治疗传染病加剧性哮喘的方法

专利名称：：治疗传染病加剧性哮喘的方法
技术领域：
：本发明一般涉及使用免疫刺激寡核苷酸及其组合物治疗因传染病加剧的哞喘的方法。
背景技术：
：细菌DNA具有激活B细胞和自然杀伤细胞的免疫刺激效应，但是脊推动物DNA却没有(Tokunaga，T.等，1988./79:682-686;Tokunaga，T.等，1984，/7VC772:955-962;Messina，J.P.等，1991，//附柳"朋/.147:1759-1764;及Krieg，1998在《应用寡核苷酸技术》中的综述；CA.Stein和A.M.Krieg编，JohnWileyandSons,Inc.,NewYork,NY,431-448页)。现已明晓，细菌DNA的这些免疫刺激效应是在特殊的碱基环境(CpG基序)中存在非甲基化CpG二核苷酸的结果，CpG基序在细菌DNA中普遍存在，但是在脊稚动物DNA中却被甲基化且不具有代表性(Krieg等，1995Nature374:546-549;Krieg,1999Biochim.Biophys.Acta93321:1-10)。细菌DNA的免疫刺激效应能用包含这些CpG基序的合成寡脱氧核苷酸(ODN)模拟。此类CpGODN对于人类和小鼠淋巴细胞有高度刺激效应，诱导B细胞增殖、细胞因子和免疫球蛋白分泌、自然杀伤(NK)细胞溶解活性和IFN-y分泌、激活树突细胞(DC)和其他抗原提呈细胞表达共刺激分子并分泌细胞因子，特别是对促进Thl样T细胞应答的发展至关重要的Thl样细胞因子。CpGODN天然磷酸二酯骨架的这些免疫刺激效应是高度CpG特异性的，因为若CpG基序经曱基化、变成GpC、或以其他方式消除或改变之后，则这种效应显著降低(Krieg等1995Nature374:546-549;Hartmann等1999Proc.Natl.Acad.SciUSA96:9305-10)。早期研究认为，免疫刺激CpG基序遵循的通式为噪呤-嘌呤-CpG-嘧啶陽嘧啶(Krieg等1995Nature374:546-549;Pisetsky，1996J.Immunol.156:421-423;Hacker等，1998EMBOJ.17:6230-6240;Lipford等，1998TrendsinMicrobiol.6:496-500)。但现已明晓，小鼠淋巴细胞能很好地应答不符合此"通式"的磷酸二酯CpG基序(Yi等，1998J.Immunol.160:5898-5卯6),并且人B细胞和树突细胞也是如此(Hartmann等，1999Proc.Natl.Acad.SciUSA96:9305-10;Liang,1996丄Clin.Invest.98:1119-1129)。最近已描述了几类不同的CpG寡核苷酸。一类有效激活B细胞，但诱导IFN-a和NK细胞活化的能力相对较弱，已将该类定义为B类。B类CpG寡核苷酸通常为完全稳定的，且在某些优选的碱基环境中包含非甲基化的CpG二核苷酸，参见如美国专利号6,194,388;6,207,646;6,214,806;6,218,371;6,239,116及6,339,068。另一类CpG寡核苷酸激活B细胞和NK细胞且诱导IFN-a,已将该类定义为C类。C类CpG寡核苷酸，正如最初所表征的那样，通常是完全稳定的，包括B类型序列和富含GC的回文结构或近似回文结构。在2001年8月17日递交的共同未决美国临时专利申请60/313,273和2002年8月19日递交的US10/224，523以及以国际公开号WO03/015711公开的相关PCT专利申请PCT/US02/26468中已对该类进行了描述。发明概述在此已发现CpG寡核苷酸(CpGODN)在抗感染特别是引起哮喘加剧的上呼吸道病毒感染中特别有效。在本发明的某些方面，C类CpGODN对于实施所述方法特别有效。如下面的实施例所示，C类CpGODN在小鼠中诱导了一组IFN相关基因，包括那些抗病毒蛋白质，并针对抗原和病毒接触组合所加剧的气道炎症进行保护。本发明有些方面涉及用于治疗病毒加剧性哞喘的方法，通过对津喘个体施用有效量的C类CpG寡核苷酸用于治疗病毒加剧性哞喘。本发明其他方面涉及用于治疗病毒加剧性哮喘的方法，通过鉴定处于病毒感染风险下的哞喘个体并对该哮喘个体施用有效量的CpG寡核苷酸来治疗病毒加剧性哞喘。所述个体可以由医务工作者鉴定。在其他实施方案中，个体基于接触病毒感染的风险因素而鉴定。根据其他方面，本发明是用于治疗病毒加剧性哮喘的方法，通过对进行非CpG哮喘治疗的哞喘个体施用有效量的CpG寡核苷酸来治疗病毒加剧性哮喘。非CpG哞喘治疗可以是类固醇治疗。在一些实施方案中，非CpG哮喘治疗和CpG寡核苷酸在不同的时间施用。在其他实施方案中，非CpG哮喘治疗和CpG寡核苷酸在相同的时间施用。根据本发明其他方面还提供了用于治疗传染病加剧性译喘的方法，通过鉴定哞喘个体的感染风险并对该哞喘个体施用有效量的CpG寡核苷酸用于治疗传染病加剧性哞喘。本发明另一方面是用于治疗病毒加剧性哞喘的方法，通过鉴定病毒感染的风险因素并在津喘个体处于病毒感染的风险期间对译喘个体施用有效量的CpG寡核苷酸来治疗病毒加剧性哞喘。在一些实施方案中，风险因素是流感季节。在其他的实施方案中风险因素是到病毒接触高风险目的地旅行。在一些实施方案中，病毒加剧性哮喘由于呼吸道病毒引起。任选地，呼吸道病毒不是RSV。在其他的实施方案中病毒加剧性哮喘由流感病毒引起。在一些实施方案中的CpG寡核苷酸是C类寡核苷酸。该C类寡核普酸可以任选是半软寡核苷酸，例如，举例为SEQIDNO:10。还提供了用于治疗病毒加剧性哮喘的方法，通过鉴定处于病毒感染风险中的哮喘个体，并对该个体施用亚治疗量的CpG寡核苷酸用来治疗病毒感染，其中CpG寡核苷酸有效降低免疫细胞的累积。免疫细胞可以是例如中性粒细胞或嗜曙红细胞。本发明其他方面是用于治疗病毒加剧性哮喘的方法，通过鉴定处于病毒感染风险的嗜喘个体，并对该哮喘个体施用至少三个剂量的CpG寡核苷酸，其中至少三个剂量的CpG寡核苷酸在时间上彼此至少间隔三天。在一些实施方案中，剂量间彼此间隔l周、2周、3周、l月、l年或其间的任意整数值。使用本发明的寡核苷酸用于刺激免疫应答和(或)治疗病毒加剧性哮喘也提供作为本发明的一方面。还提供了用于制备本发明中用来刺激免疫应答和(或)治疗病毒加剧性哞喘的寡核苷酸药物的方法。本发明的每种限定可以包括本发明的多个实施方案。因此，可预期的是，本发明包含任意一个要素或要素组合的每种限定可以包括在本发明每个方面。本发明在应用上不受限于在下面说明书中阐释或附图中阐明的解释细节和组分安排。本发明能够用于其他实施方案，并能以多种方式实施或实现。此外，在此使用的措辞和术语是用于描述目的，不应看作限制。在此使用的"包括"、"包含"或"具有"、"含有"、"包括有，，及其变体形式，意在嚢括其后列举的条目和其等同物还有增列项目。附图的简短说明附图只是举例说明性的，并不是实施在此公开的本发明所必需的。图l是简短研究方案的示意图，显示在实施例l和2中执行的一些实验条件。图2是详细研究方案的示意图，显示实施例1(#3)中执行的实验条件。图3是系列图表，描述了IFN-a(图3a)、IFN-y(图3b)和IP-10(图3c)的诱导，而第二系列的图表描述了小鼠肺中2'5，-寡腺苷酸合成酶(图3d)、Mxl(图3e)和吲哚胺2,3-双加氧酶(图3f)的上调。X轴表示每kg小鼠的寡核苷酸照数。Y轴表示细胞因子(pg/ml)(图3a-3c)或RNA量(与GAPDHRNA的比值)(图3d-3f)。图4a是图表，描述了小鼠肺中的病毒核蛋白滴度。X轴表示每kg小鼠(感染或未感染)的寡核苷酸jig数。Y轴表示吸光度。图4b和4c是图表，分别显示了支气管肺泡灌洗液中存在的中性粒细胞和单核细胞。X轴表示每kg小鼠(感染或未感染)的寡核苷酸jig数，而y轴表示细胞数(x103/ml)。