种不存在于第一种病毒衣壳融合肽中的抗原性肽插入片段；和b)组装该至少一个第一种病毒的衣壳融合肽和该至少一个第二种病毒的衣壳融合肽，形成至少一种多价病毒样颗粒，其中该多价病毒样颗粒缺少全长的感染性病毒核酸。2、按照权利要求l的方法，其中在纯化布骤后，进行该至少一个第一种病毒衣壳融合肽和该至少一个第二种病毒衣壳融合肽的组装。3、按照权利要求1的方法，其中该第一种病毒衣'壳融合肽和该第二种病毒衣壳融合肽的病毒衣壳来自相同的病毒分类成员或者来自不同的病毒分类成员。4、权利要求1的方法，其中该第一种和/或第二种病毒的衣壳融合肽的病毒衣壳来自二十面体病毒的氨基酸序列。5、权利要求4的方法，其中该二十面体病毒是豇豆褪绿斑驳病毒。6、权利要求1的方法，其中第一种和第二种病毒衣壳融合肽的抗原性肽插入片段包括来自病原体因子的抗原性肽插入片段。7、权利要求6的方法，其中该第一种衣壳融合肽和该第二种衣壳融合肽的抗原性肽插入片段来自相同或不同病原体因子。8、权利要求1的方法，其中该病毒样颗粒缺少病毒的核酸。9、权利要求1的方法，其中该第一种和/或第二种病毒的衣壳融合肽来自先前在体内生成的病毒或病毒样颗粒。10、用于生产多价病毒样颗粒的方法，包括a)体外混合i)至少一个第一种包括至少一种抗原性肽插入片段的病毒衣壳融合肽，ii)至少一个第二种包含至少一种抗原性肽插入片段的病毒衣壳融合肽，其中该至少一个第二种病毒衣壳融合肽包括至少一种不存在于第一种病毒衣壳融合肽中的抗原性肽插入片段；和iii)至少一种免疫刺激核酸，其中该免疫刺激核酸序列是CpG寡核苷酸序列；和b)组装该至少一个第一种病毒衣壳融合肽，该至少一个第二种病毒衣壳融合肽和免疫刺激核酸，形成至少一种多价病毒样颗粒，其中该多价病毒样颗粒缺少全长的感染性病毒核酸。11、权利要求10的方法，其中该CpG寡核苷酸序列是AACGTTCG(SEQIDNO:24)。12、权利要求10的方法，其中该第一种病毒衣壳融合肽和该第二种病毒的衣壳融合肽的病毒衣壳来自相同的病毒分类成员或不同的分类成员。13、权利要求10的方法，其中该第一种和/或第二种病毒的衣壳融合肽的病毒衣壳来自二十面体病毒的氨基酸序列。14、权利要求13的方法，其中该二十面体病毒是豇豆褪绿斑驳病毒。15、权利要求10的方法，其中该第一种和第二种病毒衣壳融合肽的抗原性肽插入片段包括来自病原体因子的抗原性肽插入片段。16、权利要求15的方法，其中该第一种衣壳融合肽和该第二种衣壳融合肽包括来自相同或不同病原体因子的抗原性肽插入片段。17、用于生产多价病毒样颗粒的方法，包括a)提供i)至少一个包括至少一个第一种衣壳融合肽的第一种病毒样颗粒，其衣壳融合肽包括至少一种抗原性肽插入片段；和，ii)至少一个包括至少一个第二种衣壳融合肽的第二种病毒样颗粒，其第二种衣壳融合肽包括至少一种抗原性肽插入片段；b)分解i)该第一种病毒样颗粒提供至少一种分离的第一种病毒衣壳融合肽，该病毒衣壳融合肽包括至少一种抗原性肽插入片段；禾口，ii)该第二种病毒样颗粒提供至少一种分离的第二种衣壳融合肽，该衣壳融合肽包括至少一种抗原性肽插入片段，其中该至少一个第二种病毒衣壳融合肽包括至少一种不存在于该第一种病毒衣壳融合肽中的抗原性肽插入片段；和c)体外混合i)该至少一个第一种病毒衣壳融合肽；和ii)该至少一个第二种病毒衣壳融合肽；和d)组装该至少一个第一种病毒衣壳融合肽和该至少一个第二种病毒衣壳融合肽，形成至少一种多价病毒样颗粒，其中该多价病毒样颗粒缺少全长的感染性病毒核酸。