专利名称：：使用改进的调节表达系统治疗疾病的制作方法使用改进的调节表达系统治疗疾病本申请要求2005年5月19日提交的美国临时申请60/682,761的优先权，该临时申请通过引用整体结合到本文中。发明领域本发明涉及用于疾病治疗的改进的表达系统，其用于受编码的蛋白质或核酸治疗性分子(therapeuticmolecule)的调节表达(regulatedexpression)。具体地说，本发明涉及改进的调节基因表达系统、其药物组合物和用于疾病治疗的用途。发明背景递送编码治疗性分子(TM)的核酸以进行疾病治疗，这据认为是比常规治疗方法具有更大潜力的治疗方式。具体地说，在基因疗法中编码治疗性蛋白质的核酸的递送，比起需要给予大量蛋白质的常规疗法，有可能提供显著的优点。这些潜在优点包括例如治疗性分子在患者细胞中的长期和受调节的表达，导致治疗功效最大，副作用最小，而且毒性和传染性杂质及全身性杂质得以避免。例如，递送大量蛋白质进行疾病治疗已知会导致不良副作用，包括例如与传染性和毒性杂质有关的副作用、全身性毒性、注射部位坏死、流感样症状、寒战、发热、疲劳、厌食和体重减少。在一些情况下，这些事件是剂量限制性的，可能会导致治疗完全停止。此外还知道，连续暴露于一些蛋白质治疗药物可能会导致随时间推移发生耐性。因此，需要调节表达系统，它可提供持续或长期的治疗有效水平的治疗性分子，另外一个特点是能将治疗性分子的水平快速降低或调整在动态治疗窗当中的方法。更具体地说，需要调节表达系统，它能够在治疗性分子的浓度达到潜在毒性水平时被关闭。此外，能够对治疗性分子的水平进行滴定的能力允许在随时间推移有可能对治疗性分子的耐性增加的情况下调节剂量。特别有意义和需要的是编码治疗性蛋白质的基因的递送，该蛋白质能在目标治疗患者细胞中表达，以治疗会导致疾病或由疾病所引起病况，或者终止或延緩疾病的进展。例如，许多疾病状态的病源起因于一种或多种缺陷性基因产物的表达或者一种或多种基因产物的缺陷性表达，例如分别为变异蛋白质的表达或者蛋白质的过量表达或表达不足。因此，常规的治疗方法包括给予重组蛋白质以矫正这种缺陷性的蛋白质表达或缺陷性蛋白质的表达。但是，将蛋白质治疗药物给予患者已知会导致产生抗该蛋白质的抗体和治疗对象免疫系统将该蛋白质作为外来物排斥。治疗多发性硬化症的已知方法包括给予IFN-)3蛋白质治疗药物。多发性硬化症是中枢神经系统的慢性炎性自身免疫疾病，影响北美大约40万人和全球大约100万人。多发性硬化症这种疾病影响的女性比男性多，通常在20-40岁之间发作。此外，该病是进行性疾病，早期阶段的特征为复发和緩解期，特点是数小时至数天的亚急性神经功能异常的"发作"或"复发'，，接着是可能持续数月的改善期(B.M.Keegan等，(2002)Annu.Rev.Med.53:258-302;J.Noseworthy(2000)343:938-52)。其症状包括例如眼睛、肢体和中轴肌的协调运动受到破坏而导致瘫痪。疾病过程可发展数年，致使神经症状恶化，直到患者变得严重残废。多发性硬化症的症状和征候能反映大脑神经元轴突的脱髓鞘情况，脱髓鞘会导致神经脉冲沿轴突的传导受损。此外，多发性硬化症的病理可自身表现为急性局灶性炎性脱髓鞘和轴突损失，最终导致例如慢性多灶性硬化斑块，该病因此而得名(A.Compston和A.Coles(2002)Lancet359:1221-31;L.Steinman(1996)Cell85:299-302)。多发性硬化症迄今还无法治愈，几乎所有一皮批准的治疗法都是靶向该病的炎性成分。由ScheringAG于1993年最先引入的重组(3千扰素(IFN-(3)代表了多发性硬化症治疗的突破，因为它在降低多发性硬化症患者复发数(每年总体降低30-37%)、减慢疾病进展和减少与疾病相关的残疾方面显示出明显的优势。这些作用表现为由磁共振成像(MRI)测出受治疗患者大脑中的脱髓鞘损伤数量显著降低。目前有三种IFN-P产品净皮批准用于复发-緩解形式的多发性硬化症1)Betaseron⑧或Betaferon(Scliering);2)Avonex(Biogen)和3)Rebif(Serono)。另夕卜，Betaseron⑧在欧盟(EU)、加拿大和欧洲(Europe)已被批准用于继发-进行性多发性硬化症。这些获批准的IFN-J3产品是纯化的重组蛋白质制品。在Betaseron/Betaferon(IFN-J31b)的情况中，重组蛋白质可从表达该蛋白质的细菌细胞培养物(例如大肠杆菌)纯化。在Avonex和Rebif(IFN-Pla)的情况中，重组蛋白质从表达该蛋白质的哺乳动物细胞培养物纯化。这些针对多发性硬化症的IFN-p产品通过皮下(s.c.)或肌肉内(i.m.)大剂量(bolus)蛋白质溶液注射给予，给予频率为每周一次到每隔一天一次。此外，I型干扰素(例如IFN-(3)已被批准用于多发性硬化之外的几种指征，包括几种癌症和病毒性疾病指征。但是，已知这种IFN蛋白质治疗药物会引起剂量依赖性副作用，例如患者中的流感样症状、恶心和白细胞减少(E.U.Walther(1999)Neurology53:1622-27)。这些副作用会导致对进一步IFN治疗的不耐性。而且还已知，一些接受皮下(s.c.)或肌肉内(i.m.)注射IFN蛋白的患者出现会发展成坏疽的局部注射位点反应，这会导致IFN治疗的停止(A.Bayas和R.Gold(2003)J.Neurol.250(4):IV3-IV8)。另外还已知，一些进行多发性硬化症的IFN-|3疗法的患者会产生中和性抗体，这些抗体随时间推移可限制药物疗效(S.M.Malucchi(2004)Neurology62:2031-37)。最后，药物动力学研究显示IFN在循环中的半寿期短，重组蛋白质大量递送给患者后几小时其水平就变得不可检测(R.WilsClin.Pharmacokinet.19:390-99;P.Salmon等，J.InterferonCytokineRes.16:759-64;P.-A.Buchwalder等，(2000)丄InterferonCytokineRes.20:57-66)。因此，需要进行治疗性蛋白质的基于基因的递送(gene-baseddelivery)来治疗疾病，这种递逸方式提供蛋白质的受调节的长期表达，在实现治疗功效的同时使剂量限制性毒性副作用减至最低。这种调节表达系统能避免许多与现有蛋白质治疗药物有关的重大限制性因素。但是，大多数已知的核酸递送系统不适合于临床应用，不能在细胞中产生受调节的或长期的表达。只有少数已知的核酸递送系统据报道在实验室条件下有能力调节转基因表达，但这些递送系统对临床应用的适用性和可操作性还未知(参加例如M.Gossen和H.BujardScience268:1766-69;D.No等，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:3346-51;丄F.Amara等，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:10618-23;Y.Wang(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:8180-84;丄L.Nordstrom(2002)13:453-58)。发明概述本发明提供用于疾病治疗的改进的表达系统，其用于受编码的蛋白质或核酸治疗性分子的调节表达，其中治疗性分子的治疗功效可得到最大化，而副作用减至最低。具体地说，本发明提供改进的调节基因表达系统、其用于疾病治疗的药物组合物和方法。受编码治疗性分子可以是能给患病或易患病对象提供治疗益处的核酸或蛋白质。例緩解、稳定化或预防。在一个方面，本发明提供改进的调节表达系统，其包含至少第一表达盒，该表达盒具有编码治疗性分子的核酸序列，使得当该表达系统被递送给对象的细胞时，编码的治疗性分子得到表达，且治疗性分子的表达和/或活性在调节性分子的存在下受到调节。这种调节的实例阻遏、增加或降低。在本发明的一个方面，治疗性分子的表达和/或活性以剂量响应性或剂量依赖性方式受到调节，例如根据对象细胞中存在的或给予对象的调节性分子的数量来调节。在其它方面，治疗性分子的表达和/或活性以剂量响应性或剂量依赖性方式受到调节，例如根据对象细胞中存在的或给予对象的激活性分子(activatormolecule)或失活性分子(inactivatormolecule)的H量来i周节。在本发明的另一个方面，治疗性分子的表达和/或活性是方向依赖性的。例如，在一个方面，治疗性分子在细胞中的表达和/或活性根据编码治疗性分子的表达盒的5'-3'方向受到调整，或者根据编码的治疗性分子的转录或翻译的5'-3'方向受到调整。因此，治疗性分子的表达性分子的转录或翻译的方向来调整。在另一个方面，本发明的调节表达系统还包含编码调节性分子的第二表达盒，使得当该表达系统递送到对象的细胞时，表达编码的调节性分子，其存在能调节治疗性分子的表达和/或活性。在一个优选方面，本发明的编码治疗性分子的第一表达盒和编码调节性分子的第二表达盒存在于单一运载体中。在另一个优选方面，该单一运载体是pGT23、pGT24、pGT25、pGT26、pGT27、pGT28、pGT29或pGT30。在又一个优选方面，该单一运载体是pGT54、pGT57、pGT713、pGT15或pGT16。本发明的治疗性分子可以是具有治疗活性的分离的DNA、RNA或者由核酸序列编码的蛋白质或其变体。更具体地说，本发明的治疗性分子可以是修饰的、合成的或重组的DNA、RNA或蛋白质。在本发明的另一个方面，编码的治疗性分子是具有治疗活性的核酸，例如DNA或RNA。在本发明的一个方面，受编码治疗性分子是RNA，例如siRNA或shRNA。在本发明的另一个方面，受编码治疗性分子是具有治疗活性的蛋白质，优选人蛋白质或其变体。在一个方面，受编码治疗性分子是具有治疗活性的单克隆抗体。在一个方面，受编码治疗性分子是单克隆抗体CAMPATH。在另一个方面，编码这种蛋白质的核酸序列是基因或基因片断。在一个方面，受编码治疗性分子是粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)或其变体(例如Leukine)。在另一个方面，受编码治疗性分子是干扰素，例如a干扰素(IFN-a)或(3干扰素(IFN-P),更具体地说是IFN-p-la。子。在一些方面，本发明的调节性分子是合成的或重组的分子。例如，在一些方面，本发明的调节性分子是化学化合物、DNA、RNA或蛋白质。此外，在一些方面，本发明的调节性分子是修饰的分子。在一个方面，调节性分子是人源化蛋白质。在另一个方面，调节性分子是人蛋白质或其变体。例如，在一个方面，调节性分子是转录激活剂，例如类甾醇受体，更具体地说孕酮受体。在一个方面，调节性分子包含反式激活域(例如VP16或p65反式激活域)。在另一个方面，调节性分子包含配体结合域(LBD)。此外，在一个方面，激活性分子结合调节性分子的配体结合域，从而激活调节性分子，使得被激活调节性分子的存在能调节治疗性分子表达和/或活性。在另一个方面，调节性分子包含DBD，例如GAL-4DBD。在一个方面，调节性分子包含结合DBD，其结合有效连接到编码治疗性分子的核酸的功能序列(例如启动子序列)，从而调节治疗性分子的表达(例如诱导治疗性分子表达)。在另一个方面，本发明的调节性分子被激活，从而治疗性分子表达和/或活性在受激活调节性分子的存在下受到调节。在一个方面，本发明的调节性分子在对象细胞中以非激活形式被表达或存在，并在激活性分子的存在下被激活，从而治疗性分子表达和/或活性受到激活的调节性分子的调节。在一个方面，激活性分子是生物标志。在又一个方面，激活性分子是疾病或病症的生物标志，更具体地i兌是疾病状态或病症或其症状的生物标志。在一个方面，激活性分子通过促进或抑制调节性分子的构象变化、酶促加工或修饰、特异性结合或二聚化来激活调节性分子。在一个优选方面，激活性分子通过促进调节性分子的同型二聚化来激活调节性分子。本发明的激活性分子可以是天然分子或其变体，或者是分离的分子。在一些方面，本发明的激活性分子是合成的或重组的分子。例如，在一些方面，本发明的激活性分子是化学化合物、DNA、RNA或蛋白质。此外，在一些方面，本发明的激活性分子是》务饰的分子。在一个方面，激活性分子是人源化蛋白质。在另一个方面，激活性分子是人蛋白质或其变体。在一个方面，激活性分子是化学化合物，例如抗孕激素。在一个优选方面，激活性分子是米非司酮。在另一个方面，本发明的调节性分子被失活，从而治疗性分子表达和/或活性在失活调节性分子的存在下受到调节。在一个方面，本发明的调节性分子在对象细胞中以激活形式被表达或存在，并在失活性分子的存在下^f皮失活，从而治疗性分子表达和/或活性受到失活调节性分子的调节。在一个方面，失活性分子是生物标志。在又一个方面，失活性分子是疾病或病症的生物标志，更具体地说是疾病状态或病症或其症状的生物标志。在一个方面，失活性分子通过促进或抑制调节性分子的构象变化、酶促加工、特异性结合或二聚化来失活调节性分子。在一个优选方面，失活性分子通过抑制调节性分子的同型二聚化来失活调节性分子。子。在一些方面，本发明的失活性分子是合成的或重组的分子。例如，在一些方面，本发明的失活性分子是化学化合物、DNA、RNA或蛋白质。此外，在一些方面，本发明的失活性分子是修饰的分子。在一个方面，失活性分子是人源化蛋白质。在另一个方面，失活性分子是人蛋白质或其变体。在一个优选方面，失活性分子是化学化合物。本发明的治疗性分子、调节性分子、激活性分子或失活性分子的表达可以是组成型表达或瞬时表达。在一些方面，治疗性分子、调节性分子、激活性分子或失活性分子的表达受到调节或者是组织特异性的(例如肌肉特异性的)。受调节的调节性分子的实例包括但不限于被发明治疗性分子、调节性分子、激活性分子或失活性分子的表达由受调节的启动子或组织特异性启动子驱动。在又一个方面，受调节的或组织特异性的启动子在调节性分子的存在下受到调节，更具体地说受到调节性分子与启动子的结合的调节。例如，在一个方面，本发明的调节性分子结合有效连接到编码治疗性分子的核酸序列的启动子，从而调节本文所述受编码治疗性分子在对象细胞中的表达。在一个方面，有效连接到编码治疗性分子的核酸的启动子包含至少一个GAL-4DNA结合位点(DBS)，优选包含3-18个GAL-4DBS。在另一个方面，启动子是PolII或PolIII启动子。在一个方面，启动子是PolII启动子U6H1。在另一个方面，启动子是选自以下的PolII启动子肌肉肌酸激酶启动子(MCK)、包含低氧反应元件的启动子(HRE启动子)、内皮白细胞粘附分子(ELAM)启动子、嵌合启动子(例如CMV/肌动蛋白嵌合启动子)、细胞周期蛋白A启动子和cdc6启动子。本发明还提供用于治疗疾病或病症的药物组合物和方法，其包含本文所述的本发明改进的调节表达系统。在特定的方面，本发明提供的药物组合物和方法用于治疗疾病或病况；调节治疗性分子的表达；给予治疗性分子；递送治疗性分子或者在对象细胞中表达治疗性分子，其中所述方法包括使细胞与本发明的调节表达系统相接触，使得受编码治疗性分子在细胞中得到表达，且这种治疗性分子表达在调节性分子的存在下受到调节。在一个方面，本发明提供用于治疗白血病、黑素瘤、肝炎和心肌病的药物组合物和方法。在一个优选的实施方案中，本发明调节表达系统的受编码治疗性分子是用于治疗白血病、黑素瘤、肝炎或心肌病的IFN，例如IFN-a或IFN-卩。本发明的药物组合物包舍至少一种本文描述的表达系统，具体地说至少一种本发明的治疗性分子和调节性分子，更具体地说至少一种本发明的运载体(例如pGT23、pGT24、pGT25、pGT26、pGT27、pGT28、pGT29、pGT30、pGT54、pGT57、pGT713、pGT715、pGT716、pTR-mlFN-J3或pTR-hIFN-p)。在一些方面，本发明的药物组合物包含至少一种本发明激活性分子或失活性分子。在一个方面，本发明的药物组合物包含一种或多种编码至少一种治疗性分子和/或调节性分子的运栽体。本发明的治疗性分子、调节性分子、激活性分子和失活性分子，可用任何本文描述的或本领域公知的合适给予方法，单独或一起先体外后体内(exvivo)或体内(invivo)给予对象。这种合适给予方法的实例包括但不限于注射(例如皮下注射)、口服给予和电穿孔。在一个方面，本发明的治疗性分子和调节性分子存在于单一运载体中，并存在能调节治疗性分子表达和/或活性)。在又一个方面，激活性分子是口服给予的化合物(例如米非司酮)，编码治疗性分子和调节性分子的单一运载体是通过注射或电穿孔给予对象的细胞(例如骨骼肌细胞)的单一运载体。本发明还提供运载体和包含本发明改进的调节表达系统的药盒。在一些方面，本发明改进的调节表达系统包含一个或多个运载体，每个运载体包含一个或多个表达盒。在一个方面，本发明改进的调节表达系统包含具有至少一个表达盒、更优选至少两个表达盒的单一运载体。在一个优选方面，本发明改进的调节表达系统包含含有第一表达盒和第二表达盒的单一运载体，所述第一表达盒具有至少一个供编码治疗性分子的第一核酸序列插入的克隆位点，所述第二表达盒具有至少一个供编码调节性分子的第二核酸序列插入的克隆位点。在另一个方面，运载体是用于产生病毒的运载体，例如腺伴随病毒(AAV)穿梭质粒，更具体地说AAV-1穿梭质粒。在一个方面，本发明的运载体是非病毒运载体(即不产生病毒的运载体)，例如不产生病毒的质粒运载体。在一个优选的方面，运载体是包含克隆位点的本发明质粒运载体，该克隆位点用于插入包含治疗性分子编码序列的核酸序列。本发明的这种质粒运载体的实例包括但不限于pGTl、pGT2、pGT3、pGT4、pGTll、pGT12、pGT13或pGT14。本发明的表达盒包含用于本发明受编码分子(例如治疗性分子、调节性分子、激活性分子或失活性分子)的表达的功能序列。在一些方面，表达盒包含至少一个有效连接到编码本发明分子的核酸序列的功能序列。功能序列的实例包括但不限于5'或3'非翻译区(例如UT12)、内含子(例如IVS8)、poly(A)位点(例如SV40或hGHpoly(A)位点)或DNA结合位点(DBS)(例如GAL-4DBS)。在一个方面，功能序列包含至少一个GAL-4DBS，优选包含GAL-4DBS的多聚体(例如3-18个GAL-4DBS)。这种功能序列还包括例如编码受调节启动子或组织特异性启动子的序列，所述受调节启动子或组织特异性启动子分别促进由有效连接到本发明表达盒中这种功能序列的核酸序列所编码的分子的受调节表达或组织特异性表达。在另一个方面，本发明的表达盒包含至少一个克隆位点，更优选多克隆位点(MCS)，用于插入编码本发明分子例如治疗性分子、调节性分子、激活性分子或失活性分子的核酸序列。在一个方面，本发明的第一表达盒包含着供插入编码治疗性分子的第一核酸序列的MCS、包含有至少一个DBS(例如3-18个GAL-4DBS)的可诱导启动子、5'非翻译区(例如UT12)、内含子(例如IVS8)和hGHpoly(A)位点，使得当第一核酸序列在MCS插入时，这些功能序列有效连接到这个序列。在另一个方面，本发明的第二表达盒包含用于插入编码受调节调节性分子的第二核酸序列的MCS和SV40poly(A)位点，使得当第二核酸序列在MCS插入时，这些功能序列有效连接到这个序列。在一个优选方面，第一和第二表达盒存在于单一运载体中。本发明的药盒包含至少一种本文描述的本发明表达系统，更具体地说至少一种本发明的药物組合物、运载体或分子(例如治疗性分子、调节性分子、激活性分子或失活性分子)。附图简述由以下说明结合附图进阅读，可更加完全地理解本发明的前述目标和其它目标及其各种特征以及本发明本身，各附图简述如下图l说明本发明调节表达系统的非限制性实例。图1A说明本发明调节表达系统的一个非限制性实例，它包含l)第一表达盒，其包含编码治疗性分子(TM)的第一核酸序列和编码有效连接到第一核酸序列的DNA结合位点(DBS)和TATA序列的第一启动子序列；2)第二表达盒，其包含编码调节性分子(RM)的第二核酸序列和有效连接到第二核酸序列的第二启动子序列；3)表达的调节性分子，其为融合或嵌合蛋白，包含DNA结合域(DBD)、配体结合域(LBD)和调节域(RD);和4)分别使调节性分子激活和失活的激活性分子或失活性分子(A/IM)。在一个实施方案中，激活性分子结合调节性分子而使调节性分子激活，从而被激活的调节性分子结合有效连接到治疗性分子序列的启动子序列的DBS,导致细胞(例如哺乳动物细胞)中治疗性分子表达的诱导。在另一个实施方案中，第一和笫二表达盒存在于单一运载体中。图1B说明本发明调节表达系统的一个非限制性实例，它包含l)第一表达盒，其包含编码治疗性分子(TM)的笫一核酸序列和编码有效连接到第一核酸序列的DBS和TATA序列的第一启动子序列；2)第二表达盒，其包含编码调节性分子(RM)的第二核酸序列和有效连接到第二核酸序列的第二启动子序列；3)表达的调节性分子，其为融合或嵌合蛋白，包含DBD、LBD和激活域(AD);和4)激活性分子或失活性分子(A/IM)。在一个实施方案中，激活性分子结合调节性分子而使调节性分子激活，从而被激活的调节性分子形成同型二聚体，后者结合有效连接到治疗性分子序列的启动子的DBS，导致细胞(例如哺乳动物细胞)中治疗性分子表达的诱导。在另一个实施方案中，第一和第二表达盒存在于单一运载体中。图2说明用于产生重组蛋白质的鼠IFN-P和人IFN-(3质粒运载体。图2A和B分别说明用于产生重组蛋白质的鼠IFN-P表达运载体(A,pGER90(pCEP4/mlFN)和用于基于基因的递送研究的鼠IFN-(3表达运载体(B,pGER101(pgWiz/mlFN)。pGER90中存在的CMV启动子和增强子相对于转录起始位点从-831bp延伸到+1bp，无5'UTR或内含子。pGER101中存在的CMV序列包括从-674bp到+942bp的启动子、增强子、5'UTR和天然内含子A。图2C和D分别说明用于产生重组蛋白质的人IFN-(3表达运载体(C，pGER123(pCEP4/hlFN)和用于基于基因的递送研究的人IFN-p表达运载体(D,pGER125(pgWiz/hlFN)。图3说明小鼠中注射人IFN-J31a蛋白后的药代动力学曲线。C57BI/6小鼠通过静脉内或肌肉内注射给予25ng(低剂量)或250ng(高剂量)的重组hIFN-Pla。在注射后的指定时间点进行小鼠末梢放血获得血清样品(每个时间点小鼠n=4)，通过ELISA(Toray-FugiBio，BiosourceInternational)测定样品中的人IFN-|3水平。每个数据点代表平均值+/-标准偏差图4说明小鼠中肌肉内注射AAV-1-hIFN-P后的药代动力学曲线。C57/BI/6小鼠(每组n二6)肌肉内注射0.5x1010、1.0xlO"或5.0xl(T个AAV-l-hIFN-(3病毒颗粒。在注射后的指定时间点获取血液样品，通过ELISA测定hIFN-P血清水平。每个数据点代表平均值+/-标准偏差。图5说明mIFN-P的体外(L929纟田月包中)MxlRNA诱导。将L929细胞以5xl05个细胞接种于6孔板中，用递增数量的纯化重组mIFN-|3蛋白刺激。处理4小时后，收获细胞，分离RNA，用TaqMan分析定量MxlRNA。将MxlRNA表达以增加倍数对GAPDHRNA作图。图6说明在静脉内注射(A)或者肌肉内注射(B)mIFN-P蛋白后的MxlRNA诱导情况。C57BI/6小鼠通过静脉内注射(经尾静脉)或肌肉内注射(每组小鼠11=3)给予15、150或500ng纯化重组mlFN-l3蛋白。在注射后的指定时间点，将小鼠放血，从PBMC中分离RNA。用定量RT-PCR测定MxlRNA。将MxlRNA的增加倍数对相同样品中测出的GAPDH值进行表示。对照包括首次用于实验(naive)小鼠(N)和注射介质缓沖液并在注射后2小时(V2h)或4小时(V4h)只进行Mxl分析的小鼠。每个柱条代表平均值+/-标准偏差。图7说明在静脉内注射或者肌肉内注射鼠IFN-P蛋白后IP-10(A)和JE(B)的诱导水平。C57BI/6小鼠通过静脉内注射(经尾静脉)或肌肉内注射(每组小鼠n二3)给予15、150或500ng纯化重组mIFN-P蛋白(比活性=2.(^108单位/11^)。注射后2、4、6、12、24和48小时将小鼠放血，用ELISA(R&DSystems)测定IP-10和JE的血浆水平。图8说明小鼠肌肉内注射AAV-l-mIFN-卩DNA或mIFN-|3质粒DNA并进行电穿孔(EP)后IP-10的诱导情况。给正常小鼠(C57BI/6)肌肉内注射AAV-l-mIFN-P(5乂109个病毒颗粒)或mlFN-J3质粒DNA(150吗)并进行电穿孔。在指定的时间点将小鼠放血，用ELISA测定血浆中的IP-10水平。每个柱条代表平均值+/-标准偏差(每组小鼠n=5)。图9说明肌肉内注射mlFN-J3质粒DNA后MxlmRNA的诱导情况。将不同凄i:量的编码mlFN-(3的质粒DNA(62.5、125、250或500fig)肌肉内注射到小鼠后肢腓肠肌和胫骨肌，然后进行电穿孔(每组小鼠n=5)。在注射后的指定时间点将小鼠放血，从PBMC中分离RNA,用定量RT-PCR测定Mxl表达。将MxlRNA水平归一化到GAPDH表达，显示为与未处理对照(对照11=4)相比相对第0天测得的背景的诱导倍数。每个柱条代表平均值+A标准偏差。图10说明小鼠肌肉内注射AAV-l-mIFN-P病毒或mlFN-(3质粒DNA并进行电穿孔后MxlmRNA的诱导情况。给正常小鼠(C57BI/6)肌肉内注射AAV-l-mIFN-P(5xl0")个病毒颗粒)或mIFN-卩质粒DNA(150貼)并进行电穿孔。对照小鼠包括注射PBS的小鼠(肌肉内注射对照)和注射SEAP质粒(pSEAP)或表达SEAP的AAV-1(AAV-SEAP)的小鼠。在指定时间点将小鼠放血，从PBMC中分离RNA，用定量RT-PCR测定MxlRNA水平。将MxlRNA表达归一化到GAPDH表达，显示为相对注射PBS的对照小鼠中第O天测得的背景的诱导倍数。每个柱条代表平均值+/-标准偏差(每组小鼠n=5)。图11说明IFN-P蛋白在小鼠急性EAE模型(在实施例5和材料和方法A节中描述)中的功效。用100K单位IFN-(3处理的小鼠与用介质处理的小鼠相比，显示EAE临床分数显著下降(p^.0046)。用30K单位IFN-P处理的小鼠与用介质处理的小鼠相比，也显示临床分数下降，不过这个下降没有达到统计学显著性。本研究中的阳性对照Mesopram和泼尼松龙也显著降低临床分数。图12说明mIFN-P的基于基因的递送在鼠急性EAE模型中的功效。按材料和方法中所充分描述，在第1天用PLP/百日咳毒素免疫雌性SJL小鼠。在研究的第2天，给各组小鼠(每组小鼠n40)注射以PBS、空质粒(pNull)加电穿孔(EP)(pNull+EP，120吗)或者编码mIFN-P的质粒DNA(pmlFN-(3)加EP(pmIFN-卩+EP，120貼)。对于蛋白质递送，在研究的第1天开始每隔一天通过皮下注射将重组mIFN-P蛋白(IOO，OOO单位)给予另一组小鼠。相比于pNull+EP对照组，在pmIFN-|3+EP组观察到疾病严重性的显著降低(p-0.0171)。本研究的结果在材料和方法中作充分描述。图13说明IFN-P蛋白在小鼠急性EAE模型(在实施例5和材料和方法A节中作充分描述)中的功效。图14说明质粒运载体pGTl、pGT2、pGT3和pGT4(分别为A、这些实例中，本发明的调节表达运载体在单一质粒运载体中含有1)第一表达盒，其具有供编码治疗性分子的核酸插入的多克隆位点(MCS);和2)第二表达盒，其具有供编码调节性分子的核酸插入的克隆位点。如所描述和说明，这四个运载体各自提供了第一和第二表达盒相互间的不同方向。在第一表达盒中，骨骼肌启动子(skactinpro)、非翻译区12(UT12)、来自质粒pLC]674的间插序列8(IV8)位于MCS和人生长激素poly(A)位点(hGHpolyA)的上游。包含目标治疗性分子的核酸例如转基因可在MCS插入。图15说明本发明调节表达质粒运载体的非限制性实例，它们分别用以进行鼠IFN-|3(pGT23、pGT24、pGT25和pGT26)(A)或人IFN-|3(pGT27、pGT28、pGT29和pGT30)(B)的基于基因的递送。在这些实例中，本发明的调节表达运载体在单一质粒运载体中含有l)第一表达盒，其具有多克隆位点(MCS)和在MCS插入的编码人IFN-p基因或鼠IFN-(3基因的核酸；和2)第二表达盒，其具有克隆位点和在这个位点插入的编码调节性分子的核酸，所述调节性分子含有孕酮受体的修饰LBD(例如包含SEQIDNO:22氨基酸序列或由SEQIDNO:21核酸序列编码)。如材料和方法F节中所充分描述和说明，这些运载体各自提供第一和第二表达盒相互间的不同方向。图16说明实施例6C节中所充分描述的、在鼠骨骼肌细胞中对本发明hIFN-P调节的表达质粒运载体进行的体外确证。将组成型(pGER125)和诱导型(pGT27、pGT28、pGT29和pGT30)hIFN-|3质粒运载体转染到小鼠肌肉C2C12细胞中，用MFP(10nM)处理，收集培养基。用ELISA测定培养基的hIFN-P。显示了两个独立转染的平均值。质粒运载体pGS1694+pGER129是Valentis的双质粒系统，本发明人在其中插入了WFN-卩基因。本发明的调节表达运载体构建成hlFN-(3基因在正向(hIFN,—)或反向(hIFNr,—)方向，位于调节性分子框的上游或下游。图17说明实施例6C节中所充分描述的、在鼠骨骼肌细胞中对本发明mIFN-P调节的表达质粒运载体进行的体外确证。将组成型(pGER101)和诱导型(pGT23、pGT24、pGT25和pGT26)mlFN-(3质粒运载体转染到小鼠肌肉C2C12细胞中。转染24小时后，培养基用加入或不加MFP(10nM)的新鲜培养基替换。24小时后，收集培养基，用报道基因测定法进行mIFN-|3测定。图中显示三个独立转染的平均值。pGS1694+pGER127是Valentis的双质粒系统，本发明人在其中插入了mlFN-(3基因。本发明的调节表达运栽体构建成mIFN-|3在正向(hIFN,—)或反向(hIFNr,—)方向，位于调节性分子框的上游或下游。图18说明用本发明的pBRES-lmlFN-(3调节表达系统进行的体内MxlRNAi秀导。将组成型mlFN-P质粒运栽体(pGER101)和可诱导调节表达mIFN-(3质粒运载体(pGT26)注射和电穿孔到小鼠的胫骨肌和腓肠肌(每鼠150吗l)。注射后7天收集血液。小鼠在注射后的7-10天每天经口灌服用MFP(O."mg/kg)处理。在注射后11天和l8天收集血液。从血液分离PBMC,从PBMC制备RNA，用RT-PCR测定MxlRNA的水平。将Mxl表达水平归一化到GAPDH。结果以平均值(每组小鼠11=5)+/-标准偏差表示，如材料和方法C节所充分描述，使用pBRES-l-mIFN在无MFP存在下第7天显示极少或没有MxlRNA活性，在MFP存在下第11天显示强诱导，达到高于用CMV-mIFN所得的水平。在第18天，在MFP不存在下，MxlRNA几乎降低到基线。图19说明用本发明的pBRES-1mIFN-(3调节表达系统进行的IP-10和JE诱导。将组成型mIFN表达质粒(pGER101)和诱导型pBRES-lmlFN表达质粒(pGT26)注射和电穿孔到C57BI/6小鼠的后肢肌肉中。在第7天(MFP不存在)、第11天(连续四天口服给予MFP后)和第18天，将小鼠放血，用ELISA测定血浆的细胞因子IP-10和JE。结果以平均值(每组小鼠n-5)+A标准偏差表示，如材料和方法C节所充分描述，使用pBRES-l-mIFN在MFP不存在下第7天显示极少或没有细胞因子(IP-10和JE)活性，在MFP存在下第11天显示强诱导，达到高于用CMV-mIFN所得的水平。在第18天，在MFP不存在下，细胞因子水平回复到基线。图20说明材料和方法F节中所充分描述的、用于构建质粒运载体pGER(pgWiz/mlFN)(C)的质粒运载体pbSERl89(A)和pgWIZ(B)。图21说明材料和方法F节中所充分描述的质粒运载体pGER125(pgWiz/h顾)。图22说明材料和方法F节中所充分描述的质粒运载体pGene/V5画HisA。图23说明材料和方法F节中所充分描述的质粒运载体pGene-mIFN(pGER127)。图24说明材料和方法F节中所充分描述的质粒运载体pGene-h丽(pGER129)。图25说明材料和方法F节中所充分描述的质粒运载体pSwitch(Invitrogen)。图26说明材料和方法F节中所充分描述的质粒运载体pGS1694。图27说明材料和方法F节中所充分描述的质粒运载体pLC1674。图28说明材料和方法F节中所充分描述的pGT-hGMCSF和pGT-mGMCSF穿梭质粒及其构建。图29说明材料和方法F节中所充分描述的pZac2.1-RM-hGMCSF和pZac2.1-RM-mGMCSF(A)及pZac2.1陽CMV-hGMCSF(pGT713)和pZac2.1-CMV-mGMCSF(pGT714)(B)穿梭质粒及其构建。图30说明材料和方法F节中所充分描述的分别用于构建pZac2.1-RM-hGMCSF和pZac2.1-腹曙mGMCSF的pORF-hGMCSF和pORF9-mGMCSF。图31说明材料和方法F节中所充分描述的pGT715(A)和pGT716(B)穿梭质粒。图32说明用本发明的mIFN-(3调节表达质粒运栽体进行的体内IP-10诱导。将诱导型mlFN-(3表达质粒(pGT23、pGT24、pGT25和pGT26)注射和电穿孔到C57BI/6小鼠的后肢肌肉中。在第7天(MFP不存在)、第11天(连续四天口服给予MFP后)和第18天，将小鼠放血，用ELISA测定血清的细胞因子IP-IO。结果以平均值(每组动物n-5)+A标准偏差表示。图33说明用本发明的hIFN-P调节表达质粒运载体进行的体内hIFN诱导。将组成型(pGER125)和诱导型(pGT27、pGT28、pGT29和pGT30)hlFN-(3表达质粒注射和电穿孔到C57BI/6小鼠的后肢肌肉中。在第7天(MFP不存在)、第11天(连续四天口服给予MFP后)和第18天，将小鼠放血，用ELISA测定血清的hIFN。结果以平均值(每组动物11=5)+/-标准偏差表示。图34A说明用本发明的hEPO调节表达质粒运载体进行的体内hEPO诱导。