图5是系列图表，描述了抗原刺激以及病毒感染的小鼠支气管肺泡灌洗液中响应于处理而累积的总细胞，包括总白细胞(图5a)、中性粒细胞(图5b)和单核细胞(图5c)。x轴表示小鼠的刺激类别，y轴表示细胞数(x106/ml(5a)或xl03/ml(5b和5c))。图6a是图表，描述了乙酰甲胆碱诱导的气道阻力增加。X轴表示乙酰甲胆碱的mg/ml数，y轴表示气道阻力(未刺激对照的百分比)。图6b显示了基线气道阻力。图6c显示了乙酰甲胆碱剂量应答曲线下面积。结果表示为平均值±标准误(11=7-9)。*与所示组比较P0.05(Mann-Whitney双尾检验)。图7是系列图表，描述了响应于治疗的累积总细胞，包括总白细胞(图7a)、嗜曙红细胞(图7b)、中性粒细胞(图7c)和单核细胞(图7d)还有小鼠体重(图7e)。x轴表示小鼠刺激类别。图8是系列图表,说明了小鼠气道内TLR9相关细胞因子的体内诱导。图8a显示IFNa，图8b显示IFNp图8c显示IP-10,图8d显示IL-6，而图8e显示IL-12p40。结果表示为平均值±标准误(11=10)。x轴表示每kg小鼠的寡核苷酸ng数，y轴表示细胞因子浓度(pg/ml)。图9是系列图表，说明了细胞因子的离体诱导。图9a显示IL-5，图9b显示IL-13，而图9c显示IFIV/。结果表示为平均值士标准误(i^7-8)。A与载体处理组相比PO.05(Kruskal-Wallis检验，接以Dunn，s检验用于多重比较)。x轴表示每kg小鼠的寡核苷酸网数，y轴表示细胞因子浓度(pg/ml)。图IO是两个图表，显示SEQIDNO:10对于小鼠气道中抗原诱导嗜曙红细胞和白细胞累积的体内抑制。图10a显示IgE产生，图10b显示IgG2a产生。结果表示为平均值±标准误(11=9-10)。*与载体处理组相比P<0,05(Kruskal-Wallis检验，接以Dunn，s检验用于多重比较)。x轴表示每kg小鼠(致敏或未致敏)的寡核苷酸ng数，y轴表示作为血清抗体滴度度量的吸光单位。图ll是四个图表，i兌明在施用SEQIDNO:IO后小鼠气道内嗜曙红细胞和淋巴细胞的体内累积。图lla显示存在的总白细胞，图llb显示嗜曙红细胞，图lie显示CD4阳性T细胞，而图lid显示B细胞。结果表示为平均值±标准误(11=6)。A与载体处理组相比PO.O5(Kruskal-Wallis检验，接以Dunn's检验用于多重比较)。x轴表示每kg小鼠(致敏或未致敏)的寡核香酸jig数，y轴表示细胞数。发明详述Toll样受体9(TLR9)允许离散的免疫细胞群识别非甲基化CpG寡脱氧核香酸或寡核苷酸(CpGODN)并激活宿主防卫机制并启动免疫作用，导致抑制Th2型反应。已经在结构和活性特征基础上描述了不同类的CpGODN。C类CpGODN—般具有5，末端刺激序列，含有至少一个CpG基序以及富含GC的回文结构。C类CpGODN从免疫细胞中诱导很高滴度的干扰素a(IFNa)。根据本发明的一些方面，已发现C类CpGODN具有特殊价值，可作为用于上呼吸道感染优选病毒感染(因其加剧过敏性哮喘)的新治疗手段。在下面实施例中显示的数据已说明当向小鼠气道给药C类CpGODN时，能够诱导已知具有免疫修饰和/或抗病毒活性的IFN相关基因。特别是，已知2，5，-寡腺苷酸合成酶和Mxl(MxA的小鼠同源物)具有显著抗病毒活性。在我们的小鼠模型中，C类CpGODN显示了针对流感病毒感染的保护作用，并抑制了抗原刺激和流感病毒感染组合诱发加剧的气道炎症。因此，本发明某些方面涉及用于治疗传染病加剧性哮喘、特别是病毒加剧性哮喘的方法。细菌、病毒和真菌感染能加剧和/或诱发哮喘。传染病加剧性哮喘是发生在哮喘个体中的一种病征。哞喘个体是已经诊断为患有哮喘或者是哞喘易感的个体，当接触感染因子时经历哮喘反应，或者既有/正发生的哞喘发作恶化。因此，本发明一方面包括发现CpG免疫刺激寡核苷酸能有效治疗传染病加剧性哞喘。在一些实施方案中，个体处于病毒感染风险中。处于病毒感染风险的个体是具有接触导致感染的病原的任何风险的个体。例如，处于风险的个体可以是计划去发现有特殊类型传染因子的地区旅游的人，也可以是因生活方式或医学方法而接触可能含传染性生物的体液或直接接触该生物的个体，或者甚至是居住于经鉴定有传染性生物或过敏原的地区的任何个体。处于感染发展风险的个体还包括医疗机构对之推荐以特殊传染性生物抗原接种疫苗的一般群体。可以用多种方式来鉴定处于病毒感染的风险的个体，例如通过医学工作者鉴定。医学工作者包括医生、护士、技师和医疗领域的任何其他从业者。还可以基于接触病毒感染的风险因素来鉴定处于病毒感染风险中的个体。在本发明的多个方面，鉴定病毒感染风险因素的方法旨在治疗预期会接触病毒因子或季节(例如预期处于流感和伤风季节)的个体。此类季节时令通常是公知的，且更具体地以年为基础进行确定。患有感染的个体是已经接触传染性病原并在体内具有急性或慢性可检测水平病原的个体。在此使用的传染性疾病是因体内存在外源微生物而引起的疾病。处于哮喘发展风险中的个体包括那些已经被鉴定患有哮喘但在CpG免疫刺激寡核苷酸治疗期间还没有活跃疾病的个体，以及因为遗传或环境因素认为其处在这些疾病发展风险中的个体。在哮喘个体气道中，Th2细胞因子，特别是IL-4和IL-5升高。这些细胞因子促进哮喘炎症反应的重要方面，包括IgE同种型转换、嗜曙红细胞趋化性和激活，以及肥大细胞生长。Thl细胞因子，特别是IFN^和IL-12能抑制Th2克隆的形成以及Th2细胞因子的产生。哮喘意指呼吸系统的紊乱，表征为炎症、气道狭窄及气道对于吸入因子的反应性增强。哮喘通常，尽管不唯一地与遗传性过敏症或过敏症相关。个体可以指人或脊推动物，包括但不限于狗、猫、马、牛、猪、绵羊、山羊、火鸡、鸡、灵长类如猴子、以及鱼类(水产物种)如鲑鱼。在此使用的术语治疗、治疗的，当用在诸如传染病或哞喘的紊乱时，意指增强个体对于疾病发展(如对于病原体感染)的抗性、或换句话说降低个体疾病发展(如被病原体感染)的可能性的预防性治疗，也指在个体已经罹患疾病后的治疗，以便对抗疾病(如减轻或消除感染)或防止疾病变得恶化。已在人体发现的病毒的实例包括但不限于逆转录病毒科(i^,/YmV7V/^)(如人免疫缺陷病毒，如HIV-I,也称为HDTV-III、LAVE或HTLV-III/LAV或HIV-III,及其他分离抹如HIV-LP);微小RNA病毒科(/^orfmWwV/"e)(如脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒、肠道病毒、人柯萨奇病毒、鼻病毒、埃可病毒)；卡利希病毒科(Oz/dwV7V/^)(如导致胃肠炎的林系)；披膜病毒科(7bgflv/nW^)(如马脑炎病毒、风渗病毒)；黄病毒科0F/ffWW^e)(如登革病毒、脑炎病毒、黄热病毒)；冠状病毒科(0/wfoW/7V/^)(如冠状病毒)；弹状病毒科(i^fl6flfoWm^e)(如疱渗性口腔炎病毒、狂犬病毒)；丝状病毒科(WtoWW^^)(如埃博拉病毒)；副粘病毒科(/^/*"/^:^^>/^^)(如副流感病毒、流行性腮腺炎病毒、麻渗病毒、呼吸道合胞病毒)；正粘病毒科(Or幼o附j;A^WnV/M)(如流感病毒)；布尼亚病毒科(5wrtgflW〃V/ae)(如汉坦病毒、bunga病毒、白蛉病毒和内罗病毒)；沙粒病毒科(^""flvZ/7V/fle)(出血热病毒)；呼肠孤病毒科(iv/"V/"e)(如呼肠孤病毒、呼肠孤病毒和轮状病毒)；双RNA病毒科(5/rwflWW^ie);嗜肝DNA病毒科(/Te/7fw/"flfWf7V/fle)(乙肝病毒)；细小病毒科(尸fln^v/W^i)(细小病毒)；乳多空病毒科(Pa/wvflv/W曲e)(乳头瘤病毒、多形瘤病毒)；腺病毒科(yUewov/z7V/"e)(多数腺病毒)；疱渗病毒科(/7e/77esWnV/fle)(单纯疱渗病毒(HSV)1和2、水痘-带状疱瘆病毒、巨细胞病毒(CMV)、疱瘆病毒)；痘病毒科(i\:v//7W"e)(天花病毒、痘苗病毒、痘病毒)；和虹彩病毒科(/nV^v/nVfae)(如非洲猪热病毒)；以及未分类病毒(如丁型肝炎病毒因子，据认为是乙肝病毒的缺陷型卫星)；非甲非乙肝炎病毒因子(l类=肠内传播，2类=胃肠外传播(即丙肝)；诺沃克及相关病毒以及星状病毒。