18、权利要求17的方法，其中该第一种病毒衣壳融合肽和该第二种病毒衣壳融合肽的病毒衣壳来自相同或不同的病毒分类成员。19、权利要求17的方法，其中该第一种病毒的和/或第二种衣壳融合肽的病毒衣壳来自二十面体病毒的氨基酸序列。20、权利要求19的方法，其中该二十面体病毒是豇豆褪绿斑驳病毒。21、权利要求17的方法，其中该第一种和第二种病毒衣壳融合肽的抗原性肽插入片段包括来自病原体因子的抗原性肽插入片段。22、权利要求17的方法，其中该第一种衣壳融合肽和该第二种衣壳融合肽包括来自相同或不同病原体因子的抗原性肽插入片段。23、权利要求17的方法，其中该第一种和/或第二种衣壳融合肽来自荧光假单胞菌的表达。24、按照权利要求17的方法，还包括体外混合，iii)至少一种免疫刺激核酸序列，其中该免疫剌激序列是CpG寡核苷酸序列。25、按照权利要求24的方法，其中CpG寡核苷酸序列是AACGTTCG(SEQIDNO:24)。26、一种多价病毒样颗粒，包括i)至少一个包括至少一种抗原性肽插入片段的第一种豇豆褪绿斑驳病毒衣壳融合肽；和，ii)至少一个包括至少一种抗原性肽插入片段的第二种豇豆褪绿斑驳病毒衣壳融合肽，其中至少一个第二种病毒衣壳融合肽包括至少一种不存在于第一种病毒衣壳融合肽中的抗原性肽插入片段；和其中该多价病毒样颗粒缺少全长的感染性病毒核酸。27、权利要求26的多价病毒样颗粒，其中该第一种衣壳融合肽和该第二种衣壳融合肽包括抗原性肽插入片段，其中该抗原性肽插入片段来自相同或不同的病原体因子。28、权利要求26的多价病毒样颗粒，其中该生成的多价病毒样颗粒缺少病毒的核酸。29、权利要求26的多价病毒样颗粒，其中该病毒样颗粒包括CpG寡核苷酸序列。30、权利要求26的多价病毒样颗粒，其中CpG寡核苷酸序列包括AACGTTCG(SEQIDNO:24)。31、一种提高多价病毒样颗粒溶解度的方法，包括体外混合，至少一个包括至少一种抗原性肽插入片段的第一种病毒衣壳融合肽，和至少一个包括至少一种抗原性肽插入片段的第二种病毒衣壳融合肽，其中至少一个第二种病毒衣壳融合肽包括至少一种不存在于第一种病毒衣壳融合肽中的抗原性肽插入片段，和组装至少一个第一种病毒衣壳融合肽和至少一个第二种病毒衣壳融合肽，形成至少一种多价病毒样颗粒，其中生成的多价病毒样颗粒缺少全长的感染性病毒核酸。32、一种疫苗，其包含权利要求1的多价病毒样颗粒。全文摘要本发明涉及生产和在体外将重组病毒衣壳蛋白组装到病毒样颗粒中。特别地，本发明提供快速的、可扩展的并符合成本效益的生产多价病毒样颗粒的方法，该方法使用了含有不同抗原性肽插入片段的衣壳融合肽的分离群体，这些衣壳融合肽在体外组合以生产多价病毒样颗粒。按照本发明生产的病毒样颗粒可用于在人或动物中诱导免疫反应。文档编号A61K39/12GK101287489SQ200680019623公开日2008年10月15日申请日期2006年6月1日优先权日2005年6月1日发明者J·费尔普斯,L·拉索霍娃,P·P·道申请人:陶氏环球技术公司