将诱导型双质粒hEPO表达质粒(pGS1694+pEP1666)和单质粒BRES-lhEPO表达质4立(pGT27、pGT28、pGT29和pGT30)注射和电穿孔到C57BI/6小鼠的后肢肌肉中。每组有5只动物连续4天(第7-10天)通过腹膜内注射给予MFP,全部动物在最后一次MFP注射6小时后放血。每组余下的5只动物在没有进行MFP处理下在第10天放血。用ELISA测定血清的hEPO。结果以平均值(每组动物11=5)+/-标准偏差表示。图34B说明用本发明的hEPO调节表达质粒运载体进行的体内血细胞比容计数的诱导。将诱导型双质粒hEPO表达质粒(pGS1694+pEP1666)和单质粒BRES-1hEPO表达质粒(pGT27、pGT28、pGT29和pGT30)注射和电穿孔到C57BI/6小鼠的后肢肌肉中，按上文所迷对各动物进行MFP处理或不进行处理并放血。使血液凝结，在微毛细管(microcapillarytube)中离心，测量红细胞(RBC)百分数。结果以平均值(每组动物11=5)+/-标准偏差表示。图35说明用本发明的hlFN-J3调节表达AAV运载体进行的体内长期持续多重hIFN诱导。将诱导型hIFN-P表达AAV运载体AAV-1-GT58注射到C57BI/6小鼠的后肢肌肉中。如所指示在MFP不存在或存在(连续4天腹膜内注射)下，将动物放血，用ELISA测定血清的hIFN。结果以平均值(每组动物n-5)+A标准偏差表示。图36说明反复给予本发明的hIFN-P调节表达质粒运载体进行的、响应递增剂量MFP的体内长期持续多重IP-10诱导。在第0天，将诱导型mlFN-f3表达质粒pGT26注射和电穿孔到C57BI/6小鼠的后肢肌肉中。连续4天(第7-10天和第63-66天)通过腹膜内注射给予小鼠各种浓度的MFP，然后在随后的一天(笫11天和第67天)放血，在第77天和第189天再次注射质粒DNA。质粒再注射后的MFP处理分别在第84-87天和第196-199天进行。力文血分别在第88天和第200天进行。用ELISA测定血清的细胞因子IP-10。结果以平均值(每组动物11=5)表示。图37A说明用本发明的hIFN-(3调节表达AAV运载体进行的体内hIFN诱导的动力学。将诱导型hIFN-P表达AAV运载体AAV-1GT58注射到C57BI/6小鼠的后肢肌肉中。各动物连续4天通过腹膜内注射给予MFP,然后如图中所示在第一次MFP注射后的不同时间放血。用ELISA测定血清的hIFN。结果以平均值(每组动物11=5)+/-标准偏差表示。图37B说明用本发明的hIFN-P调节表达AAV运载体进行的体内hIFN去诱导(de-induction)的动力学。将诱导型hIFN-卩表达AAV运载体AAV-1GT58注射到C57BI/6小鼠的后肢肌肉中。各动物连续4天通过腹膜内注射给予MFP,然后如图中所示在最后一次MFP注射后的不同时间放血。用ELISA测定血清的hIFN。结果以平均值(每组动物11=5)+/-标准偏差表示。图37C说明用本发明的WFN-P调节表达质粒运载体进行的响应脉动或长期MFP治疗的mIFN诱导和去诱导的动力学，以及基因表达在数月里的持续情况。将組成型(pGER101,CMV)和诱导型(BRES-l,pGT26)mIFN表达质粒注射和电穿孔到小鼠的后肢肌肉中，如图中所示在MFP治疗前、治疗过程中或治疗之后的不同时间点将动物放血。用ELISA测定血清的细胞因子IP-IO。结果以平均值(每组动物n=5)表示。图38说明用本发明的mIFN-P调节表达质粒运载体进行的体内Mx-1诱导。将诱导型mIFN-(3表达质粒pBRES-1mIFN(pGT26)或pBRES-1Null-MFP(对照)质粒注射和电穿孔到患急性EAE的SJL小鼠的后肢肌肉中。小鼠在质粒注射后每天一次(d)或每三天一次(etd)通过腹膜内注射MFP(0.33mg/kg)进行处理。注射后第5天收集血液。从血液分离PBMC，从PBMC制备RNA,用RT-PCR测定MxlRNA的水平。将Mxl表达水平归一化到GAPDH。结果以平均值+/-标准偏差表示。发明详述本文引述的参考文献，包括例如专利、专利申请、期刊、书籍和网站出版物，通过引用整体结合到本文中。缩写AAV(腺伴随病毒)AAV-1(腺伴随病毒血清型1)AAV-2(腺伴随病毒血清型2)AM(激活性分子)AMP(氨苄青霉素)bp(石威基对)BRES-1(Berlex调节表达系统-1)BGH(牛生长激素)CMV(巨细月包病毒)DBD(DNA结合域)DNA(脱氧核糖核酸)EAE(实验性变态反应性脑脊髓炎)enh(增强子)ElbTATA(腺病毒Elb基因启动子TATA盒)EBNA-l(Epstein-Ban病毒核抗原)EDTA(乙二胺四乙酸)EF-la(延伸因子-la)ELAM(内皮白细胞粘附分子)ELISA(酶联免疫吸附测定)EP(电穿孔)EPO(促红细胞生成素)GAL-4(酵母GAL-4蛋白)6xGAL-4(六个拷贝的GAL-4DNA结合位点)GAPDH(甘油醛3-石寿酸脱氢酶)GMCSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)hGMCSF(人粒细胞巨噬细胞集落刺激因)hIFN(人干扰素)hIFN-(3(人(3干扰素)hr(小时)HR(激素受体)HRE(低氧反应元件)hGH(人生长激素)hPR(人孕酮受体)HTLV(人T细胞嗜淋巴细胞病毒)HSV(单纯疱渗病毒)Hygro(潮霉素)IFN-(3(干扰素|3)IFN-(31a(干扰素卩a)IFNf3lb(干扰素Plb)IFNsigseq(干护u素信号序列)IgK(免疫球蛋白K)i.m.或IM(月几肉内)inj.(注射)INR或inr(转录起始子元件)IP-10或IP-10(干扰素a可诱导蛋白10)ITR(末端反向重复序列)i.p.或IP(腹膜内)IVS8(间插序列或内含子8)i.v.或IV(静脉内)JE(MCP-1的鼠类似物)kDA(千道尔顿)kan(卡那霉素)KanR(卡那霉素抗性基因)LBD(配体结合域)MCP-1(单核细胞趋化蛋白)MCS(多克隆位点)MFP(米非司酮)mg(毫克)mGMCSF(小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)mIFN(鼠干扰素)mIFN-卩(鼠干扰素|3)ml(毫升)min(分钟)MCK(肌肉肌酸激酶)Mxl(MxA的鼠同系物)MxA(人黏病毒蛋白)ng(纟内克)ORF(可读框)On(复制起点)OriP(Epstein-Barr病毒的复制起点)pBRES(质粒Berlex调节表达系统)p65(NFkappaBp65蛋白的转录调节域)PBS(磷酸緩冲盐水)PEG(聚乙二醇)PINC(保护性相互作用性非缩合聚合物)Pg(皮克)pk(药物动力学)polyA或poly(A)(聚腺苷酸化位点)PR(孕酮受体)pro(启动子)PTK(单纯疱渗病毒胸苷激酶基因的启动子)pUCori(pUC质粒的复制起点)r(反向)RM(调节性分子)RNA(核糖核酸)rpm(每分钟转数)RT(室温)s.c.或SC(皮下)SEAP(分泌型碱性磷酸酶)SHR(类甾醇激素受体)shRNA(短发夹RNA)siRNA(小干扰RNA)skactinpro(骨駱肌启动子)SkM或Sk(骨骼肌)SV40(猿猴病毒40)TK(胸普激酶)TKpA(胸香激酶polyA)TM(治疗性分子)UbiB(遍在蛋白B)吗(微克)5'UTR(5'非翻译区)UT12(非翻译区12)VP-16(疱疹病毒VP-16反式激活域)vol.(体积)WPRE(旱獭转录后调节元件)技术和科学术语本文所用的技术和科学术语其含义为本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义，除非另有定义。本文提到了本领域普通技术人员公知的各种方法。阐明所提到的这种公知方法的出版物和其它资料，通过引用如同全文提出一样整体结合到本文中。阐明重组DNA技术的一般原理的标准参考资料包括Sambrook,J.等，(1989)Mo/ecw/arC7ow/wg，丄"Z)oratoryMa"wcr/,第二片反，ColdSpringHarborLaboratoryPress,Planview,N.Y.;McPherson,M.J.(编辑)(1991)Z),>ecfec/A/w^afgewes/s.-^尸rac,/ct//^4/7/roac/z,LRLPress,Oxford;Jones,J.(1992)J〃7/"0y4cz't/;^尸，/cfeS声/wXOxfordSciencePublications,Oxford;Austen,B.M.和Westwood，O.MR.(1991)7V他,力7，ar妙力g和&cr"/w，IRLPress,Oxford。任何本领域普通技术人员公知的合适材料和/或方法都可用来实施本发明，但本文描述了优选的材料和/或方法。在以下描述和实施例中提到的材料、试剂等可获自商业来源，除非另有指明。调节表达系统本发明改进的调节表达系统是高度创新的技术，它提供编码能被递送到对象细胞中并在其中表达的治疗性分子的核酸，使得被表达的治疗性分子的表达和/或活性可以调节，从而给对象提供治疗益处以治疗疾病。本发明的调节表达系统的优点在于，它使治疗性分子例如蛋白质或核酸得以在对象细胞中受到紧密调控表达。本发明的另一个优点在于，它使治疗性分子的表达和/或活性得以在对象细胞中以剂量依赖性或方向依赖性方式(如本文所述)进行，例如分别取决于存在于或给予对象的调节性分子的量或者编码治疗性分子的核酸的方向。因此，本发明的组合物和方法的又一个优点在于，它们可用于以对对象的疾病或疾病状态特异的方式优化治疗。本发明表达系统的还一个优点在于，它可包含单一核酸运载体，该运载体可通过单次注射给予对象。因此，本发明表达系统提供了优于已知的基于核酸的疗法或基于大剂量蛋白质的疗法的显著优点。具体地说，本发明的表达系统提供治疗性分子(例如蛋白质或核酸)在对象细胞中的受调节的长期表达，在产生治疗功效的同时使剂量限制性副作用减至最低。更具体地说，使用本发明表达系统的基因疗法可提供蛋白质的受调节的长期表达，从而使该蛋白质的剂量限制性副作用减至最低，而治疗功效最大化，以对对象的疾病进行治疗。例如，已证实干扰素(3(IFN-P)对患多发性硬化症的对象来说是减少该病的严重程度和减慢其进展的有效蛋白质药物。但是，已知IFN-J3的循环半寿期短。此外，该蛋白质的频繁局部给予可能会引起剂量依赖性副作用。但是，使用本发明的调节表达系统，可将编码IFN-P(例如IFN-P-la)的核酸给予对象的细胞，受编码IFN-(3在细胞中的表达可得到长期调节和优化，以获得IFN-p药物在多发性硬化症治疗中的最大治疗功效和最小剂量限制性副作用。在一个实施方案中，激活性分子是可口服丸剂形式的小分子激活剂，控制由本发明调节表达系统的核酸序列编码的治疗性分子的启动子诱导和随后的表达。这样，表达的治疗性分子(例如蛋白质或核酸)在对象的循环中的水平，能以开/关方式和/或剂量依赖性方式得到紧密调节。本发明的激活性分子可直接或间接控制治疗性分子的表达。例如，在一个实施方案中，激活性分子将调节性分子激活，激活的调节性分子的存在因而调节(例如诱导)治疗性分子在对象细胞中的表达。因此，本发明的调节表达系统的另一个优点在于，它使得可以选择对象细胞中表达的治疗性分子(例如蛋白质或核酸)的连续疗法或者脉动疗法(pulsatiletherapy)，和调节治疗性分子的表达水平，以使治疗性分子的治疗功效最优化，同时使其任何副作用减至最低。具体地说，本发明的调节表达系统第一次使得可以在多发性硬化症的对象中选择连续持久或者脉动的IFN-P蛋白疗法。此外，本发明的另一个优点在于，它通过编码治疗性分子的核酸运载体的反复给予，可提供治疗性分子在对象细胞中的可再生表达。更具体地说，本发明调节表达系统使得可以通过调节和优化治疗性分子在对象细胞中的表达水平，进行对象特异性或疾病特异性疗法，以得到最大治疗功效和最小副作用。本文所用的"对象特异性"或"疾病特异性"疗法是指对有特定疾病、疾病阶段或疾病状况或症状的对象特异的治疗。例如，使用本发明的调节表达系统，在多发性硬化症对象的细胞中表达的IFN-P水平可得到调节和优化，以获得最大治疗功效和最小副作用，来治疗多发性硬化症的特定病症、症状或阶段(例如复发、緩解、原发性进展或继发性进展)；或者根据对象对IFN-(3的反应或耐受性。更具体地说，本发明提供改进的调节基因表达系统、其药物组合物和方法用于疾病治疗。受编码治疗性分子可以是为患病或易患病对象提供治疗益处的核酸或蛋白质。本文所用的"治疗益处"或"治疗活性'，包括但不限于疾病或疾病症状或状况的改善、调节、緩解、抑制、稳定化或者发作或进展上的预防、延迟或减慢。本文所用的"对象"是指哺乳动物(例如人类)，更具体地说指需要疾病治疗的哺乳动物。"治疗"或其语法上的等同词语是指给对象提供针对疾病，包括疾病的阶段、症状或状况的治疗益处。本文所用的"疾病"涵括疾病的阶段、症状、状况或病理，或者对疾病的遗传易感性。这种疾病可以是自身免疫疾病或炎性疾病。在一些实施方案中，疾病是癌症。在一些实施方案中，疾病例如是多发性硬化症、白血病、黑素瘤、肝炎或心肌病。此外，本发明改进的调节表达系统提供了在动物基因组(例如鼠基因组)中用于工程化变化的新途径，使得动物模型中的基因功能可进行准确的分析，且可产生出可靠的人类疾病动物模型(例如鼠模型)。具体地说，本发明改进的调节表达系统提供了极具价值的生物医学研究工具，因为使用本发明系统能以时间和空间特异性方式调节动物基因组中的靶分子例如靶基因(或者本发明的其它分子)的表达。此外，本发明改进的调节表达系统提供了在体外和体内进行靶shRNA的选择性表达或独特表达的新途径。例如，使用本发明的调节表达系统，可对基于聚合酶II(POLn)的表达系统进行修饰，以选择性地和独特地产生靶shRNA。例如为独特地产生耙shRNA,可将本发明的调节表达系统修饰和用来产生shRNA:将POLII启动子有效连接到含有内含子的基因，所得的剪接内含子通过加入MIR序列进行加工，以表达靶shRNA。同样例如，可将本发明运载体的靶向调节性分子蛋白质的GAL-4结合位点和本文描述的表达盒插入到U6启动子的上游，以产生调节性分子响应性系统，另外的潜在修饰可为用聚合酶m(Polin)激活剂(例如Oct-2Q)替换p65反式激活蛋白。在一个实施方案中，本发明提供改进的调节表达系统，其包含至少第一表达盒，该表达盒具有编码治疗性分子的核酸序列，使得当递送给对象的细胞时，受编码治疗性分子得到表达，且治疗性分子的表达和/或活性在调节性分子的存在下得到调节。本文所用的本发明分子(例如治疗性分子)的活性和/或表达的"调节"，是指对该分子的表达和/或活性的调控，导致例如这种分子的活性和/或表达的诱导、阻遏、增加或减少。这种调节的更多实例包括但不限于对本发明分子(例如治疗性分子)的数量、构象、信号转导、结合特异性、半寿期、稳定性或者其它细胞修饰或加工的调控。在优选的实施方案中，本发明表达系统的治疗性分子受到调节。但是，适合于在本发明表达系统中调节的失活性分子。在本发明的一个实施方案中，治疗性分子的表达和/或活性以剂量响应性或剂量依赖性方式得到调节，例如根据存在于对象细胞中或给予对象的调节性分子的数量。在其它实施方案中，治疗性分子的表达和/或活性以剂量响应性或剂量依赖性方式得到调节，例如根据存在于对象细胞中或给予对象的激活性分子或失活性分子的数量。在一个实施方案中，治疗性分子的表达和/或活性以剂量响应性或剂量依赖性方式得到调节，例如根据存在于对象细胞中或给予对象的相同治疗性分子或不同治疗性分子的数量。本文所用的"剂量响应性"或"剂量依赖性"是指本发明分子(例如治疗性分子)的表达和/或活性与存在于对象细胞中或给予对象的第二种分子的具体剂量或数量之间的相关性。这种第二种分子的实例包括但不限于调节性分子、激活性分子、失活性分子或治疗性分子。第二种分子的更多实例包括细胞分子例如生物标志(如疾病相关生物标志)。本文所用的"对象细胞"是指来自本文所述对象的自体细胞，或者不是来自对象、但递送给或给予对象的异源细胞。优选地，自体细胞存在于对象中，异源细胞递送给对象并存在于其中。在优选的实施方案中，将本发明的组合物例如编码治疗性分子和/或调节性分子的运载体体内递送给对象的自体细胞，使得编码的分子在对象中存在的细胞中表达。在一个实施方案中，将本发明的组合物例如编码治疗性分细胞，然后将处理过的细胞递送给对象，使得编码的分子在对象中存在的细胞中表达。在本发明的另一个实施方案中，治疗性分子的表达和/或活性是方向依赖性的。本文所用的"方向依赖性"是指编码本发明治疗性分子的表达盒的5'-3'方向，或者本发明的受编码治疗性分子的转录或翻译的5'-3'方向，在一些实施方案中，所述方向为相对于包含表达盒或编码治疗性分子的运载体；相对于相同运载体上的另一个表达盒的方向；或者相对于相同运载体所编码的另一个分子的表达方向。例如，在一个实施方案中，治疗性分子在细胞中的表达和/或活性沿编码治疗性分子的表达盒的5'-3'方向得到调节，或者沿受编码治疗性分子的转录或翻译的5'-3'方向得到调节。因此，治疗性分子表达和/或活性可通或翻译的方向来调节。本发明的调节表达系统包含至少一个编码治疗性分子的表达盒，且可包含编码一种或多种本发明分子例如治疗性分子、调节性分子、激活性分子或失活性分子的另外表达盒。此外，一个或多个表达盒可存在于单一运栽体中，或者存在于一个以上运载体中。此外，本发明并不限于单个的治疗性分子、调节性分子、激活性分子或失活性分子，而是涵括具有一个或多个或众多本发明治疗性分子、调节性分子、激活性分子或失活性分子的实施方案，它们可单独或一起存在于单一运载体中或一个以上运载体中。本文所用的"运载体"是指适合于在细胞中插入和表达编码一种或多种本发明分子例如治疗性分子、调节性分子、激活性分子或失活性分子的核酸序列。本文所用"表达盒，，是指编码本发明分子(例如蛋白质或核酸、治疗性分子、调节性分子、激活性分子或失活性分子)在细^L中表达所必需的成分或功能序列的核酸，其中所述分子由有效插入到表达盒中(例如在表达盒中的克隆位点)和有效连接到表达盒功能序列的核酸序列编码。本文所用的"有效连接"或"有效插入"的一个或多个序列是指与其它序列融合、连接、附加或以其它方式关联在一起的一个或多个序列，使得各个序列发挥预期、已知的功能和/或实现特定的结果(例如有效连接到基因序列的启动子序列促进受编码基因的表达)。图1A和1B说明了本发明调节表达系统的非限制性实例，其包含l)第一表达盒，其包含编码治疗性分子的第一核酸序列和编码有效连接到第一核酸序列的DNA结合位点(DBS)和TATA序列的第一启动子序列；2)第二表达盒，其包含编码调节性分子的第二核酸序列和有效连接到第二核酸序列的第二启动子序列，其中所述调节性分子包含DNA结合域(DBD)、配体结合域(LBD)和调节域(RD)，所述调节域更具体地说在图1B中为激活域(AD);和4)分别使调节性分子激活和使调节性分子失活的激活性分子或失活性分子，它们使得:故激活或失活的调节性分子的存在能调节治疗性分子的表达和/或活性。在一个实施方案中，第一表达盒包含以下有效连接的功能序列6xGAL-4DBS、ElbTATA和转录起始位点(例如SEQIDNO:1)、5'非翻译区UT12(例如SEQIDNO:2)、合成内含子IVS8(例如SEQIDNO:3)、多克隆位点(例如SEQIDNO:4或SEQIDNO:5)、人生长激素(hGH)聚腺苷酸化(poly(A))位点(例如SEQIDNO:6);第二表达盒包含以下有效连接的功能序列鸡骨骼肌a-肌动蛋白启动子(例如SEQIDNO:7)和SV40poly(A)位点(例如SEQIDNO:8)。在一个优选的实施方案中，第一和第二表达盒存在于单一运载体中(例如如图IA-B所图示)。在另一个优选的实施方案中，运栽体是单一质粒运栽体，例如pGTl(包含序列SEQIDNO:9和SEQIDNO:4)、pGT2(包含序列SEQIDNO:10和SEQIDNO:4)、pGT3(包含序列SEQIDNO:11和SEQIDNO:4)或pGT4(SEQIDNO:12)，其中每个运载体包含位于IVS8的3'和hGHpoly(A)位点的5'的多克隆位点(SEQIDNO:4)(例如如图14A-D所示意说明)，或者pGTll(包含序列SEQIDNO:9和SEQIDNO:5)、pGT12(包含序列SEQIDNO:10和SEQIDNO:5)、pGT13(包含序列SEQIDNO:11和SEQIDNO:5)或pGT14(包含序列SEQIDNO:12和SEQIDNO:5),其中每个运载体包含位于IVS8的3'和hGHpoly(A)位点的5'的多克隆位点(SEQIDNO:5)。此外，在优选的实施方案中，治疗性分子是IFN-P或GMCSF。例如，在一个实施方案中，第一核酸序列编码的治疗性分子为包含SEQIDNO:13氨基酸序列的人IFN-卩la，由SEQIDNO:14核酸序列编码。在另一个实施方案中，第一核酸序列编码的治疗性分子为包含SEQIDNO:15氨基酸序列的小鼠IFN-(3，由SEQIDNO:16核酸序列编码。在另一个实施方案中，第一核酸序列编码的治疗性分子为包含SEQIDNO:17氨基酸序列的人GMCSF,由SEQIDNO:18核酸序列编码。在另一个实施方案中，第一核酸序列编码的治疗性分子为包含SEQIDNO:19氨基酸序列的小鼠GMCSF,由SEQIDNO:20核酸序列编码。此外，在优选的实施方案中，调节性分子是野生型或天然孕酮受体(PR)的变体。例如，在一个实施方案中，第二核酸序列编码的调节性分子为包含SEQIDNO:22氨基酸序列的突变PR,由SEQIDNO:21核酸序列编码。在优选的实施方案中，编码治疗性分子的核酸序列^f皮插入或克隆到单一质粒运载体的第一表达盒的MCS的SpeI和NotI限制酶位点中。在一个实施方案中，包含编码治疗性分子的核酸序列的单一质粒运载体是例如pGT23(SEQIDNO:23)、pGT24(SEQIDNO:24)、pGT25(SEQIDNO:25)或pGT26(SEQIDNO:26)，其中受编码治疗性分子是小鼠IFN-J3(例如包含SEQIDNO:15氨基酸序列和/或由SEQIDNO:16核酸序列编码)，受编码治疗性分子和;故插入核酸序列的转录的5'-3'方向在图15A中图示说明(见箭头)。在另一个实施方案中，包含编码治疗性分子的核酸序列的单一质粒运载体是例如pGT27(SEQIDNO:27)、pGT28(SEQIDNO:28)、pGT29(SEQIDNO:29)或pGT30(SEQIDNO:30),其中受编码治疗性分子是人IFN-(3(例如包含SEQIDNO:13氨基酸序列和/或由SEQIDNO:14核酸序列编码)，受编码治疗性分子和被插入核酸序列的转录方向在图15B中图示说明(见箭头)。此外，在一个实施方案中，单一质粒运载体包含运载体骨架的核酸序列(例如SEQIDNO:12)、MCS(例如SEQIDNO:31)和Spel-Notl片断(SEQIDNO:31)，其中所述片断编码的治疗性分子为小鼠IFN-p,在5'末端和3'末端分别具有适于该片断在MCS中Spel-Notl位点插入的Spel序列和Notl序列，插入在MCS的Spel-Notl位点。此外，在一个实施方案中，单一质粒运载体包含运载体骨架的核酸序列(例如SEQIDNO:12)、MCS(例如SEQIDNO:32)和Spd-Notl片断(SEQIDNO:31),其中所述片断编码的治疗性分子为人IFN-f3，在5'末端和3'末端分别具有适于该片断在MCS中Spel-Notl位点插入的Spel序列和Notl序列，插入在MCS的Spel-Notl位点。此外，在一个实施方案中，激活性分子结合调节性分子而将其激活，从而激活的调节性分子结合有效连接到治疗性分子序列的启动子序列的DBS,导致治疗性分子在细胞(例如哺乳动物细胞)中的表达和/或活性的诱导。但是，在另一个实施方案中，失活性分子结合调节性分子而将其失活，从而失活的调节性分子不结合治疗性分子启动子的DBS,导致治疗性分子表达和/或活性被阻遏或缺乏诱导。在图IB所例示的实例的一个实施方案中，激活性分子结合调节性分子的LBD而将其激活，从而激活的调节性分子形成同型二聚体，后者结合有效连接到治疗性分子序列的启动子的DBS,导致治疗性分子在细胞(例如哺乳动物细胞)中的表达和/或活性的诱导。在图1A和1B所例示的实例的另一个实施方案中，第一和第二表达盒存在于单一运载体中。在另一个优选的实施方案中，编码本发明治疗性分子的第一表达盒和编码本发明调节性分子的第二表达盒存在于单一运载体中(例如pGT23(SEQIDNO:23)、pGT24(SEQIDNO:24)、pGT25(SEQIDNO:25)、pGT26(SEQIDNO:26)、pGT27(SEQIDNO:27)、pGT28(SEQIDNO:28)、pGT29(SEQIDNO:29)或pGT30(SEQIDNO:30》。本文所用的"治疗性分子"是指具有治疗活性或提供治疗益处的分子。本发明的治疗性分子可以是具有治疗活性的分离的DNA、RNA或者由核酸序列编码的蛋白质或其变体。本文所用的"变体"包括突变物(mutein)，例如分离的DNA、RNA、蛋白质或化学化合物的突变物。更具体地说，本发明的治疗性分子可以是修饰的、合成的或重组的DNA、RNA或蛋白质。本文所用的"修饰"涵括化学法、合成法或通过重组技术修饰的分子，包括例如突变的、融合的或嵌合的分子。在一个实施方案中，受编码治疗性分子是在对象细胞中被表达和切割或加工的蛋白质，从而导致产生多个治疗性分子或者激活的治疗性分子，或者与被表达而未一皮切割或未:f皮加工的治疗性分子不同的治疗性分子。在本发明的另一个实施方案中，受编码治疗性分子是具有治疗活性的核酸(例如RNA)。在一个实施方案中，受编码RNA编码在对象细胞中被多重剪接或差别剪接的多剪接位点。在一些实施方案中，被多重剪接或差别剪接的RNA编码具有类似或单独的治疗活性的不同或变异的蛋白质，或者包舍具有类似或单独的治疗活性的不同或变异的RNA。在一些实施方案中，被多重剪接或差别剪接的RNA因响应特定因素、疾病、病况或组织的存在而发生剪接。在本发明的另一个实施方案中，受编码治疗性分子是具有治疗活性的蛋白质，优选人蛋白质或其变体。在又一个实施方案中，编码这种蛋白质的核酸序列是基因或基因片断。在一个实施方案中，治疗性分子是粒细胞巨噬细胞集落剌激因子(GMCSF)。在另一个实施方案中，治疗性分子是干扰素，例如或卩干扰素(IFN-I3)，更具体地说是IFN-Pla或IFN-(31b。在一些实施方案中，受编码治疗性分子是抗体，优选单克隆抗体(例如CAMPATH)。合适的编码单克隆抗体的序列可用本领域公知的方法鉴定和制备，并插入到本文所述的本发明调节表达系统的运载体中。单克隆抗体的治疗活性已有^^艮导(参见例如Gatto,B.(2004)4:411-414;Groner等，(2004)4:539-547)。本文所用的"调节性分子"是指调节本发明治疗性分子的表达和/或活性的分子。这种由本发明调节性分子进行的调节的实例包括但不限于由本发明调节性分子对治疗性分子表达和/或活性的调控，更具体地说，治疗性分子表达和/或活性的增加、减少、激活(或诱导)或者失活(或阻遏)。此外，这种由本发明调节性分子对治疗性分子表达和/或活性进行的调控，可以是直接的(例如通过调节性分子与治疗性分子的直接接触)或者间接的(例如调节性分子影响信号转导途径中的分子导致治疗性分子表达和/或活性的调控)。此外，适合用于本发明调节表达系统的调节性分子的实例，包括但不限于能实现本发明治疗性分子的细胞表达、活性或加工的分子。这种合适的治疗性分子的实例包括但不限于转录调节性分子(例如激活、失活、降低或增加表达的治疗性分子RNA转录的分子)；RNA加工分子(例如激活、失活、降低或增加RNA加工如RNA剪接、聚腺苷酸化或者表达的治疗性分子RNA切割的分子)；或者实现蛋白质翻译或蛋白质的翻译后加工的分子(例如激活、失活、降低或增加表达的治疗性分子的蛋白质磷酸化、切割或者特定构象或多聚形式形成的酶)。本发明的调节性分子可以是天然的或分离的分子，或者是它们的变体。在一些实施方案中，本发明的调节性分子是合成的或重组的分子。例如，在一些实施方案中，本发明的调节性分子是化学化合物、DNA、RNA或蛋白质。此外，在一些实施方案中，本发明的调节性分子是修饰的分子。在一个实施方案中，调节性分子是人源化蛋白质。在另一个实施方案中，调节性分子是人蛋白质或其变体。例如，在一个实施方案中，调节性分子是转录激活剂，例如类甾醇受体，更具体地说孕酮受体。在一个实施方案中，调节性分子包含共激活因子(例如p300/CBP)、基础转录因子(e.g.TFIIB)或组蛋白乙酰转移酶(e.g.p300/CBP或P/CAF，Latchman,D.(2004)EukaryoticTranscriptionFactors,ElsevierAcademicPress,London;Goodman等，(2000)Genes&Devi14:1553-1577;Shikama等，(1997)TrendsinCellBio7:230画236)的反式激活域(例如VP16或p65反式激活域，参见例如Schmitz等，(1991)EMBOJ10:3805-3817;Moore等，(1993)Molec和CellBiol13:1666;Blair等，(1994)Molec和CellBiol14:7226-7234)和/或其它功能域(例如基础因子相互作用域)。在另一个实施方案中，调节性分子包含配体结合域(LBD)。此外，在一个实施方案中，激活性分子结合调节性分子的LBD从而激活调节性分子，使得激活的调节性分子的存在能调节治疗性分子表达和/或活性。在另一个实施方案中，调节性分子包含DBD,例如GAL-4DBD。在一个实施方案中，调节性分子包含的DBD结合有效连接到编码治疗性分子的核酸的功能序列(例如启动子序列)，从而调节治疗性分子表达(例如诱导治疗性分子表达)。在另一个实施方案中，本发明的调节性分子被激活性分子激活，从而治疗性分子表达和/或活性在激活的调节性分子的存在下得到调节。本文所用的"激活性分子"是指诱导或增加本发明治疗性分子的表达和/或活性的分子。这种激活性分子的激活的实例包括但不限于本发明调节性分子的表达和/或活性的诱导或增加。此外，这种由本发明过激活性分子与调节性分子的直接接触)或者间接的(例如激活性分子影响信号转导途径中的分子导致调节性分子表达和/或活性受到调控)。此外，适合用于本发明调节表达系统的激活性分子的实例包括但不限于能实现本发明调节性分子的细胞加工的分子(这种细胞加工的实例本文中有描述，例如见上文)。在一个实施方案中，激活性分子是生物标志。在又一个实施方案中，激活性分子是疾病或病症的生物标志，更具体地说是疾病状态或病症或其症状的生物标志。在一个实施方案中，激活性分子通过促进或抑制调节性分子的构象变化、酶促加工或修饰、特异性结合或二聚化来激活调节性分子。在一个优选的实施方案中，激活性分子通过促进调节性分子的同型二聚化来激活调节性分子。在一个实施方案中，激活性分子通过结合调节性分子，更具体地说结合调节性分子的功能域例如调节性分子的AD,而将调节性分子激活。本发明的激活性分子可以是天然的或分离的分子，或者是它们的变体。在一些实施方案中，本发明的激活性分子是合成的或重组的分子。例如，在一些实施方案中，本发明的激活性分子是化学化合物、DNA、RNA或蛋白质。此外，在一些实施方案中，本发明的激活性分子是修饰的分子。在一个实施方案中，激活性分子是人源化蛋白质。在另一个实施方案中，激活性分子是人蛋白质或其变体。在一个实施方案中，激活性分子是化学化合物，例如抗孕激素。在一个优选的实施方案中，激活性分子是米非司酮。在一个实施方案中，本发明的调节表达系统包含l)第一表达盒，其具有编码治疗性分子的第一核酸序列和至少一个位于上游且有效连接到第一核酸序列的GAL-4DNA结合位点(DBS)，更具体地说六个GAL-4DBS(6XGAL-4DBS);2)第二表达盒，其具有编码调节性分子的第二核酸序列和位于上游且有效连接到第二核酸序列的肌动蛋白启动子序列，所述调节性分子是包含VP-16AD或p65AD(例如包含SEQIDNO:39核酸序列或SEQIDNO:40氨基酸序列的p65AD)、孕酮(PR)LBD和GAL-4DBD的修饰孕酮受体；和3)激活性分子，其为小分子诱导物例如米非司酮(MFP)，其当口服给予对象时能激活对象细胞中表达的调节性分子，从而激活的调节性分子形成二聚体，后者结合6XGAL-4DBS而诱导受编码治疗性分子的表达。在一个优选的实施方案中，第一和第二表达盒存在于单一运载体中。在另一个实施方案中，本发明的调节性分子是转录调节剂，更具体地说是突变的类甾醇受体。在一个实施方案中，调节性分子是突变的人PR(hPR),包含着突变的hPR受体LBD(例如具有约19-66个氨基酸的C末端缺失)，其中所述调节性分子在激活性分子的存在下被激活，该激活性分子是突变PR所衍生自的野生型PR的拮抗剂。在另一个实施方案中，本发明的调节性分子包含调节域(RD),例如激活域(AD)，更具体地说反式激活域(TD)。适合用于本发明调节性分子的调节域的实例包括但不限于本领域所公知的或本文所描述的(例如TAF-1、TAF画2、TAU-1和TAU-2)。在另一个实施方案中，本发明的调节性分子被失活，从而治疗性"失活性分子"是指使本发明调节性分子的表达和/或活性失活的分分子的表达和/或活性的阻遏或降低。此外，这种由本发明失活性分子子与调节性分子的直接接触)或者间接的(例如失活性分子影响信号转导途径中的分子导致调节性分子表达和/或活性的失活)。此外，适合用于本发明调节表达系统的失活性分子的实例包括但不限于能实现本发明调节性分子的细胞加工的分子(这种细胞加工的实例本文中有描述，例如见上文)。在一个实施方案中，本发明调节性分子在对象细胞中以激活形式被表达或存在，并在失活性分子的存在下被失活，从而治疗性分子表达和/或活性受到被失活调节性分子的调节。在另一个实施方案中，失活性分子是生物标志。在又一个实施方案中，失活性分子是疾病或病症的生物标志，更具体纟也i兌是疾病纟大态或病症或其症状的生物标志。在一个实施方案中，失活性分子通过促进或抑制调节性分子的构象变化、酶促加工或修饰、特异性结合或二聚化来使调节性分子失活。在一个优选的实施方案中，失活性分子通过抑制调节性分子的同型二聚化来使调节性分子失活。在一个实施方案中，失活性分子通过结合调节性分子，更具体地说结合调节性分子的功能域例如调节性分子的AD，而使调节性分子失活。