革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌都可以在脊推动物中作为抗原。此类革兰氏阳性细菌包括但不限于巴氏杆菌属物种、葡萄球菌属(5te/7/^/ococc/)物种和链球菌属CS^印toc0cc"s)物种o革兰氏阴性细菌包括但不限于大肠杆菌、假单胞菌属CPwmfo附omw)物种和沙门氏菌属0^/附0/^//")物种。传染性细菌的特别实施例包括但不限于幽门螺杆菌(/^//C0^ICter/J^to/W)、伯氏逸乾螺3走体(56>"//"6w^/0^/e/7)、嗜肺军团菌pwew/wop/r///fl)、分斗支杆菌属物种(iW);coAacten."(如结核分斗支杆菌(M".似^rcw/^&)、鸟分枝杆菌(M.flv/"/M)、胞内分枝杆菌(M^^mce//Mtofe)、堪萨斯分枝杆菌(Af.A:flfis似7)、戈氏分枝杆菌(M:gor甴w"e))、金黄色葡萄球菌((S鄉/f卢cocc"s"M,e"51)、淋病奈瑟菌(A^/Mer/flgo"orr/^efle)、脑膜炎奈瑟菌(A^sseWfl/wemVig/&Vfc)、单核细胞增生李斯特氏菌(丄Z他r/fl附o朋qvtogewes)、化腺性链球菌(5^c/7tococc"s1/y;og^ies1)(A群链J求菌)、无乳链球菌(&r印tococc"s"gfl/fl"/"e)(B群链球菌)、链球菌(草纟录色群)、粪链球菌OS^/7toC0CC附/fl^Cfl//51)、牛链球菌(iS^/7,OCOCC"5"Z^v/力、链J求菌(厌氧物种)、肺炎链球菌(5^印toc0cc"s/mew附ow/fle)、致病性弯曲菌属物种(C麵/^/0toter5/7.)、肠球菌属物种(五MtefWOCCMS5/7.)、流感嗜血杆菌(/T"e附0/7/rz7ws/"y7"e"^ze)、炭疽芽孢杆菌(BflC77/"sflWrac&)、白W矣才奉状杆菌(cw戸eA""m'w附鄉/r,/^,/"e)、棒状軒菌属物种(c，"e6fl"m'"附5/7.)、红斑丹毒丝菌(￡>j;5^e/o^r/x;r/iM5io/7fl^zVie)、产气荚膜梭菌(C7os^7VZ/w附/^/"//"ge尸51)，破伤风梭菌(670俯油."附teto"/)、产气肠杆菌、肺炎克氏杆菌(iT/e6s/e〃fl/mew附ort/fle)、多杀性巴氏杆菌(PtfS,""//"/M"/to"V/")、类杆菌属物种(5tfCte/wVfes5/7.)、具核梭杆菌(F"S^Afl"m'M附"MC/Cfl,M附)、念珠状链軒菌(AS,尸e/7to6fl"7/W51附0"仏yb,附/s)、苍白密虫累旋体(7>印卵柳"/m〃Mw附)、细弱密虫累旋体(r尸e/70w柳fl/;e他鼎e)、钩端螺i走体属(丄印to印/m)、立克次氏体(iWcA:e欲/fl)和以色列；改线菌真菌的实例包括新生隐球菌(O，tococc"sweq/br附做s)、荚膜组织胞浆菌(历加/;/fl57Wflcfl/7S"/a似附)、粗球孑包子菌(CVc"V/ZwVfey/附附/斷、皮炎芽生菌(5/flsto/wj;cesfife/7flriftV//s)、沙目艮衣原体(C/r/"附yJ/fl^"ac/rtf附fl^s)、白色念其他传染性生物(即原生动物)包括疰原虫属物种(iVosmo^wm^/7.)，例如恶性*原虫(P/fl5"附6^/w附/"/"》am附)、三曰痴原虫(7Vfl57MoWw附/wfl/flW"e)、卵形痗原虫(/V"雄0flf/w附ovfl/e)、间曰疾原虫(/VflS7no必w柳viVflx)和刚地弓形虫(7bjc印/似附flgom///)。经血液传播的和/或组织寄生虫包括痴原虫属物种、田鼠巴贝斯虫(5flAew'fl附/cra/i)、分歧巴贝斯虫CBfl^wVd/vefge"s)、热带利4十曼原虫(jLe/s/r附fl附Vif,o/;/cfl)、矛'H十曼原虫属物种(Z^is/rwwwi/fl5pj7.)、巴西利4十曼原虫(ILeis/rimwi/a6尸""7/ew^s)、^土氏利"f十曼原、虫(Z^/s/f/MflmViflto/i0Vflrm)、刚比亚锥虫(7Vj;/m"仍o附flgfl柳6/e"5^)和罗4寻西亚锥虫(71rj;/m"oswwflr/tf^/es/ew5^)(非洲昏睡病)、克氏锥虫(7Vj/7fl"fwo附a(南美锥虫病(Chagas'disease))和刚地弓形虫。其他医学相关的微生物已在文献中有广泛描述，例如，见C.G.AThomasMM/cfl/M/m6她g，BailliereTindall，GreatBritain1983，其全部内容在此引入作为参考。在一些实例中病毒加剧性哮喘由呼吸道病毒导致，特别是上呼吸道病毒如流感病毒。任选地，呼吸道病毒可以不是RSV(呼吸道合胞病毒)。用于治疗病毒加剧性哮喘的方法还可以包括使用CpG寡核普酸和抗微生物剂或非CpG哮喘治疗(例如哮喘药)的组合。可选的治疗剂即抗微生物剂或哮喘药可以在和CpG寡核苷酸不同的时间施用或与CpG寡核香酸在相同的时间施用。对哮喘个体施以有效量的CpG寡核苷酸用于治疗病毒加剧性哮喘。如果施用组合治疗，可以施用有效量CpG寡核苷酸来防止病毒感染，而哮喘药可以在出现过敏或哞喘症状时向对个体施用。因而，可以对个体施用CpG寡核苷酸，然后可以随后施用哮喘药，或者两者在相同的时间一起施用。CpG寡核苷酸包含发现可引发免疫应答的特异性序列。引发免疫应答的这些特异性序列称为"免疫刺激基序"，而含有免疫刺激基序的寡核苷酸称为"免疫刺激寡核苷酸分子，，及等同的"免疫刺激寡核苷酸"。本发明的免疫刺激寡核苷酸因此包括至少一个免疫刺激基序。在优选的实施方案中，免疫刺激基序是"内部免疫刺激基序"。术语"内部免疫刺激基序"指在基序序列的位置位于较长的寡核苷酸序列之内，后者的长度比基序序列长至少一个核苷酸，所述核苷酸连接在免疫刺激基序序列的5，及3，末端。CpG寡核苷酸包括至少一个非甲基化CpG二核苷酸。含有至少一个非甲基化CpG二核苷酸的寡核苷酸是含有非甲基化胞嘧咬-鸟噤呤二核苷酸序列(即"CpGDNA"，或含有5，胞嘧咬之后是3，鸟噤呤并通过磷酸键相连的DNA)并激活免疫系统的寡核苷酸分子。CpG寡核苷酸可以是整个非甲基化或部分非甲基化，但至少5'CG3，中的C必须为非甲基化。本发明的方法可以包含A类、B类和C类CpG免疫刺激寡核苷酸的用途。关于CpG寡核苷酸，最近被描述为存在不同类的CpG寡核苷酸。一类有效激活B细胞但在诱导IFN-a和NK细胞活化方面相对较弱，此类命名为B类。B类CpG寡核苷酸一般是完全稳定的，且在某些优选的碱基环境内包含非甲基化的CpG二核苦酸，见例如美国专利No.6,194,388、6,207,646、6，214，806、6，218，371、6,239,116及6,339,068。另一类有效诱导IFN-a和NK细胞活化但在刺激B细胞方面相对较弱，此类命名为A类。A类CpG寡核苷酸一般在5，和3，末端具有稳定的poly-G序列，还有一段含回文磷酸二酯CpG二核苷酸的至少6个核苷酸的序列，见例如公开的专利申请PCT/US00/26527(WO01/229卯)。而另一类CpG寡核苷酸激活B细胞和NK细胞并诱导IFN-a，此类命名为C类。C类CpG寡核香酸，像最初所表征的那样，一般完全稳定，包括B类的序列和富含GC的回文或近回文结构。这类已在2002年8月19日递交的美国专利申请10/224,523、2004年10月29日递交的US10/978,282中有所描述，其完整内容在此引入作为参考。"A类"CpG免疫刺激寡核苷酸不仅在USP6,207,646Bl、而且还在美国非临时专利申请流水号09/672,126和公开的PCT申请PCT/US00/26527(WO01/22990)中有所描述，两者均于2000年9月27曰递交。这些寡核苷酸的特征在于能够诱导高水平干扰素a，而对于B细胞激活有最小的效应。A类CpG免疫刺激寡核苷酸不一定含有Yamamoto及其同事描述的六聚体回文结构GACGTC、AGCGCT或AACGTT(YamamotoS等//附附mwo/148:4072-6(1992))。B类CpG免疫刺激寡核苷酸强烈激活人B细胞，但诱导干扰素-a的效应最小。B类CpG免疫刺激寡核苷酸在分别于2001年2月27日和2001年5月29日授权的USP6,194,388Bl和6,239,116Bl中有所描述。本发明在一个实施方案中提供了至少如下通式所示的B类CpG寡核苷酸5，X^CGXsW,其中XpX2、X3和X4是核苷酸。在一个实施方案中，X2是腺噤呤、鸟嘌呤或胸腺嘧啶。在另一实施方案中，X3是胞嘧啶、腺噤呤或胸腺嘧啶。本发明在另一实施方案中提供了至少如下通式所示的分离的B类CpG寡核苷酸5，NAX2CGXAN23，其中XpX2、X3和X4是核苷酸，N是任意核苷酸，且]N^和N2各自为由约0到25个N组成的寡核苷酸序列。在一个实施方案中，X^2是选白GpT、GpG、GpA、ApA、ApT、ApG、CpT、CpA、CpG、TpA、TpT或TpG的二核苷酸；而XsX4是选自TpT、ApT、TpG、ApG、CpG、TpC、ApC、CpC、TpA、ApA或CpA的二核苷酸。优选XiX2是GpA或GpT，而X3X4是TpT。在其他实施方案中，^或X2或两者均为噤呤，而X3或X4或两者均为嘧啶；或者XiX2是GpA、而X3或X4或两者均为嘧啶。在另一优选的实施方案中，XiX2是选自TpA、ApA、ApC、ApG或GpG的二核苷酸。而在另一实施方案中，XsX4是选自TpT、TpA、TpG、ApA、ApG、GpA或CpA的二核苷酸。在另一实施方案中，X^2是选自TpT、TpG、ApT、GpC、CpC、CpT、TpC、GpT或CpG的二核苷酸；乂3是从由A和T组成的组中选择的核苷酸，而X4是核苷酸，但其中当XiX2是TpC、GpT或CpG时，XsX4不是TpC、ApT或ApC。在一些实施方案中，所述寡核苷酸具有5，TC。在另一个优选实施方案中，CpG寡核苷酸具有5，TCNJXiX2CGX3X43'(SEQIDNO56)序列。在一些实施方案中，本发明的CpG寡核苷酸包括从由GpT、GpG、GpA和ApA组成的组中选择的XiX2以及从由TpT、CpT和TpC组成的组中选择的X3X4。本发明的B类CpG寡核苷酸序列是如上所广泛描述及如PCT公开的专利申请PC17US95/01570和PCT/US97/19791和分别于2001年2月27日和2001年5月29日出版的USP6,194,388Bl和USP6,239,116Bl中公开的那些。例示性的序列包括但不限于在后面的这些申请和专利中所公开的那些序列。C类免疫刺激寡核苷酸含有至少两个不同的基序，并对免疫系统细胞具有独特的、期望的刺激效应。这些ODN中的一些具有传统的"刺激性"CpG序列和"富含GC"或"B细胞中和"基序。这些组合基序寡核苷酸具有免疫刺激效应，该效应介于传统"B类"CpGODN(B细胞活化和树突细胞(DC)活化的强诱导剂)的相关效应与A类CpGODN(IFN-a和自然杀伤细胞(NK)活化的强诱导剂，但是为B细胞和DC活化的相对弱的诱导剂)的相关效应之间。虽然优选的B类CpGODN通常具有疏代磷酸酯骨架、而优选的的A类CpGODN具有混合或嵌合骨架，但是C类组合基序免疫刺激寡核苷酸可以具有或者稳定的如硫代磷酸酯、嵌合的或者磷酸二酯骨架，且在一些优选的实施方案中，它们具有半软骨架。刺激性结构域或基序可以定义为通式5，XPCGHX23，D是除C之外的核苷酸，C是胞嘧啶，G是鸟噤呤，H是除G之外的核苷酸。Xi和X2是长0到IO个核苷酸的任意寡核苷酸。Xi可以包括CG，在此情况下这个CG之前优选紧接一个T。在一些实施方案中，DCG是TCG。&优选长0到6个核苷酸。在一些实施方案中，X2不含任何polyG或polyA基序。在其他实施方案中，免疫刺激寡核苷酸在5，末端或3，末端具有polyT序列。在此使用的"poly-A"或"poly-T"应指分别为4个或更多连续A或T的一段序列，例如5，AAAA3，或5，TTTT3'。在此使用的"poly-G末端"应指出现在寡核苷酸5，末端或3'末端的4个或更多连续G的一段序列，例如5，GGGG3，。在此使用的"poly-G寡核苷酸，，应指具有通式5，X^2GGGX3X43'的寡核苷酸，其中X"X2、乂3和X4是核苷酸且优选X3和X4中至少之一是G。落入此通式的B细胞刺激性结构域的一些优选设计包括TTTTTCG、TCG、TTCG、TTTCG、TTTTCG、TCGT、TTCGT、TTTCGT、TCGTCGT。寡核苷酸的第二个基序称为P或N，并位于紧挨&的5，或紧挨X2的3，。N是以CGG三核苷^始且长至少10核苷酸的B细胞中和序列。B细胞中和基序包括至少一个CpG序列，其中CG之前为C或之后为G(KriegAM等，1998，尸wc7VW"aw/5W95:12631-12636)，或者是含CG的DNA序列，其中CG中的C是甲基化的。在此使用的"CpG，，应指5，胞嘧啶(C)后接3，鸟噤呤(G)并且以磷酸酯键相连。至少5，CG3，的C必须是非甲基化的。中和基序是当出现在不同的非刺激性基序中时具有某种程度的免疫刺激能力的基序，然而当出现在其他免疫刺激基序环境中时起降低其他基序免疫刺激潜能的作用。P是长至少10个核苷酸的序列，含有富含GC的回文。在此使用的"回文"和等同的"回文序列"应指反向重复，即例如ABCDEE，D，C，B，A，的序列，其中A和A，、B和B，等是能够形成通常的Watson-Crick碱基对的碱基。在此使用的"富含GC回文"是指至少三分之二的碱基组成是G和C的回文。在一些实施方案中，富含GC的结构域优选位于"B细胞刺激性结构域"的3，。从而在10个碱基长的富含GC回文的情况中，回文含有至少8个G和C。在12个碱基长的富含GC回文的情况中，回文也含有至少8个G和C。在14画mer富含GC回文的情况中，回文中至少10个碱基是G和C。在一些实施方案中，富含GC的回文仅由G和C构成。在一些实施方案中，富含GC回文的碱基组成具有至少81%的G和C。从而在这样的IO个碱基长的富含GC回文中，回文全部由G和C组成。在这样的12个碱基长的富含GC回文中，优选回文中至少10个碱基(83%)是G和C。在一些优选的实施方案中，12个碱基长的富含GC回文仅由G和C构成。在14-mer富含GC回文的情况下，回文中至少12个碱基(86%)是G和C。在一些优选实施方案中，14个碱基长的富含GC回文仅由G和C构成。富含GC回文中的C可以是非曱基化的，或可以被曱基化。一般这个结构域具有至少3个C和3个G,更优选各为4个，而最优选各为5个或更多。这个结构域中C和G的数目无需相同。优选如此排列C和G以^使它们能形成自身互补双链体或回文，例如CCGCGCGG。这可以被A或T打断，但是优选至少部分地保留自身互补性，例如像基序CGACGTTCGTCG(SEQIDNO:49)或CGGCGCCGTGCCG(SEQIDNO:50)那样。当不保留互补性时，优选非互补碱基对是TG。在优选实施方案中，不超过3个连续碱基不是回文的部分，优选不超过2个，最优选只1个。在一些实施方案中，富含GC的回文包括至少一个CGG三聚体，至少一个CCG三聚体，或至少一个CGCG四聚体。在其他实施方案中，富含GC的回文不是CCCCCCGGGGGG(SEQIDNO:51)或GGGGGGCCCCCC(SEQIDNO:52)、CCCCCGGGGG(SEQIDNO:53)或GGGGGCCCCC(SEQIDNO:54)。富含GC区域中的至少一个G可被肌苷(I)取代。在一些实施方案中，P包括不止1个I。