本发明的失活性分子可以是天然的或分离的分子，或者是它们的变体。在一些实施方案中，本发明的失活性分子是合成的或重组的分子。例如，在一些实施方案中，本发明的失活性分子是化学化合物、DNA、RNA或蛋白质。此外，在一些实施方案中，本发明的失活性分子是修饰的分子。在一个实施方案中，失活性分子是人源化蛋白质。在另一个实施方案中，失活性分子是人蛋白质或其变体。在一个优选的实施方案中，失活性分子是^f匕学化合物。本发明的治疗性分子、调节性分子、激活性分子或失活性分子的表达可以是组成型表达或瞬时表达。在一些实施方案中，治疗性分子、调节性分子、激活性分子或失活性分子的表达受到调节或者是组织特异性的(例如肌肉特异性的)。受调节的调节性分子的实例包括但不限方案中，本发明治疗性分子、调节性分子、激活性分子或失活性分子的表达由受调节的启动子或组织特异性启动子驱动。在又一个实施方方案中，组织特异性启动子是月几肉特异性启动子，更具体地说肌动蛋白启动子。在一个实施方案中，本发明调节性分子结合有效连接到编码治疗性分子的核酸序列的启动子，从而调节本文所述受编码治疗性分子在对象细胞中的表达。本发明的治疗性分子、调节性分子、激活性分子或失活性分子，可用本文所述(例如下文所述)的用于核酸、蛋白质和化学化合物的公知方法和测定法进行分离、生产或修饰。药物组合物和治疗方法本发明还提供用于治疗多种疾病的药物组合物和方法，其包含本文所述的本发明改进的调节表达系统。在具体的实施方案中，本发明提供的药物组合物和方法用于治疗疾病或病况；调节治疗性分子的表达；给予治疗性分子；递送治疗性分子；或者在对象细胞中表达治疗性分子，其中所述方法包括使对象的细胞与本发明的调节表达系统相接触，使得受编码治疗性分子在对调节。本发明的药物组合物包含至少一种本发明治疗性分子、调节性分子、激活性分子或失活性分子，在一些实施方案中，编码这种分子的核酸序列单独或一起存在于单一运载体中或一个以上运载体中。在其它实施方案中，对于治疗性分子、调节性分子、激活性分子或失活性分子这四者，本发明的药物组合物可包含一者以上，且可包含它们各自的一种以上(例如第一和第二治疗性分子、调节性分子、激活性分子和/或失活性分子)。更具体地说，对于治疗性分子、调节性分子、激活性分子或失活性分子这四者，本发明的药物组合物可包含编码其一者以上和其各自一种以上的核酸序列。在一个实施方案中，本发明的药物组合物包含至少一种本发明运载体(例如pGT23(SEQIDNO:23)、pGT24(SEQIDNO:24)、pGT25(SEQIDNO:25)、pGT26(SEQIDNO:26)、pGT27(SEQIDNO:27)、pGT28(SEQIDNO:28)、pGT29(SEQIDNO:29)或pGT30(SEQIDNO:30》。在一些实施方案中，本发明的药物组合物包含至少一种本发明激活性分子或失活性分子。在一个实施方案中，本发明的药物组合物包含一种或多种编码至少一种治疗性分子和/或调节性分子的运载体。本发明的治疗性分子、调节性分子、激活性分子和失活性分子可用任何本文描述的或本领域公知的合适给予方法，单独或一起先体外后体内或体内给予对象。这种合适给予方法的实例包括但不限于注射(例如肌肉内或皮下注射)、口服给予和电穿孔。在一个实施方案中，本发明的治疗性分子和调节性分子存在于单一运载体中，并与能激活调节性分性分子表达和/或活性)。在又一个实施方案中，激活性分子是口服给予对象的化合物(例如米非司酮)，编码治疗性分子和调节性分子的单一运栽体是通过注射或电穿孔给予对象的细胞(例如骨骼肌细胞)的单一运载体。给予本发明组合的合适方法的更多实例，包括将组合物例如编码治疗性分子和/或调节性分子的核酸运载体先体外后体内递送给对象的细胞，然后将受处理细胞递送给对象，使得受编码的分子在对象细胞中得到表达(参见例如Studeny等，(2004)JNatlCancerInst96(21):1593-1603;Studeny等，(2002)CancerRes62(13):3603画3608)。在一个实施方案中，本发明的调节表达系统包含编码通过注射给予对象的治疗性基因(例如IFN-|3基因)的核酸序列。本文所用的"治疗性基因"是指编码治疗性分子例如具有治疗活性的蛋白质(例如IFN-Pla或lb)的基因。在一个具体的实施方案中，所述基因是IFN-Pla，用本发明的运载体以单次肌肉内注射的形式定期(例如3-6个月)给予。在其它实施方案中，治疗性基因每l-3个月、3-6个月、6-9个月或9-12个月进行给予。在另一个实施方案中，通过对驱动受编码蛋白质在对象细胞或组织中表达的启动子的控制诱导，来实现对表达蛋白质的循环水平的调节。在一个优选的实施方案中，调节性分子是可口服丸剂形式的小分子激活剂，能控制启动子诱导和随后的治疗性分子、更具体地说治疗性基因的表达。这样，表达的治疗性分子(例如蛋白质或核酸)在循环中的水平可以以开/关方式和/或剂量依赖性方式得到紧密调节。因此，本发明的调节表达系统第一次使得可以选择治疗性分子(例如蛋白质或核酸)的连续疗法或者脉动疗法，和调节治疗性分子的表达水平，以使治疗性分子的治疗功效最优化，同时使其任何副作用减至最低。具体地说，本发明的调节表达系统第一次使得可以对在对象中选择进行治疗性分子的连续疗法还是脉动疗法，更具体地说，使得可以通过调整和优化治疗性分子在对象细胞中的表达水平进行对象特异性疗法，以实现最大治疗功效和最小副作用来治疗疾病。使用本发明的调节表达系统，可将编码治疗性分子(例如蛋白质或核酸)的核酸递送到对象的靶细胞以治疗疾病。更具体地说，使用本发明的调节表达系统，可将编爿冯治疗性分子的核酸递送到对象的靶细胞，使得以治疗有效剂量或治疗有效量提供表达的治疗性分子。本文所用的"治疗有效剂量"或"治疗有效量，，的本发明治疗性分子是这样的剂量或数量，其当在需要疾病治疗的对象细胞中存在时能给对象产生治疗益处(即导致疾病得到治疗)。此外，编码给予对象或存在于对象细胞中的治疗性分子的核酸的合适数量或剂量；或者，给予和/或存在于对象细胞中、导致治疗性分子在对象细胞中存在的调节性分或失活性分子的核酸的合适数量或剂量，和/或治疗性分子的治疗有效量，都可由本领域技术人员凭经验确定。例如，在一个实施方案中，给予对象的调节性分子或编码调节性分子的核酸的合适剂量或数量，是调节(例如诱导)治疗性分子在对象细胞中的表达和/或活性而达到治疗有效量的剂量或数量。构成治疗有效量的治疗性分子数量的影响因素包括但不限于待治疗疾病的严重程度和病史，正在进行疗法的对象的年龄、健康和身体状况。本发明治疗性分子的治疗有效量还可取决于给药频率和正在进行治疗的对象的疾病严重程度。本发明治疗性分子的给药方案可连续进行达到所需效果而要求的时间，所述所需效果例如为本文所述的疾病、疾病相关症状、疾病严重程度和/或疾病复发周期性的防止和/或改善。在一个实施方案中，给药方案连续进行最长达一年乃至不定期的时间，如进行一个月至30年，约三个月至约20年，约6个月至约10年。用于本发明调节表达系统的合适核酸的实例包括但不限于编码具有治疗活性的激素、生长因子、酶、细胞因子、受体或MHC分子的基因的核酸。另外，用于本发明组合物和方法的合适基因包括编码目标基因的核酸可引入其中的细胞的外源或内源核酸序列。特别值得关注且适合用于本发明组合物和方法以治疗疾病的基因是编码多肽的基因，该多肽在患有或易患遗传疾病的对象中不存在、产生量减少或者以突变形式产生。这种遗传疾病的实例包括但不限于成视网膜细胞瘤、Wilms肿瘤、腺苷脱氨酶缺乏症(ADA)、地中海贫血、嚢性纤维变性、镰形细胞病、亨廷顿舞蹈病、迪歇纳氏肌营养不良、苯丙酮酸尿症、Lesch-Nyhan综合征、高歇尔氏病和泰-沙二氏病。同样特别值得关注且适合用于本发明组合物和方法以治疗疾病的基因，是编码肺瘤抑制基因的核酸。由这种合适肿瘤抑制基因的实例包括但不限于成视网膜细胞瘤、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、人生长激素(HGH)、TNF、TGF-(3、TGF-a、血红蛋白、白细胞介素、共刺激因子B7、胰岛素、因子VIII、因子IX、PDGF、EGF、NGF、EPO和(3-球蛋白以及这种基因编码的蛋白质的生物活性或治疗活性突变蛋白。供递送到靶细胞的合适基因可来自任何物种，但优选哺乳动物物种，更优选人。此外，作为合适基因的来源的优选物种是目标基因用本发明的方法和组合物引入其中的物种，例如哺乳动物物种，优选人。用于本发明组合物和方法的合适核酸的更多实例包括但不限于编码具有抗炎、抗病毒或抗癌活性的蛋白质或核酸治疗性分子的核酸。这种合适核酸的实例包括但不限于编码具有抗癌活性的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)或其变体(例如Leukine或人GMCSFLeu23Asp27Glu39)的核酸(参见例如美国专利第5,032,676号、第5,391，485号和第5,393,870号的GMCSF突变体)。还有例如，合适的核酸包括但不限于编码具有抗炎或抗病毒活性的干扰素的核酸，所述干扰素具体地说是IFN-(3，更具体地说是IFN-Pla或IFN-(3lb。在一个优选的实施方案中，使用本发明的组合物和方法来治疗多发性硬化症，其通过给需要治疗的对象递送编码IFN-p、更具体地说IFN-(3la治疗性分子的核酸，使得IFN-J3在对象细胞中得到表达，且IFN-P的表达和/或活性得到调节性分子的调节，如本文所述。多发性硬化症是以中枢神经系统(CNS)中出现局灶性炎症为特征的慢性严重疾病(参见例如Hemmer等，(2002)Neuroscience3:291-301;Keegan等，(2002)Ann.Rev.Med.53:285-302;Young,V.Wee(2002)Neurology59:802-808;Goodin等，(2001)Am.AcademyofNeurology58:169-178)。该病的显著特征还有髓鞘与神经细胞轴突相隔离(脱髓鞘)的相关损失和轴突的变性。由局灶性炎症所致的星形胶质细胞增生(astrocytoticgliosis)导致在脑白质中形成硬化病斑(scleroticlesion)(参见例如Prineas(1985)DemyelinatingDiseases,Elsvevier:Amsterdam;Raine(1983)MultipleSclerosis,Williams和Wilkins:Baltimore;Raine等,(1988)J.Neuroimmunol.20:189-201和Martin(1997)J.NeuralTransmission(Suppl)49:53-67)。多发性硬化症发作时的对象群体类型主要有两种复发-緩解性多发性硬化症对象和原发性进行性多发性硬化症对象。复发-緩解性多发性硬化症以发作(所谓的复发或恶化)和緩解期为特征，在发作期新的神经缺损出现或已有的神经缺损恶化，在緩解期临床症状稳定化或减少，而原发性进行性多发性硬化症对象则是遭受进行性神经退化，无恶化。很大一部分复发-緩解性多发性硬化症对象在其发病过程中还经历与复发无关的神经性症状恶化，该恶化与或不与复发重叠出现。一旦到达这个疾病阶段，则被称为继发性进行性多发性硬化症。多发性硬化症的临床症状据认为是由于血脑屏障(BBB)出现局灶性破坏，让炎性渗入物得以进入大脑和脊髓所致。此外，这些渗入物据认为由各种淋巴细胞和巨噬细胞所组成，它们会导致脱髓鞘、轴突变性和瘢痕组织形成，以及CNS髓鞘质生产所必需的少突神经胶质细胞的变性(参见例如Martin(1997)J.NeuralTransmission(S卿l)49:53-67)。因此，神经隔离性髓鞘质和少突胶质细胞修复受损髓鞘质的能力都受到严重削弱(参见例如ScientificAmerican269(1993》106-114)。多发性硬化症的这些症状包括上肢和下肢疼痛和麻刺、局部性和全身性麻痹、痉挛和虚弱、站立或行走时平衡困难、言语和吞咽困难、认知缺陷、疲乏以及肠和膀胱功能异常。尽管多发性硬化症尚无法治愈，但用干扰素进行的免疫调节疗法已证明能成功降低多发性硬化症对象中的隐伏疾病的严重程度。干扰素是以抗病毒、抗增殖和免疫调节活性为特征的重要细胞因子。这些活性构成了在多发性硬化症对象的治疗中所观察到的临床益处的基础。干扰素分为I型干扰素和II型干扰素。IFN-(3属于I型干扰素，这类干扰素还包括a千扰素、T千扰素和(o干扰素，而y干扰素是独特的II型干扰素的唯一已知成员。人IFN-P是由166个氨基酸残基组成的分子量22kDa的调节多肽。该多肽可由身体的大多数细胞特别是成纤维细胞响应病毒感染或对其它生物的暴露而产生。此外，IFN-P能结合多聚细胞表面受体，有效的受体结合会产生一系列胞内事件，导致IFNB可谦导基因的表达，而这又产生出可分为抗病毒作用、抗增殖作用和免疫调节作用的各种作用。人IFN-P是一种得到很好表征的多肽，人IFN-P的氨基酸序列已阐明(参见例如Gene10:11-15,1980及EP83069、EP41313和美国专利第4,686,191号)。此外，已分别报道了人和鼠IFN-(3的晶体结构(参见例如Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:11813-11818,1997;J.Mol.Biol.253:187-207,1995;CellMol.LifeSci.54:1203-1206,1998综述)。另夕卜，已报道了经蛋白质工程改造的IFN-(3变体(参见例如WO9525170、WO9848018、美国专利第5,545,723号、第4,914,033号、EP260350、美国专利第4,588585号、第4,769,233号，Stewart等，DNAVol.6No.21987,第119-128页；Runkel等，1998,Jour.Biol.Chem.273，No.14,第8003-8008页)。还有，已才良道了IFN-(3在CHO细胞中的表达(参见例如美国专利第4,966,843号、第5,376,567号和第5,795,779号)。再次，已报道了IFN-卩融合蛋白，例如在WO00/23472中。有市售的IFN-(3制品被批准用于治疗多发性硬化症对象，它们以以下商品名出售Betaseron(也称Betaferon⑧或IFN-(3lbserl7，未糖基化，用重组细菌细胞生产，有N末端甲硫氨酸残基缺失和C17S突变)、Avonex⑧和Rebif⑧(也称IFN-j3la，糖基化，用重组哺乳动物细胞生产)。此外，Pharm.Res.15.641-649,1998中给出了IFN-|3la和IFN-Plb在结构和功能方面的比较。IFN-P是第一种被证实能延迟多发性硬化症进展的治疗干预药物。另外，已证实IFN-|3的批准剂量能有效降低多发性硬化症的恶化速度，受其治疗的对象与安慰剂治疗的对象相比能更长时间保持不发生恶化。而且，残疾的累积速度(accumulationrate)也降低(参见例如Neurol.51:682-689,1998)。IFN-P对白细胞增殖和抗原呈递具有抑制作用。而且，IFN-P可将细胞因子生产谱(profile)调整到抗炎表现型。最后，IFN-P能通过抑制T细胞基质金属蛋白酶的活性降低T细胞迁移。这种IFN-P活性很可能协同起作用，是IFN-(3在多发性硬化症对象的治疗中有益作用的原因(参见例如Neurol.51:682-689,1998)。在一个优选的实施方案中，本发明组合物和方法用于治疗遭受各种临床确认形式的多发性硬化症的对象，所述各种形式包括但不限于复发-緩解性多发性硬化症、不同类型的进行性多发性硬化症(包括但不限于例如原发性和继发性进行性多发性硬化症、进行性-复发性多发性硬化症)，还有暗示多发性;更化症的临床孤立综合征。本文所用的"复发-缓解性"多发性硬化症是多发性硬化症的一个临床过程，以明确定义的不定时恶化或复发为特征，在这期间已有的症状变得更加严重和/或新的症状出现。跟随这种恶化或复发之后可以是部分恢复或者完全恢复和緩解。这些不定时恶化或复发之间的时间可长达数月或数年，在这期间炎性损害、脱髓鞘、轴突损失和瘢痕形成可仍继续发生。复发-緩解性多发性硬化症是多发性硬化症最常见的开始阶段，据报道在发作后10-15年内有大约50%的病例出现进展，在发作25年内有另外40%。本文所用的"原发性-进行性"多发性硬化症是多发性硬化症的一个临床过程，一开始就以进行性疾病为特征，没有高原期或緩解期，或者偶然的高原期和非常短期的微小改善。随着疾病的进展，对象可能会经历行走困难，运动机能逐步下降，在多个月和多年时间里残疾增加>通常不出现复发-緩解性多发性硬化症所特有的明显炎性发作。本文所用的"继发性-进行性"多发性硬化症这种多发性硬化症临床过程，起初是复发-緩解过程，然后是变成不定速度的独立于复发的进行性过程。虽然经历这种类型的多发性硬化症的对象可能继续经历炎性发作或恶化，但最终恶化和緩解期间会减少，疾病呈现原发性-进行性多发性硬化症所观察到的特征性衰退。本文所用的"进行性-复发性"多发性硬化症是多发性硬化症的临床过程，从疾病的发作开始就可显示持久的神经学退化，不过它具有类似于复发-緩解性多发性硬化症的明显急性恶化或复发。对于这些对象，受损的功能可能永不能恢复。据报道，这种类型的多发性硬化症如不进行治疗会有很高的死亡率。暗示多发性硬化症的临床孤立综合征包括但不限于早期发作多发性硬化症和单症状多发性硬化症。对于本发明的目的，术语"多发性硬化症"意在涵括每种这些疾病临床表现和暗示多发性硬化症的临床孤立综合征，除非另有说明。例如，患有多发性硬化症或具有多发性硬化症相关症状的对象是需要多发性硬化症或多发性硬化症相关症状的治疗的对象。在一个实施方案中，当患有多发性硬化症的对象以本发明的药物组合物和方法进行治疗时，该治疗可导致多发性硬化症疾病症状、疾病严重程度和/或疾病复发的周期性得到预防和/或改善，也即用本发明的组合物和方法治疗多发性硬化症能使各症状爆发期之间的时间延长，和/或能抑制正在发生的与该疾病(如不进行治疗的话会增加疾病进展和残废)有关的免疫或自身免疫应答。此外，对象在用本发明的药物组合物或方法进行治疗之前，可以已用药物组合物进行预治疗，也可以是没有用药物组合物进行预治疗的未治疗对象。例如，对于多发性硬化症的治疗，进行过预治疗的对象可以是在用本发明组合物或方法进行治疗之前，用IFN-f3蛋白药物(例如IFN-Pla)或IFN-P变体(例如IFN-(3lb)进行过预治疗的对象。例如，可用Betaseron、Avonex⑧或Rebif⑧的批准剂量预治疗对象。因此，本发明的药物组合物和方法适合用于治疗进行过预治疗和未治疗的对象。本发明的药物组合物和方法也可用来阻断或降低与疾病有关的生理性和病原性退化，例如大脑和神经系统其它区域中的炎性反应，血脑屏障的穿裂或破坏、大脑中损害的出现、组织破坏、脱髓鞘、自身免疫炎性反应、急性或'隄性炎性反应、神经元死亡和/或神经胶质死亡。本发明药物组合物和方法的有益作用包括但不限于预防疾病、减慢既有疾病的发作、改善疾病症状、降低恶化速度、减慢疾病的进展、延迟或防止残疾(包括认知下降、工作能力丧失、住院和最终死亡)。特定类型的疾病(例如多发性^硬化症)的发作性复发可例如如下进行治疗降低与发作有关的症状(如上述症状)的严重程度；或者延长各次发作复发之间的时间，例如延长至数天、数周、数月或数年，其中所述发作可以以疾病症状爆发和恶化为特征；或者预防或减慢例如在多发性硬化症中大脑炎性损害的出现(参见例如Adams(1993)PrinciplesofNeurology,第777页有关神经学炎性损害的描述)。此外，用于本发明组合物和方法的合适核酸可编码为融合蛋白或嵌合蛋白质或者融合核酸或嵌合核酸(例如RNA)的治疗性分子。在一生物途径(例如脓血症途径)中的一个或多个步骤，从而提供治疗益处。此外，所述核酸可编码融合到治疗性分子的毒素(所述治疗性分子例如受体配体基因或将融合毒素导向靶标如肺瘤细胞或病毒的抗体)，从而具有治疗益处。用以有效插入和/或融合本发明的核酸序列和/或氨基酸序列的标准方法在本文中和本领域中有描述(参见例如Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版.，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.(1989);Ausubel等，(编辑)，CurrentProtocolsInMolecularBiololgy,JohnWiley和Sons(1987》。一些疾病治疗方案所致的不良反应是本领域公知的(参见例如Munschauer等，(1997)ClinicalTherapeutics19(5):883-893;Walther等,(1999)Neurology53:1622-1627;Lublin等，(1996)46:12-18;Bayas等,(2000)2:149-159;Ree等，(2002)8:15-18;Walther等，(1998)5(2):65-70)。例如，多发性硬化症的治疗所致的一些不良反应包括但不限于例如流感样症状；痉挛增加或神经性症状恶化；月经不调；实验室异常结果(例如异常血液计数/血红蛋白值、白细胞、粒细胞、淋巴细胞或凝血细胞值)；肝脏酶类(例如胆红素、转氨酶或碱性磷酸酶)的异常实验室检测值；注射部位反应(例如发炎、疼痛或红斑)；皮肤或皮下坏死；和抑郁。合适的合用药物(co-medication)以及这些合用药物与本发明组合物和方法联合以治疗由于疾病(例如多发性硬化症)治疗所致的不良反应的应用，可根据本领域通常所知的用以治疗这种反应的合用药物来确定(参见例如Munschauer等，(1997)ClinicalTherapeutics19(5):883-893;Walther等，(1999)Neurology53:1622-1627;Lublin等,(1996)46:12-18;Bayas等，(2000)2:149-159;Ree等，(2002)8:15-18;Walther等，(1998)5(2):65-70)。这种合用药物的剂量和给药方案也是公知的。这种合用药物是本领域公知的，可包括但不限于例如能帮助緩和或减轻因疾病或因疾病治疗所致的不良反应的药物。这种合用药物的实例包括但不限于镇痛药、非甾体抗炎药(NSAID)和类甾醇。合用药物的其它合适实例还包括但不限于例如布洛芬、对乙酰氨基酚、乙酰水杨酸、泼尼松、己酮可可碱、巴氯芬、类甾醇、抗菌剂和抗抑郁药(参见例如Walther等，(1999)Neurology52:1622-1627)。例如，流感样症状可用NSAID(例如布洛芬或乙酰水杨酸)或对乙酰氨基酚或己酮可可石成来治疗；痉挛增加或神经性症状恶化也可用NSAID和/或肌肉松弛剂(例如巴氯芬)来治疗；月经不调可用口服避孕药来治疗；注射部位反应可用全身性NSAID和/或类甾醇(例如氪化可的松)来治疗；皮肤或皮下坏死可用抗细菌药物治疗；抑郁可用抗抑郁药来治疗(参见例如Walther等，(1999)Neurology53:1622-1627)。与有效治疗特定疾病、具有不同不良事件谱(profile)的其它药物进行的组合疗法，可以增加治疗效果和使不良事件谱平摊。对于多发性硬化症的治疗，组合疗法的实例包括但不限于例如醋酸格拉替雷(Copaxone)、米托蒽醌、环磷酰胺、环胞菌素A、克拉屈滨、单克隆抗体(例如Campath-Hl⑧或Antegren⑧/Natazulimab⑧)和抑制素。用本发明方法对对象的疾病的有效治疗(例如对多发性硬化症的治疗)可用几种替代方法来验-〖正，所述方法包括例如EDSS(扩展残疾状态量表，extendeddisabilitystatusscale)评分、功能复合评分(FunctionalCompositeScore)、认知测试、恶化的征候或MRI。EDSS是对多发性硬化症所致临床损害进行评级的一种手段(参见例如Kurtzke(1983)Neurology33:1444)。对八大功能系统、行走范围、行走能力和保持自我照顾功能的能力进行评估，以确定神经学损害的类型和严重程度。例如，在治疗前，评估以下系统中的损害锥体系统、小脑系统、脑干系统、感觉系统、肠和膀胱系统、^f见觉系统、大脑系统和其它系统。连同对行走范围、在有或没有辅助装置下的行走能力和保持自我照顾功能的能力的评估结果，计算出最终EDSS分数。然后在治疗的确定时间间隔:，获取后续追踪分数。分级量表的范围可例如从0(正常)到IO(因多发性石更化症死亡)。增加一整级(或在较高的基线EDSS分数下增加半级)则可确定疾病发生进展(参见例如Kurtzke(1994)Ann.Neurol.36:573-79,Goodkin(1991)Neurology.41:332.)。对于多发性硬化症的治疗，恶化可定义为可归因于多发性硬化症并伴随发生适当的新神经学异常情况的新症状出现(参见例如IFN-pMSStudyGroup)。恶化通常持续至少24小时，之前是至少30天的稳定或改善期，或者从最后一次事件发作起相隔至少30天。标准的神经学检查可根据神经学等级量表(NeurologicalRatingScale,参见例如评估医师的意见，将恶化情况分类为轻微、中等或严重。然后确定年恶化速度(或其它关于复发频率的度量，例如周期性复发的危害比率)、无恶化情况的对象的比例和疾病活性的其它基于复发的度量，并针对任何这些测量结果在受治疗组和安慰剂组之间的治疗有效性进行评估。此外，用于本发明组合物和方法以治疗疾病的合适运载体是具有最小免疫毒性的运载体，例如质粒或AVV运载体。例如，在CMV启动子控制下的编码TGF-P或IL-4的质粒运栽体，据报道能以最小的免疫毒性保护小鼠免除髓鞘碱性蛋白(MBP)诱导的EAE(参见例如CAPiccirillo和G.J.Prud'homme(1999)HumanGeneTherapy10:1915-22))。此外，有多种运载体和靶组织据才艮道适合用于在EAE;漠型中表达细胞因子，包括鞘内给药后表达IL-4、IL-10或IL-1拮抗剂的非复制型单纯疱渗病毒(HSV)I型运载体(参见例如G.Martino等,(2000)丄Neuroimmunol107:184-90)。还有许多新技术可用来进行疾病的诊断(例如多发性硬化症)和治疗管理。例如，磁共振成像(MRI)扫描可用作疾病和疾病活性的伴随指示工具，也可用作诊断工具(参见例如Paty等，(1993)Neurology43:662-667;Frank等，(1994)Ann.Neurology36(suppl.):S86-S90;(1995)Neurology45'.1277-1285;Filippi等，(1994)Neurology44:635-641)。例如，对于多发性硬化症的治疗，可运用MRI，用例如钆-DTPA增强的T加权成像测量活性损伤(参见例如McDonald等，(2001)Ann.Neurol.50:121-127),或者用T2加权和Tl加权技术测量损伤的位置和程度。可获得基线MRI,之后可将同一成像平面和对象位置用于随后的每个研究。对于多发性硬化症，可勾勒出损伤区域和分片区对总损伤面积进行加和，并可检验各种指标，例如l)新损伤的迹象；2)活性或新损伤的出现速度；3)损伤面积或损伤体积的变化(参见例如Paty等，(1993)Neurology43:665)。因此，然后可确定由疗法产生的改善情况，例如当单个对象与基线值相比或者受治疗组与安慰剂组相比有统计学上显著的改善时。组合物的制剂和给药在优选的实施方案中，配制本发明的核酸组合物用于给予或递送给对象的细胞。在一些实施方案中，本发明的核酸组合物用非离子聚合物和/或阴离子聚合物配制。这种聚合物可增强由所述核酸编码的分子的转染效率和表达，并保护所述核酸免于降解。因此，在用本发明的配制核酸组合物增强转染效率或表达的一些实施方案中，可使用较低量的核酸组合物(例如编码本发明分子例如本发明治疗性分子和/或调节性分子的运载体)。本文所用的"生物可降解聚合物"指能被对象体内代谢或清除、对对象没有或有极低毒性作用或副作用的聚合物。本文所用的"阴离子聚合物"指具有在中性pH下有净负电荷的重复亚单位的聚合物，所述重复亚单位包括例如离子化羧基、磷酸根或硫酸根基团。适合用于本发明的阴离子聚合物的实例包括但不限于聚氨基酸(例如聚谷氨酸、聚天冬氨酸和它们的组合)、聚核酸、聚丙烯酸、聚半乳糖醛酸和聚乙烯基硫酸盐。在其中聚合物为高分子酸的一些实施方案中，聚合物以盐形式使用。其它聚合物的实例包括但不限于PVP、PVA和壳聚糖。本文所用的"聚-L-谷氨酸，，在本文中与"聚-L-谷氨酸钠盐"、"聚-L-谷氨酸钠"和""聚-L-谷氨酸盐"可互换使用。本文所用的"聚-L-谷氨酸盐"指聚-L-谷氨酸的钠盐。此外，在优选的实施方案中，将聚谷氨酸的L型立体异构体用于本发明的组合物中，但在其它实施方案中，其它立体异构体或各异构体的外消旋混合物适合用于本发明的组合物中。再且，在一些实施方案中，阴离子氨基酸聚合物的其它盐类适合用于本发明的组合物中。本文所用的术语"阴离子氨基酸聚合物"指特定阴离子氨基酸的聚合形式，例如聚谷氨酸或聚天冬氨酸。在一些实施方案中，由阴离子氨基酸例如谷氨酸和天冬氨酸的混合物形成的聚合物，同样可适合用于本发明的组合物中。配制药物组合物的方法是本领域公知的。例如参见Remington'sPharmaceuticalSciences18.sup.ed.:MackPub.Co.:Eaton,Pa.1990有关药物可接受载体、稳定剂和isomolyte的配制和选择的详细讨论(另参见例如美国专利第4,588,585号、第5,183,746号、第5,795，779号和第5,814,485号；美国申请号10/190,838和10/035,397;PCT国际申请号PCT/US02/21464和PCT/USO1/51074)。可将药物可接受载体和其它成分(例如合用药物)用于本发明的药物组合物和方法中。本文所用的"药物可接受载体"是本领域常规用来帮助药物组合物治疗性成分的储藏、给药和/或所需作用的载体或稀释剂。载体还可以降低将本发明的药物组合物给予或递送给对象所带来的不良副作用。合适载体优选是稳定的，例如不能与制剂中的其它成分反应。此外，合适的载体在为治疗而应用的剂量和浓度下不会在对象中产生明显的局部或全身不良反应。这种载体是本领域公知的。合适的药物可接受载体是例如溶剂、分散介质、抗细菌剂和抗真菌剂、微胶嚢、脂质体、阳离子脂质载体、等渗和吸收延緩剂等，它们不是与本发明药物组合物不相容的成分。这种介质和物质用于治疗有效性或活性物质的用途是本领域公知的。还可将辅助性活性成分掺入到本发明的药物组合物中和用于本发明的方法中。用于本发明药物组合物的药物适宜载体的另外实例是大的稳定高分子，如清蛋白、明胶、胶原、多糖、单糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基S臾、不挥发油、油酸乙酯、脂质体、葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘露糖、右旋糖、右旋糖酐、纤维素、甘露糖醇、山梨糖醇、聚乙二醇(PEG)、肝素-藻酸等。緩释载体如透明质酸也适用。也可将稳定剂如人血清白蛋白(HSA)、甘露糖醇、右旋糖、海藻糖、硫代甘油和二硫苏糖醇(DTT)加入到本文的药物组合物中，以提高它们的稳定性。合适的稳定剂包括但不限于乙二胺四乙酸(EDTA)或其盐之一如EDTA二钠；聚氧乙烯山梨糖醇酯例如聚山梨醇酯80(TWEEN80)、聚山梨醇酯20(TWEEN20);聚氧丙烯-聚氧乙烯酯例如PluronicF68和PluronicF127;聚氧乙烯醇例如Brij35;semethicone;聚乙二醇例如PEG400;溶血;岸脂酰胆^5威和聚氧乙烯-p-t-辛基酚例如TritonX-IOO。表面活性剂对药物组合物的稳定化作用是本领域公知的(参见例如Levine等，(1991)J.ParenteralSci.Technol.45(3):160-165)。本发明药物组合物的其它可接受成分可包括但不限于提高等渗性的緩沖液如水、盐水、磷酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、乙酸、天冬氨酸盐和其它有机酸或其盐。优选地，本发明的药物组合物包含非离子张性剂(tonicityagent)，其量足以使组合物与体液等渗。可用多种本领域公知的非离子张性调节剂使本发明的药物组合物等渗，所述张性调节剂例如各种类别的^F友水4b合物(参见例如Voet和Voet(1990)Biochemistry(JohnWiley&Sons,NewYork);归类为醛糖(例如葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖)、核糖以及酮糖(例如果糖、山梨糖和木酮糖)的单糖；二糖(例如蔗糖、麦芽糖、海藻糖和乳糖)；醛醇(无环多轻基醇)，例如甘油、甘露糖醇、木糖醇和山梨糖醇。在一个优选的实施方案中，非离子张性调节剂是海藻糖、蔗糖和甘露糖醇或它们的组合。优选地，非离子张性调节剂的加入量足以使制剂与体液等渗。在一个实施方案中，当将非离子张性调节剂掺入到本发明的药物组合物中(包括例如无HAS的药物组合物)时，取决于所用的非离张性调节剂，其存在浓度为约1%至约10%(参见例如美国申请号10/190,838、10/035,397;PCT国际申请号PCT/US02/21464和PCT/US01/51074)。此外，优选的本发明药物组合物可掺入緩冲剂，该緩沖剂可减少因注射引起的局部疼痛和刺激，或者改善本发明药物组合物(例如包含和/或编码治疗性分子、调节性分子、激活性分子和/或失活性分子)的成分的溶解性或稳定性。这种緩冲液包括但不限于例如低磷酸盐、天冬氨酸盐和琥珀酸盐缓沖剂。本发明的药物组合物可另外包含能够提高组合物各成分的溶解性的增溶性化合物或配方。合适的增溶性化合物包括例如含有胍基的化合物，优选精氨酸。合适的增溶性化合物的另外实例包括但不限于例如氨基酸精氨酸，或者能保持提高本发明IFN-P突变蛋白溶解性的能力的精氨酸的氨基酸类似物。这种氨基酸类似物的实例包括但不限于例如含有精氨酸的二肽和三肽。合适的增溶性化合物的更多实例在例如美国专利第4,816,440号、第4,894,330号、第5,005,605号、第5,183,746号、第5,643,566号和在Wang等，(1980)J.ParenteralDrugAssoc.34:452-462)中讨论。在优选的实施方案中，本发明的药物组合物(例如包含和/或编码治疗性分子、调节性分子、激活性分子和/或失活性分子)配制成单位剂量，以可注射形式如溶液剂、混悬剂或乳剂形式配制，或者以冻干粉的形式配制，该冻干粉在给药前可转化成溶液剂、混悬剂或乳剂。