在某些实施方案中，免疫刺激寡核苷酸具有下列通式之一5，NXPCGHX23'、5，XiDCGHX2N3，、5，PX!DCGHX23，、5，X丄DCGHX2P3，、5，X^CGHX2PX33，、5，X^CGHPXs3，、5,DCGHX2PX33，、5，TCGHX2PX33，、5，DCGHPX33，或5,DCGHP3，。本发明其他方面提供了如下通式定义的免疫刺激寡核苷酸5，N^yGNzP3，，M是长1到6个核苷酸的任意序列，Py是噤呤，G是乌嘌呤，N2是长0到30核苷酸的任意序列，P是长至少10个核苷酸的序列，包含富含GC的回文。Ni和N2可以含有多于50%的嘌呤，而更优选多于50。/。的T。Ni可以包括CG,在此情况下优选这个CG前紧接T。在一些实施方案中，NfyG是TCG(如ODN5376，具有5，TCGG),而最优选TCGN2，其中1\2不是G。l^PyGNzP可以包括一个或多个肌苷(I)核苷酸。N,中的C或者G可以净皮替换为肌苷，但是CpI优于IpG。对于肌苷取代例如IpG，可通过使用"半软，，或嵌合骨架可以得到最佳的活性，其中在IG或CI间的键是磷酸二酯键。Nt可以包括至少一个CI、TCI、IG或TIG基序。在某些实施方案中，NiPyGN2是从由TTTTTCG、TCG、TTCG、TTTCG、TTTTCG、TCGT、TTCGT、TTTCGT和TCGTCGT组成的组中选择的序列。C类ODN也在2004年10月28日递交的美国专利申请流水号10/978,283中有所描述。在此描述的核酸全部引入作为参考。根据本发明的可用的一些非限制性的CpG寡核苷酸实例包括<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>免疫刺激寡核苷酸分子可以具有嵌合骨架。出于本发明的目的，嵌合骨架指部分稳定的骨架，其中至少一个核苷酸间键是磷酸二酯键或磷酸二酯样键，并且其中至少一个其他核苷酸间键是稳定的核苷酸间键，其中所述至少一个磷酸二酯键或磷酸二酯样键和所述至少一个稳定键是不同的。因为硼膦酸酯(boranophosphonate)键已经报道相对磷酸二酯键稳定，为了骨架嵌合性的目的，硼膦酸酯键可以被归类为磷酸二酯样键或是稳定键，依赖于上下文而定。例如，根据本发明的嵌合骨架在一实施方案中可以包括至少一个磷酸二酯键(磷酸二酯键或磷酸二酯样键)和至少一个硼膦酸酯(稳定)键。在另一实施方案中，依据本发明的嵌合骨架可以包括硼膦酸酯键(磷酸二酯键或磷酸二酯样键)和硫代磷酸酯(稳定)键。"稳定的核苷酸间键"指与磷酸二酯核苷酸间键相比，对体内降解(例如介由外切核酸酶或内切核酸酶)具有相对抗性的核苷酸间键。优选稳定的核苷酸间键包括但不限于硫代磷酸酯键、二硫代磷酸酯键、甲基膦酸酯键和曱基硫代磷酸酯键。其他稳定的核苷酸间键包括但不限于肽、烷基、脱磷酸基团(dephospho)等等，如上文所述。修饰骨架例如硫代磷酸酯可以使用磷酰胺或氬膦酸(H-phosphonate)化学通过自动化技术合成。芳基-和烷基-膦酸酯可以如美国专利号4,469,863所述制备；烷基磷酸三酯(其中带电荷的氧部分如美国专利号5,023,243和欧洲专利号092,574所述进行烷基化)可以利用商购试剂通过自动化固相合成制备。用于进行其他DNA骨架修饰和取代的方法已在UhlmaimE等(1990),及ev90:544;GoodchildJ(1990)，C&w1:165中描述。制备嵌合寡核苷酸的方法也已知。例如授予Uhlmann等的多项专利中已经描述了此类技术。混合骨架修饰ODN可以使用商购DNA合成仪和标准亚磷酰胺化学来合成(F.E.Eckstein，"OligonucleotidesandAnalogues画APracticalApproach",IRLPress,Oxford,UK，1991以及M.D.Matteucci和M.H.Caruthers，TetrahedronLett,719(1980))。在4禺联后，4吏用Beaucage试剂(R.P.Iyer,W.Egan，J.B.Regan及S.LBeaucage，J.Am.Chem.Soc.112,1253(1990)(0.075M乙腈溶液)或二石克化二苯乙酰(PADS)通过石克化反应引入PS键，然后使用乙酸酐、2，6-二甲基吡啶的四氢呋喃液(l:l:8，v:v:v)及7V-曱基咪唑(16%的四氢呋喃液)来封端。这个封端步骤在硫化反应之后进行，以使应该为硫代磷酸酯键的位置上不期望的磷酸二酯键(PO)的形成最小化。在引入磷酸二酯键时，例如在CpG二核苷酸处，用碘的水/吡啶溶液处理氧化中间体磷III。在从固相支持物上裂解、通过用浓氨水处理(15小时，5(TC)最终去保护之后，使用NaCl梯度(例如緩冲液A:10mMNaH2P04的乙腈/水-l:4/v:v溶液，pH6.8;緩冲液B:10mMNaH2PO4、1.5MNaCI的乙腈/水=l:4/v:v溶液；1ml/min，30分钟，5%到60%的B)在Gen-PakFax柱(Millipore-Waters)上通过HPLC或通过毛细管凝胶电泳来分析ODN。可以通过HPLC或FPLC在Source高性能柱(AmershamPharmacia)上来纯化ODN。合并HPLC均质级分，并通过C18柱或通过超滤脱盐。用MALDI-TOF质镨分析ODN来证实其计算分子量。本发明的寡核苷酸还包括其他修饰。这些包括非离子DNA类似物，如烷基-和芳基-磷酸S旨(其中带电荷的膦酸氧原子以烷基或芳基代替)、磷酸二酯和烷基磷酸三酯(其中带电荷氧部分被烷基化)。也已表明，在任一端或两端同时含有二醇如四乙二醇或六乙二醇的寡核苷酸对于核酸酶降解基本上具有抗性。在一些实施方案里，寡核苷酸可以是软或半软寡核苷酸。软寡核苷酸是具有部分稳定骨架的免疫刺激寡核苷酸，其中磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键仅存在于至少一个内部嘧咬-噤呤二核苷酸(YZ)内部和紧邻处。优选YZ是YG，即嘧啶-鸟嘌呤(YG)二核苷酸。所述至少一个内部YZ二核苷酸本身具有磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键。存在于紧邻所述至少一个内部YZ二核香酸处的砩酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键可以位于所述至少一个内部YZ二核苷酸的5，、3，、或5，和3，两端。特别地，磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键包括"内部二核苦酸"。一般内部二核普酸指通过核苷酸间键相连的任意邻近核苷酸对，其中该核苷酸对中的任何一个核苦酸都不是末端核苷酸，即在该核苷酸对中的任何一个核苷酸都不是界定寡核苷酸5，或3，末端的核苷酸。因此长n个核苷酸的线性寡核苷酸总共有n-l个二核苷酸，且只有n-3个内部二核苷酸。在内部二核苷酸中的每个核苷酸间键是内部的核苷酸间键。因此长n个核苷酸的线性寡核苷酸总共有n-l个核苦酸间键，且只有n-3个内部核苷酸间键。因此，策略性设计的磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键是指位于寡核苷酸序列中任意核苦酸对之间的磷酸二酯或磷酸二酯样核香酸间键。在一些实施方案中，磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键不位于最接近于5，或3，末端的任一核苷酸对之间。优选地，存在于紧邻至少一个内部YZ二核普酸处的磷酸二酯键或磷酸二酯样键本身为内部核苷酸间键。因而对于序列NiYZN2，其中和N2彼此独立地分别为任意单个核苷酸，YZ二核苷酸具有磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键，此外(a)当N!是内部核苷酸时，A和Y以磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键相连；(b)当N2是内部核苷酸时，Z和N2以磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键相连；或(c)当]^是内部核苷酸时，]^和Y以磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键相连，并且当N2是内部核香酸时，Z和N2以磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键相连。认为和完全稳定寡核苷酸相比，根据本发明的软寡核苷酸相对更易于为核酸酶切割。认为本发明的软寡核苷酸可被切割为相对于全长软寡核苷酸具有降低或无免疫刺激活性的片段，但这不意味着束縛于特殊的理论或机制。认为引入至少一个核酸酶敏感核苷酸间键，特别是接近寡核苷酸中部的位置，可提供改变寡核苷酸药代谢动力学的"开关，，，从而降低寡核苷酸最大免疫刺激活性的持续时间。这在期望避免急性局部炎症或免疫刺激相关损伤的组织(例如肾)和临床应用中具有特殊价值。半软寡核苷酸是具有部分稳定骨架的免疫刺激寡核苷酸，其中磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键仅存在于至少一个内部嘧啶-噤呤(YZ)二核苷酸内部。半软寡核苷酸一般相对于相应的完全稳定免疫刺激寡核苷酸拥有更强的免疫刺激效力。由于半软寡核苷酸的效力更高，在一些情况下，为获得期望的生物效应，与常规完全稳定免疫刺激寡核苷酸相比，可以使用更低有效浓度和更低有效剂量的半软寡核苷酸。认为半软寡核苷酸的前述性质一般随参与内部YZ二核苷酸的磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键的"剂量"增加而增加。因此认为一般对于例如给定的具有5个内部YZ二核苷酸的寡核苷酸序列而言，具有5个内部碑酸二酯或磷酸二酯样YZ核苷酸间键的寡核苷酸比具有4个内部磷酸二酯或磷酸二酯样YG核苷酸间键的寡核香酸免疫刺激性更强，后者进而又比具有3个内部磷酸二酯或磷酸二酯样YZ核苷酸间键的寡核苷酸免疫刺激性更强，后者进而又比具有2个内部磷酸二酯或磷酸二酯样YZ核苷酸间键的寡核苷酸免疫刺激性更强，后者进而又比具有1个内部磷酸二酯或磷酸二酯样YZ核苷酸间键的寡核苷酸免疫刺激性更强。重要的是，认为纳入甚至一个内部磷酸二酯或磷酸二酯样YZ核苷酸间键比没有内部磷酸二酯或磷酸二酯样YZ核苷酸间键有利。除了磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键的数目外，沿寡核苷酸长度的位置也能够影响效力。除了在优选内部位置处的磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键外，软及半软寡核苷酸一般还包括抗降解的5，和3，末端。此类降解抗性末端包括导致对外切核酸酶消化抗性与相应未修饰末端相比增强的任何适当修饰。例如5，和3'末端可以通过纳入骨架的至少一个磷酸修饰而稳定化。在优选的实施方案中，在骨架每一末端的至少一个磷酸修饰是独立的硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯或曱基硫代磷酸酯核苷酸间键。在另一实施方案中，降解抗性末端包括在3，末端处以肽键或酰胺键连接的一个或多个核苷酸单位。磷酸二酯核苷酸间键是具有自然界发现的寡核苷酸特征的键型。磷酸二酯核苷酸间键包括两翼有两个桥接氧原子并为另外两个氧原子(一个带电，另一个不带电)结合的磷原子。当降低寡核苷酸的组织半衰期非常重要时，特别优选磷酸二酯核苷酸间键。磷酸二酯样核苷酸间键是含磷的桥接基团，与磷酸二酯在化学上和/或呈非对称异构体相似。磷酸二酯相似性的测定包括对核酸酶消化的敏感性和激活RNAseH的能力。因此例如磷酸二酯(但不是硫代磷酸酯)寡核苷酸易于被核酸酶消化，而磷酸二酯和硫代磷酸酯寡核苷酸都能激活RNAaseH。在优选的实施方案中，磷酸二酯样核苷酸间键是硼磷酸酯(boran叩hosphate)(或等同的硼膦酸酯)键(美国专利号5,177,198，5,859,231，6,160,109，6,207,819;Sergueev等，1998，/爿附C&附5Vc120:9417-27)。在另一优选实施方案中，磷酸二酯样核香酸间键是非对称异构体纯的Rp硫代磷酸酯。认为非对称异构体纯的Rp硫代磷酸酯更易被核酸酶消化，且与混合或非对称异构体纯的Sp硫代磷酸酯相比更能激活RNAaseH。CpG寡核苷酸的立体异构体是1999年7月27日递交的共同未决美国专利申请09/361,575和公开的PCT申请PCT/US99/17100(WO00/06588)的主题。为本发明目的，应注意术语"磷酸二酯样核苷酸间键"特别地把二硫代磷酸酯和甲基膦酸酯核苷酸间键排除在外。如上所述本发明的软和半软寡核苷酸可以位于具有C和G之间的磷酸二酯样键。磷酸二酯样键的一个实例是采用Rp构象的硫代磷酸酯键。寡核苷酸p手性对于CpG寡核苷酸免疫活性可具有明显的相反效应，取决于测量活性的时间点。在早期时间点40分钟时，硫代磷酸酯CpG寡核苷酸的Rp而非Sp立体异构体诱导小鼠脾细胞的JNK磷酸化。与此形成对照，当在晚期时间点44小时测量时，Sp而非Rp立体异构体有刺激脾细胞增殖的活性。所述Rp和Sp在动力学和生物活性上的不同不是因为细胞才聂取方面的不同，而最有可能是由于p手性的相反生物学功能所致。首先，Rp立体异构体和Sp比较在早期时间点刺激免疫细胞的增强活性提示Rp可能在与CpG受体TLR9相互作用或诱导下游信号通路方面更为有效。另一方面，RpPS寡核苷酸与Sp相比更快地降解，导致其信号传递持续时间要短得多，从而在较晚时间点测定时SpPS寡核苷酸显示出更强的生物活性。CpG二核苷酸本身的p手性取得了令人吃惊的强烈效应。与立体随机的CpG寡核苷酸比较，其中单个CpG二核苷酸以Rp形式连接的同类物具有略微更高的活性，而含有Sp键的同类物对于诱导脾细胞增殖几乎没有活性。免疫刺激寡核苷酸的大小(即沿寡核苷酸长度的核苷酸残基的数目)可能也对寡核苷酸的刺激活性有贡献。为促进细胞摄入，免疫刺激寡核苷酸优选具有至少6个核苷酸残基的长度。根据本发明，如果存在足够的免疫刺激基序，大于6个核苷酸的任意大小的寡核苷酸(甚至许多kb的长度)能够诱导免疫应答，因为较大的寡核苷酸在细胞内降解。本发明人认为如果能够^f皮送递到细胞内部，短至4个核苷酸的半软寡核苷酸也可以是免疫刺激性的。在根据本发明的某些优选实施方案中，免疫刺激寡核苷酸长4-100个核苷酸。在典型的实施方案中，免疫刺激寡核苷酸长6-40个核苷酸。在根据本发明的某些实施方案中，免疫刺激寡核苷酸长6-19个核苷酸。免疫刺激寡核苷酸一般长度范围为4-100,而在一些实施方案中为8-40。长度范围可以在16-24个核苷酸。术语"寡核苷酸"也包括具有取代或修饰的寡核苷酸，例如碱基和/或糖取代或修饰。例如，包括这样的寡核苷酸，其骨架糖共价附着于低分子量的有机基团，而非2，位上的羟基基团，也非5，位上的磷酸基团或羟基基团。因而修饰的寡核苷酸可以包括2，-0-烷基化核糖基团。此外，修饰的寡核苷酸可以包括诸如阿拉伯糖或2，-氟阿拉伯糖的糖来替代核糖。因此，寡核苷酸可以在骨架组成上具异质性，从而包含连接在一起的任意可能的多聚体组合，如肽-核酸(其具有带寡核苷酸碱基的氨基酸骨架)。寡核苷酸还包括取代的噤呤和嘧啶，如C-5丙炔嘧啶和7-脱氮杂-7-取代-嘌呤#"饰的碱基(WagnerRW等，19967VW14:840-4)。噤呤和嘧啶包括但不限于腺噤呤、胞嘧啶、鸟噪呤、胸腺嘧啶、5-甲基胞嗜啶、5-羟基胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯噤呤、2，6-二氨基噤呤、次黄噤呤和其他天然和非天然存在的核碱基、取代和未取代的芳香族部分。