本发明的药物组合物可通过膜过滤除菌，同时除去聚集物，并保藏在单剂量或多剂量容器如密封小并瓦、安瓿或注射器中。在另一个实施方案中，本发明的激活性分子或失活性分子配制成供口服给药。在一个实施方案中，编码本发明治疗性分子和/或调节性分子的核酸配制成供注射或电穿孔给药，本发明的激活性分子和/或失活性分子配制成供口服给药。例如，在一个优选的实施方案中，本发明的调节表达系统包含编码至少一种治疗性分子和调节性分子的单一运载体，其配制成通过注射或电穿孔递送到对象细胞，以及配制成供口服给予对象的激活性分子，使得激活性分子在对象细胞中的存在能激活调节性分子，从而调节性分子诱导治疗性分子在对象细胞中的表达。本发明的液体、冻干或喷雾干燥的药物组合物可按本领域所公知进行制备，例如制备成供随后按本发明方法给予对象的含水或非水溶液剂或混悬剂。每种这些药物组合物可包含治疗或预防上有效的或有活性的成分。本文所用的治疗或预防上"有效的"或"有活性的"的成分是一定量的本发明分子(例如包含和/或编码治疗性分子、调节性分子、激活性分子和/或失活性分子)，其被包括在本发明药物组合物中，以在需要用本发明组合物和方法治疗的对象中产生有关疾病或病症的治疗、预防或诊断的所需治疗性或预防性反应。优选本发明的药物组合物包含适当的稳定剂、填充剂或两者，以使制备和储藏过程中生物或治疗活性损失的问题减至最低。本发明药物组合物的制剂优选在制造和储藏条件下稳定，并防腐对抗微生物如细菌和真菌的污染作用。防止微生物污染的方法是公知的，例如可通过加入各种抗细菌剂和抗真菌剂来防止。本发明药物组合物的合适形式可包括无菌水溶液剂或分散剂，和供临场制备无菌可注射溶液剂或分散剂的无菌散剂。合适的剂型优选是无菌的，其流动性程度达到容易通过注射器吸取和注射。典型的栽体可包括溶剂或分散介质，其含有例如水緩沖水溶液(即生物相容性緩沖液)、乙醇、多元醇如甘油、丙二醇、聚乙二醇、它们的合适混合物、表面活性剂或植物油。除菌可通过任何本领域公认的技术来实现，包括但不限于过滤或添加抗细菌剂或抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸或硫柳汞。此外，也可将等渗剂如糖或氯化钠掺入到本发明组合物中。含有本发明药物组合物的无菌可注射溶液剂的生产可这样进行将所需量的组合物与各种成分(例如本文列举的成分)掺合在一起成为适当的制剂，然后进行除菌。为获得无菌散剂，以上溶液剂可按需进行真空干燥或冷冻千燥。本发明的药物组合物因此可以以治疗有效剂量与合适的药物可接受载体一起复合，以供以治疗有效量进行方便和有效的给药。应用于人类的本发明组合物和方法的精确治疗有效量，可由技术人员在考虑多发性硬化症对象在年龄、体重、炎性细胞的细胞浸润程度和身体状况方面的个体差异下进行确定。为了给药方便和剂量均一，特别有利的是以剂量单位形式配制胃肠外组合物。本文所用的剂量单位形式指适合作为单一剂量用于待治疗哺乳动物对象的物理上分立的单位；每个单位含有经计算与所要求的药物载体结合在一起能产生所需治疗作用的预定量的活性材料。主要活性成分可以与合适的药物可接受载体一起复合成本文所述的剂量单位形式，以供以治疗有效量进行方便和有效的给药。此外，合用药物可以以本领域公知的量包含在单位剂量形式中。在含有辅助活性成分例如合用药物的组合物的情况中，可例如参考该成分的已知剂量和给药方式来确定其剂量。本发明的药物组合物可按与剂型相容的方式进行给药，且所给予的数量将是治疗上有效的。此外，本发明的药物组合物可按任何医学上可接受的且可能取决于所治疗疾病或相关症状的具体类型或阶段的方式进行给药。可能的给药途径包括注射途径、胃肠外途径如血管内、静脉内、动月永内、皮下、月几肉内、肿瘤内、腹膜内、心室内、硬膜内或其它，以及口服途径、鼻内途径、眼内途径、直肠途径、局部途径或吸入途径。在一个优选的实施方案中，给药途径是^L肉内途径。在一个优选的实施方案中，本发明的药物组合物每3-12个月进行肌肉内给药。在另一个优选的实施方案中，肌肉内给药通过药物组合物的自动或手工注射(例如使用注射器)来进行。还设想了緩释给药，例如用可蚀植入物来进行。具体地说，本发明的核酸药物组合物可用本文描述和本领域公知的任何方式，包括例如注射方式或其它合适方式来递送给对象的细胞。例如，通过物理方式将核S臾递送到细胞的已知方法是适合使用的，它们包括但不限于电穿孔、声致穿孔(sonoporation)和压力。在一些实施方案中，本发明核酸组合物的递送通过电穿孔进行，包括应用脉沖电场在细胞膜中造成暂时的孔口，从而外源分子例如本发明的核酸组合物;故递送到细胞。已知通过调整电穿孔系统所产生的电脉冲，核酸分子能得以穿过细胞中在这个过程所产生的通道或孔口(参见例如美国专利第5，704,908号和第5,704,908号)。本文所用的"脉冲电压装置"或"脉沖电压注射装置"指能够通过给细胞发射局部化电脉冲，从而造成细胞膜失稳定导致在细胞膜中形成通道或孔口，来造成核酸分子被摄取到对象细胞中的设备。这种类型的常规装置适合用于递送本发明的核酸组合物。在一些实施方案中，所述装置经过标准化，能让本领域普通技术人员选择和/或调整脉沖电压的所需电压幅度和/或持续时间。脉沖电压核酸递送装置可包括例如在例如以下专利中描述的电穿孔设备美国专利第5，439，440号、第5,704,908号、第5,702,384号、PCTNo.WO96/12520、PCTNo.WO96/12006、PCTNo.WO95/19805或PCTNo.WO97/07826。用来装盛本发明药物组合物的活性成分的包装材料可包括玻璃、塑料、金属或任何其它合适的惰性材料，优选是不会与其中所盛的任何成分发生化学反应的包装材料。在一个实施方案中，药物组合物包装在透明玻璃单次使用小瓶中;并对每个药物小瓶配上装有稀释剂的单独小瓶。在另一个优选的实施方案中，稀释剂在注射器中提供(即注射器预填充有稀释剂)。在又一个优选的实施方案中，本发明的药物组合物在注射器中以溶液剂形式提供(即注射器预填充有溶液剂形式的药物组合物)，因此现成可用。在一个实施方案中，本发明的药物组合物可在2。-8。C(36。-46。F)的冷冻下保藏。在一个优选的实施方案中，药物组合物在室温下保藏。运载体和药盒本发明还提供运载体和包含本发明改进的调节表达系统以供治疗疾病的药盒。在一些实施方案中，本发明改进的调节表达系统包含一个或多个运载体，每个运载体包含一个或多个表达盒。在一个实施方案中，本发明改进的调节表达系统包含具有至少一个表达盒、更优选至少两个表达盒的单一运载体。适合用于本发明调节表达系统的运载体包括但不限于当给予对象的细胞时能够表达本发明的受编码治疗性分子和/或其它受编码分子(例如调节性分子、激活性分子或失活性分子)的运载体。合适运载体的实例包括但不限于本文描述和本领域公知的运载体，它们包括用以产生病毒的运栽体和非病毒运载体(不能产生病毒的运载体)。例如，有一类合适的运载体采用了可提供自主复制的染色体外质粒的DNA元件，其衍生自动物病毒如牛乳头状瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒或SV40病毒。此外，用以产生病毒的已知运栽体(参见例如Wang等，GeneTherapy,4:432-441，1997;Oligino等，GeneTherapy,5:491-496,1998)可进行修饰而适用于本发明的调节表达系统。此外，本发明的运载体也可进行修饰以包括附加的功能序列和有效连接序列，以使受编码分子的表达最优化。合适功能序列的实例包括但不限于剪接类型、聚腺苷酸化类型和其它类型的RNA加工序列；及转录启动子、增强子和终止序列。掺入这种功能序列的合适cDNA表达运载体包括Okayama,H.,Mol.Cell.Biol.3:280(1983)描述的运载体以及其它运载体。本文所用的"质粒"指包含染色体外遗传物质的组合物，其通常为环状双链DNA，能独立于染色体DNA进行复制。质粒可用作本文所述的运栽体。本文所用的"运载体"指包含^C设计用来指导靶细胞转化或转染的遗传物质的组合物(例如核酸构建物)。此外，运载体可含有多个这样的功能序列，它们相对于运载体的其它序列在位置和序列上定4立(positionallyandsequentiallyoriented),4吏4寻本发明的受编石马分子能在转染或转化的细胞中被转录和必要时被翻译。在运载体或表达盒编码本发明分子(例如治疗性分子、调节性分子、激活性分子或失活性分子)的情况中，它包含按本文所述的本发明调节表达系统在异源细胞(例如对象的细胞)中表达受编码分子所必需的成分(例如启动子、poly(A)位点、转录起始位点和终止位点)。在一个优选的实施方案中，本发明改进的调节表达系统包含含有第一表达盒和第二表达盒的单一运载体，所述第一表达盒具有至少一个供编码治疗性分子的第一核酸序列插入的克隆位点，所述第二表达盒具有至少一个供编码调节性分子的第二核酸序列插入的克隆位点。在另一个实施方案中，运载体是用以产生编码本发明分子(例如治疗性分子和/或调节性分子)的病毒的运载体，如本文所述供递送到对象细胞，例如穿梭质粒，更具体地i兌AAV-l穿梭质粒(参见例如表8)。在一个优选的实施方案中，运载体是单一质粒运载体，例如pGTl(包含序列SEQIDNO:9和SEQIDNO:4)、pGT2(包含序列SEQIDNO:10和SEQIDNO:4)、pGT3(包含序列SEQIDNO:11和SEQIDNO:4)或pGT4(SEQIDNO:12)，其中各运载体包含位于IVS8的3'和hGHpoly(A)位点的5'的多克隆位点(SEQIDNO:4)(例如如图14A-D所示意说明)，或者pGTll(包含序歹寸SEQIDNO:9和SEQIDNO:5)、pGT12(包含序列SEQIDNO:10和SEQIDNO:5)、pGT13(包含序歹')SEQIDNO:11和SEQIDNO:5)或pGT14(包含序列SEQIDNO:12和SEQIDNO:5)，其中各运载体包含位于IVS8的3'和hGHpoly(A)位点的5'的多克隆位点(SEQIDNO:5)。本发明的表达盒包含供表达本发明受编码分子例如治疗性分子、调节分子、激活分子或失活性分子的功能序列。在一些实施方案中，表达盒包含至少一个有效连接到编码本发明分子的核酸序列的功能序列。本文所用的"功能序列，，指在细胞中具有功能或活性的核酸或氨基酸序列，所述功能或活性例如与分子的细月包表达、加工或克隆有关的功能或活性，或者与分子的生物或细胞活性或者功能有关的功能或活性。功能序列的实例包括编码本发明分子(例如治疗性分子、调节性分子、激活性分子或失活性分子)的序列、启动子、蛋白质或核酸结合位点、剪接位点、转录终止位点、调节域(例如激活域)、转录起始位点、蛋白质或核酸稳定化位点、间插序列、限制酶位点或克隆位点、病毒包装信号或者其它细胞、蛋白质或核酸加工或调节信号(例如信号转导序列或组织特异性序列)。功能序列的更多实例包括但不限于5'或3'非翻译区(例如UT12，SEQIDNO:2)、内含子(例如IVS8，SEQIDNO:3)、聚腺苷酸化(poly(A))位点(例如SV40，SEQIDNO:8或hGHpoly(A)位点，SEQIDNO:6)或DNA结合位点(DBS)(例如SEQIDNO:49)。这种功能序列还包括例如编码受调节启动子或组织特异性启动子的序列，所述受调节启动子或组织特异性启动子分别促进由有效连接到本发明表达盒中这种功能序列的核酸序列所编码的分子的受调节表达或组织特异性表达。合适的启动子的实例包括但不限于CMV启动子、肌肉特异性启动子(例如肌动蛋白启动子或肌肉肌酸激酶(MCK)启动子)、条件特异性(例如低氧或发炎)启动子或元件(例如ELAM启动子或HRE)、组成型启动子(例如遍在蛋白、PGK或EFla启动子)、合成或嵌合启动子(例如CMV/肌动蛋白启动子)、细胞周期特异性启动子(例如细胞周期蛋白A或cdc6启动子)。在一个实施方案中，启动子是生理响应性启动子，例如响应炎症、优选响应指示疾病存在的启动子。合适的启动子的更多实例在下表l中提供。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table>在一个实施方案中，本发明的调节表达系统包含着一个或多个包含有至少一个表达盒的运载体，所述表达盒具有有效连接到为融合或嵌合蛋白的本发明分子的编码核酸序列的CMV启动子序列，所迷启动子驱动受编码分子(例如治疗性分子、调节性分子、激活性分子或失活性分子)的表达。在一些实施方案中，合适的启动子是可提供受编码分子在对象细胞中的持久表达水平的启动子。在一个实施方案中，核酸运载体编码有效连接到能在对象细胞中提供持久表达的启动子的本发明分子(例如治疗性分子、调节性分子、激活性分子或失活性分子)，将该核酸运载体通过电穿孔给予对象的细胞，使得所述分子在细胞中、优选在给予部位得到表达。在一个优选的实施方案中，受编码分子是治疗性分子。在另一个实施方案中，本发明的调节表达系统包含着一个或多个包含有第一表达盒的运载体，所述表达盒具有有效连接到编码本发明分子的核酸序列的、包含至少一个GAL-4DBS的启动子序列。在一个实施方案中，启动子序列包含GAL-4DBS的多聚体，例如3-18个GAL-4DBS。此外，本发明的表达盒可适当进行修饰以包含供所需核酸序列插入的克隆位点。在另一个实施方案中，本发明的表达盒包含至少一个供编码本发明分子例如治疗性分子、调节性分子、激活性分子或失活性分子的核酸序列插入的克隆位点，更优选多克隆位点(MCS)。本文所用的"克隆位点"指核酸中的酶位点或其它位点，用例如本领域公知的常规方法可将某核酸序列插入、有效连接或以其它方式附接到其中，使得该核酸序列按其预定用途起作用。在一个实施方案中，本发明的第一表达盒包含供第一核酸序列插入的MCS,该第一核酸序列编码治疗性分子、包含有至少一个DBS(例如3-18个GAL-4DBS)的可诱导启动子、5'非翻译区(例如UT12，SEQIDNO:2)、内含子(例如IVS8，SEQIDNO:3)和hGHpoly(A)位点(例如SEQIDNO:6),使得当第一核酸序列在MCS(例如SEQIDNO:4或SEQIDNO:5)插入时，这些功能序列有效连接到第一核酸序列。在另一个方面，本发明的第二表达盒包含供编码受调节调节分子的第二核酸序列插入的MCS和SV40poly(A)位点，使得当笫二核酸序列在MCS插入时，这些功能序列有效连接到第二核酸序列。在一个优选的实施方案中，第一和第二表达盒存在于单一运载体中。本发明的药盒包含至少一种本文描述的本发明表达系统，更具体地说至少一种本发明的药物组合物、运载体或分子(例如治疗性分子、调节性分子、激活性分子或失活性分子)。组合物的分离和构建本发明的组合物包括例如化学化合物、蛋白质和核酸(例如DNA或RNA分子)，具体地说编码蛋白质或RNA的核酸。本发明的化学化合物、核酸和蛋白质组合物可用本文描述或本领域公知的常规方法和测定法进行分离、构建和/或测试。本文所用的"蛋白质"或"氨基酸分子"指肽、全长蛋白质或全长蛋白质的片断或部分。此外，本发明的蛋白质可以是融合、嵌合、修饰、分离、合成或重组的氨基酸分子。具体地说，适合用于本发明组合物和方法的蛋白质的实例包括但不限于野生型全长蛋白质(包括其分泌形式)或者其具有生物或治疗活性的类似物、衍生物或变体。更具体地说，本发明的蛋白质变体可以是突变蛋白，即包含突变例如单个或多个氨基酸取代、缺失或添加，使得变体保持或具有生物或治疗活性。编码蛋白质的序列可包括例如野生型蛋白质序列的密码子优化版本或者人源化序列。人类中优化的密码子选择可从表达的人基因密码子选择频率确认，并可用本领域公知的方法来确定，例如程序"HumanHigh.codN，，(自WisconsinSequenceAnalysisPackage,版本8.1,GeneticsComputerGroup,Madison,WI)。例如，在高度受表达的人基因中最频繁使用的密码子可以成为供在人对象细胞中进行表达的优化密码子，因此可用作构建合成的编码序列的基础。本文所用的涉及本发明分子的"核酸"指核酸分子，例如DNA或RNA，或者它们的融合、嵌合、修饰、分离、合成或重组的形式。具体地说，适合用于本发明组合物和方法的核酸的实例，包括-(旦不限于编码蛋白质的野生型全长DNA或RNA(例如mRNA)，或者具有生物或治疗活性的其它核酸分子(例如shRNA、siRNA、核酶、反义RNA或DNA、RNA或DNA寡核苷酸)，或者它们的类似物、衍生物或变体。更具体地说，本发明的核酸变体可以是突变体，即包含突变例如单个或多个核酸取代、缺失或添加，使得变体保持或具有生物或治疗活性。此外，本发明调节表达系统的修饰可用本文描述或本领域公知的常规方法和测定法来实施和测试。本文所用的涉及本发明分子(例如包含和/或编码治疗性分子、调节性分子、激活性分子和/或失活性分子)的"修饰，，，指任何导致参考核酸、氨基酸或化学分子发生变化或变更，从而产生所需的本发明酸的突变，产生所需的具有特定生物和/或治疗活性的其变体；蛋白质或核酸序列的突变，产生所需的人源化序列；或者化学化合物的突变，产生所需的化学结构和/或生物和/或治疗活性)。例如，本发明分子的功能域或功能序列，包括任何有效连接到本发明分子或编码本发明分子的序列(包括例如运载体序列或转录控制序列)，可进行修饰以产生所需的本发明组合物和分子。具体地说，本发明的调节表达系统可进行修饰或优化，以获得特定的特异性(例如对特定组织、病况、疾病或者生物标志或其它分子的特异性)、严格性或者用于疾病治疗的调节、表达和/或活性的量，如本文所述。例如，本发明的调节表达系统可通过分离或构建以下各项进行修饰或优化以达到这些目标l)具有对调节性分子LBD的所需结合特异性的新型或变异激活性分子和失活性分子；2)具有新型或变异AD、LBD(例如结合新型或变异激活性分子或失活性分子)和/或DBD(例如结合新型或变异启动子序列)的调节性分子；3)其活性对特定调节性分子的存在高度特异和响应的启动子(例如在特定调节性分子的存在下被特异性激活或失活，如通过与特定调节性分子的结合)；4)完全人源化序歹^例如编码GAL-4DBD和GAL-4DBS从而使其完全人源化的修饰序列)；5)供进行RNA(例如shRNA、siRNA、核酶或反义RNA)、具体地说RNA治疗性分子的表达的表达盒；6)修饰启动子或其它功能序列，其特别用来减少由有效连接到该启动子或其它功能序列上的序列编码的治疗性分子的非特异性表达。在一个实施方案中，本发明的调节表达系统经修饰使得治疗性分子的基础表达显著降低，以增加对调节性分子的给予的依赖，从而借赖性来使安全容限增加。例如，有效连接到编码治疗性分子的核酸编码序列的启动子序列，可针对GAL-4DBS的拷贝数进行修饰和优化，使得该启动子的响应性(及所至丈的治疗性分子表达)能通过具有GAL-4DBD的调节性分子的存在(例如与其结合)得到调节。同样例如，可用标准方法构建和修饰最小限度启动子(minimalpromoter),并有效连接到治疗性分子，以减少该治疗性分子的基础表达。此外，在一些实施方案中，治疗性分子由核酸序列编码，其当被递送到和/或存在于对象的细胞时，治疗性分子以低水平表达。在一些实施方案中，优选通过被递送到和/或存在于对象细胞中的、编码治疗性分子的核酸的固有性质，来调节治疗性分子表达的水平。例如，在一些实施方案中，由于对象细胞中的治疗性分子基础表达水平随着编码治疗性分子的核酸量的增加而增加，因此合宜的是通过采用弱启动子来减少在对象细胞中表达的治疗性分子蛋白质的量。可采用启动子区域中的独特限制性内切核酸酶位点，修饰启动子的不同区域和5'UTR,以缺失可能会对治疗性分子在本发明调节性分子存在或不存在下的表达产生影响的序列。例如，在另一个实施方案中，在编码转录起始区域(inr)的序列中造成缺失，使得有效连接到编码治疗性分子的序列的可诱导启动子的固有活性受到修饰，例如降低或增加该活性。在另一个实施方案中，转录起始区域(inr)的下游是有效连接的编码UT12(CMV的5'非翻译区，+1至+112)的序列。在另一个实施方案中，治疗性分子由有效连接到可诱导启动子序列(例如SEQIDNO:l)的核酸序列编码，所述启动子序列具有有效连接到TATA框序列的6XGAL-4DBS。从-33至-22的序列适合用于本发明的一个实施方案，该序列含有来自II型腺病毒的EIb区域(NCBI登录号J01917的残基1665-1677)的TATA框。在另一个实施方案中，启动子序列包含有效连接到AdElbTATA框序列的6XGAL-4DBS和含有CMV启动子推定起始子(inr)区域的CMV序歹'J(Macias等，Journ.ofVirol.70(6):3628(1996))，使得这些功能序列有效连接到编码治疗性分子的核酸。在一些实施方案中，治疗性分子由有效连接到多个拷贝的GAL-4DBS的核酸序列编码，所述GAL-4DBS包含17核普酸序列5，-TGGAGTACTGTCCTCCG陽3'或5，匿CGGAGTACTGTCCTCCG画3'(例如SEQIDNO:49的共有GAL-4DBS的17核苦酸序列)。在一个实施方案中，治疗性分子由有效连接到4个拷贝的GAL-4DBS的核酸序列编码，所述GAL-4DBS各自包含一皮具有核苷酸序列5'-AGTTTAAAAG-3'的10核香酸间隔区隔开的17核香酸序列5'匿CGGAGTACTGTCCTCCG匿3',如在例如SEQIDNO:50中。在另一个实施方案中，治疗性分子由有效连接到6个拷贝的GAL-4DBS的核酸序列编码，所述6个拷贝的GAL-4DBS分两组排列，每组3个GAL-4DBS拷贝，且其中l)在每个組中(含有3个拷贝的GAL-4DBS)，第二拷贝的GAL-4DBS包含17核苷酸序列5'-TGGAGTACTGTCCTCCG画3'，第一和第三拷贝的GAL-4DBS各自包含17核普酸序列5'-CGGAGTACTGTCCTCCG-3';2)3个拷贝的组中各拷贝^皮二核苷酸5'-AG-3'隔开；3)两个3个拷贝的组之间有较长的间隔区序列5'-AGTCGAGGGTCGAAG-3'(例如所述包含六个拷贝GAL-4DBS的SEQIDNO:51的序列)。在一些需要在特定组织中进行表达的实施方案中，本发明的调节表达系统可进行修饰以包含组织特异性启动子。例如，如果治疗性分子表达的靶组织是肌肉，可将编码治疗性分子的核酸序列有效连接到肌肉特异性启动子，例如肌动蛋白启动子序列。组织特异性启动子(例如肌肉特异性启动子)可增加受编码治疗性分子的表达的保真性。在一些实施方案中，组织特异性启动子可提供在树突细胞或其它抗原呈递细胞中的表达减少的优点，从而避免对:f皮表达治疗性分子(例如蛋白质或核酸)的免疫反应。在一个实施方案中，对本发明的调节表达系统进行修饰，以在编码治疗性分子的核酸(例如运载体)的递送和治疗性分子表达的诱导之间加入滞后时间，特别是在存在着对核酸递送的炎性反应的情况下。在这个实施方案中，可将治疗性分子表达延迟到炎性反应出现降低为止。例如，在一些实施方案中，通过将滞后期(诱导治疗性分子表达前的时间)的长度增加例如12天到54天，可降低抗治疗性分子抗体的产生的发生率。此外，在一些实施方案中，合宜的是延长编码治疗性分子的核酸的引入和调节治疗性分子在对象细胞中表达和/或活性的激活性分子(例如MFP)的给予(例如激活性分子激活调节性分子，被激活的调节性分子的存在因此调节治疗性分子表达和/或活性的这种情况)之间的延期。在一个实施方案中，滞后期是12天，优选20天，更优选55天或直到免疫反应已降低。在一个实施方案中，调节表达系统^皮修饰，使得治疗性分子表达和/或活性的特异性、选择性、精确定时和/或水平在调节性分子的存在下得到调节。在又一个实施方案中，调节性分子在被给予本发明调节性分子的对象中被快速清除。在一个实施方案中，调节性分子是蛋白质，它被修饰而使得它在特异性或关联(cognate)配体的存在下被激活，从而激活的调节性分子的存在调节治疗性分子的表达和/或活性。此外，调节性分子的激活的特异性和严格性，可通过突变调节性分子的GAL-4DBD以使任何在激活性分子不存在下形成二聚体的倾向减至最低，来进行优化。更具体地说，为使调节性分子的任何非特异性激活和/或二聚体形成(例如在激活性分子不存在下)减至最低，可对调节性分子进行以下修饰通过使GAL-4DBD的C末端部分(例如20个C末端残基)发生缺失或以别的方式发生突变，从而减少据预测造成GAL-4同型二聚体形成的巻曲螺旋结构的长度，来使GAL-4结构域发生突变。在一些实施方案中，GAL-4DNA结合域("GAL-4DBD，')包含GAL-4N末端DBD的氨基酸1-93的部分或片断(例如氨基酸2-93的序列是SEQIDNO:37而氨基酸l是甲硫氨酸的情况)。例如，在一些实施方案中，GAL-4DBD包含GAL-4的N末端DBD的氨基酸2-93(例如包含SEQIDNO:38氨基酸序列或由SEQIDNO:37核酸序列编码)在一个实施方案中，GAL-4DBD包含GAL-4的N末端DBD的氨基酸2-93和有效连接的N末端肽序列，例如在SEQIDNO:46中(或如由SEQIDNO:45核酸序列编码)，其中例如该N末端肽序列后紧接着是GAL-4的N末端DBD的氨基酸2-93。在其它实施方案中，GAL-4DBD包含GAL-4的N末端DNA结合域的氨基酸2-74(例如包含SEQIDNO:48氨基酸序列或由SEQIDNO:47核酸序列编码)。在一些实施方案中，合适的GAL-4DBD在核酸序列或氨基酸序列中具有修饰，该修饰导致GAL-4DBD的突变，使得它保持结合规范(canonical)17聚体结合位点CGGAAGACTCTCCTCCG的能力，但形成进行自体二聚化所需的螺旋三级结构的能力降低。在一些实施方案中，在横跨GAL-4DBD序列的氨基酸75-93和/或54-74的区域造成突变或缺失。例如，在一个实施方案中，造成GAL-4DBD序列的氨基酸54-64或65-75发生缺失，以通过包含突变GAL-4DBD的调节性分子的巻曲螺旋区域使得自体二聚化减至最低。在一个实施方案中，修饰调节性分子的核酸序列，使其编码包含一个或多个功能域，例如DNA结合域(DBD)、配体结合域(LBD)和/或调节域(RD)(例如激活域)的融合蛋白或嵌合蛋白。用于本发明的融合蛋白或嵌合蛋白的合适功能^i的实例包括但不限于GAL-4DBD、人孕酮受体(hPR)LBD和NFK邵paBp65AD。NFkappaBp65、VP-16、TAF-1、TAF-2、TAU-1、TAU-2、ORF-IO、TEF-1和任何其它具有调节功能(例如调节本发明分子的表达和/或活性)、更具体地说转录调节功能的核酸或氨基酸序列(参见例如Pham等，(1992)6(7):1043-50Mol.Endocrinol.;Dahlman-Wright等，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91,1619-1623;Million等，(1997)Mol.Endocrinol.11(12):1795-805;Moriuchi等，(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA92(20):9333陽7);Hwang等，(1993)EMBOJ12(6):2337-48)。在一个实施方案中，优选的RD是人反式激活域(例如NFkappaBp65)。在另一个实施方案中，调节性分子特别是调节性分子的功能域(例如RD)是人源化的。在一个实施方案中，本发明调节性分子的LBD衍自与类固醇受体家族中受体的野生型LBD相关的氨基酸序列，所述受体例如孕酮受体(PR)，更具体地说人孕酮受体(hPR)。在另一个实施方案中，调节性分子是类固醇受体，该类固醇受体(例如PR,更具体地说hPR)的LBD的氨基酸序列被突变，所导致产生的突变类固醇受体LBD(例如突变的hPRLBD)能选择性结合为抗孕激素而不是孕酮的激活性分子。因此，在这个实施方案中，突变的类固醇受体LBD(例如突变的hPRLBD)这种调节性分子能被为抗孕激素而不是天然孕酮的激活性分子所选择性激活。具体地说，在一个实施方案中，抗孕激素结合天然PR,但起到拮抗剂的作用。在一个实施方案中，孕酮结合野生型PR并起到激动剂的作用，而不结合截短或突变的PR。在另一个实施方案中，突变的PR保持结合抗孕激素的能力，但作为激动剂对抗孕激素作出响应。在一个优选的实施方案中，当抗孕激素结合为调节性分子的突变PR时，突变PR蛋白被激活形成二聚体。在这个实施方案中，二聚体-抗孕激素复合物然后结合启动子序列的DBS,/人而诱导有效连接到该启动子的编码治疗性分子的核酸序列的转录。在一个实施方案中，在抗孕激素MFP(RU486)存在下，嵌合的调节性分子结合有效连接到编码治疗性分子的核酸序列的17聚体GAL-4DBS,导致治疗性分子表达的有效配体诱导反式激活。调节性分子的修饰的类固醇激素LBD,也可通过缺失^i基末端氨基酸、优选约1-120个羧基末端氨基酸来进行修饰。所需缺失的程度可用标准的分子生物学技术获得，以实现对所需配体的选择性和当给予配体时的高可诱导性。在一个实施方案中，突变的类固醇激素受体LBD通过缺失约1至约60个羧基末端氨基酸来进行突变。在另一个实施方案中，缺失42个羧基末端氨基酸。在既有高选择性也有高可诱导性的又一个实施方案中，缺失19个羧基末端氨基酸。在一个实施方案中，调节性分子的核酸序列包含这样的序列，其编码截短的GAL-4DBD、C末端缺失19个氨基酸的突变孕酮受体和p65反式激活域(例如SEQIDNO:39)。在另一个实施方案中，调节性分子的核酸序列包含这样的序列，其编码具有突变孕酮-受体配体结合域的嵌合受体、截短的GAL-4DNA结合域和VP16或p65反式调节域，其中所述p65反式调节域是人p65蛋白的激活域的一部分；NfkappaB复合物的成分。通过用各种人源激活域例如人p65的残基286-550代替VP16,嵌合受体的强力可诱导性可得以保持，同时使受体蛋白发生"人源化"或者降低发生病毒VP16成分所致的外来蛋白免疫反应的潜在可能性。本发明调节性分子的DBD并不限于本文描述的修饰的GAL-4DBD。例如，在一些实施方案中，合适的DBD是已^皮修饰而除去了序列的DBD，这些序列对结合位点的识别来说并不是必需的，但由其二级结构预测可能会引起自体二聚化。其它可以这样进行修饰且合适的DBD包括例如类固醇受体家族成员(例如糖皮质类固醇受体、孕酮受体、视黄酸受体、曱状腺激素受体、雄激素受体、蜕皮激素受体)或其它细胞DNA结合蛋白如cAMP应答元件结合蛋白(CREB)或锌指DNA结合蛋白如SP1的已知DBD。基因调节蛋白的类固醇受体家族也适合用于本发明调节性分子的构建。类固醇受体是配体激活的转录因子，其配体范围可从类固醇到类视色素、脂肪酸、维生素、甲状腺激素及其它目前未筌定的小分子。这些化合物结合受体而上调或下调受类固醇调节的基因的表达。这些化合物据报道通过现有机制得以从身体清除，因此通常无害。在本发明中，类固醇受体的配体可以是任何化合物或分子，其例如通过结合或者以其它方式与类固醇受体的LBD相互作用来激活类固醇受体。本文所用术语"类固醇激素受体"指类固醇受体超家族中的类固醇激素受体。类固醇激素受体家族的代表性实例包括但不限于雌激素、孕酮、糖皮质类固醇、盐皮质类固醇、雄激素、甲状腺激素、视黄酸、类视色素X、维生素D、COUP-TF、蜕皮激素、Nurr-l的受体和孤独受体。例如类固醇/甲状腺激素/类视色素超基因家族中的激素的受体，是能结合激素敏感性基因的调节区中的靶序列以增强或抑制其转录的转录因子。这些受体在一系列的分立结构域中具有进化上保守的相似性，所述结构域包括配体结合域(LBD)、DNA结合域(DBD)、二聚化域和一个或多个反式激活域。可在不同结构域的氨基酸序列中产生各种突变或变化，以形成变异类固醇受体或者更具体地说突变类固醇受体。在一个实施方案中，突变类固醇受体能够优先结合非自然(non-natural)或非天然(non-native)配体，而不是结合野生型或天然的激素受体配体。在一个实施方案中，突变的激素受体通过缺失参考(reference)激素受体(例如野生型或天然激素受体)羧基末端的氨基酸，例如缺失参考激素受体的羧基末端的约1个至约120个氨基酸来产生。在另一个实施方案中，本发明的突变孕酮受体包含参考孕酮受体(例如野生型或天然激素受体)的约1个至约60个氨基酸的羧基末端缺失。在另一个实施方案中，突变的孕酮受体包含参考孕酮受体(例如野生型或天然激素受体)的19个氨基酸的羧基末端缺失。供进行修饰和/或用于本发明组合物和方法的修饰或突变类固醇激素受体的更多实例描迷于例如以下文献(1)"AdenoviralVector-MediatedDeliveryofModifiedSteroidHormoneReceptorsandRelatedProductsandMethods"，国际专利申请WO0031286(PCTAJS99/26802);(2)"ModifiedGlucocorticoidReceptors,GlucocorticoidReceptor/ProgesteroneReceptorHybrids",国际专利申"i貪W09818925(PCTAJS97/19607);(3)"ModifiedSteroidHormonesforGeneTherapyandMethodsforTheirUse"，国际专利申请WO9640911(PCT/US96/0432);(4)"MutatedSteroidHormoneReceptors,MethodsforTheirUseandMolecularSwitchforGeneTherapy",国际专利申请WO9323431(PCTAJS93/0439);(5)"ProgesteroneReceptorsHavingC-TerminalHormoneBindingDomainTruncations"，美国专利第5,364,791号；(6)"ModifiedSteroidHormoneReceptors,MethodsforTheirUseandMolecularSwitchforGeneTherapy"，美国专利第5,874,534号；(7)"ModifiedSteroidHormoneReceptors,MethodsforTheirUseandMolecularSwitchforGeneTherapy"，美国专利第5,935,934号。此外，可基于野生型类固醇激素受体的拮抗剂甚至在野生型受体激动剂的存在下激活突变受体的能力，来选择突变的类固醇激素受体LBD。例如，在一个实施方案中，孕酮是孕酮受体的正常配体，用作该受体的强激动剂。抗孕激素MFP(RU486)是孕酮受体的非自然或非天然配体。认为MFP是"抗孕激素"是因为尽管它能够对野生型孕酮受体产生激动剂作用，但它抑制孕酮的激动剂作用。因此，当在正常激动剂存在时，即当MFP和孕酮两者与野生型孕酮受体共同存在时，MFP可认为是野生型孕酮受体的"拮抗剂"。但是，在本发明的一个实施方案中，突变的孕酮类固醇激素受体不被孕酮(野生型受体的激动剂)激活，而是在MFP(野生型受体的"拮抗剂")的存在下被激活。另外，在一个实施方案中，孕酮不阻断MFP对突变类固醇激素受体的激活。因此，突变受体的特征是结合野生型受体拮抗剂(例如MFP)时被激活，甚至在野生型孕酮受体激动剂(例如孕酮)的存在下。在一个实施方案中，突变的类固醇受体在野生型类固醇激素受体拮抗剂的存在下激活所需治疗性分子的转录。在一些实施方案中，拮抗剂是用作野生型类固醇受体(例如野生型类固醇激素受体)的拮抗剂的非天然或非野生型配体。在一个实施方案中，野生型类固醇激素受体的拮抗剂是能与野生型类固醇激素受体相互作用或与该受体结合，从而阻断该受体激动剂的活性的分子。在另一个实施方案中，野生型类固醇激素受体的激动剂是能与野生型类固醇激素受体相互作用，以调节治疗性分子在对象细胞中的表达和/或活性的分子。这种激动剂的实例包括但不限于用于孕酮受体10的孕酮，其中孕酮结合野生型孕酮受体以激活孕酮调节基因的转录。在一个实施方案中，合适的孕酮受体激动剂是才莫拟孕酮的化学化合物。例如，米非司酮(MFP，或称RU48)是也能结合野生型孕酮受体并与孕酮竟争结合的非自然配体。在一个实施方案中，在孕酮和野生型孕酮受体的存在下，MFP通过阻断孕酮对该受体的激活而对该受体产生拮抗作用。可修饰孕酮受体(PR),例如在孕酮受体的LBD中进行修饰，使得它只结合MFP而不结合孕酮。例如，孕酮受体的LBD的突变可以使得MFP的结合能激活孕酮受体。在一个实施方案中，将突变的PRLBD，或者更一般地，任何其它突变的类固醇受体LBD,与特定的DBD(例如GAL-4DBD)融合，使得MFP的结合能选择性激活调节性分子，后者反式激活由被PRDBD识别的启动子所驱动的治疗性分子表达和/或活性。因此，在一些实施方案中，本发明的突变类固醇受体在野生型类固醇受体的激动剂的存在下不被激活，而是在非自然配体的存在下被激活。术语"非自然配体"或"非天然配体"指化合物，它们是非野生型或非天然存在的、结合受体的配体结合域的配体。非自然配体的实例是选择性孕酮受体调节剂(SPRM)或中孕酮(mes叩rogestin)(参见例如Chwalisz等，(2002)AnnNYAcadSci955:373-388;Elger等，(2000)Steroids65(10-11):713-723;Chwalisz等，(2004)SeminReprodMed22(2):113-119;DeManno等，(2003)68(10-13):1019-1032;Fuhrmann等，(2000)JMedChem43(26):5010画5016)。SPRM或mesoprogestins的实例在下表2中描述和说明。表21.名称17(3-曱氧基-17a-(曱氧基曱基)-ll(3-甲氧基苯基-4,9-雌二烯-3-酮结构P57-1分子式C28H36N04分子量436.60g/mol熔点184-186。C(二氯甲烷)2.名称4-[17l3-甲氧基-17a-(曱氧基曱基)-3-氧代雌-4,9-二烯-ll卩-基]苯甲醛-1(E)-[O-(乙氧基)羰基]肟结构P57-2分子式C31H39N06分子量521.66g/mol熔点143-151。C(分解，甲醇)3.名称4-[17J3-甲氧基-17a-(曱氧基甲基)-3-氧代雌-4,9-二烯-l卩-基]苯甲醛-l(E)-肟乙酸酯结构P57-3分子式C30H37NO5分子量491.63g/mol熔点110-119。C(乙酸乙酯)4.名称4-[17a-(乙氧基甲基)-17l3-甲氧基-3-氧代雌-4,9-二烯-lip-基〗苯甲醛-l(E)-肟结构P58-4分子式C29H37N04分子量463.62g/mol熔点90-95。C(曱基叔丁基醚)HPLC纯度98.9面积％(264nm)5.名称4-[17(3-曱氧基-17a-(曱氧基甲基)-3-氧代雌-4,9-二烯-llf3-基]苯甲膝-缩氨基硫脲结构P58-5分子式C29H37N303S分子量507.69g/mol熔点217-236。C(曱醇)6.名称4-[17卩-羟基-17a-(甲氧基甲基)-3-氧代雌-4,9-二烯-ll(3-基]苯甲醛-l(E)-肝乙酸酯结构P58-6分子式C29H35N05分子量477.61g/mol熔点112。C(丙酮，分解)，aD=+209。(CHC13)7.名称4-[17P-羟基-17a-(曱氧基曱基)-3-氧代雌-4,9-二烯-ll卩-基]苯曱醛-l-(E)-[O-(乙基氨基)羰基]肟结构P59-7分子式C3QH38N205分子量506.65g/mol熔点184-190。C(二氯甲烷/乙酸乙酯)8.名称4-[17P-甲氧基-17a-(甲氧基甲基)-3-氧代雌-4，9-二烯-lip-基]苯甲醛-l-(E)-[O-(曱氧基)羰基]肟(ZK280993)结构P59-8分子式C30H37NO6分子量507.63g/mol熔点110。C(mtbe，分解)9.名称4-(17(3-羟基-17a-甲基-3-氧代雌-4,9-二烯-lip-基]苯曱搭-l(E)-/lt(ZK280999)结构P59-9分子式C26H31N03分子量405.53g/mol熔点163-165。C(乙醇/水)10.名称4-[17卩-甲氧基-17a-(甲氧基甲基)-3-氧代雌-4,9-二烯-ll卩-基]苯甲醛-1(E)-[O-(乙硫基)羰基]肟(ZK190425)结构P60-10分子式C31H39N05S分子量537.72g/mol熔点148-155。C(分解，丙酮/正己烷)11.名称4-[17p-羟基-17a-(2-丙氧基甲基)-3-氧代雌-4,9-二烯-lll3-基]苯甲醛-1(E)-月亏(ZK281100)结构P60-11分子式C29H37N04分子量463.62g/mol熔点192-196。C(二乙醚，分解)12.名称4-(4'-溴-17|3-甲氧基17a-(曱氧基甲基)-3-氧代雌-4,9-二烯-ll卩-基]苯曱醛-l(E)-月亏(ZK281117)结构P60-12手性分子式C28H34BrN04分子量528.48g/mol熔点138-141°C(二乙醚/正己烷)13.名称4-[17卩-曱氧基-17a-(曱氧基曱基)-3-氧代雌-4，9-二烯-n(3-基〗苯乙酮1113-(4-乙酰苯基)l7f3-曱氧基-17a-(曱氧基曱基)-4,9-雌二烯-3-酮(ZK139905)结构P61-13分子式C29H3604分子量448.61g/mol熔点133-137。C(二乙醚/二氯曱烷)14.名称11卩-[4-(二曱氨基)苯基]-17(3-曱氧基-17(1-(曱氧基甲基)-4,9-雌二烯-3-酮(ZK281317)结构P61-14分子式C29H39N03分子量449.64g/mol泡沫(己烷)，aD=+184°(CHC13)15.名称4-[17a-乙炔基-17(3-甲氧基-3-氧代雌-4,9-二歸-ll(3-基]苯甲醛-l(E)-月亏(ZK281527)结构P61-15分子式C28H31N03分子量429.56g/mol熔点149-157。C(丙酮)16.名称4-[9a,10a-环氧-17l3-羟基-17a-(甲氧基甲基)-3-氧代雌-4-烯-1l卩-基]苯曱醛-(E)-肟(ZK234965)结构P62-16分子式C27H33N05分子量451.57g/mol熔点110。C(分解，丙酮/甲基叔丁基醚)非自然配体或非天然配体的实例还有抗激素，它们可包括以下11-(4-二曱氨基苯基)-17-羟基-17c-丙炔基-4,9-雌二烯-3-酮(RU38486或米非司酮)；1l-(4-二曱氨基苯基)-17o-羟基-17-(3-羟丙基)-13-甲基-4，9-gonadiene-3-酮(ZK98299或Onapristone);11-(4-乙酰苯基)-17-羟基-17c-(1-丙炔基)-4,9-雌二烯-3-酮(ZK112993);11-(4-二曱氨基苯基)-17-羟基-17(z-(3-羟基-l(Z)-丙烯基-雌-4,9-二烯-3-酮(ZK98734);(7，1U7)-11-(4-二曱氨基苯基)國7-甲基-4',5'-二氢螺[雌誦4，9-二烯-17,21(3'H)-呔喃]-3-酮(Org31806);(11,4,17c)-4',5'-二氢-ll-(4-二曱氨基苯基)-[螺雌-4,9-二烯-17,2'(3'H)-呋喃]-3-酮(Org31376);5-0孕烷-3，2-二酮、Org33628(Kloosterboer等，(1995)AnnNYAcadSciJun12;761:192-201)、Org33245(Schoo腿等,(1998)JSteroidBiochemMolBiolFeb;64(3-4):157-70)。这种配体的更多实例是例如用作本发明调节性分子的诱导物的非类固醇孕酮受体结合配体。使用标准的氨基酸或核酸修饰方法(包括例如缺失、插入、点突变、融合)，可对本发明分子(例如治疗性分子、调节性分子、激活性分子、失活性分子或者编码治疗性分子、调节性分子、激活性分子或失活性分子的核酸)的蛋白结构域(例如AD、LBD、DBD)或功能核酸序列(例如编码蛋白质、RNA、启动子、剪接位点、内含子、DNA结合位点或poly(A)位点)进行修饰或优化，用于这种调节、表达和/或活性。此外，可对本发明分子(例如治疗性分子、调节性分子、激活性分子、失活性分子或者编码治疗性分子、调节性分子、激活性分子或失活性分子的核酸)进行修饰，-使得分子的表达和/或活性是瞬时表达或组成型表达，和/或由特定病症、疾病、生物标志或其它分子的存在进行调节，或者自我调节。更具体地说，可对本发明的核酸或氨基酸分子或化学化合物的一级、二级或三级结构进行修饰，以获得特定的严格性、特异性或者结合、激活、失活或构象的量(例如形成同型二聚体或异型二聚体或其它多聚体，或者结合特异性或关联的配体或位点)。例如，可对本发明表达盒的转录部分进行修饰以包括转录后元件(例如UTR、剪接位点、内含子和/或poly(A)信号)，所述转录后元件能优化或改进有效连接的、编码的和表达的分子(例如治疗性分子、调节性分子、激活性分子或失活性分子)的表达和/或活性的特异性、水平和保真性。此外，可对编码本发明分子的有效连接的序列的启动子序列进行修饰，使得受编码分子的表达是例如瞬时表达或组成型表达、可诱导表达或可阻遏表达，和/或由特定病症或分子的存在进行调控或以别的方式进行调节。可对本发明表达盒的各种功能序列进行修饰，以优化受编码分子(例如治疗性分子、调节性分子、激活性分子或失活性分子)的表达和/或活性。例如，可修饰内含子序列，以优化这种序列的RNA转录物的高度有效和准确的剪接。由此，本发明核酸所编码的所需分子(例如治疗性分子、调节性分子、激活性分子或失活性分子)的隐蔽剪接可减至最低，表达可最大化。用于本发明组合物的合适合成内含子的实例包括但不限于5'剪接位点、3'剪接位点和/或分支点的共有序列。5'剪接位点据报道能与UlsnRNA配对。合适的5'剪接位点共有序列是被优化以使UlRNA和合成5'剪接位点(例如包含5'-CAGGUAAGU-3'的5'剪接位点序列)之间螺旋形成的自由能减至最低的共有序列。此外，分支点(BP)序列除了单凸起A残基(singlebulgedAresidue)外，据报道能与U2snRNA配对。因此，可对分支点序列进行优化，以使U2RNA和该序列之间的螺旋形成的自由能减至最低。分支点通常位于3'剪接位点上游18-38个核苷酸处。在一个实施方案中，合成内含子的分支点序列位于3'剪接位点上游24个核苷酸处，是例如包含5'UACUAC3'的分支点序列。此外，对于3'剪接位点功能，可对3'剪接位点的共有序列的多嘧咬段(polypyrimidinetract)进行优化。例如椐报道，对于3'剪接位点功能，最好有至少5个连续尿嘧啶残基，因此在一些实施方案中，本发明合成内含子的多密度段具有7个连续尿密度残基。类似地，可对内含子的长度进行优化。例如，已知天然内含子的长度可达90-200个核苷酸。在一个实施方案中，所产生的内部外显子的长度小于300个核苷酸。在一个实施方案中，合成内含子是IVS8(例如SEQIDNO:3)，包含限制酶位点、Bbsl和Earl(位于合成内含子当中)以及Pstl和Nhel。限制酶Bbsl可用来在5'剪接位点精确切割DNA，Earl可用来在3'剪接位点精确切割DNA。此外，可将合成内含子插入编码本发明分子的核酸序列的多个位置。例如，在一些实施方案中，对编码本发明分子的核酸序列进行修饰，以包含多个内含子。在另一个实施方案中，修饰本发明的表达盒，以使除包含合成内含子IVS8(例如SEQIDNO:3)外，还包含编码称为UT12的CMV5'UTR这种表达控制元件(例如SEQIDNO:2》的核酸序列。在另一个实施方案中，修饰本发明的表达盒，以包含编码SV40poly(A)信号(例如SEQIDNO:8)的核酸序列。在又一个实施方案中，修饰本发明的表达盒，以包含编码人生长激素("hGH，，)poly(A)信号(例如SEQIDNO:6)的核酸序列。本文描述的这些和其它的纟务饰可应用来优化由本文所描述的本发明核酸序列编码(例如由表达盒或运载体的核酸序列编码)的受编码分子(例如治疗性分子、调节性分子、激活性分子、失活性分子)的表达的水平和保真性。本文所用术语"内含子"指以下序列，它编码在DNA序列中，会被RNA聚合酶转录成RNA分子，但被剪接除去而形成成熟信使RNA。"合成内含子"指以下序列，它最初不是从天然内含子序列复制而来，因此通常不会具有天然序列，但会在正常的转录后加工过程中从RNA转录物中除去。这种合成内含子可设计成具有多种不同的特性，具体地说，这种内含子可设计成具有所需的剪接位点强度和所需的长度。在本发明的一个优选实施方案中，分子开关表达盒和治疗基因表达盒都包括合成内含子。合成内含子包括5'剪接位点、3'剪接位点和分支点的共有序列。合成内含子当被掺入到设计来表达治疗基因的真核生物运载体中时，会指导RNA转录物以高度有效和准确的方式剪接，从而使隐蔽剪接减至最低和使所需基因产物的生产最大化。此外，可使用已知的方法对编码蛋白质结构域的功能序列进行修饰，以使蛋白质的活性最优化。例如，可使用分子建模法设计出截短突变体，使得其二聚化潜力减低，同时保持具有GAL-4DBD的蛋白质的序列特异性DNA结合活性。GAL-4DBD据"t艮道以二聚体形式结合回文17聚体GAL-4DBS(CGGAAGACTCTCCTCCG),这种二聚体结合据报道会导致具有GAL-4DBS的可诱导启动子被激活。因此，可对编码具有GAL-4DBD的蛋白质的核酸序列进行修饰，使得GAL-4DBD的三级结构得到优化，以减少任何导致可诱导启动子被激活的不被调节(例如不依赖激活性分子的)或不需要的二聚化。GAL-4DBD序列的结构和功能已知(例如残基PCT/US01/30305)。例如，半胱氨酸(C)可能参与螯合锌；形成二聚化元件的巻曲螺旋结构包含残基54-74和86-93;通常疏水的氨基酸据报道在每个七残基重复序列的第一和第四个位置；残基Ser47和Arg51据报道能在蛋白质链之间形成氢键，从而形成二聚体；残基8-40据报道能形成Zn结合域或DNA识别单位。这个DNA识别单位具有两个a螺旋域，它们形成紧密的球状结构，在Zn的存在下所导致产生的结构据报道是双核金属离子簇而不是锌指，即富含半胱氨酸的氨基酸序歹寸(CysXa-Xaa2-Cys14画Xaaa-CysZ1-Xaa6-CysZS-Xaa2-Cys31-Xaaa-Cys38)结合两个Zn(II)离子(Pan和Coleman(1990)PNAS87:2077-81)。该Zn簇可能负责与17-met结合位点两最末端处的3bp的大沟接触；26位置处的脯氨酸(顺式脯氨酸)据报道能形成环，它将锌簇结构域的两个a螺旋域连接，故对这个功能也是至关重要的。此外，残基41-49据报道能将DNA识别单位和二聚化元件(残基54-74和86-93)连接。一旦发生二聚化，二聚体的残基47-51也可与DNA靶标的磷酸酯相互作用。残基50-64可参与弱二聚化。二聚体由短巻曲螺旋组成，该螺旋形成两性a螺旋，其中两个a螺旋堆积形成类似于亮氨酸拉链的平行巻曲螺旋。残基54-74当中除了存在3对亮氨酸和1对缬氨酸的疏水相互作用外，还有2对Arg-Glu20盐键及一个单体的Arg51与另一个单体的Ser47之间的氢键。残基65-93可形成强二聚化结构域。残基65-71的结构是一个七残基重复序列的巻曲螺旋结构的延长部分。残基72-78含有脯氨酸，因此会破坏两性螺旋。但是，残基79-99含有三个更具潜力的a螺旋七残基序列(Marmorsteinetal(1992)Nature356:408-414)。此外，GAL-4残基1-100的结合的Kd据报道为3nM(Reece和Ptashne(]993)Science261:909-911)。鉴于GAL-4DBD序列的结构和功能，有可能对GAL-4结构域的各区域作出多种可能修饰。在一些实施方案中，对GAL-4各区域进行修饰，以使任何基础表达的消除或减少及序列特异性DNA结合的保持最优化。更具体地说，在一些实施方案中，可通过缺失来缩短含有GAL-4DBD的各相互作用性巻曲螺旋序列(例如残基54-74和残基86-93)的区域的长度，例如通过缺失氨基酸序列54-64、65-74、54-74或86-93来缩短。同样，可通过缺失一个巻曲螺旋区域，构建出只有一个巻曲螺旋区域的GAL-4突变体。另外，可利用位于例如每个a螺旋七残基序列的接点(junction)处的独特限制位点，将突变序列或人工序列插入到GAL-4结构域中。因此，可产生出a螺旋七残基序列渐次减少的GAL-4结构域修饰版本。在一些实施方案中，修饰天然GAL-4序列，以除去N末端曱硫氨酸，并将另外氨基酸加到该序列的N末端。在这些实施方案中，对天然GAL-4序列的N末端氨基酸的修饰无关紧要，只要它们不影响Zn结合域的残基8-40的三级结构。此外，在一些实施方案中，小分子激活性分子例如MFP对具有GAL-4DBD蛋白质(例如调节性分子)的突变hPRLBD的特异性结合，会引起该蛋白质中出现构象变化，从而引发该蛋白质的二聚化。另外，在一些实施方案中，本发明表达盒包含编码SEQIDNO:37的GAL-4DBD序列的残基2-93的核酸序列。此外，在一个实施方案中，GAL-4DBD的DNA识别序列包含SEQIDNO:37的GAL-4DBD序列的残基9-40。在本发明的一个实施方案中，GAL-4结构域通过缺失GAL-4DBD的C末端部分的19个氨基酸而被截短，并包含SEQIDNO:37的GAL-4DBD序列的残基75-93。在一个实施方案中，本发明调节性分子是包含突变的孕酮受体和突变的孕酮受体LBD的嵌合蛋白，所述突变的孕酮受体包含SEQIDNO:37的GAL-4DBD序列的残基2-74，所述突变的孕酮受体LBD在激活性分子的存在下被特异性激活。此外，在激活性分子不存在下，调节性分子极少或没有被激活，从而有效连4妄到具有GAL-4DBS的启动子的核酸序列其转录极少或没有被诱导或激活。前文提到，编码天然分子(例如蛋白质或核酸)的各种变体的核酸也适用于本发明的组合物和方法。例如，IFN-|3的变体(例如IFN-Plb)适合用作本发明组合物和方法中的治疗性分子，具体来说是用于治疗多发性硬化症。优选地，IFN-P变体是天然人IFN-P的变体。天然人IFN-P的变体一一可能是天然的(例如在IFN-P基因座发生的等位基因变体)，或者是重组产生的，或者是合成产生的，其氨基酸序列类似于或基本上类似于成熟的天然IFN-p序列。编码天然人IFN-|3(例如包含SEQIDNO:13氨基酸序歹'j)的核酸适用于本发明的组合物和方法，例如IFN-|3la(例如SEQIDNO:14)。同样，编码人IFN-|3变体的核酸适用于本发明组合物和方法，例如IFN-Plb(参见例如美国专利第4,588,585号、第4,737,462号和第4,959,314号)。变体还涵括编码保持生物或治疗活性的天然分子(例如蛋白质或核酸)片断或截短形式的核酸。例如，编码天然蛋白质这些生物活性片断或截短形式的核酸。此外，在一些实施方案中，本发明表达的蛋白质可以发生糖基化或不发生糖基化。此外，用于本发明组合物和方法的合适蛋白质变体和核酸变体，可以分别是任何哺乳动物物种的天然或野生型蛋白质或核酸的变体，所述哺乳动物物种包括但不限于鸟类、犬科动物、牛科动物、猪科动物、马科动物和人类。本发明涵括的IFN-P变体(例如由核酸编码)的非限制性实例，参见例如Nagata等，(1980)Nature284:316-320;Goeddel等，(1980)Nature287:411-416;Yelverton等，(1981)NucleicAcidsRes.9:731-741;Streuli等，(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78:2848-2852;EP028033B1和EP109748B1。另参见例如美国专利号4,518,584、4,569,卯8、4,588，585、4,738,844、4,753,795、4,769,233、4,793,995、4,914,033、4,959,314、5,545,723和5,814,485。这些引用文献还提供了有关可被变更而又不失去生物活性的IFN-P蛋白残基和区域方面的指导。可通过在编码本发明受表达蛋白质和核酸(例如RNA)的核苷酸序列中造成突变，引入它们的变化或修饰，从而导致受表达蛋白质的氨基酸序列或核酸序列出现变化，而又不改变受表达分子的生物或治疗活性。例如，可通过向相应的核苷酸序列中引入一个或多个核苷酸取代、添加或缺失，构建编码其氨基酸序列不同于参考或起始蛋白质氨基酸序列的变体蛋白质的分离核酸分子(例如IFN-J3变体的核苷酸序列，参见例如美国专利第5,588,585号、第4,959,314号、第4,737,462号；L.Lin(1998)Dev.Biol.Stand.96:97-104),使得一个或多个氨基酸取代、添加或缺失被引入到编码参考或起始蛋白质的序列中，从而导致当受编码蛋白质^皮表达时产生变体蛋白质。例如，可用修饰核酸序列或氨基酸序列的标准技术，如定点诱变和PCR介导的诱变来引入突变。此外，可对编码蛋白质的核酸序列进行修饰，使其在一个或多个预测的、优选非必需氨基酸残基处编码保守氨基酸取代。本文所用的"非必需"氨基酸残基是可从蛋白质的残基序列进行变更而又不改变蛋白质的生物或治疗活性的残基，而"必需"氨基酸残基则为这种活性所要求。本文所用的"保守氨基酸取代"是其中用具有类似侧链的氨基酸残基代替氨基酸残基的取代。具有类似侧链的氨基酸残基的家族在本领域中已有定义。这些家族包括有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、有(3分枝侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和有芳族側链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。在优选的实施方案中，不对保守氨基酸残基或位于保守基序中的氨基酸残基作这种取代。此外，可通过沿参考分子的编码序列的全部或一部分随机引入突变，如通过饱和诱变，产生变体分子的核香酸序列，然后筛选所产生的突变体的生物或治疗活性。诱变后，可重组表达编码的蛋白质，该蛋白质的活性可用本文描述或本领域公知的标准测试^支术进行测定。在优选的实施方案中，生物或治疗活性蛋白质变体与充当比较或参考基础的参考蛋白质的氨基酸序列有至少80%、更优选约90%至约95%或更高、最优选约96%至约99%或更高的氛基酸序列同一性。本文所用的"序列同一性"是指当将变体蛋白质的氨基酸序列的指定邻接区段与充当参考分子的蛋白质分子的氨基酸序列进行比对和比较时，在变体蛋白质和参考分子当中所发现的相同氨基酸残基。对于序列同一性测定的目的，为使两个序列的匹配比对最优化，变体的氨基酸序列的邻接区段相对于参考分子的氨基酸序列，可具有额外的氨基酸残基或者缺失了氨基酸序列。用于与参考氨基酸序列进行比较的邻接区段须包含至少20个连接氨基酸残基。可通过分配空隙罚分，对因在变体氨基酸序列中包括空隙所致的序列同一性增加进行修正。序列比对的方法是本领域公知的。例如，可用数学算法完成任何两个序列之间的同一性百分率的测定。用于序列比较的数学算法的一个优选非限制性实例是例如Myers和Miller(1988)Comput.Appl.Biosci.4:11-7的算法。这种算法被应用在ALIGN程序(版本2.0)中，该程序是GCG比对软件包的一部分。当进行氨基酸序列比较时，ALIGN程序可使用PAM120加权残基表(weightresiduetable)、空隙长度罚分12和空隙罚分4。用于比较两个序列的数学算法的另一个优选非限制性实例是Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5877的算法，在Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.SciUSA90:5873-5877中作了改进。这种算法被并入到Altschul等，(1990)J.Mol.Biol.215:403-410的NBLAST和XBLAST程序中。BLAST氨基酸序列搜索可用XBLAST程序进行，得分=50,字长=3，以获得类似于目标蛋白质的氨基酸序列。为获得缺口比对(gappedalignment)以作比4支目的，可采用Altschul等，(1997)NucleicAcidsRes.25:3389-3402中描述的缺口BLAST程序。或者，可用PSI-BLAST来进行集成检索(integratedsearch),检测各分子之间的远源关系(例如Altschul等，(1997),出处同上)。当应用BLAST、缺口BLAST或PSI-BLAST程序时，可使用默认参数(参见例如ww.ncbi.nlm.nih.gov)。另见ALIGN程序(Dayhoff(1978)inAtlasofProteinSequenceandStructure5:Suppl.3,NationalBiomedicalResearchFoundation,Washington,D.C.)和WisconsinSequenceAnalysisPackage版本8(可获自GeneticsComputerGroup,Madison,Wis.)中的程序例如GAP程序，其中釆用这些程序的默认参数。当评判氨基酸序列同一性的百分率时可发现，一些氨基酸残基位置可能因不影响蛋白质功能特性的保守氨基酸取代而有不同。在这些情况中，可将序列同一性百分率向上调整，以解决保守取代的氨基酸的类似性问题。这种调整是本领域公知的(参见例如Myers和Miller(1988)Comput.Appl.Biosci.4:11-17)。此外，在其中调节性分子、激活性分子或失活性分子是蛋白质的实施方案中，可将该蛋白质与例如聚乙二醇(PEG)或清蛋白共价连接。这些共价杂合分子可具有某些合宜的特性，如给予对象后血清半寿期延长。构建PEG-IFN加合物的方法涉及对单甲氧基聚乙二醇进行化学修饰以产生活化化合物，该化合物能与本发明的蛋白质反应。制备和使用PEG连接的蛋白质的方法报道于例如Delgado等，(1992)Cnt.Rev.Ther.Drug.CarrierSyst.9:249-304(和如在本文背景部分所描述)。构建清蛋白融合蛋白的方法涉及将目标蛋白质和清蛋白的编码序列进行融合，该方法例如在美国专利第5,876,969号中有报道。发明所涵括的生物或治疗活性蛋白质或核酸变体优选保持或具有生物或治疗活性。在一些实施方案中，变体保持参考分子(例如蛋白质或核酸)的生物或治疗活性的至少约25%、约50%、约75%、约85%、约90%、约95%、约98%、约99%或以上。本发明还涵括与参考分子(例如蛋白质或核酸)的活性相比其活性增加的变体。变体的生物或治疗活性可用本领域公知的任4可方法测定(参见例如以下文献中描迷的测定法Fellous等，(1982)Proc.Natl.Acad.SciUSA79:3082-3086;Czemiecki等，(1984)J.Virol.49(2):490-496;Mark等，(1984)Proc.NatlAcad.Sci.USA81:5662-5666;Branca等，(1981)Nature277:221-223;Williams等，(1979)Nature282:582-586;Herberman等，(1979)Nature277:221-223;Anderson等，(1982)J.Biol.Chem.257(19):11301-11304)。一般来说，为进行本文描述的克隆、测试和其它应用，可用本领域公知的方法来产生或合成本发明的核酸、蛋白质和化学组合物。例如，可用包含编码本发明蛋白质或核酸的核普酸序列的表达运载体转化宿主细胞，通过培养该宿主细胞来产生蛋白质。宿主细胞是可转录该核苷酸序列并产生所需蛋白质或核酸的细胞，可以是原核生物细胞(例如大肠杆菌)或真核生物细月包(例如酵母、昆虫或哺乳动物细胞)。重组产生IFN-(3的实例包括合适的表达运载体，在例如以下文献中提供Mantei等，(1982)Nature297:128;Ohno等，(1982)NucleicAcidsRes.10:967;Smith等，(1983)Mol.Cell.Biol.3:2156和美国专利第4,462,940号、第5,702,699号和第5,814,485号；美国专利第5,795,779号)。此外，基因已用重组DNA("rDNA")技术克隆，且可以在例如动物或植物细胞或者转基因动物中产生和测试(参见例如Nagola等，(1980)Nature284:316;Goeddel等，(1980)Nature287:411;Yelverton等，(1981)Nuc.AcidRes.9:731;Streuli等，(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78:2848)。蛋白质也可以用rDNA技术产生，例如通过从病毒诱导的人细胞中提取富含poly-A的12S信使RNA,用该信使RNA作为模板合成双链cDNA，将该cDNA引入到适当的克隆运栽体中，用该运载体转化合适的微生物，收获微生物并从中提取蛋白质(参见例如欧洲专利28033号(1981年5月6日公布)、32134号(1981年7月15曰公布)和34307号(1981年8月26日公布))。而且，蛋白质还可以用任何肽领域技术人员公知的技术来化学合成并测试(参见例如Li等，(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:2216-2220，Steward和Young(1984)SolidPhasePeptideSynthesis(PierceChemicalCompany,Rockford,III.)及Baraney禾口Merrifield(1980)ThePeptides:Analysis,Synthesis,Biology,Gross和Meinhofer(编辑)，第2巻(AcademicPress,N.Y.,1980),第3-254页，这三个文献讨论固相肽合成技术；Bodansky(1984)PrinciplesofPeptideSynthesis(Springer画Verlag,Berlin)及Gross和Meinhofer(编辑)，(1980),ThePeptides.Analysis,Synthesis,Biology,第1巻(AcademicPress,NewYork),这两个文献讨论经典的溶液合成)。本发明的蛋白质也可例如用同步多重肽合成的方法进行化学制备。参见例如Houghten(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:5131-5135和美国专利第4,631,211号。此夕卜，本领域技术人员会知道如何用本领域/>知的公认和适当的动物才莫型和方法，就疾病的治疗测试本发明组合物。例如，已才良道在几种动物自身免疫疾病模型中可用基因递送系统来递送细胞因子，所述模型例如包括实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)、关节炎、狼疮、NOD糖尿病才莫型(参见例如G.C.Tsokos和GT.Nepom(2000)Clin.Invest.06:181-83;G丄Pmd'homme(2000)J.GeneMed.2:222-32)。EAE是中枢神经细胞炎症的模型，该炎症是在用某些CNS自身抗原例如衍自大脑的蛋白脂质或髓鞘质碱性蛋白质进行免疫后继发的。它的进程和临床表现与人类多发性硬化症类似，已成为研究多发性硬化症的公认模型。已有几个报道描述了鼠(murine)和大鼠(rat)EAE模型中I型IFN作为蛋白质(15-20)由运栽体递送的试验结果(参见例如K.Triantaphyllopoulos等，(1998)GeneTherapy5:253-63;丄L.Croxford等，(1998)J.Immunol.160:5181-87)。Yu等证实，给予mIFN-|3蛋白的小鼠在EAE疾病诱导时与正常小鼠相比，显示出发展到残疾的进程延迟(由临床评分测定)，复发的发作延迟和恶化频率降低(参见例如M.Yu等，(1996)J.Immunol.64:91-100)。这些结果与在人体上获得的IFN-卩治疗结果极相似。Triantaphyllopoulos等在基于基因疗法的方法中使用了基于质粒的运载体，在神经元特异性启动子控制下将IFN-f3递送到CNS(参见例如K.Triantaphyllopoulos等，(1998)GeneTherapy5:253-63)。这些运载体在小鼠EAE的效应期颅内注射给小鼠，减少或防止了疾病的临床征候。迄今在鼠EAE模型中用IFN-P进行的研究的结果证明，IFN在EAE模型中是延迟疾病发作和逆转疾病表现症状的有效疗法。在这个模型中递送IFN-(3的基因治疗方法(局部颅内给药)已证实是有效的。