其他此类修饰为本领域技术人员所熟知。与天然RNA和DNA相比，本发明的免疫刺激寡核苷酸可包括多种化学《务饰和取^f义，包括磷酸二酯核苦酸间桥、p-D-核糖单元和/或天然核苷酸碱基(腺噪呤、鸟噤呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧咬)。化学修饰的实例为技术人员所知，并描述在例如UhlmannE等(1990)C&附及ev90:543;"ProtocolsforOligonucleotidesandAnalogs",SynthesisandProperties&SynthesisandAnalyticalTechniques,S.Agrawal编，HumanaPress,Totowa，USA1993;CrookeST等(1996)及evi^"r附"o/7kdco/36:107-129及HunzikerJ等(1995)ikforf分w^Afe幼oA7:331-417中。根据本发明的寡核苷酸可以具有一种或多种修饰，其中与由天然DNA或RNA构成的同样序列的寡核苷酸相比，每种修饰定位在特定的磷酸二酯核苷酸间桥和/或特定的卩-D-核糖单元和/或特定的天然核苷酸碱基位置上。例如，本发明涉及的寡核苷酸可能包含一种或多种修饰，且其中每种修饰独立地选自a)以修饰的核苷酸间桥来替换位于核苷酸3，和/或5'末端的磷酸二酯核苷酸间桥；b)以脱磷酸桥来替换位于核苷酸3，和/或5，末端的磷酸二酯桥；c)以其他单元替换糖磷酸骨架中的糖磷酸单元；d)用修饰的糖单元替换p-D-核糖单元，及e)用修饰的核苷酸碱基替换天然核苷酸碱基。关于寡核苷酸化学修饰的更详细实例如下。位于核苷酸3，和/或5，末端的磷酸二酯核苷酸间桥可以替换为修饰的核苷酸间桥，其中修饰的核苷酸间桥是选自例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、NR、、磷酰胺、硼磷酸酯、a-羟基千基膦酸、(d-CM)-O-烷基磷酸西旨、[(CVd2)芳基-(CrC20-O-烷基磷酸酯、(CrCs)烷基膦酸酯和/或(C6-d2)芳基膦酸酯桥、(Crd2)-a-羟甲基芳基(例如在WO95/01363中公开)，其中((Vd2)芳基、(C6-C20)芳基和(CVd4)芳基可任选被卤素、芳基、烷氧基、硝基、氰基取代，且其中Ri和R"彼此独立地为氢、(Crds)-烷基、(C6-C20)-芳基、(cvd4)-芳基-(d-C5)-烷基，优选氢、(d-Cs)-烷基，优选((:1-<:4)-烷基和/或曱氧乙基，或R1和R2与携带它们的氮原子一起形成5-6元杂环，所述杂环可以额外含有从由O、S和N组成的组中选择的杂原子。用脱磷酸桥(脱磷酸桥在例如UhlmaimE和PeymanA在"MethodsinMolecularBiology"巻20,《ProtocolsforOligonucleotidesandAnalogs》S.Agrawal编，HumanaPress,Totowa1993，16章355页中描述)替换位于核苷酸3，和/或5，末端的磷酸二酯桥，其中脱磷酸桥选自例如脱磷酸桥曱缩醛(formacetal)、3'-硫曱缩醛(3，-thioformacetal)、甲基羟胺、將、亚甲基二甲基亚肼基(methylenedimethyl-hydrazo)、二甲基亚砜(dimethylenesulfone)和/或甲硅烷基团。糖磷酸骨架(即由糖磷酸单元组成的糖磷酸骨架)中的糖磷酸单元(即P-D-核糖和磷酸二酯核苷酸间桥一起形成糖磷酸单元)可以替换为其他单元，例如，其中所述其他单元适于建立"吗啡啉衍生物"寡聚体(例如如StirchakEP等(1989)6VZg卵wc/"Vfey及^17:6129-41所述)，换句话说，例如用吗啡啉衍生物单元进行替换；或者适于建立聚酰胺寡核苷酸("PNA"，例如在NielsenPE等(1994)5,Wwi/"gC^附5:3-7中所述)，换句话说，例如用PNA骨架单元如2-氨基乙基甘氨酸进行替换。可以用修饰的糖单元来替换p-核糖单元或p-D-2，-脱氧核糖单元，其中修饰的糖单元选自例如p-D-核糖、ot-D-2，-脱氧核糖、L-2，-脱氧核糖、2，-F-2，-脱氧核糖、2，-F-阿拉伯糖、2'-0-(d-C6)烷基核糖，优选2'-0-(CVC6)烷基核糖是2，-0-曱基核糖、2'-0-(C2-C6)烯基核糖、2，--10、IL-6、IL-10和TNFa)。小鼠气道中细胞因子的刺激通过在轻度异氟醚麻醉进行鼻内滴注将递SEQIDNO:10(10-1000Hg/kg)或载体(40jil盐水)送至小鼠气道。24小时以后，用l毫升盐水经气道套管进行支气管肺泡灌洗。测定支气管肺泡灌洗液中的细胞因子浓度(IFNa、IFNy、IP-IO、IL-6和IL-12p40)。絲如表3所示，SEQIDNO:10诱导分离的小鼠脾细胞分泌TLR9相关细胞因子。与此形成对照，具反向CpG基序的对照ODN、单独的SEQIDNO:10的5'末端刺激序列或单独的回文没有明显的活性。10jig/mlODN诱导了最高滴度的各细胞因子(较低浓度的数据未显示)，11.山=未检测(<12pg/ml)。因此，SEQIDNO:10以浓度依赖性方式诱导了IFNa、IFNy、IP-10、IL-6、IL-10和TNFa的分泌。各细胞因子的最高滴度由10jig/mlSEQIDNO:IO诱导。为评估SEQIDNO:10中CpG基序正确的顺序对此生物活性的重要性，用与SEQIDNO:10具有相同序列但其5，末端刺激序列(SEQIDNO:55)中的CpG基序相反的ODN重复进行测定。结果显示，对照寡核苷酸几乎没有诱导这些TLR9相关细胞因子的能力。单独的SEQIDNO:10的5，末端刺激序列或单独的回文也没有明显活性，证明了具有这两个结构域的完整分子是活性所必需的(各序列情况如表3所示)。表3_ODNODN(10ng/ml)资导的细胞因子滴度(pg/ml)匪a画yHMOIL画6IL-10TNFa单独的培养基34.4n.d.21.964.8n.d.n.d.SEOIDNO:10199.0539.9111.111531.5113.171.1对照ODN22.1n.d.22.4537.5n.d.n.d.单独的刺激序列19.5n.d.17.9427.1n.d.21.0单3虫的回文18.8n.d.17.759.0n.d.n.d.接下来研究在体内向小鼠气道给药时，SEQIDNO:IO是否能够诱导TLR9相关细胞因子。SEQIDNO:10谦导了IFNa、IFNy、IP-IO、IL-6和IL-12p40的分泌，如通过支气管灌洗液中这些细胞因子浓度的增加所证明的那样(图8)。实施例4SEOIDNO:10"i秀导偏离针对抗原致敏的Th2反应的免疫应答为确定SEQIDNO:10在和致敏抗原(卵清蛋白)一起向小鼠足垫注射时是否能抑制针对抗原致敏的Th2反应，在回忆测定中以抗原对小鼠进行离体再刺激。才法小鼠用注射到右后足垫的抗原(IOjigV级卵清蛋白，Sigma,St.Louis,MO，USA)致敏。单独注射抗原或者与SEQIDNO:10(10-1000ng/kg)—起注射。每种情况下，注射总体积为20jil。6天后，切下肿大的(draining)月国窝淋巴结，使淋巴结轻轻挤过细胞筛(孔径70nm),制备细胞悬液。在存在或不存在抗原(卵清蛋白，10jig/ml)的情况下，在220jil培养基(含10。/o胎牛血清的RPMI1640,均来自Invitrogen，Carlsbad,CA，USA)中孵育(37。C、5%C02)1x106未分级的淋巴结细胞，进行离体抗原回忆测定。孵育36小时后，如下所述检测培养基中的分泌细胞因子(IL-5、IL-13和匪力。潜^致敏小鼠的胭窝淋巴结细胞分泌IL-5、IL-13和IFNY(图9)。细胞在没有抗原或与不致敏小鼠的对照抗原(蟑螂)一起孵育时，并不分泌可检测滴度的任何这些细胞因子(<19pg/ml)。