实施例以下给出的实施例只作说明目的，并不意在以任何方式限制本发明。如以下各实施例所述，构建了人IFN-|3(MFN-(3)和鼠IFN-|3(mIFN-P)表达运载体，开发了直接测量血清中IFN-P的测定法，鉴定了与体内IFN-|3表达有关的生物标志。此外，采用肌肉内注射编码IFN-P的非病毒质粒DNA或腺伴随病毒(AAV)运载体，在正常小鼠中进行了比较IFN-P的基于基因的递送与大剂量蛋白质递送的药代动力学研究，并展示了优良的药代动力学曲线。另夕卜，表达hlFN-(3的AAV-1运载体观察到近6个月的长期稳定的hlFN-f3表达。而且，编码mIFN-P的质粒DNA的单次肌肉内注射，证实在实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)的鼠模型中有效，且与mIFN-P蛋白的隔天注射同样有效。如下所述，构建并测试了本发明调节表达系统的实例。例如，用本发明的调节表达系统在正常小鼠中显示了IFN-P的调节表达，所述调节表达系统中治疗性分子和调节性分子包含在单一质粒运载体中。得自这些实施例中所描迷的研究的数据，证明了本发明调节表达这些实施例证明了本发明调节表达系统用来递送编码IFN-P(例如IFN-(3la)的核酸，以进行蛋白质的长期调节表达来治疗多发性硬化症的潜在用途。在一个实施方案中，递送运载体是包含分别编码治疗性分子(例如1FN-P)和调节性分子的第一和第二表达盒的单一质粒运载体，该运载体通过激活性分子例如小分子诱导物(如MFP)的口服给予可以进行持续的(例如3个月以上)和可更新的表达，而且该运载体能够通过肌肉内注射反复给予。实施例1:用于IFN-p或GMCSF基因疗法的运载体的构建A.质粒运栽体将来自细菌表达运载体pbSER189的鼠IFN-J3(mlFN-P)基因进行PCR扩增，免疫球蛋白k(IgK)(供进行蛋白质纯化)或mlFN-P(供进行基因治疗)信号序列加在5'引物上。将PCR产物分别插入在表达运载体pCEP4/WPRE和pgWiz中的巨细胞病毒(CMV)启动子的下游，分别产生供进ft重组蛋白质表达和纯化的pGER90(图2A)和供进行基因治疗的pGER101(图2B)。按与mIFN-P基因相同的程序(例外的是基因治疗运载体用MFN信号序列)，将来自细菌表达运载体pbSER178的人IFN-P基因进行PCR扩增，并分别插入到pCEP4/WPRE和pgWiz中以分别产生供进行重组蛋白质表达和纯化的pGER123(图2C)和供进行基因治疗的pGER125(图2D)。质粒运载体的构建在材料和方法F节中充分描述。B.AAV-1运栽体通过将编码hIFN-P的pGWIZ/hIFN-卩的补平HincII/Notl片断插入到AAV-1运载体pTReGFP的补平Agel-Sall位点，构建出编码hlFN-(3的AAV-l-hlFN-(3穿梭质粒。所得的穿梭质粒命名为pGT62(SEQIDNO:44),用来产生编码hIFN-|3的AAV-1病毒。用标准方法按本文描述制备两批AAV-1病毒，用于药代动力学研究(图4)。用ELISA验证这两批病毒中的MFN-P表达水平。同样，通过将编码mGMCSF或hGMCSF的片断插入到运载体pGENE/V5HisA(Invitrogen)中，构建编码mGMCSF或hGMCSF的AAV-l-GMCSF穿梭质粒pGT714和pGT713(图30B)。所得运载体命名为pGT723-GENE/hGMCSF和pGT724-GENE/mGMCSF。然后通过Kpnl-Xbal消化从pGT724-GENE/mGMCSF运载体中切除编码mGM-CSF的片断。类似地，通过Kpnl-Xbal消化从pGT723-GENE/hGMCSF运载体中切除编码hGM-CSF的片断。将运载体pZac2.1用Kpnl-Xbal消化和用牛肠磷酸酶(CIP)处理，将切除的编码mGMCSF或hGMCSF的片断在Kpnl-Xbal位点插入到pZac2.1中。所得的穿梭质粒命名为pGT713(pZac2.1-CMV-hGMCSF)和pGT714(pZac2.1-CMV-mGMCSF)(图30B)。本发明的运载体的构建在材料和方法F节中作充分描述。实施例2:IFN-P基因递送的药代动力学研究A.人IFN-P的药代动力学研究在正常小鼠中进行药代动力学研究以比较人IFN-p(hIFN-P)大剂量蛋白质递送与基于基因的递送。l)人IFN-pia蛋白药代动力学研究在C57/BI6小鼠中，使用通过肌肉内(i.m.)或静脉内(i.v.)注射递送的重组hlFN-)31a的大剂量注射进行药代动力学研究，用市售ELISA检测WFN-P的血清水平。图3显示单次肌肉内或静脉内注射25ng(1pg/kg)或250ng(10)tig/kg)hlFN-(31a蛋白后，小鼠血清中hIFN-pla蛋白的药代动力学曲线。静脉内注射后，hIFN-P1a在第一个时间点(30分钟)以剂量依赖性方式在血清中被检测到，然后被快速清除，到第6小时时其水平接近测定的检测限(LOD)(LOD=12.5pg/ml)。重组hIFN-pia蛋白肌肉内注射后2小时，hlFN-(31a血清水平达到最大值，到第6小时时降低大约IO倍。肌肉内注射与静脉内注射相比，到第6小时时血清中剩余的hlFN-(31a数量较高。对于静脉内注射和肌肉内注射两者来说，都是高剂量和低剂量之间血清hIFN-pia水平相差10倍。重组WFN-pia大剂量注射后所显示的高度短暂的动力学形态，与之前在人和其它动物物种中所报道的结果非常相似(Buchwalder,P陽A等，(2000)JInterferonCytokineRes20:57-66;Pepinsky,RB等，(2001)JPharmExpTher297:1059-55)。2)AAV-l-CMVhIFN-pia的基于基因递送的药代动力学研究构建组成型表达人IFN-|3(AAV-l-CMVWFN-f31a)的AAV-1运载体，通过肌肉内注射三种剂量(0.5x1010、l.Oxl(T或5.0xl01Q个病毒颗粒)递送到C57BI/6小鼠中。结果在图4中显示。人IFN-pia在小鼠血清中的表达在第2天仍低，随后快速增加，到第IO天时所有三个剂量组的血清水平达到稳定水平或者还逐渐增加。用所给予的递增数量的AAV-1-CMVhIFN-(31a观察到明显的剂量响应。对于两个较高的剂量，注射后171天在血清中检测到稳定水平的hlFN-(31a表达。与釆用大剂量肌肉内注射重组hIFN-pia蛋白的研究相比，采用编码hIFN-pia的AAV-1运载体的基于基因递送的这个研究，显示在单次注射运载体后血清中有hIFN-|31a的长期表达。实施例3:用于基因疗法的IFN-(3生物标志的鉴定和应用A'.mIFN-P生物标志的开发为以更高的灵鸟t度检测体内鼠IFN-|3(mIFN-p)活性，在小鼠中注射mIFN-卩蛋白或编码mlFN^的基因治疗运载体后，鉴定mIFN-P活性的生物标志。可用生物标志来监测用Betaseron(IFN-|3lb)治疗的患者其临床样本中的人IFN-P活性(参见4列^口Arnason,BG(1996)C7/'w/附附wwo//mmwwopa^o/81:1-11;Deisenhammer,F等，(2000)A^wra/ogy54:2055-60;Knobler,RL等,(1993)//"fer/eraw13:333-40;Kracke,A等，(2000)Mwra/ogy541:193-9)。用于IFN-卩临床研究的一种主要生物标志是MxA(参见例如Kracke,A等，(2000)A^wra/ogy541:193-9;Bertoloto,A等，(2001)J//wwMd/z256:141-152),因为它能被I型IFN特异性诱导(参见例如vonWussow,P等，(1990)J/wm20:2015-19)。在本研究中，用从鼠外周血单核细胞(PBMC)分离的MxA小鼠同系物Mxl(参见例如Hug,H等,A/o/G〃fi/o/8:3065-79;Pavlovic,J(1993)CibaFoundSymp176:233-43)的表达，来检测生物活性mIFN-P的存在。开发了定量PCR/RT-PCR测定法，来定量鼠PBMC中的MxlmRNA水平。具体地i兌，用mIFN-|3蛋白处理或mIFN-(3基因的基于基因的递送后从小鼠分离外周血单核细胞(PBMC)。将从受处理小鼠获得的血液样品在ficoll垫(ficollcushion)上以2,000rpm离心25分钟。使纯化的PBMC沉淀，用Qiagen的"RNAeasy"小型提取试剂盒纯化供进行Mxl测定的RNA。将RNA在H20中-80°C保藏。用TaqMan化学进行MxlRT-PCR，在AppliedBiosystems(ABI)PRISM7700序列检测仪上进行分析。对于RNA的逆转录和cDNA的扩增，使用ABI的"One-stepTaqManRNA"试剂盒。将RNA在48。C下逆转录30分钟，然后进行40个循环的扩增，其中变性步骤为95。C30秒钟，退火/延伸步骤为60°C1分钟。用Mxl特异性探针/引物组合对样品进行分析。将Mxl表达归一化到用ABI的标准测定法平行测量的GAPDH表达。通过检查用纯化重组mIFN-P蛋白处理的鼠L929细胞中的MxlRNA诱导情况，对测定进行体外验证(图5)。观察到MxlRNA表达的剂量依赖性增加，ECso为约50pg/mlmIFN-P，其导致MxlRNA水平增加100倍。B.mIFN-P蛋白的大剂量注射诱导体内短暂的生物标志响应在这些研究中测定了大剂量注射纯化的重组mIFN-P后的生物标志响应。不管是静脉内还是肌肉内给予，每个受试mIFN-卩浓度都观察到MxlRNA表达的诱导(相对于注射介质的小鼠有25至50倍)(图6)。在注射后2小时测量到最高Mxl表达水平。肌肉内递送的mIFN-P在该时间点观察到明显的剂量响应。Mxl表达快速下降，注射12小时以后没有检测到超过背景的MxlRNA水平。静脉内注射的mIFN-|3在150ng下观察到最高诱导。在500ng剂量下，MxlRNA诱导水平降低。已在其中高IFN-P水平导致生物响应明显下调的其它研究中观察到该饱和效应，这可能是因为I型IFN受体被下调(参见例如Mager,DE和Jusko,WJ(2002)尸/w，19:1537-43)。静脉内注射小鼠中的MxlRNA表达也在注射后大约2小时达到高峰，然后快速下降。这是MxlRNA的表达第一次被用作生物标志来监测小鼠中的mIFN-(3活性。结果清楚显示，MxlRNA在小鼠PBMC中〗氐水平组成型表达，可被mIFN-P治疗强烈上调。但是，上调是短时间的，在12-24小时内从高表达水平快速下降到背景水平。这个快速动力学形态与人(参见例如Salmon,P等，(19%)J/",e厂/er朋C_ytoyb"e7^16:759-64;Buchwalder,P-A等，(2000)和其它动物物种(Pepinsky,RB等，(2001),/尸/wr附￡^297:1059-55;Mager,DE等，(2003)J尸/2arwEx/306:262-70)<//"&r/era"QytoA:,"eAm20:57-66)中对I型干扰素所才艮道的短半寿期相符。C.细胞因子IP-10和JE:在对mIFN-P处理小鼠的血浆样本的分析过程中，还鉴定出两种鼠细胞因子P-10和MCP-1的鼠同系物JE(单核细胞趋化蛋白，参见例如Yoshimura,T(1989)FESSLett244:487-93),如MxlRNA—样具有对mIFN-(3的响应和激活(图7和8)。静脉内或肌肉内给予mIFN-|3蛋白2小时后观察到IP-10和JE的强烈诱导。在静脉内递送的高剂量下，IP-10水平增加3000倍。三个受试的mlFN-(3剂量都是在24小时时观察到IP-10和JE的血浆水平快速下降到背景水平。两种给予途径都观察到IP-10和JE的明显剂量响应。IFN-f3对IP-10和JE的这种强烈剂量依赖性诱导之前不为人所知，直到如本文所述由本发明人证实。尽管由启动子区域中的千扰素响应元件(ISRE)知道IP-10是IFN-y的生物标志(参见例如Luster,AD等,(1985)A^wre315:672-76)，但先前并没有证实它是小鼠mIFN-p的特异性生物标志。D.体内mIFN-P基因递送后的长期生物标志响应这些研究证明肌肉内递送编码mIFN-(3的质粒DNA或AAV-1运载体后小鼠中mlFN-(3生物标志的诱导的测量结果。实施例4:mIFN-P基因的递送A.mIFN-P基因的质粒递送为进行质粒递送，将不同剂量的编码mIFN-(3的质粒DNA肌肉内注射到小鼠中，然后对被注射肌肉进行电穿孔。测量从每只小鼠分离的PBMC的Mxl表达情况，以相对于对照组背景水平的增加倍数表示(图9)。接受mIFN-卩质粒DNA的所有四个组在注射后第2天都出现MxlRNA的强烈上调(40至130倍诱导)。所有四个组的Mxl表达都显著超过背景水平(p0.002)。Mxl表达数据显示存在着剂量响应，最佳DNA浓度为250pg。电穿孔后第1天出现初次峰值，然后表达下降，在较后的时间点表达水平又增加。生物标志响应的这一变动在细^g包因子IP-10和JE的水平上也有反映(数据未显示)，在应用IFN-P的质粒递送的其它研究中似乎是可再现的现象。直到本研究的第49天都观察到显著水平的Mxl诱导。B.mIFN-p基因的AAV-1递送给C57BI/6小鼠注射编码mlFN-(3的pGT61DNA或者从编码mlFN-J3的pGT61产生的病毒，或者编码SEAP的pGER75DNA(参见材料和方法G节)。在注射后2、10、14和17天将小鼠放血。接受pGT61DNA的小鼠在第2天显示MxlRNA的诱导水平为背景水平的约15倍。Mxl表达继续增加，到第10天时超过背景水平的100倍。到第17天时MxlRNA表达水平为背景水平的约180倍。接受pGER75DNA的对照组没有观察到Mxl表达增加。注射从pGT61产生的病毒的小鼠与接受pGT61DNA的小鼠相比，在第10、14和17天MxlRNA表达水平为约5倍高。这得到在被注射肌肉上进行的IFN-PRNART-PCR分析的证实。在第17天处死小鼠时，注射DNA的肌肉中的mlFN-J3RNA表达为9.0xl()S拷贝/^gRNA，与之相比注射病毒的肌肉中为2.0xl(f拷贝/吗RNA(数据未显示)。还分析了血浆样品的IP-IO和JE(图7和8)。所得结果与MxlRNA诱导的所得结果非常相似。在第2天，通过电穿孔接受DNA的小鼠与注射AAV-l-mIFN-(3表达的病毒的小鼠相比，显示更高的IP-10血浆水平。但是，到第IO天时，注射AAV-l-mIFN-|3的小鼠中IP-10水平显示强烈增加，平均为注射质粒mIFN-P的小鼠的5至IO倍高。C.总结和结论大剂量注射人IFN-(31a蛋白后的药代动力学曲线非常类似于用WFN-(31a给予正常人志愿者和患者所作的研究的已发表报道(参见例如Buchwalder,P-A(2000)JInterferonCytokineRes20:57-66)。静脉内注射的人IFN-J31a蛋白被快速清除，到第6小时血清水平低于测定的检测限。在肌肉内注射该蛋白质后，峰值较低，但血清半寿期延长。但是，动力学还是非常快速，血清水平在数小时内下降到检测限以下。最近用PEG化形式的IFN-pia在小鼠、大鼠和猴中进行的药代动力学研究显示，20-kDa聚乙二醇(PEG)聚合物的连接能使半寿期(t,/2)从大约1小时延长到10小时(参见例如Pepmsky,RB等，(2001)JPharmExpTher297:1059-66)。在质粒DNA递送后，尽管用ELISA在^皮注射肌肉的裂解液中测量到可检测水平的hIFN-P蛋白(数据未显示)，但试图测量hIFN-|3的血清水平却未获成功，原因可能是转基因的低表达。但是，使用编码hIFN-卩的AAV-1运载体，在月几肉内注射后，用hlFN-(3ELISA以剂量依赖性方式检测出非常高血清水平的hlFN-(3蛋白。此外，在注射后直到几乎6个月都测量到非常稳定和持续的水平。值得指出的是，这个模型中缺乏对作为外来转基因的hIFN-P表达的明显免疫原性反应，虽然没有分析血液中抗hIFN-|3抗体的存在。已报道WFN-(3的大剂量蛋白递送在其它动物才莫型(例如猴子，参见ref.33)中具有高度免疫原性。结果提示，编码hIFN-P的AAV-1运载体的肌肉内给予可被开发作为实现长时间高转基因表达的平台。采用鼠IFN-B蛋白或基因递送进行了三种mIFN-P生物标志的筌定和验证，以进行药代动力学研究。开发了高度灵敏的定量RT-PCR测定法，以测量从一皮给予mlFN-(3的小鼠其PBMC分离的MxlRNA的诱导情况。两种鼠细胞因子IP-10和JE也被鉴定为灵敏的IFN-p生物标志，市售的ELISA提供了快速定量和支持MxlTaqMan测定所获结果的手段。测试了两种不同类型的基因递送运栽体一一质粒DNA(加电穿孔)和AAV-1。静脉内或肌肉内给予大剂量mIFN-P蛋白导致所有三种生物标志强烈但短暂的诱导，Tmax大约为2小时。生物标志水平在注射后12-24小时快速下降到背景水平。当月几肉内注射mIFN-卩时，观察到Mxl、IP-10和JE的剂量响应。生物标志水平的快速下降直接反映了大剂量蛋白质给予后IFN-(3的全身快速清除。用质粒加电穿孔或AAV-1运载体进行mIFN-(3的基于基因的递送，其所导致的生物标志响应大于注射mIFN-P蛋白时所观察到的响应。对于质粒DNA，生物标志响应直到第49天都能测量到，在第63天则下降到背景水平。这些数据第一次证明，mlFN-(3表达质粒能够表达生物活性mIFN-P达至少7个星期。当mlFN-j3DNA通过AAV-1运载体递送时，生物标志响应的动力学稍有不同。该响应在感染后早期较低，在第一个星期的时间里增加。在感染后第二和第三星期观察到生物标志响应稳定在高水平。总之，已证明与小鼠中大剂量蛋白质给予相比，人和鼠IFN-I3的基于基因的递送显示更好的药代动力学曲线。首先，表达的IFN-I3的水平等于或大于蛋白质递送所实现的水平，这在血清中直接测得或者由IFN-P生物标志的诱导所反映。其次，与蛋白质给药所观察到的短暂动力学(几个小时)相比，单次注射IFN-P运载体所致的IFN-P表达持续时间(稳定表达几个星期至几个月)要长得多。实施例5:采用mIFN-P基于基因的递送进行的功效研究这些研究证明基于基因的递送在多发性硬化症的动物模型中是有效的。啮齿动物EAE模型是多发性硬化症的公认模型，有几个报道证实IFN-13在这些才莫型中具有活性(Yu,M等，(1996)JImm64:91-100)。还有报道说IFN-(3的基于基因的递送在一些这些模型中是有效的(参见例如Triantaphyllopoulos,Ketal.,(1998)GeneTherapy5:253-63)。这些研究的结果验证了使用mlFN-(3蛋白的鼠EAE模型，并比较该模型中mlFN-J3的基于基因的递送和蛋白质递送。A.mIFN-p蛋白在小鼠急性EAE模型中的功效将八周龄雌性SJL小鼠在第1天用蛋白脂质蛋白质(PLP)免疫，然后在研究过程中隔天皮下(s.c.)注射不同剂量(10，000、20,000、30,000或100,000单位/组)的纯化重组鼠mIFN-(3蛋白来处理。本研究所用的阳性对照是Mesopram和泼尼松龙，每日两次腹膜内(i.p.)给予。具体地说，将编码mIFN-P的基因克隆到pCEP4表达运载体(Invitrogen)中。用X-tremeGeneRo-1539TransfectionReagent(Roche)将编码mIFN-P的表达质粒短暂转染到293E细胞(EdgeBiosystems)中。通过离子交换层析和疏水相互作用层析从介质中纯化出mlFN-J3蛋白。将产物唾液酸化(sialyzed)，对稀释緩沖液(50mM乙酸钠(pH5.5)、150mM氯化钠和5%聚丙二醇)浓缩，无菌过滤。将纯化蛋白的等分试样在-80。C下保藏。采用AccessBiomedical(SanDiego，CA)的市售mIFN-(3参考标准品，用萤光素酶报道基因测定法(Hardy等，(2001)Blood97:473-482)测评纯化蛋白的活性。纯化蛋白的比活性为2x108单位/mg。对于动物研究，将纯化的mIFN-|3在稀释緩沖液中稀释到100昭/mL。在动物注射之前，将mIFN-P储备溶液稀释到所需的mIFN-卩浓度。用于这些研究的介质对照是不含mlFN-l3的稀释緩沖液。研究的结果在图11中显示。用100,000单位的IFN-f3(大约500ng,20昭/kg)处理的小鼠与用介质处理的小鼠相比，其EAE临床分数显著降低(p-0.0046)。用30,000单位的IN-(3处理的小鼠与用介质处理的小鼠相比，也显示临床分数下降，不过这个下降没有达到统计学显著性。本研究的阳性对照Mes叩rara和泼尼松龙也显著降低临床分数。B.mIFN-P基于基因的递送在鼠急性EAE模型中是有效的根据之前研究的结果，即证明mIFN-P蛋白在鼠急性EAE模型中是有效的，进行第二个研究，以测试和比较mIFN-(3的质粒递送与蛋白质递送。如在第一个研究中，小鼠在第1天注射PLP。对于基因递送，在研究的第2天，给小鼠肌肉内注射PBS、空质粒DNA(pNull)加电穿孔(EP)、mlFN-(3质粒DNA(加EP)或用称为"PINC"的聚合物配方配制的mIFN-|3质粒DNA(Mumper,RJ等，(1998)JControlledRelease52:191-203)。对于蛋白质递送，小鼠隔天注射mIFN-P蛋白(IOO,OOO单位，皮下注射)或介质。本研究的结果在图12中显示。如同前一研究，用100,000单位的mIFN-(3蛋白处理的小鼠与用介质对照处理的小鼠相比，其临床分数显著降低&=0.045)。mIFN-(3的基因递送+EP相比pNull的基因递送+EP，也显著降低临床分数(p:0.0171)。用IFN-J3的PINC配方进行的基因递送与pNull相比没有使临床分数发生统计学上的降低(数据未显示)。本研究的全部结果在材料和方法A节和图13中描述。C.总结和结论，通过证明研究过程中隔天注射100,000单位的mlFN-f3与介质对照相比显著降低了疾病的严重程度，验证了釆用重组mlFN-(3蛋白的鼠急性EAE模型。编码mIFN-|3的质粒的基于基因的递送证实能显著降低患病小鼠的临床分数。在研究的第2天单次注射质粒，在降低临床分数上与隔天注射IFN-P蛋白一样有效。这些研究证明IFN-P的基于基因的递送在多发性硬化症的动物模型中是有效的。实施例6:使用调节表达系统的IFN-P的体内调节表达A.设计、构建和体外验证本发明的调节表达系统具有优于已知表达系统的优点。在一个优选的实施方案中，本发明的系统在单一运栽体中具有编码目的治疗性分子(例如IFN-P转基因)的第一表达盒和编码调节治疗性分子表达的调节性分子的第二表达盒，从而解决了几个开发和制造上的问题。作为一个优选的实施方案的实例，本发明提供了新的改进的调节表达系统。在这个实施方案中，本发明调节表达系统的表达盒存在于称为BRES-1的单一质粒运载体中。BRES-1单一运载体在其设计中结合了多种通用(versatile)特征，包括供不同转基因插入的多克隆位点(MCS)及驱动调节蛋白表达的不同启动子。另夕卜，BRES-1表达盒的大小与包括质粒和AAV运载体在内的许多不同递送运载体相兼容。B.用于基因疗法的mIFN-p和hIFN-p可i秀导型表iiJ逸载体的构建将来自pGER101和pGER125的mIFN-卩和hIFN-卩基因分别转染到一系列四种BRES-1运载体(图14A-D)。所得的质粒其编码鼠或人IFN-(3基因的表达盒和编码调节性分子基因的表达盒相互间有四个不同方向(图15A-B)。所得的编码mlFN-j3的BRES-1质粒标示为pGT23、pGT24、pGT25和pGT26(图15A)，所得的编码hIFN-卩的BRES-1质粒标示为pGT27、pGT28、pGT29和pGT30(图15B)。有关这些质粒的构建的完整描述见材料和方法F节。C.IFN-p表达运载体的体外验证将组成型hIFN-(3表达质粒(pGER125)和可诱导型hIFN-(3表达质粒(pGT27、pGT28、pGT29和pGT30)转染到鼠肌肉C2C12细胞中。用诱导物MFP处理细胞，用ELISA测定培养基的hIFN-P(图l6)。结果表明在MFP不存在下hlFN-(3表达极少。人IFN-|3从BRES-l-hIFN-P质粒的表达被MFP诱导大约20-90倍，其水平达到从CMV启动子(pGER125)的表达水平的约50%。与双质粒表达系统(pGS1694加pGER129)相比，BRES-1系统的所有四个质粒方向都显示在MFP不存在下有相当的基础活性，在MFP存在下所诱导的活性等于或大于双质粒表达系统。用mIFN-pBRES-l质粒进行了类似的体外研究(图17)，结果与WFN-f3BRES-1质粒的结果非常相似。D.IFN-P的体内调节表达用mIFN-(3BRES-1质粒运载体pGT26在首次用于实验的C57BI/6小鼠中进行研究，该运载体如下构建用Sail消化pGER101，用KlenowDNA聚合酶填补5'突出端使成平端，连接SpeI接头，用SpeI和NotI消化，将所得的携带mIFN基因的片断插入pGT4的Spel位点和Notl位点之间。用质粒运载体pGT26来试验是否能通过口服给予诱导物MFP以关/开/关脉动方式调节mIFN-P的表达。将组成型和可诱导型BRES-1mlFN-(3表达质粒注射并电穿孔到小鼠的后肢肌肉中。在注射后第7天起，连续4天用MFP处理小鼠。在注射后第11天和18天收集血液，分离PBMC，用RT-PCR测定MxlRNA水平。还测定了血浆样品的细胞因子1P-10和JE。MxlRNA生物标志分析和细胞因子分析的研究结果分别在图18和19中显示。在MFP不存在下的第7天极少或没有观察到生物标志诱导。口服给予MFP后，在第ll天所有生物标志都被强烈诱导到高于CMV-mlFN-f3的水平。到了第18天，细胞因子水平回复到基线，MxlRNA水平几乎降低到基线(有关本研究和对照的描述参见以下材料和方法G节)。E.总结和结论本发明人已确证两种运载体——非病毒质粒DNA和I型腺伴随病毒(AAV-1)适合用于递送治疗性分子(例如IFN-P基因)来治疗慢性疾病(例如多发性硬化症)。此外，本发明人已证实鼠动物模型中这两种质粒都可通过肌肉内注射递送到骨骼肌，产生的IFN-(3表达水平可测量且持久。在质粒DNA方面，本发明人已证明在多发性硬化症的动物才莫型中单次注射(加电穿孔)编码mlFN-j3的质粒就有效，与隔天注射mlFN-(3蛋白一样有效。本发明人开发了mIFN-P的生物标志，证实单次注射后质粒编码的mIFN-P表达持续至少45天。在AAV-1运载体方面，本发明人已证实单次肌肉内注射编码人IFN-(3的AAV-1运载体导致高血清水平的人IFN-P蛋白持续6个月。质粒运栽体和AAV-1运载体两者都已证明与本发明的BRES-1调节表达系相兼容。例如，用本发明的单质粒运载体BRES-1调节表达系统，本发明人证明了小鼠中IFN-f3的调节表达。在新的和改进的BRES-1调节表达系统的一个实施方案中，表达盒存在于单一运载体例如单一质粒运载体中。在这个实施方案中，BRES-1单一质粒运载体在该单一穿梭质粒表达运载体上含有调节性分子(例如转录激活剂如修饰的类固醇激素受体)和治疗性分子(例如人或鼠IFN-(3)的表达盒。BRES-1调节表达系统的单一运载体含有多克隆位点(MCS)，可简化启动子、调节元件和转基因向质粒骨架中的插入或置换。本发明人在本文中论述到，已在体外构建和试验了BRES-1mIFN-p和BRES-1hIFN-P单质粒运载体，证实它们在小分子诱导物MFP这种激活性分子不存在下具有低背景活性，在MFP存在下显示高可诱导性(可与双质^立系统相比)。在正常小鼠中应用BRES-1mlFN-(3质粒运载体并口服给予MFP，进行体内研究。采用生物标志来监测mIFN-(3表达水平，结果显示在MFP不存在下mlFN-J3生物标志的低背景水平表达，在MFP给予后出现强烈诱导，除去MFP时又回复到基础表达水平(图18和19)。根据这些结果，本发明人实现了用本发明的调节表达系统进行IFN-f3的体内调节表达。因此，这些研究及本发明组合物和方法的一个成果是IFN-I3的基于基因的递送系统，该系统提供IFN-(3的长期调节表达，以治疗疾病或病症，例如抗炎性疾病或病症，更优选多发性硬化症。本发明的基因治疗运载体可掺入一个或多个表达盒，用以递送治疗疾病或病症的目标治疗性分子(例如IFN-P)。在一个实施方案中，通过口服给予小分子诱导物MFP，本文所述的调节表达系统可提供长期可更新的表达。单运载体BRES-1系统能够例如通过肌肉内注射反复给予，使得可以在临床上进行IFN-P连续疗法与脉动疗法的比较试验。实施例7:候选运栽体的选择实施例7:BRES-1调节表达系统A.BRES-1方向所进^f亍的体内研究利用了如图15所述构建的四种BRES-1方向中的一种。如本文所述，这是基于体外数据，该数据显示构建物pGT26在MFP的存在下具有最高的转基因表达水平。这四个BRES-1方向可用本文描述的方案进4亍体内试验，以确定哪一个方向提供最好的转基因表达"窗口"(例如没有MFP时的最低基础表达水平和加有MFP时的最高诱导表达水平)。i.BRES-1质粒中靶基因表达的方向依赖性作用用mlFN-f3BRES-1质粒运载体pGT23、24、25和26在首次用于实验的C57BI/6小鼠中进行研究，以确定mIFN表达的水平，该水平由充当mIFN表达生物标志的细胞因子IP-10的水平来测定。将pGT23、pGT24、pGT25和pGT26注射加电穿孔到小鼠后肢肌肉中，每组15只小鼠。每组选5只小鼠在MFP不存在下的第7天放血。每组余下的IO只小鼠在质粒注射后的第7天起连续4天用MFP处理。在注射后的第11天和第is天收集血液，夯析血浆样品的ip-io(详见"实验设计，，)。结果显示pGT26提供最佳的无MFP时低表达和有MFP时高表达的组合，与体外结果相一致(图32)。pGT24有最高的IP-10表达诱导，但在MFP不存在下的IP-10水平比其它方向要高。pGT25在不存在和存在MFP下IP-10水平都较低，pGT23其在MFP存在下的IP-10水平与pGT26大致相同。但是，pGT24在不存在MFP下的IP-10水平比pGT26的要高得多。这些结果整体表明了基础靶基因表达和诱导靶基因表达两者的方向依赖性作用。实^i殳计BRES-1/mIFN质粒的体内转染和pBRES-1/mIFN的四个方向的比较如下进行。用单运栽体BRES-1小鼠IFN表达质粒注射和电穿孔正常C57BI/6小鼠。通过生物标志响应和mIFNRNA分析来监测mIFN表达。各小鼠经历MFP处理的一个关/开/关循环。DNA溶液所有注射组的每只小鼠接受150plPBS中的250叫质粒DNA。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage112</column></row><table>n=动物数DNA递送在第0天给成年雄性C57BI/6小鼠双侧注射150piPBS中的250叫质粒DNA。每个后腿胫骨肌注射DNA溶液25pi,腓肠肌注射50pi,然后用卡钳(caliper)进行电穿孔(200V/cm下8个脉沖，1Hz,20msec/脉冲)。MFP处理按下表指示，给l-4组(所有注射小鼠)经口灌服MFP0.33mg/kg(100pl，0.083mg/ml，芝麻油中，新鲜制备)。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage113</column></row><table>第7天比较在MFP不存在下表达的基线水平。第11天比较MFP处理后表达的诱导水平。第18天比较不进行MFP处理7天后的表达。血液收集和终点分析/测定程序在上表所示的时间点，小鼠通过割尾(tailnick)和心脏穿刺(终点放血，terminalbleed)放血。室温下将血液收集到Microtainer管(含EDTA)中。从尾血收集的血浆进行IP-10测定。从终点血分离和收集PBMC，剩余血浆通过ELISA测定IP-IO。ii.BRES-1质粒中把基因表达的方向依赖性作用同样按如上所述的类似方式测试BRES-1/hIFN质粒。将组成型质粒(pGER125)或可诱导型BRES-l/hlFN质粒(pGT27、pGT28、pGT29和pGT30)注射加电穿孔到首次用于实验的C57BI/6小鼠的后肢肌肉中。小鼠进行质粒注射后，在MFP不存在下的第4天放血，然后在第7天起连续4天用MFP处理。在注射后的第11天和第18天收集血液。从凝结血液收集血清，用ELISA测定样品的WFN(详见以下"实验设计，，)。结果显示pGT28提供最佳的无MFP时低表达和有MFP时高表达的组合，与体外结果一致(图33)。所有BRES-1/hIFN质粒在MFP不存在下的第4天MFN表达都不可检测。第7天在MFP存在下的WFN表达，pGT27比用CMV启动子低，但pGT28、29和30更高。pGT28的hIFN表达为CMV的5倍高之多。第18天时，所有BRES-1/hIFN质粒的表达都下降到几乎不可招r测，其中pGT28在该时间点的表达最低。这些结果整体说明了基础華巴基因表达和诱导靶基因表达两者的方向依赖性作用。实验没计BRES-1/hIFN质粒的体内转染和pBRES-1/hIFN的四个方向的比较如下进行。给正常的成年C57BI/6小鼠注射携带RES-1/hIFN或CMV-hIFN表达盒的质粒运载体。经过MFP处理的一个关/开/关循环后测定人IFN表达。质粒DNA溶液组2-6小鼠(质粒)每鼠接受250吗DNA，体积150jil。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage114</column></row><table>*11=动物凄欠DNA递送对于组2-6小鼠(质粒)，每个后腿胫骨肌注射DNA溶液25)Lil，腓肠肌注射50W，然后用卡钳(caliper)进行电穿孔(200V/cm下8个脉沖，1Hz,20msec/脉沖)。MFP处理按下表指示，在第7-10天通过腹膜内注射给予组2-5MFP0.33mg/kg(画pl，0.083mg/ml，芝麻油中，新鲜制备)。表6:循环1<table>tableseeoriginaldocumentpage115</column></row><table>血液收集和终点分析/测定程序在上表所示的时间点，小鼠通过割尾和心脏穿刺(终点放血)放血。