分离自SEQIDNO:10处理动物的细胞显示，抗原诱导的Th2细胞因子IL-5和IL-13的分泌减弱。与此形成对照，Thl细胞因子IFNy的分泌显著增加(图9c)。细胞在没有抗原或与不致敏小鼠的对照抗原(蟑鄉)一起孵育时，并不分泌可检测滴度的任何这些细月包因子(<10pg/ml)。实施例5SEOIDNO:10在体内抑制小鼠抗原诱导的IgE产生并刺激IgG2a产生接下来确定当在抗原致敏时向小鼠给药SEQIDNO:10能否改变免疫球蛋白产生谱。才法小鼠被抗原致敏两次，间隔7天，使用溶解在氢氧化铝佐剂(0.2ml,PierceImjectAlum,Rockford,IL，USA)中的腹膜内抗原(IOfigV级卵清蛋白，Sigma,St.Louis，MO，USA)。在两次致敏中每次的前两天和每次致敏的当天，通过^M内注射使小鼠接受SEQIDNO:10(1-1000jig/kg)或对照载体(盐水，10ml/kg)。在第二次致敏后的12天对小鼠进行心脏穿刺取血。离心收集血清，并如下分析卵清蛋白特异性的IgE和IgG2a。在微孔滴定板(Nunc，Rochester,NY，USA)上进行ELISA，在下述各步骤之间用溶液磷酸援沖盐液(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)中的0.05%聚山梨醇酯20(Sigma,St.Louis,MO，USA)洗涤。以溶于结合緩沖液(O.lMNaHC03，Sigma)中的卵清蛋白(150jil，100jig/ml)于4°C包被微板15小时。然后于20。C用测定稀释液(200jil/孑L，Pharmingen，BDBiosciences,FranklinLakes,NJ，USA)封闭微板2小时。加入血清样本(在测定稀释液中l比40稀释，100nl/孔)并在20。C静置2小时。加入生物素缀合的大鼠抗小鼠IgE或IgG2a(Pharmingen，在测定稀释液中2ng/ml，100n!/孔)并在4'C静置2小时。然后加入链霉亲和素缀合的辣^^过氧化物酶(Pharmingen,在测定稀释液中1:1000稀释，100nI/孔)并在20。C静置1小时。在20。C力口入四曱基联苯胺底物试剂(Pharmingen，100pl/孔)30分钟，然后用2N硫酸(50fil/孑L)终止反应。用分光光度计(Spectramax，MolecularDevices,Sunnyvale,CA，USA)测量450nm处的吸光值。錄果SEQIDNO:IO抑制了抗原特异性IgE的产生(在1000jig/kg的剂量下抑制了85%),而加强了IgG2a的产生，提供了偏离针对抗原的Th2反应的免疫应答进一步证据。实施例6SEOIDNO:10在体内抑制小鼠气道肿抗原诱导的嗜曙红细胞和淋巴细胞的累积实施例4和5证明了SEQIDNO:10能够抑制Th2免疫应答。因此，在抗原i秀导的气道炎症小鼠模型中检查了SEQIDNO:10的保护作用。才法用腹膜内抗原(蟑埤)致敏小鼠，然后每周两次向气道滴注抗原，进行两周的抗原刺激。在2周刺激的每一周，用SEQIDNO:IO或载体滴注小鼠气道，进行一次处理。可选的，小鼠未进行处理。在末次抗原刺激后48小时进行支气管灌洗，并计数回收的细胞。用自动化细胞计数>(义计数总白细胞(a)和嗜曙红细胞(b)。潜果因为此试验模型和过敏性哮喘共有标志性特点，所以研究了SEQIDNO:IO对此适应症的保护作用。当每周一次气道给药为期两周时，SEQIDNO:10抑制了因肺内抗原刺激诱导的气道中嗜曙红细胞、T细胞和B细胞的累积(图11)。在测试的最高剂量(300ng/kg)处，SEQIDNO:10抑制这些细胞的累积分别达78%、65%和79%。结论在患有哞喘的儿童和成人中，呼吸道病毒感染是气道阻塞和呼吸困难的重要促因。其中涉及的炎症过程复杂。然而，病毒诱导的中性粒细胞和单核细胞的募集和激活牵涉到气道阻塞的恶化，导致这些哞喘加剧。在此呈现的数据证明了CpGODN，特别是C类ODN显著抑制了由病毒感染和抗原刺激组合所诱导的中性粒细胞和单核细胞的加剧性累积。认为前述书面说明足以使本领域技术人员实施本发明。因为实施例旨在作为本发明一方面的单个举例说明，且其他功能等同的实施方案落在本发明范围之内，所以本发明范围不受限于提供的实施例。基于前述说明，除了那些在此显示和描述的以外，本发明的多种变动对本领域技术人员将是显而易见的，并落入所附权利要求的范围之内。本发明的优点和目标不必为本发明的每个实施方案所涵盖。权利要求1.治疗病毒加剧性哮喘的方法，包括向哮喘个体施用有效量的C类CpG寡核苷酸以治疗病毒加剧性哮喘。2.权利要求l的方法，其中病毒加剧性哮喘由呼吸道病毒引起。3.权利要求2的方法，其中呼吸道病毒不是RSV。4.权利要求l的方法，其中病毒加剧性哮喘由流感病毒引起。5.权利要求l的方法，其中个体由医务工作者鉴定。6.权利要求1的方法，其中个体基于接触病毒感染的风险因素来鉴定。7.权利要求l的方法，其中所述方法包括鉴定处于病毒感染风险中的哮喘个体的步骤。8.权利要求l的方法，其中C类寡核苷酸是半软寡核苷酸。9.权利要求1的方法，其中C类寡核苦酸是SEQIDNO:10。10.治疗病毒加剧性哞喘的方法，包括鉴定处于病毒感染风险中的哮喘个体，和向所述哮喘个体施用有效量的CpG寡核苷酸以治疗病毒加剧性哮喘。11.权利要求10的方法，其中病毒加剧性哮喘由呼吸道病毒引起。12.权利要求ll的方法，其中呼吸道病毒不是RSV。13.权利要求10的方法，其中病毒加剧性哮喘由流感病毒引起。14.权利要求10的方法，其中风险因素是流感季节。15.权利要求10的方法，其中风险因子是到病毒接触高风险目的地旅行。16.权利要求10的方法，其中CpG寡核苷酸是C类寡核香酸。17.权利要求16的方法，其中C类寡核苷酸是半软寡核普酸。18.权利要求16的方法，其中C类寡核苷酸是SEQIDNO:10。19.治疗病毒加剧性哞喘的方法，包括对进行非CpG哮喘治疗的哞喘个体施用有效量的CpG寡核苷酸以治疗病毒加剧性哮喘。20.权利要求19的方法，其中非CpG哮喘治疗是类固醇治疗。21.权利要求19的方法，其中非CpG哮喘治疗与CpG寡核苷酸在不同的时间施用。22.权利要求19的方法，其中非CpG哮喘治疗与CpG寡核苷酸在相同的时间施用。23.权利要求19的方法，其中CpG寡核苷酸是C类寡核苷酸。24.权利要求23的方法，其中C类寡核苷酸是半软寡核苷酸。25.权利要求23的方法，其中C类寡核苷酸是SEQIDNO:10。26.治疗传染病加剧性哮喘的方法，包括鉴定处于感染风险中的哮喘个体，和向所述哮喘个体施用有效量的CpG寡核苷酸以治疗传染病加剧性哮喘。27.治疗病毒加剧性哮喘的方法，包括鉴定处于病毒感染风险中的哮喘个体，和向所述哮喘个体施用亚治疗量的CpG寡核苷酸以治疗病毒感染，其中CpG寡核苷酸有效降低免疫细胞的累积。28.权利要求27的方法，其中免疫细胞是中性粒细胞。29.权利要求27的方法，其中免疫细胞是嗜曙红细胞。30.治疗病毒加剧性哮的方法，包括鉴定处于病毒感染风险中的哮喘个体，和向所述哮喘个体施用至少三个剂量的CpG寡核苷酸，其中至少三个剂量的CpG寡核苷酸在时间上彼此至少间隔三天。31.治疗病毒加剧性哮的方法，包括鉴定病毒感染的风险因素，和在哮喘个体处于病毒感染的风险期间向所述哞喘个体施用有效量的CpG寡核苷酸以治疗病毒加剧性哮喘。全文摘要本发明提供了用于治疗传染病加剧性哮喘的方法，包括向哮喘个体施用有效量的CpG寡核苷酸，特别地该传染病加剧性哮喘可以是病毒加剧性哮喘。文档编号A61K31/7088GK101193646SQ200680020252公开日2008年6月4日申请日期2006年4月10日优先权日2005年4月8日发明者A·M·克里格,G·T·德桑克提斯,J·A·小施密特,R·A·贾普,S·L·安德伍德申请人:科勒制药集团公司;塞诺菲-安万特美国有限责任公司