将血液收集在Microtainer管(无抗凝剂)中。从血液分离和收集血清，然后用ELISA测定hIFN。iii.BRES-1质粒中靶基因表达的方向依赖性作用同样按如上的类似方式测试BRES-l/hEPO质粒。将可诱导型单质粒BRES-l/hEPO(pGT15、pGT16、pGT17和pGT18)运载体或双质粒(pGS1694+pEP1666)运载体注射加电穿孔到首次用于实验的C57BI/6小鼠的后肢肌肉中，每组10只小鼠。每组5只小鼠在质粒注射后笫7天起连续4天用MFP处理，每组的另5只小鼠不接受MFP。在注射后第10天的最后一次MFP处理后6小时收集血液。从凝结血液收集血清，用ELISA测定样品的hEPO(详见以下"实验设计")。结果显示4种BRES-1/EPO质粒中有3种其诱导表达水平高于双质粒系统，且表达水平随方向而变，这与mIFN和hIFNBRES-1质粒相符(图34A)。结果显示EPO表达和血细胞比容水平之间有良好的相关性(图34B),这证明了可诱导EPO基因表达的生理作用。这些结果整体说明了基础靶基因表达和诱导靶基因表达两者的方向依赖性作用。实4H殳计BRES-l/hEPO质粒的体内转染和pBRES-l/hEPO的四个方向与双质粒调节表达系统的比较如下进行。给正常的成年C57B1/6小鼠注射BRES-l/hEpo质粒运栽体或双质粒调节表达系统，其中Epo为GS响应性耙基因。在MFP处理不存在和存在下测定人Epo表达。以下方案由5组小鼠组成(N40,其中"N"是小鼠个数)。对于每组，所有10只小鼠都用4种pBRES-l质粒中的一种或者双质粒注射/电穿孔。另加一组N-10(组6)不进行注射，作阴性对照。对于以下的每个尾部放血或终点放血，立即收集10卩il血液作血细胞比容测定，还收集剩余血液的血清。参见下文的"血液收集和终点分析/测定程序"。对于组1-5的每个组，有5只小鼠在第7-10天早上注射MFP，在第10天下午最后一次MFP注射后6小时进行尾部放血(诱导样品)。每组余下的5只小鼠不用MFP诱导，在第11天进行终点放血(为使未诱导水平准确，终点放血是必要的)。组6在第11天进行终点放血。因此，在本实验中，将pBRES-l和双质粒系统在MFP诱导水平和未诱导水平方面和在随时间推移的恒定诱导水平方面进行比较。质粒DNA溶液组1小鼠每鼠每种质粒接受100照，体积150pl。组2-5的小鼠每鼠接受200昭，体积150pl。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage116</column></row><table>*n=动物数DNA递送每个后腿胫骨肌注射25pl，腓肠肌注射50pl，然后用卡钳进行电穿孔(200V/cm下8个脉冲，1Hz,20msec/乐P中)。MFP处理通过腹膜内注射100plMFP溶液(0.083mg/ml，芝麻油中)给予小鼠MFP。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage117</column></row><table>血液收集和终点分析/测定程序在上表所示的时间点，小鼠通过割尾和心脏穿刺(终点放血)放血。将血液收集在Microtainer管(无抗凝剂)，让其凝结，离心，收集血清。用ELISA测定血清的hEpo。血细胞比容直接从割尾收集(抽吸)大约10jxl血液到毛细管中，用粘土密封，在收集后IO分钟内在约10,000g下离心约5分钟。血液在毛细管中分成3层，即底层RBC(总体积的40-50%)、小"浅黄色层"(WBC和血小板)和上层血浆。用游标卡尺读取血细胞比容(RBC占总血的百分比)。B.BRES-1骨架本文所述的本发明BRES-1运载体的任何质粒骨架修饰都可掺入到本发明的BRES-1运载体中，该修饰显示转基因表达的水平和/或持续时间显著增加(由本文描述的方法测定)。对本发明BRES-1运载体的另外修饰可包括使用更强的启动子。这种类型的修饰由于BRES-1系统的模块化设计而相对容易测试。C.BRES-1/运载体测试本发明人进行的药代动力学和功效研究釆用了利用CMV启动子增强子的IFN-(3表达盒。本发明的BRES-1表达系统能修改成适合本文所述的具体治疗需要。例如，可在首次用于实验的C57BI/6小鼠中测试本发明运载体或表达盒的变化或修饰。进行这些研究可例如为了l)确定在连续或脉动治疗方案中为实现治疗性分子(例如IFN-P)全身治疗水平所需的运载体和激活性分子(例如小分子诱导物MFP)的最佳剂量，2)确定转基因表达的持续时间，以及确定运载体和诱导物的反复给予的最佳时间。一旦在小鼠(或其它合适的动物)中确定了这些参数，就可以在另一种物种、优选非人灵长类动物中使用这些优化的递送条件，来建立基于基因的递送相对于蛋白质递送的更优良药代动力学概况(例如表达水平、表达持续时间、可再生表达)。实施例8:候选运载体的选择运载体类型的选择可由具体的研究来确定。例如，对于质粒DNA，可以确定电穿孔是否是肌肉内注射的一个必需步骤，来获得治疗性分子的治疗水平，例如IFN-P的治疗水平。如果本发明基因治疗运载体需要通过电穿孔来给予，则可由本文所述和另外由本领域所公知，设计出临床上可行和可接受的装置和方案。例如，对于本发明的AAV-1运载体，可根据所报道的AAV运载体的潜在免疫原性特性(参见例如Chirmule,N等，(2000)JVirol74:2420-25)确定是否需要反复给予该运载体。A.用质粒DNA改进骨骼肌转染的方法质粒DNA是基于基因的递送的适宜运载体，因为它简单、无免疫原性，容易生产和制造。已开发出几种不同的方法，来增强肌肉内注射的质粒DNA的骨骼肌(SkM)转染效率。这些方法包4舌在递送前使用酶如透明质酸酶来处理肌肉和周围胞外基质(参见例如Mennuni,C等，(2002)HumGeneTher13:355-65)、使用各种聚合物配方(参见例如Mumper,RJ等,(1998)JControlledRelease52:191-203;Nicol,F等，(2002)GeneTher9:1351-58)和使用装置如电穿孔装置(参见例如Aihara,H等，(1998)Nat.Biotech16:867-70;Bloquel,C等，(2004)JGeneMed6:SIl-S23)或超声装置(参见例如Schratzberger,P等，(2002)MolTher6:576-83)。使用高压和大体积将质粒DNA血管内递送到肢体SkM(袖套法，"cuff，method),已证实能有效实现质粒DNA向这个靶组织的高转染和广分布(参见例如Budker,V等，(1998)GeneTher5:272-76)。在所有这些方法中，电穿孔和血管内递送据报道最有效，在几种动物模型中已证实相对于单独棵DNA能增强质粒DNA向SkM中的转染达2-3个数量级(参见例如Bloquel,C等，(2004)JGeneMed6:S1卜S23;Qian，HS等，(2004)MolTher9:S叩p1，S91)。本发明人使用质粒DNA证实，在质粒DNA的递送中使用电穿孔时在血清中可获得可检测水平的IFN-P(血清中可测量的IFN-J3蛋白、生物标志响应或功效)。供临床用于递送IFN-(3质粒DNA的合适电穿孔装置，可通过用本文描述或本领域公知的方法在兔子和其它更大动物中进行试验来评估和确定。适合于这种试验和使用的电穿孔装置可包括InovioAS,IchorMedicalSystems,Genetronics,Inc所开发的电穿孑L装置。Genetronics已才艮道在人体中进行了装置试验(在GordonResearchConferenceonBioelectrochemistry,July25-30，NH的未发表净艮告)。Inovio也报道了在人志愿者中进行的电穿孔技术试验的结果(参见例如Kjelen,R等，(2004)MolTher9:Suppl,S60)。IchorMedicalSystems最近报道了适合用于递送治疗性DNA的电穿孔装置的开发(参见例如Evans，CF等，(2004)MolTher9:Supp1，S56)。本发明人使用编码LacZ报道基因的质粒证明，采用质粒溶液的动脉内递送可获得向大鼠后肢骨骼肌的高转染效率。Mirus最近报道了在较低压力下以较少体积递送质粒DNA的静脉内递送方法，该方法可用本发明描述或本领域/>知的方法来测试其SkM质粒递送(参见例如Hagstrom,JE等，(2004)MoleTher10:386-98)。电穿孔或血管内递送之外的、用以增强质粒DNA向SkM中的摄取和随后的转基因表达的方法，可用本文描述或本领域公知的方法进行测试和确定其递送质粒DNA的合适性。为此，可试验几种据报道能增强运载体向SkM的摄取的化学物质，它们可能适合用于递送本发明的质粒运载体，包括聚合物配方和触角肽(antennopediapeptide,AP)。例如，"F68"是用来配制和递送质粒DNA的泊洛沙姆配方，据报道能增强质粒DNA向SkM的递送达约10倍(参见例如Mumper,RJ等，(]998)JControlledRelease52:191-203;Qian,HS等，(2004)MolTher9:Supp1,S91)。触角肽(AP)和具有类似组成的其它肽据报道能促进大分子转运穿过细胞膜(参见例如Bucci，M等，(2000)Nat.Med6:1362-67;Gratton,J-P等，(2003)NatMed9:357-62)。B.增强质粒DNA运载体的IFN-p表达的水平和持续时间的方法除了评估某些能增强质粒DNA向SkM的摄取的化学物质外，还可采用各种手段来提高本发明质粒DNA运载体的转基因表达的水平和持续时间。例如，已有报道说，从质粒DNA除去细菌DNA序列所产生的只含表达盒的圓形质粒("小环DNA")，与标准质粒DNA相比，转染小鼠肝脏后导致转基因表达提高10-100倍(用因子IX和al-抗胰蛋白酶作为转基因)(参见例如Chen,Z-Y等，(2003)MolTher8:495-500)。已证实除去富含CpG区的细菌DNA序列能降低质粒DNA运载体的转基因表达沉默，导致更持续的表达(参见例如Ehrhardt,A等，(2003)HumGeneTher10:215-25;Yet,NS(2002)MolTher5:731-38;Chen,ZY等，(2004)GeneTher11:856-64)。本发明的调节表达系统可用这种手段来修饰，以增加和延长采用质粒DNA运载体的转基因表达的水平。在一个优选的实施方案中，对编码IFN-P的BRES-1质粒运载体进行修饰，以增加和延长转基因表达的水平。在一个实施方案中，IFN-{3转基因在本发明调节表达系统中的表达由强大的巨细胞病毒(CMV)启动子驱动，以组成型表达IFN-P。已有报道说，采用CMV启动子的基于基因的表达由于启动子区域的体内大量甲基化而发生沉默(参见例如Brooks,A等，(2004)JGeneMed6:395-404)。另外，本发明人用BRES-1基因治疗质粒运载体pGT26-mlFN-P进行的体内研究的结果证实，采用BRES-1表达盒所实现的IFN-P水平比采用CMV驱动的表达盒达到的水平更高(参见例如实施例6)。鉴于这些结果，本发明的IFN-f3BRES-1表达系统可产生出比迄今用CMV驱动的质粒DNA表达盒所观察到的表达水平显著更高和更持续的表达水平，因此它适合用于试验不进行电穿孔下的BRES-1质粒运载体递送。在一个优选的实施方案中，给予方法是在不进行电穿孔下肌肉内注射IFN-j3质粒溶液。血清中IFN-P的可检测水平可通过将质粒运载体肌肉内注射给予首次用于实—验的小鼠来测试。可对BRES-1表达盒的表达水平和持续时间进行全面鉴定，并与之前使用的CMV运载体进行比较。可测试质粒配方(包括F68泊洛沙姆和触角肽)增强SkM质粒转染和随后的IFN-p转基因表达的能力。最后，可研究质粒运载体骨架的修饰(例如除去细菌序列)，作为增加和延长转基因表达的手段。C.AAV-1运载体腺伴随病毒(AAV)是单链DNA病毒(纟田小病毒)，最初作为人腺病毒分离物中的污染物被分离。AAV所具有的多种特征使得它作为基因治疗运载体特别引人注目。它除了在辅助病毒不存在下具有非病源性质和复制缺陷性质外，基因组也非常简单，只由rep和cap两个基因组成。在重组AAV运载体中这些基因用所需的转基因取代，该转基因的侧翼是各为约135个碱基对的特征性5'和3'末端反向重复序列(ITR)。ITR是AAV衍生DNA进行运载体递送所需的唯一残余成分。至今为止的研究证实，没有rep基因的重组AAV运栽体在体内不发生整合，而是形成大的串联体结构，这种结构在非分裂细胞中保持为游离型结构(参见例如Duan,D等，(1998)JVirol72:8568-77;Vincent-Lacaze,N等，(1999)JVirol73:1949-55;Schnepp,BC等，(2003)JVirol77:3495-3504)。AAV对DNA的容量相对较小，约为4.5kb，但这通常足够容纳最大的治疗性转基因以外的所有转基因。已在人基因治疗试验中测试过AAV2，证实它可提供长期表达，炎症产生最少(参见例如Silwell，JL和Samulski,RJ(2003)BioTechniques34:148-59)。最近证实，AAV运栽体系统除了有长期表达特性外，替代性AAV血清型还具有优良的SkM转染效率(参见例如Grimm,D和Kay,MA(2003)OutGeneTher3:281-304)。本发明人用在CMV启动子下表达萤光素酶的AAV-1运载体进行的研究证实，运载体肌肉内注射到小鼠后肢后高表达持续超过12个月(参见例如Qian，HS等，(2004)MolTher9:Supp1,S60)。已报道了hEPO在非人灵长类动物中的持续表达超过5年之久(参见例如Xiao,W等，(1999)JVirol73:3994-4003)。如本文所述，本发明人已测试了AAV-1IFN-J3表达运载体(用CMV启动子/增强子进行组成型表达)，证明运载体肌肉内注射到C57BI/6小鼠的后肢中后有高水平的hIFN-|3蛋白及mIFN-卩生物标志响应。在挑选基于病毒的递送运载体以治疗慢性疾病如多发性硬化症时，可用本文描述或本领域公知的方法，测试本发明调节表达系统的以下两方面能力不仅能长期表达治疗性转基因，而且能将基因反复给予(参见例如Chi画le,N等，(2000)JVirol74:2420-25)。为了确定AAV-1是否是进行反复给予的合适运载体，可例如用候选运载体AAV-1和据认为在人群中最流行的血清型AAV2进行研究。这个方案可用来确定l)现有的抗AAV2或AAV-1抗体是否会影响递送和表达AAV-1运载体中编码的基因的能力，2)AAV-1运载体是否能以足以维持小鼠中治疗性水平IFN-J3的剂量进行再给予。可以以不同的剂量肌肉内给予表达报道基因荧光素酶或治疗性基因鼠IFN-P(在AAV-1或AAV2运载体中)的运载体，并监测转基因表达。四个星期后，可再次给予运载体，同样可再监测转基因表达。可以通过先体外后体内方式(exvivo),由受免疫小鼠血清在基于细胞的测定中抑制病毒摄取的能力，测量中和性抗体。i.pBRES-l-hIFNAAV运载体的体内活性在首次用于实验的C57BI/6小鼠中，采用注射到小鼠后肢肌肉中的hlFN-J3BRES-1AAV运载体AAV-1GT58进行研究。小鼠进行质粒注射后，在MFP不存在下的第4天放血，然后在笫7天起连续4天用MFP处理。在注射后的第11天和第18天收集血液。从凝结血液收集血清，用ELISA测定样品的hIFN(详见以下"实验设计")。然后将小鼠再进行7个循环的MFP处理，各次;改血间隔约6-S个星期。每个循环由以下组成在MFP处理前3天》t血，接着MFP处理4天，然后在最后一次MFP处理后的一天放血，然后过7天再放血。结果显示非常高的可诱导hIFN表达，在注射后约3个月达到峰值，其水平为最强的BRES-l/hlFN质粒所获水平的75倍高之多(图35)。hIFN表达随时间推移逐渐降低，在整个实验过程中MFP不存在下的背景表达都是4M氐。这证明了来自AAV运载体的治疗性耙基因的长期、持续(另见实施例9B)、可诱导表达。实验没计如下给正常成年C57BI/6小鼠注射携带BRES-1/hIFN表达盒的AAV运载体。经过MFP处理的多个关/开/关循环后测定人IFN表达。病毒溶液组1小鼠(AAV)每鼠接受5xl0"个病毒颗粒(vp)，体积75pl。表9<table>tableseeoriginaldocumentpage123</column></row><table>*11=动物数MFP处理按下表指示，在第7-10天通过腹膜内注射给予组1小鼠MFP0.33mg/kg(1000.083mg/ml，芝麻油中，新鲜制备)。表10:循环l-3:1-12星期<table>tableseeoriginaldocumentpage124</column></row><table>血液收集和终点分析/测定程序在上表所示的时间点，通过割尾给小鼠放血。将血液收集在Microtainer管(无抗凝剂)中，离心分离收集血清。用ELISA测定血清的hIFN。实施例9:使用调节表达系统的基因治疗A.剂量/响应和动力学研究可进行剂量/响应研究，以确定为在小鼠(或其它合适的动物)中达到治疗性分子(例如IFN-p)的治疗性水平所需递送(不管是通过质粒还是通过AAV-1递送)的本发明基因治疗运载体的量。在一个实施方案中，治疗性水平定义为由运载体在全身实现的治疗性分子(例如编码治疗性蛋白质的转基因)的诱导水平，其与在人体中以mg/kg计给予的治疗量大剂量治疗性蛋白质所实现的治疗性蛋白质水平相当。例如，在一个优选的实施方案中，治疗性水平定义为由本发明的基因治疗运载体在全身实现的IFN-p的诱导水平，其与在人体中以mg/kg计给予的治疗量大剂量IFN-P蛋白所实现的IFN-(3水平相当。在人体中目前的IFN-pia单剂量为30pg或44pg(Rebif)。概况分析，以确定激活性分子剂量/响应以及激活性分子给予后治疗性分子表达的诱导的动力学。例如，在一个优选的实施方案中，可用诱导物MFP进行IFN-(3表达的完全药代动力学概况分析，以确定MFP剂量/响应以及MFP给予后IFN-P诱导的动力学。i.MFP剂量/响应和用BRES-1/mIFN质粒在体内进行质粒再注射在首次用于实验的C57BI/6小鼠中用mIFN-PBRES-1质粒运载体pGT26进行研究，以确定因响应各种剂量MFP的mIFN表达水平，该水平由细胞因子IP-10的水平来测定。将pGT26注射加电穿孔到小鼠后肢肌肉中，在质粒注射后的笫7-10天，用0.0033mg/kg-1.0mg/kg的MFP处理小鼠。在注射后的第11天收集血液，测定血清样品的IP-10(详见"实验设计")。结杲显示IP-10水平出现MFP剂量依赖性增加(图36)。在MFP不存在或为0.0033mg/kg下，与背景IP-10水平比较没有出现增加。而在0.01-1.0mg/kgMFP下，IP-10水平增加。在第39天和笫67天，以相同的浓度进行MFP"i秀导的第二个和第三个循环。到第67天时，IP-10水平与第11天的水平相比下降了几倍，因此在笫77天再次注射质粒DNA。再进行一个MFP处理循环，在第88天给小鼠放血。结果显示IP-10表达被重新诱导到与笫11天相同的水平。在第102天和第137天再进行两个MFP循环，仍观察到MFP剂量响应，同时随时间推移IP-10水平逐渐下降。随后，在第189第三次注射质粒DNA，接着的MFP循环和在第200天的放血再次显示强烈的MFP剂量响应，IP-10表达恢复到笫11天和第88天的相同水平。这既证明耙基因病毒和诱导物剂量有正相关性，也证明质粒运载体的反复给予能使基因表达持续和更新(见下文实施例9B)。在人体安全性研究方面，可对激活性分子和治疗性分子表达在激活性分子撤销后能被"关闭"的速度进行全面表征。可评估为实现治疗性分子的稳态水平所需的激活性分子给予频率。在一个优选的实施方案中，可对MFP和IFN-(3表达在MFP诱导物撤销后能被"关闭"的速度进行全面表征。此外，可评估为实现IFN-p的稳态水平所需的MFP给予频率。实验设计如下给正常的C57BI/6小鼠注射加电穿孔上单运载体BRES-1鼠IFN病毒质粒，并用各种剂量的MFP处理，通过生物标志响应测定mIFN表达。表12<table>tableseeoriginaldocumentpage126</column></row><table>表13<table>tableseeoriginaldocumentpage127</column></row><table>表14<table>tableseeoriginaldocumentpage127</column></row><table>DNA溶液每只小鼠接受150^PBS中的250昭质粒DNA。DNA递送在第0天给成年雄性C57BI/6小鼠每鼠双侧注射150plPBS中的250fug质粒DNA。每个后腿胫骨肌注射DNA溶液25pl，腓肠肌注射50然后用卡钳进行电穿孔(200V/cm下8个脉冲，1Hz,20msec/"永冲)。MFP处理如以上和一下各表所示，在第7-10天组1-7通过腹膜内注射接受单独100pl芝麻油或者各种浓度的MFP。表15:循环l<table>tableseeoriginaldocumentpage128</column></row><table>表16:循环2:MFP浓度同循环<table>tableseeoriginaldocumentpage128</column></row><table>表17:循环3:MFP浓度同循环1和2<table>tableseeoriginaldocumentpage129</column></row><table>表18<table>tableseeoriginaldocumentpage129</column></row><table>表19:循环4:组2-7的MFP浓度同循环1-3。对照组(l和8)用0.33mg/kgMFP处理。<table>tableseeoriginaldocumentpage129</column></row><table>表20:循环5:组2-7的MFP浓度同循环1-5。对照组(l和8)用0.33<table>tableseeoriginaldocumentpage130</column></row><table>表21:循环6:MFP处理同循环5。<table>tableseeoriginaldocumentpage130</column></row><table>表22<table>tableseeoriginaldocumentpage131</column></row><table>血液收集和终点分析/测定程序通过割尾或心脏穿刺给小鼠放血，血液收集在Microtainer管(无抗凝剂)。然后从血液分离收集血清，用ELISA测定IP-IO。ii.BRES-1AAV运载体的体内hIFN诱导和去诱导动力学的测定用hIFN-PBRES-1AAV运载体AAV-1GT58在首次用于实验的C57BI/6小鼠中研究诱导和去诱导的动力学。将AAV-1GT58注射到C57BI/6小鼠的后肢肌肉中，连续4天通过腹膜内注射给予小鼠MFP,在第一次MFP注射后的不同时间进行放血，以测定诱导动力学。然后在最后一次MFP注射后的不同时间给小鼠放血，以测定去诱导动力学(详见以下"实验设计")。用ELISA测定血清的hIFN。结果显示诱导和去诱导动力学快速，在第一次MFP处理后48-72小时MFN达到峰值水平(图37A)，在MFP处理后的96小时内减少到背景水平(图37B)。这证明BRES-1系统在体内能快速开启和关闭。实验设计如下给正常的成年C57BI/6小鼠注射携带BRES-1/MFN表达盒的AAVl运载体。按下表的"收获时间"所指示，处死每组5只动物(11=5)。MFP不存在下或者单次/多次给予MFP后用ELISA测定血清中的人IFN表达。表25<table>tableseeoriginaldocumentpage132</column></row><table>病毒溶液和递送组1小鼠每鼠在一条后腿(右腿)接受75piPBS，组2-6小鼠每鼠在一条后腿(右腿)接受75piPBS中的5x101()个病毒颗粒(vp)。25pl注射到胫骨肌中，50jil注射到腓肠肌中表26<table>tableseeoriginaldocumentpage133</column></row><table>*11=动物凄丈MFP处理按以下方案组3=第17天，组4=第16+17天，组5==笫15-17天，组6=第18-21天，给3-6组小鼠腹膜内注射MFP0.33mg/kg(100^1,0,083mg/ml，芝麻油中，新鲜制备)。血液收集和终点分析/测定程序在表27所示的时间点，小鼠通过心脏穿刺(终点放血)放血。血液收集在Microtainer管(无抗凝剂)中，从血液分离收集血清，用ELISA测定hIFN。B.表达持续性和反复给药的研究至今为止所得的数据表明，用基于CMV启动子的构建物进行的表达，对于组成型IFN-P用质粒DNA持续至少49天，用AAV-1运载体持续至少6个月。计划是用候选运载体及BRES-1系统重复和扩展这些研究，以证明IFN-P的持续且可调节的表达为期至少3个月。这些研究可在首次用于实验的C57/BI6小鼠中进行。可在C57BI/6小鼠(或其它合适的动物)中，测试本发明的BRES-1运载体响应ELISA或激活性分子给药的重复生物标志终点。可监测抗BRES-1运载体、^L表达治疗性分子(例如转基因)、调节性分子或治疗性蛋白质的中和性抗体的存在。例如，可长期地和以脉动方式给予激活性分子，以评估其以下能力随时间推移保持治疗性分子表达水平在一个优选的实施方案中，可在C57BI/6小鼠(或其它合适的动物)中，测试本发明的IFN-PBRES-1运载体响应MFP给予或IFN-j3给予的重复生物标志终点。可监测抗该运载体、IFN分子(例如IFN-|3转基因)、调节性分子或IFN-P蛋白的中和性抗体的存在。可长期地和以月永动方式给予MFP,以评估其以下能力随时间推移保持IFN-P表达水平和以开/关方式随MFP的给予提供可更新的表达水平。i.脉动和长期MFP处理下BRES-1质粒的mIFNi秀导和去i秀导的动力学用pGT26在首次用于实验的C57BI/6小鼠中进行研究，以探究BRES-1质粒运载体的mIFN-P诱导和去诱导的动力学，比较mIFN基因表达对MFP的脉动给予或长期给予的响应，和探究基因表达在几个月时间里的持续情况。将组成型mIFN表达质粒(pGERlOl，CMV)或可诱导型mIFN表达质粒(pGT26,BRES-l)注射加电穿孔到每组20只小鼠后月支H几肉中，每组有5只小鼠在MFP不存在下在第7天放血。所有20只接受pGT26的小鼠在质粒注射后第7-10天用MFP处理。为探究去诱导动力学，在注射后笫ll、12、14、16和18天的每一天从每組5只小鼠中收集血液。然后所有20只pGT26小鼠在第21-24天接受MFP，为探究诱导动力学，在第22、23和25天的每一天从每组5只小鼠中收集血液(详见以下"实验设计，，)。为探究响应连续MFP处理的耙基因表达，接受pGT26的小鼠在第35-50天每天腹膜内注射MFP，并在这期间的第35(MFP处理前)、39、42、45和51天每组5只小鼠进行放血。为探究3.5个月后的基因表达，将小鼠在第105天力丈血，然后在第105-108天用MFP处理，在第109和第116天》文血。测定血液才羊品的IP-10,其为mIFN表达的生物标志。结果(图37C)显示MFP处理后24小时内出现BRES-1质粒的IFN表达诱导，在达到诱导峰值后24-48小时表达降低到基线。BRES-1系统的mIFN表达高于CMV启动子驱动的表达。在两到三个月的时间里所有三个循环的mIFN表达都为高水平。连续MFP处理导致mIFN的高水平表达持续超过两个星期。3.5个月后的HMO水平比之前的各MFP循环小约一半到三分之二，但仍远高于背景IP-10水平，也比CMV启动子的mIFN表达(同样以大约相同的动力学随时间推移而下降，3.5个月后表达丧失三分之二)所产生的IP-10水平高的多。总的来说，本实验证明了BRES-1系统在几个月时间里进行连续高水平靶基因表达的能力，以及多次被快速关闭和再开启的能力。实验设计如下给正常的C57BI/6小鼠注射加电穿孔单运载体BRES-1和CMV启动子小鼠IFN表达质粒。对IFN表达监测至少几个月，用IP-10作为mIFN活性的终点生物标志。设计MFP处理和放血以测定"开启"响应和"关闭"响应的动力学。dna溶液所有注射组的每只小鼠接受150^PBS中的250吗质粒DNA。表27<table>tableseeoriginaldocumentpage135</column></row><table>dna递送在第0天给每只成年C57BI/6小鼠双侧注射150^PBS中的250jug质粒DNA。每个后腿胫骨肌注射DNA溶液25pi,腓肠肌注射50mJ，然后用卡钳进行电穿孔(200V/cm下8个脉沖，1Hz,20msec/脉冲)。MFP处理按下表指示，通过腹膜内注射给予组2小鼠MFP0.33mg/kg(100ia1,0.083mg/ml,芝麻油中，新鲜制备)。方案循环1(第7-18天)测定"关闭，，动力学。循环2(笫21-25天)测定"开启"动力学。<table>tableseeoriginaldocumentpage136</column></row><table>血液收集和终点分析/测定程序在上表所示的时间点，小鼠通过割尾和心脏穿刺放血(终点放血)。将血液收集在Microtainer管(无抗凝剂)中，离心分离收集血清。用ELISA测定组1和2的血清的IP-IO。C.生物等效性研究可在正常小鼠和在一种其它物种(优选非人灵长类动物)中，用候选运载体和BRES-1表达系统，在例如上述研究所建立的递送条件下进行药代动力学研究。"生物等效性"可以是例如证明本发明的调节表达系统在所定义的两个动物才莫型中，所提供的IFN-|3基于基因的递送的药代动力学曲线优于IFN-J3蛋白质递送，但不限于下表中的标准。表31:生物等效性标准的非限制性实例<table>tableseeoriginaldocumentpage137</column></row><table>*在一个非限制性实施方案中，动物模型中的"治疗性水平"定义为全身IFN-p水平相当于在人体中以mg/Kg计给予治疗量的大剂量IFN-pla蛋白所实现的IFN-卩水平(例如通过E1ISA和/或生物标志i秀导来测定)。D.安全性/毒性研究如果选择AAV-1作为候选运载体，可进行肌肉内给予候选运载体后的生物分布研究。终点包括运载体DNA及表达的IFN-(3RNA和蛋白质向靶组织(肌肉)、血液、淋巴、心脏、肝脏、肾脏、肺、雄性和雌性性腺(睾丸、卵巢)中的分布。E.用以治疗疾病或病症的基于基因的递送这些研究的成果是用以递送治疗性分子(例如编码治疗性蛋白质的转基因)以治疗疾病或病症的基于基因的递送系统。在一个优选的实施方案中，本发明提供用以递送IFN-P转基因的调节表达系统，该系统可提供IFN-P的长期调节表达，以治疗多发性硬化症。在一个优选的实施方案中，这些研究的成果是，本发明的BRES-1运载体通过小分子诱导物MFP的口服给予可提供持续可更新的表达(例如3个月以上)；且它能够通过肌肉内注射进行反复给予。i.EAE疾病小鼠中BRES-1mIFN质粒活性的鉴定为了显示在多发性硬化症的动物疾病模型中的生物学作用，在患有活动性EAE的SJL小鼠中进行研究。将组成型mlFN表达质粒(pGER101、pmIFN)或可诱导型mlFN表达质粒(pGT26、pBRES-l/mlFN)和空质粒对照注射加电穿孔到SJL小鼠的后月支肌肉中。在注射pmIFN前一天和后一天，和在注射pBRES-l/mlFN后的第7天和第9天，通过注射PLP139-151/百曰咳毒素在小鼠中诱导EAE。小鼠在质粒注射后每天(d)或每三天(etd)—次腹膜内注射MFP(0.33mg/kg)进行处理。注射后第5天收集血液。从血液分离PBMC,从中制备RNA,通过RT-PCR测定MxlRNA的水平(详见以下"实验设计")。结果显示pBRES-1/mIFN加每天注射MFP导致MxlRNA水平的约8倍增加，而在MFP不存在下没有超过空运载体的显著增力口(图38)。这证明了在动物疾病模型中有生物响应，该生物响应类似于已证实在这个沖莫型中有效的生物响应。实验设计如下将雌性SJL小鼠(8周龄，JacksonLabs，约20g)分成12组(每组n=13)，按确立的鼠A-EAE方案在第1天和第3天给每组小鼠注射PLP139-151/百日咳毒素。组l,未处理。无处理对照。组2-3，CMV质粒加电穿孔(EP):双侧肌肉内注射Null(pgWiz)或mIFN(pGER101)CMV质粒DNA，其中胫骨肌20pl，腓肠肌40pl，其后第2天立即进行EP。组4-9，BRES1质粒加EP:双侧肌肉内注射BRES-1Null(pGT4)或BRES-1mIFN(pGT26)质粒DNA,其中胫骨肌20pl，腓肠肌40然后在疾病开始前进行EP—个星期(至第7天)。从第1天起每天(d)或每三天(etd)腹膜内注射MFP(0.33mg/kg)。接受"etd"MFP的小鼠在第1、4、7、10、13、16、19和22天给予MFP。组10-11,緩冲液对照，mIFN蛋白从第1天起，隔天皮下注射给予IFN蛋白緩沖液或mIFN蛋白(l00,000单位=500ng)。组12,泼尼松龙从第1天起每日两次腹膜内注射给予泼尼松龙。表32<table>tableseeoriginaldocumentpage139</column></row><table>表33<table>tableseeoriginaldocumentpage139</column></row><table>组11mIFN蛋白IOO，OOO单位(500ng)/100pl注射x13只小鼠x15次注射=1.95x107单位(97.5吗)/19.5ml。mIFN储备溶液=100昭/mL或2x1()7单位/mL。稀释管含有100^iLx15只小鼠-1.511^(共备15个稀释管，含150mMNaCl,50mM乙酸钠，pH5,5%丙二醇)。将75pL储备溶液加入到每个管中。终浓度=106单位/mL。终点分析(MxlRNA分析)组1-9各三只小鼠在第5天处死，终点放血进行MxlRNA分析(使用含EDTA的紫色管)，手机被注射肌肉进行IFNRNA分析。F.产生本发明包含BRES-1MFN-P表达盒的基因治疗运载体的产生方法可适合于cGMP制造。使用本文描述或本领域公知的方法，可制备出具有足够纯度、效价和稳定性的本发明BRES-1运载体，以进行临床前开发研究。可使用本文描述或本领域公知的方法，对本发明的基因治疗运载体、优选本发明的BRES-1运载体进行质粒骨架、衣壳(AAV作为递送运载体的情况下)、转基因表达产物(IFN-P)和诱导物(MFP)方面的全面表征。G.药理学可在动物^^莫型中证明与蛋白质递送的生物等效性。可在体内表征和优化运载体和诱导物或激活性分子(例如小分子诱导物MFP)的剂量/响应。可全面表征反复给予和转基因表达持续性。可用候选运载体进行免疫原性研究。H.药代动力学/安全性/毒理学使用被表达IFN-(3转基因的直接检测和IFN-|3生物标志的测量，可进行4支表达IFN-(3转基因的药代动力学研究。如果选择AAV-1作为候选运载体，可进行生物分布研究，以探究运载体DNA及其表达产物的命运。材料和方法A.小鼠急性EAE中鼠IFN-P蛋白的基于基因递送的功效给70只8周龄雌性SJL小鼠(JacksonLabs)皮下注射0.1ml(分配在尾根和上背)含150昭蛋白脂质蛋白质(PLP)139-151(于补充有200pg结核分枝杆菌(M.tuberculosis)H3了Ra的弗氏不完全佐剂(IFA)中)的注射液进行免疫。该乳液通过将含3mg/mlPLP的盐水与含4mg/ml磨碎结核分枝杆菌的IFA1:1混合获得。所有小鼠在免疫后立即腹膜内注射0.1ml百日咳毒素。所有小鼠在免疫后两天(研究的第3天)接受第二次腹膜内注射百曰咳毒素。自免疫日起直到研究结束，用IFN-P蛋白或其介质(20nMNaAc,pH5.5,150mMNaCl,5%丙二醇)处理的小鼠隔天一次皮下给予0.1ml。本研究所用的阳性对照是9mg/kgMesopram(ZK-117137)和2.5mg/kg泼尼松龙。两个对照所用剂量体积都是O.lml/注射，自免疫当天早上起直到研究结束每日两次腹膜内注射给予。实验组(n-10):1.介质2.10K单位鼠IFN-(33.20K单位鼠IFN-P4.30K单位鼠IFN-(35.IOOK单位鼠IFN匿P6.Mesopram，9mgZkgIP7.泼尼松龙，2.5mg/kglP小鼠急性EAE的临床评分根据以下评分体系每天评分小鼠:0=正常1=尾巴不举2=正位困难3=单侧或双侧后肢不完全瘫痪4=单侧或双侧后肢完全瘫痪，或者后肢能活动但拖曳5=双侧后^L完全瘫痪和前力支虛弱/瘫痪，垂死或死亡垂死小鼠处以安乐死。给显示临界临床症状的小鼠加0.5分。用100K单位IFN-P处理的小鼠与用介质处理的小鼠相比EAE临床分数显著降低(=0.0046)。用30K单位IFN-p处理的小鼠与用介质处理的小鼠相比临床分数也降低，不过该降低没有达到统计学显著性。本研究的阳性对照Mesopram和泼尼松龙也显著降低临床分数。参见实施例5和图13。B.小鼠急性EAE中鼠IFN-P的基于基因递送的功效给130只8周龄雌性SJL小鼠(JacksonLabs)皮下注射0.1ml(分配在尾根和上背)含150吗蛋白脂质蛋白质(PLP)139-1M(于补充有200將结核分枝杆菌H37Ra的弗氏不完全佐剂(IFA)中)的注射液进行免疫。该乳液通过将含3mg/mlPLP的盐水与含4mg/ml磨碎结核分枝杆菌的IFA1:1混合获得。所有小鼠在免疫后立即腹膜内注射0.1ml百日咳毒素。在第2天，质粒+电穿孔组的小鼠接受适当的肌肉内注射，然后立即进行电穿孔。质粒+PINC组的小鼠也接受适当的肌肉内注射。所有小鼠在免疫后两天(研究的第3天)接受第二次腹膜内注射O.lml百日咳毒素。在第5天，质粒+PINC组的小鼠接受与第2天相同的处理。自免疫曰起直到研究结束，用IFN-P蛋白或其介质(20nMNaAc,pH5.5,150mMNaCl,5%丙二醇)处理的小鼠隔天一次皮下给予0.1ml。本研究所用的阳性对照是9mg/kgMesopmm(ZK-117137)和2.5mg/kg泼尼松龙。两个对照所用剂量体积都是O.lml/注射，自免疫当天早上起直到研究结束每日两次腹膜内注射给予。本研究共有10组，每组13只小鼠。每组最后3只小鼠在研究的第6天进行割尾放血用于Mx1RNA分析。在第6天放血的这3只小鼠在研究的第13天进行心脏穿刺放血，用于来自PBMC的Mx1RNA分析，并收集被注射肌肉进行分析。实验组(n-13):1.PBS对照2.pNull+EP3.pmIFN-|3+EP4.pNull+PINC5.pmIFN-(3+PINC6.IFN-I3蛋白(100K单位)，皮下注射7.介质，皮下注射8.Mesopram，9mg/kg，^U莫内注射9.泼尼松龙，2.5mg/kg，腹膜内注射10.未处理200680025898EAE的临床评分根据以下评分体系每天评分小鼠0=正常1=尾巴不举2=正位困难3=单侧或双侧后力支不完全瘫痪4=单侧或双侧后肢完全瘫痪，或者后肢能活动但拖戈5=双侧后肢完全瘫痪和前肢虚弱/瘫痪，垂死或死亡垂死小鼠处以安乐死。给显示临界临床症状的小鼠加0,5分。用100K单位鼠IFN-卩蛋白处理的小鼠与用介质处理的小鼠相比，EAE临床分数显著降低&=0.045)。与pNull的基因递送+EP相比鼠mlFN-j3+EP的基因递送也显著降低临床分数^=0.0171)。用IFN-(3的PINC配方的基因递送与pNull和PINC相比没有在统计学上降低临床分数。EAE模型的阳性对照Mesopram和泼尼松龙显著降低临床分数。C.IFN-P的体内调节表达IFN15-GS5:BRES-1/IFN质粒的体内转染电穿孔到小鼠肌肉中的BRES-l/mIFN-(3质粒的米非司酮(MFP)调节鼠干扰素卩(mIFN-卩)表达的证明。实验没计可给正常的C57BI/6小鼠注射和电穿孔下表34和35所述的本发明BRES-1单一运载体和对照质粒DNA。表34<table>tableseeoriginaldocumentpage143</column></row><table>表35:各组(n-5/组)<table>tableseeoriginaldocumentpage144</column></row><table>可在3个时间点由小鼠中的生物标志和RNA水平测定mlFN-)3表达。在DNA注射后的第7天，组1、3和4可进行终点放血，组2可进行尾部放血，以测定与未注射的小鼠(组l)和接受空BRES-1运载体的小鼠(组2)相比，接受GS/mlFN-MFP的小鼠(组3)的未诱导背景mIFN-P表达和生物标志活性。CMV/mlFN(组4)充当阳性对照。组12可进行尾部放血，以测定SEAP表达的未诱导背景水平。组2、6、9、11和12的小鼠在DNA注射后的第7-10天用MFP处理。在第11天，组5-7小鼠可进行终点;改血，以测定与4秦受CMV/mlFN的小鼠(組7)相比接受RM/mlFN+MFP的小鼠(组6)的诱导mIFN表达和生物标志活性。还可测定接受RM/mlFN-MFP的小鼠(组5)的未诱导水平。组2(空BRES-1运载体)可进行终点放血，以测定MFP是否刺激生物标志响应。组8-10可进行尾部力t血，以测定生物标志活性在少量血液中是否可检测到，和确定这些小鼠的诱导时间点以与第18天的未诱导水平作比较。组11(CMV/mlFN+MFP)可进行终点;改血，以测定MFP是否影响mIFN表达或抑制生物标志响应。组12可进行尾部放血，以测定SEAP表达的诱导水平。组13作为SEAP表达的阴性对照。在第18天即最后一次MFP处理后8天，组8-10小鼠可进行终点》文血，以测定RM/mlFN-/+/-MFP组(组9)相比于从未接受MFP的RM/mlFN小鼠(组8)，其mlFN-(3RNA水平和生物标志活性是否已回复到基线。CMV/mlFN(组IO)再次充当阳性对照。组12可进行终点放血，以测定SEAP表达是否已回复到基线。D.试剂DNA溶液组2-11的每只小鼠接受150plPBS中的250昭质粒DNA。组l2的每只小鼠可接受l50PBS中的25jug质粒DNA(见下表36)。表36:制备用于每组5只小鼠加额外小鼠的DNA溶液<table>tableseeoriginaldocumentpage145</column></row><table>E.动物处理方案1)DNA递送(组2-12):在第0天可给成年雄性CWBI/6小鼠(每组5只)每鼠双侧注射150plPBS中的250昭(組2-ll)或25昭(组12)质粒DNA。每个后腿胫骨肌注射DNA溶液25pl，腓肠肌注射50pl，然后用卡钳进行电穿孔(200V/cm下8个脉冲，1Hz,20msec/脉冲)。2)MFP处理(组2、6、9、11和12):可如下表37所示在注射后笫7-10天给组2、6、9、11和12的小鼠经口灌服给予MFP0.33mg/kg(1000.083mg/ml，芝麻油中，新鲜制备)。组12小鼠可在第7天MFP处理前进行力丈血。表37<table>tableseeoriginaldocumentpage146</column></row><table>通过用Nhel和Notl消化pGER75(CMV/SEAP),然后将携带SEAP基因的所得片断插入pGTl的Spel和Notl位点之间，构建pGT31。3)血液和肌肉的收获(组1-11):如上表6所示在DNA注射后的适当日期可给小鼠进行尾部放血或终点放血。当小鼠进行终点放血时，可收集^皮注射肌肉。血液可在室温下将血液收集在Microtainer管(含EDTA)中，然后可分离并收集PBMC。剩余的血浆可保藏在-20。C下用于细胞因子测定。肌肉可收获两腿的被注射肌肉，集中在一起，切成一边不大于5mm的片块。可将大约四分之一的切碎肌肉》丈入于2ml管中的1.5mlRNA-Later溶液中。剩余的肌肉可保藏在-70。C下。可从RNA-Later溶液中的肌肉样品提取DNA和RNA。可将样品在4°C下保藏至少24小时，然后如果样品可以保藏超过5天的话将它们转移到-20。C。血液(组12和13):组12小鼠可在第7天和第11天进行尾部放血和在第1S天进行终点放血，收集到Microtainer管(无抗凝剂)中。小鼠可在第7天MFP处理前进行》欠血。组13小鼠可在第11天进行终点it血，收集到黄色Microtainer管(无抗凝剂)中。4)终点分对斤/测定程序生物标志测定的结果使用BRES-l-mlFN-j3(pGT26)在第7天MFP不存在下，MxlRNA和两种细胞因子(IP-IO和JE)不显示或极少显示活性。在第11天MFP存在下，所有生物标志被强烈诱导至高于CMV-mIFN-P所有的水平。在第18天MFP不存在下，细胞因子水平回复到基线，MxlRNA几乎降低到基线。参见图18和19。PBMC的MxlRNA:可从分离的PBMC制备RNA,通过TaqMan测定MxlRNA。血浆的JE和IP-10蛋白可用ELISA测定血浆的JE和IP-10细胞因子。肌肉的mIFN-pRNA:可从被注射肌肉制备RNA,通过TaqMan测定mIFN-卩RNA。肌肉的质粒DNA:可从被注射肌肉制备DNA，通过TaqMan测定质粒DNA。可将对CMV启动子特异的引物和探针用于组4、7、10和11的DNA。可将对调节性蛋白质的GAL-4DNA结合域特异性的引物和探针用于组2、3、5、6、8和9。血清的SEAP蛋白可用组13小鼠的血清作为稀释液，通过化学发光活性测定法测定血清的SEAP表达。F.质粒运栽体的构建pGER101(pgWiz/mlFN):从质粒运载体pbSER189(图20A)PCR扩增小鼠IFN-13(mIFN-P)基因，其中mIFN信号序列置于5'引物上，Sail和NotI限制酶位点加在5'和3'末端。将片断用Sail和NotI消化，插入到质粒运载体pgWIZ(图20B)的Sail和NotI位点中，产生质粒运载体pGER101(图20C)。pGER125(pgWiz/hlFN):从质粒运载体pbSER178PCR扩增人IFN-卩(hIFN-卩)基因，其中hIFN信号序列置于5'引物上，Sail和NotI限制酶位点加在5'和3'末端。将片断用Sail和NotI消化，插入到质粒运载体pgWIZ的Sail和NotI位点中，产生质粒运载体pGER125(图21)。pGene/V5-HisA:质粒运载体购自Invitrogen,含有位于最小启动子(ElbTATA)上游的6个GAL-4结合位点、为衍自CMV的UT12的5'非翻译区(UTR)、合成内含子8(IVS8)、多克隆位点(MCS)和牛生长激素(bGH)poly(A)位点。在MCS插入的基因可通过调节性分子进行调节。例如，在MCS插入的基因可在激活形式的修饰孕酮受体(例如包含SEQIDNO:22氨基酸序列或由SEQIDNO:21核苷酸序列编码)结合GAL-4位点时(图22)，由该激活的调节性分子诱导。pGene-mIFN(pGER127):将质粒运载体pGER101用Sail消化，加入Klenow,连接到HindIII接头，用HindIII和NotI消化。将mlFN國J3基因片断插入到质粒运载体pGene/V5-HisA的HindIII和NotI位点中，产生质粒运载体pGene-mIFN(图23)。pGene-hlFN(pGER129):将质粒运载体pGER125用Sail消化，加入Klenow,连接到HindIII接头，用HindIII和NotI消化。将mlFN-J3基因片断插入到质粒运载体pGene/V5-HisA的HindIII和NotI位点中，产生质粒运载体pGene-MFN(pGER129)(图24)。pSwitch:这个质粒运载体购自Invitrogen,编码修饰的孕酮受体(例如包含SEQIDNO:22氨基酸序列或由SEQIDNO:21核苷酸序列编码)，该受体基因连接到可自诱导的调节性分子响应性启动子(4XGAL-4DNA结合位点和胸苷激酶(tk)启动子)，该启动子位于4汙自CMV的5'非翻译区12(UT12)和合成内含子8(IVS8)的上游，驱动调节性分子蛋白质的基因表达(图25)。pGS1694:质粒运载体pGS1694由Valentis提供，含有鸡骨银肌肌动蛋白启动子(skactinpro)、5'非翻译区12(UT12)和合成内含子8(IVS8)，其驱动编码修饰孕酮受体(例如包含SEQIDNO:22氨基酸序列或由SEQIDNO:21核香酸序列编码)的基因的表达(图26)。pLC1674:质粒运载体pLCl674由Valentis提供，含有"调节性分子响应性"启动子(即能响应激活形式的修饰孕酮受体(例如包含SEQIDNO:22氨基酸序列或由SEQIDNO:21核香酸序列编码)的启动子)、5'非翻译区12(UT12)和合成内含子8(IVS8)，其驱动编码萤火虫荧光素酶基因(luc)的基因的表达(图27)。G.用以产生病毒的运载体的构建用以产生病毒的运载体(例如穿梭质粒)和产生病毒(例如AAV-1病毒)的方法是本领域公知的，可用来产生本发明的病毒。在一些实施方案中，本发明的病毒从穿梭质粒(例如参见表38)产生，并用于在对象细胞中递送和表达本发明的分子(例如由该质粒中含有的序列编码的治疗性分子和/或调节性分子)以治疗疾病。pGT2/mGMCSF和pGT/hGMCSF:如下构建穿4发质粒pGT2/mGMCSF和pGT/hGMCSF(图28)。用Agel和Nhel消化pORF9-mGMCSF(图30)，从该质粒运载体切除编码鼠GMCSF(mGM-CSF)的片断。然后将这个片断补平。类似地，用SgrAI和NheI消化pORF-hGMCSF(图30),从质粒运载体切除编码人GMCSF(hGM-CSF)的片断。然后将这个片断补平。将切除并补平的编码mGMCSF或hGMCSF的片断插入到pGT2质粒运载体的EcoRV位点中。然后通过限制酶切消化作图检查插入物的方向。所得的穿4炎质粒命名为pGT2/mGMCSF(编码鼠GMCSF)和pGT2/hGMCSF(编码人GMCSF)(图28)。pZac2.1-RM-hGMCSF和pZac2.1-RM-mGMCSF:如下构建穿梭质粒pZac2.1-RM曙hGMCSF和pZac2.:i-RM-mGMCSF(图29A)。用Agel和Nhel消化质粒pORF9-mGMCSF(图30),从中切除编码鼠GMCSF的片断，将该片断补平，将所得的补平片断插入到质粒pGT2的EcoRV位点中，产生质粒pGT2/mGMCSF。类似地，用SgrAI和Nhel消化质粒pORF-hGMCSF(图30)，从中切除编码人GMCSF的片断，将该片断补平，将所得的补平片断插入到质粒pGT2的EcoRV位点中，产生质粒pGT2/hGMCSF。通过限制酶切消化作图检查和核实所得质粒运载体中的插入物。然后用Fsel和Srfl消化质粒运载体pGT2/hGMCSF和pGT2/mGMCSF。然后将这些BRES-1-GMCSF片断进行补平。用Bgl2和Clal消化质粒运载体pZac2.1并补平。将补平的BRES-1-GMCSF片断各自连接到补平的pZac2.1运载体。通过限制酶切消化验证阳性克隆。所得的穿梭质粒命名为pZac2.1-RM-hGMCSF(编码人GMCSF)和pZac2.1-RM-mGMCSF(编码鼠GMCSF)(图29A)。pZac2.1-CMV-mGMCSF和pZac2.1画CMV-hGMCSF:如下构建pZac2.1画CMV-mGMCSF和pZac2.1-CMV画hGMCSF(图29B)。将编码人GMCSF的片断和编码鼠GMCSF的片断各自单独克隆到质粒运载体pGENE/V5HisA(Invitrogen)中，分别产生质粒pGT723-GENE/hGMCSF(编码人GMCSF)和pGT724-GENE/mGMCSF(编码鼠GMCSF)。用KpnI和XbaI消化质粒pGT724/mGMCSF,从中切除编码小鼠GMCSF的片断，用Kpnl和Xbal消化质粒pGT723/hGMCSF，从中切除编码人GMCSF的片断。将所得的片断各自单独插入到已用Kpnl和Xbal消化和用牛碱性磷酸酶(CIP)处理的运载体pZac2.1的Kpnl/Xbal位点。所得的穿梭质粒命名为pGT713(或pZac2.1-CMV-hGMCSF，编码人GMCSF)和pGT714(或pZac2.1-CMV-mGMCSF,编码鼠GMCSF)(图29B)。另外的穿梭质粒按下表38的描述构建。表38<table>tableseeoriginaldocumentpage151</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage152</column></row><table>编码有效连接到CMV启动子的SEAP的质粒用pSEAP2DNA(Clonetech)作为模板PCR扩增编码SEAP的片断，将扩增的片断插入到运载体phRL-CMV(Promega)的Nhel-Xbal位点，产生出质粒pGER75。在上表38中，对于AAV-l-BRES-1构建物，在MCS修饰pZAC2.1穿梭质粒产生穿梭质粒pGT53,以使含有BRES-1序列的片断能够插入到这个运载体中。为将含有BRES-1序列的片断插入到pGT53中，用限制酶消化适当的pGT质粒(如上表38所述)，导致产生含有编码各IFN的完整BRES-1序列的片断，并将此片断插入到pGT53的相容位点中。用AAV-1病毒的标准产生方法将所得的AAV-1穿梭质粒用来按本文所述制备AAV-1病毒制品。对于含有CMV启动子的穿梭质粒，通过限制酶消化从适当的质粒运载体分离编码各IFN基因的片断，并将此片断插入到上表8所述的pZAC2.1质粒运载体的相容限制位点处。对于BRES-1hGMCSF穿梭质粒，将编码hGMCSF的pORF9-hGMCSF(Invitrogen)的SrgAI/Nhel片断进行末端补平，插入到pGT2的EcoRV位点，产生pGT711。将含有完整BRES-1序列的pGT712的Fsel/Srfl片断进行末端补平，插入到pZAC2.1中，产生pGT715(图31A)。对于BRES-1mGMCSF穿梭质粒，将编码mGMCSF的pORF9-mGMCSF(Invitrogen)的Agel/Nhel进行末端补平，插入到pGT2的EcoRV位点，产生pGT712。将含有完整BRES-1序列的pGT712的Fsel/Srfl片断进行末端补平，插入到pZAC2.1中，产生pGT716(图31B)。将来自各pORF9质粒(Invitrogen)的小鼠和人GMCSF基因通过质粒pGENE/V5HisA(Invitrogen)进行克隆，使得它们各自能用Kpnl/Xbal切除并克隆到pZAC2.1中。本领域技术人员会容易认识到，本发明的组合物和方法非常适合于实现和获得本文所述的及本发明所固有的目标、目的和优点。本领域技术人员会想到本发明组合物和方法及其它用途的变化方案，这种变化一支设想和涵括在描述和要求保护的本文内。权利要求1.一种用于治疗疾病的调节表达系统，所述调节表达系统包含至少一种运载体，其中所述运载体包含第一表达盒，其包含i)供编码具有治疗活性的治疗性分子的第一核酸序列插入的克隆位点，和ii)当所述第一核酸序列在所述第一克隆位点插入时有效连接到其上的第一启动子和第一poly(A)位点，其中所述治疗性分子在对象细胞中表达，且所述治疗性分子表达或活性是方向依赖性的，在调节性分子的存在下被调节。2.权利要求1的调节表达系统，其中所述运载体还包含第二表达盒，所述第二表达盒包含i)供编码所述调节性分子的第二核酸序列插入的第二克隆位点，和ii)当所述第二核酸序列在所述第二克隆位点插入时有效连接到其上的第二启动子和第二poly(A)位点，其中所述调节性分子在所述细胞中表达。3.权利要求l的调节表达系统，所述调节表达系统还包含在所述第一克隆位点插入的编码所述治疗性分子的第一核酸序列。4.权利要求3的调节表达系统，所述调节表达系统还包含在所述第一克隆位点插入的编码所述治疗性分子的第一核酸序列，和在所述第二克隆位点插入的编码所述调节性分子的第二核酸序列。5.—种用于治疗疾病的调节表达系统，所述系统包含至少一种运载体，所述运载体包含A.第一表达盒，其包含i)编码具有治疗活性的治疗性分子的第一核酸序列，和ii)有效连接到所述第一核酸序列的第一启动子和第一poly(A)位点，其中所述治疗性分子在对象细胞中表达，且所述治疗性分子表达或活性是剂量依赖性的，在调节性分子的存在下^^调节；和B.第二表达盒，其包含i)编码所述调节性分子的第二核酸序列，和ii)有效连接到所述第二核酸序列的第二启动子和第二poly(A)位点。6.—种用于治疗疾病的调节表达系统，所述系统包含至少一种运载体，所述运载体包含A.第一表达盒，其包含i)编码具有治疗活性的治疗性分子的第一核酸序列，和ii)有效连接到所述第一核酸序列的第一启动子和第一poly(A)位点，其中所述治疗性分子在对象细胞中表达，且所述治疗性分子表达或活性是剂量依赖性的，在调节性分子的存在下被调节；B.第二表达盒，其包含i)编码所述调节性分子的第二核酸序列，和ii)有效连接到所述第二核酸序列的第二启动子和第二poly(A)位点，其中所述调节性分子在所述细胞中表达，并在激活性分子的存在下被激活，从而调节所述治疗性分子的表达或活性。7.—种用于治疗疾病的调节表达系统，所述系统包含至少一种运载体，所述运载体包含A.第一表达盒，其包含i)编码具有治疗活性的治疗性分子的第一核酸序列，和ii)有效连接到所述第一核酸序列的第一启动子和第一poly(A)位点，其中所述治疗性分子在对象细胞中表达，且所述治疗性分子表达或活性是剂量依赖性的，在激活的调节性分子的存在下被诱导；B.第二表达盒，其包含i)编码所述调节性分子的第二核酸序列，和ii)有效连接到所述第二核酸序列的第二启动子和第二poly(A)位点，其中所述调节性分子在所述细胞中表达，并在激活性分子的存在下被激活，从而诱导所述治疗性分子的表达或活性。8.权利要求7的调节表达系统，其中所述调节表达系统还包含与所迷运载体分开给予的激活性分子。9.权利要求5的调节表达系统，其中所述治疗性分子的表达或活性在所述调节性分子的存在下被诱导。10.权利要求5的调节表达系统，其中所述治疗性分子的表达或活性在所述调节性分子的存在下被阻遏。11.权利要求5的调节表达系统，其中所述治疗性分子的表达或活性在所述调节性分子的存在下被增加。12.权利要求5的调节表达系统，其中所述调节性分子被激活，从而调节所述治疗性分子的表达或活性。13.权利要求12的调节表达系统，其中所述调节性分子在激活性分子存在下被激活。14.权利要求12的调节表达系统，其中所述调节性分子因其构象变4匕而一皮;敫活。15.权利要求12的调节表达系统，其中所述调节性分子因其修饰而一皮-敫活。16.权利要求13的调节表达系统，所述调节表达系统还包含激活性分子。17.权利要求16的调节表达系统，其中所述激活性分子是天然分子或其变体。18.权利要求16的调节表达系统，其中所述激活性分子是修饰的分子。19.权利要求16的调节表达系统，其中所述激活性分子是合成分子。20.权利要求16的调节表达系统，其中所述激活性分子是化学化合物。21.权利要求20的调节表达系统，其中化学化合物是抗孕激素。22.权利要求21的调节表达系统，其中抗孕激素是米非司酮。23.权利要求5的调节表达系统，其中所述调节性分子的表达是组成型表达或瞬时表达。24.权利要求23的调节表达系统，其中所述调节性分子的表达是组成型表达。25.权利要求5的调节表达系统，其中所述调节性分子的表达被调节。26.权利要求25的调节表达系统，其中所述第二启动子是被调节的启动子。27.权利要求5的调节表达系统，其中所述第二启动子是组织特异性启动子。28.权利要求27的调节表达系统，其中所述笫二启动子是肌肉特异性启动子。29.权利要求28的调节表达系统，其中所述第二启动子是肌动蛋白启动子。30.权利要求9的调节表达系统，其中所述调节性分子结合所述第一启动子，从而诱导所述治疗性分子的表达或活性。31.权利要求9的调节表达系统，其中所述调节性分子被激活，从而结合所述第一启动子和诱导所述治疗性分子的表达或活性。32.权利要求5的调节表达系统，其中所述调节性分子包含反式激活域。33.权利要求32的调节表达系统，其中所述反式激活域是VP16或p65反式激活域。34.权利要求5的调节表达系统，其中所述调节性分子包含配体结合域(LBD)。35.权利要求34的调节表达系统，其中所述调节性分子包含配体结合域(LBD),且所述激活性分子结合所述LBD，从而激活所述调节性分子。36.权利要求5的调节表达系统，其中所述调节性分子包含DNA结合域(DBD)。37.权利要求36的调节表达系统，其中所述DNA结合域(DBD)包括GAL-4DBD。38.权利要求5的调节表达系统，其中所述第二表达盒还包含有效连接到所述第二核酸序列的第二功能序列。39.权利要求5的调节表达系统，其中所述第二poly(A)位点是猿猴病毒40(SV40)poly(A)位点。40.权利要求5的调节表达系统，其中所述调节性分子是天然分子或其变体。41.权利要求5的调节表达系统，其中所述调节性分子是修饰的分子。42.权利要求41的调节表达系统，其中所述调节性分子是蛋白质。43.权利要求42的调节表达系统，其中所述蛋白质是人源化蛋白质。44.权利要求42的调节表达系统，其中所述蛋白质是人蛋白质或其变体。45.权利要求44的调节表达系统，其中所述蛋白质是转录激活剂。46.权利要求45的调节表达系统，其中所述转录激活剂是核类固醇受体。47.权利要求45的调节表达系统，其中所述转录激活剂是修饰的核类固醇受体。48.权利要求47的调节表达系统，其中所述修饰的核类固醇受体是修饰的孕酮受体。49.权利要求5的调节表达系统，其中所述治疗性分子的表达是组成型表达或瞬时表达。50.权利要求5的调节表达系统，其中所述第一启动子是被调节的启动子。51.权利要求5的调节表达系统，其中所述第一启动子是可诱导启动子。52.权利要求5的调节表达系统，其中所述第一启动子是组织特异性启动子。53.权利要求5的调节表达系统，其中所述第一启动子选自以下启动子肌肉肌酸激酶(MCK)启动子、低氧反应元件(HRE)启动子、内皮白细胞粘附分子(ELAM)启动子、CMV/肌动蛋白嵌合启动子、细胞周期蛋白A启动子和cdc6启动子。54.权利要求5的调节表达系统，其中所述第一启动子是PolII启动子。55.权利要求54的调节表达系统，其中所述PolII启动子是ElB启动子。56.权利要求36的调节表达系统，其中所述第一启动子包含所述调节性分子的所述DNA结合i或的结合位点。57.权利要求56的调节表达系统，其中所述结合位点包含至少一个GAL-4结合位点。58.权利要求57的调节表达系统，其中所述结合位点包含所述GAL-4结合位点的多聚体。59.权利要求58的调节表达系统，其中所述结合位点包含3-18个GAL-4结合位点。60.权利要求5的调节表达系统，其中所述第一poly(A)位点是人生长激素(hGH)poly(A)位点。61.权利要求5的调节表达系统，其中所述第一表达盒还包含有效连接到所述第一核酸序列的第一功能序列。62.权利要求61的调节表达系统，其中所述第一功能序列编码5'非翻译区和/或内含子。63.权利要求62的调节表达系统，其中所述第一功能序列编码包含UT12的5'非翻译区。64.权利要求62的调节表达系统，其中所述第一功能序列编码包含IVS8的内含子。65.权利要求5的调节表达系统，其中所述治疗性分子是天然分子的变体。66.权利要求5的调节表达系统，其中所述治疗性分子是修饰的分子。67.权利要求5的调节表达系统，其中所述治疗性分子是合成或重组分子。68.权利要求5的调节表达系统，其中所述治疗性分子是蛋白质。69.权利要求68的调节表达系统，其中所述治疗性分子是人蛋白质或其变体。70.权利要求69的调节表达系统，其中所述治疗性分子选自GMCSF、Leukine⑧、IFN-a和IFN-(3或者所述蛋白质的变体。71.权利要求70的调节表达系统，其中所述治疗性分子是GMCSF。72.权利要求68的调节表达系统，其中所述治疗性分子是单克隆抗体。73.权利要求72的调节表达系统，其中所述单克隆抗体是CAMPAT風74.权利要求3的调节表达系统，其中所述运载体是质粒运载体。75.权利要求74的调节表达系统，其中所述质粒运载体选自pGTl、pGT2、pGT3、pGT4、pGTll、pGT12、pGT13和pGT14。76.权利要求5的调节表达系统，其中所述运载体是质粒运载体。77.权利要求76的调节表达系统，其中所述质粒运栽体选自pGT23、pGT24、pGT25、pGT26、pGT27、pGT28、pGT29和pGT30。78.权利要求3的调节表达系统，其中所述运载体是穿梭质粒。79.权利要求5的调节表达系统，其中所述运载体是穿梭质粒。80.权利要求79的调节表达系统，其中所述穿梭质粒是腺伴随病毒(AAV)穿梭质粒。81.权利要求80的调节表达系统，其中所述AAV是AAV血清型1(AAV-1)。82.权利要求81的调节表达系统，其中所述AAV-1穿梭质粒选自以下AAV-1运载体pGT53、pGT54、pGT57、pGT58、pGT715和pGT716。83.权利要求13的调节表达系统，其中所述激活性分子口服给予，从而激活所述调节性分子。84.权利要求5的调节表达系统，其中所述运载体通过注射给予。85.权利要求5的调节表达系统，其中所述运载体通过使所述细胞在体外或先体外后体内与所述运载体接触来给予。86.权利要求85的调节表达系统，其中所述接触在体内进行或通过注射进行。87.权利要求84的调节表达系统，其中所述注射是肌肉内注射。88.权利要求87的调节表达系统，其中所述注射是骨骼肌细胞的肌肉内注射。89.权利要求85的调节表达系统，其中所述接触先体外后体内进行或通过电穿孔进行。90.—种用于调节表达系统的运载体，其中所述运载体是pGTl、pGT2、pGT3、pGT4、pGTll、pGT12、pGT13或pGT14。91.一种用于调节表达系统的运载体，其中所述运载体是pGT23、pGT24、pGT25或pGT26。92.—种用于调节表达系统的运载体，其中所述运栽体是pGT27、pGT28、pGT29或pGT30。93.—种用于调节表达系统的运载体，其中所述运载体是pGT53、pGT54、pGT57、pGT58、pGT715和pGT716。94.一种用于调节表达系统的运载体，其中所述运载体是pGT53。95.—种使用权利要求5-89中任一项的调节表达系统在对象细胞中调节治疗性分子表达的方法，所述方法包括使所述对象的细胞与所述表达系统接触，使得所迷治疗性分子在所述细胞中表达，且在所调节。96.—种使用权利要求5-89中任一项的调节表达系统将治疗性分子给予对象细胞的方法，所述方法包括使所述对象的细胞与所述表达系统接触，使得所述治疗性分子在所述细胞中表达，且在所述细胞97.—种使用权利要求5-89中任一项的调节表达系统将治疗性分子递送到对象细胞的方法，所述方法包括使所述对象的细胞与所述表达系统接触，使得所述治疗性分子在所述细胞中表达，且在所述细98.—种使用权利要求5-89中任一项的调节表达系统在对象细胞中体内或先体外后体内表达治疗性分子的方法，所述方法包括使所迷对象的细胞与所述表达系统-接触，使得所述治疗性分子在所述细胞中表达，且在所述细胞中所述治疗性分子的表达或活性在所述调节性分子存在下被调节。99.一种药物组合物，所述药物组合物包含至少一种权利要求5-89中任一项的表达系统。100.—种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求91-94中任一项的运载体。101.—种将治疗性分子递送到对象细胞的药盒，其中所述药盒包含至少一种权利要求1-89中4壬一项的调节表达系统。102.—种将治疗性分子递送到对象细胞的药盒，其中所述药盒包含至少一种权利要求90的运载体。103.—种将治疗性分子递送到对象细胞的药盒，其中所述药盒包含至少一种权利要求91-94中4壬一项的运载体。全文摘要本发明提供改进的表达系统，其用于对象细胞中的受编码蛋白质或核酸治疗性分子的受调节表达，以治疗疾病。具体地说，本发明提供改进的调节基因表达系统和药物组合物以及它们在治疗疾病中的用途。文档编号A61K48/00GK101238214SQ200680025898公开日2008年8月6日申请日期2006年5月18日优先权日2005年5月19日发明者M·鲍宗,P·克雷特施默,P·西曼斯基,R·N·哈金斯,T·赫米斯顿申请人:拜尔先灵制药股份公司