专利名称：：核酸向组织细胞中的电转移的制作方法核酸向组织细胞中的电转移本发明涉及核酸经电介导的基因转移进入组织细胞、特别是肌肉或肿瘤细胞中。电介导的基因转移也称DNA电转移或者电基因疗法，已经得到密切关注，因为这是体内非病毒基因转移的最有效方法之一(AndreandMir，2004)。所述方法已经显示有效地将质粒DNA电转移进多种组织中肌肉(AiharaandMiyazaki，1998;Miretal"1998a;Miretal.,1999)，肝(Helleretal.,1996;Suzukietal.，1998),皮肤(Titomirovetal.，1991;Zhangetal.，1996)，月中瘤(Helleretal.，2000;Wellsetal"2000;HellerandCoppola,2002)，小鼠睾丸(Muramatsuetal.，1997;Muramatsuetal.，1998)等组织中(AndreandMir,2004)。电脉冲介导DNA转移进靶细胞的机制还未十分明了。然而，普遍认为为了改善DNA转移进组织中，该组织中细胞必须是可通透的。这种通透可以使用简便的短方波电脉冲(在lOOjis范围内)而实现(Miretal.,1991b;Gehletal.，1999;Miklavcicetal.,2000)。这种脉冲己经在称作"抗肿瘤电化学疗法"的治疗中广泛用于局部输送非通透性抗癌药物(如博来霉素或顺铂(cisplatin))(Miretal.,1991a;Glassetal.，1997;Sersaetal"1998;Miretal"1998b;Rodriguezetal"2002)。事实上，在体外或体内为肿瘤输送例如8次1300V/cm和lOO^is脉冲足以诱导细胞膜瞬时重排，使得非通透性抗癌分子如博来霉素通过扩散进入细胞并且充分发挥其胞毒性活性(Poddevinetal.，1991;Miretal.，1991b;Gehletal.，1998)。这些短通透性电脉冲也已经显示增加质粒DNA向一些组织的转移(Hdleretal.,1996;Helleretal.,2000)。然而，另一种类型的方波电脉冲被用于肌肉(AiharaandMiyazaki,1998;Miretal.，1999)、肿瘤(Rolsetal.,1998)、肝(Suzukietal.，1998)及一些其它组织(AndreandMir,2004)，并发现其对于DNA电转移更有效(Miretal.，1999;Helleretal，，2000)。这些脉冲通常是较低电压但较长持续时间(在几十毫秒范围内)(AiharaandMiyazaki，1998;Rolsetal"1998;Miretal"1999;Bettanetal.，2000;Matsumotoetal.，2001)。推测这种类型的脉冲通过诱导两种独特的效应而介导DNA转移进细胞中，所述独特效应包括细胞透化(如短脉冲)和在输送电场期间DNA电泳迁移(Klenchinetal.,1991;Sukharevetal"1992;Neumannetal"1996;Miretal"1999;Golzioetal.，2002)。有效的电转移进肌细胞中已经在WO-A-99/01158中使用一或多次(直至100,000次)1-800伏特/cm的单极电脉冲加以描述，并且在WO-A-98/43702中使用5-200伏特/cm电流刺激加以描述，其中所述电流可以是2-30,000方波双极脉冲形式。电脉冲对于体内DNA电转移的双重作用通过如下方式而证实，即使用由高压短脉冲(或称HV;例如800V/cm和lOOps)和随后的低压长脉冲(或称LV;例如80V/cm和100ms)组成的电脉冲组合而证实(Bureauetal.，2000;Satkauskasetal.，2002)。这项研究显示这些HV和LV脉冲可以在HV与LV之间由不同的延迟(lag)隔开，而不明显丧失转染效力。这些延迟的范围在对于1次HV和1次LV处理而言为直至300s，对于1次HV和4次LV组合而言为直至3000s(Satkauskasetal.，2002)。本申请人发现通过使用HV与LV脉冲的特异性组合仍可以改善电转移效力。出于相似目的对于肿瘤和/或其它组织例如肝的转染也是感兴趣的。对于HV和/或LV的优选电场强度(V/cm)根据组织而改变。本发明的第一个目的是核酸在制备用以在体内转移进组织细胞中的人用或兽用药物中的应用，其中所述药物与组织细胞接触，并如下对所述组织进行电刺激-首先用至少一次200至2000伏特/cm高压(HV)场强脉冲刺激，-其次用单次的50至200伏特/cm低压(LV)场强脉冲刺激，持续300至2000ms。如本文所用，术语"组织"是指动物的肿瘤或非肿瘤组织，所述动物例如人或非人哺乳动物如啮齿动物(例如小鼠、兔或大鼠)、狗、猫或灵长类动物。非肿瘤组织可以是肌肉特别是骨骼肌或肝。根据本发明的一个实施方案，所述组织是肌肉。对于这种但非限于这种组织而言，优选所述组织首先用至少一次200至1400伏特/cm的HV场强脉冲进行电刺激。根据本发明的另一个实施方案，所述组织是肿瘤组织。对于这种但非限于这种组织而言，优选所述组织首先用至少一次400至2000伏特/cm的HV场强脉冲进行电刺激。所述药物与组织细胞优选在应用单次的LV脉冲处理之前及更优选在应用HV脉冲之前接触。注射核酸与电脉冲之间的时间、特别是注射与HV脉冲之间的时间不是关键的。典型地，所述药物与所述组织细胞接触几秒钟至10分钟，例如接触30秒至5分钟。在HV脉冲之前5-10分钟的间隔也是可以接受的。可以通过直接肌内注射、全身给予(例如经静脉内或动脉内途径给予)或者通过局部或皮下给予使所述药物与接触。在本发明的一个优选方面，特别是对于肌肉，单次的LV脉冲的场强为50至140伏特/cm之间，特别是80至120伏特/cm之间，优选在90至110伏特/cm之间，典型是大约100伏特/cm。在本发明的一个优选方面，特别是对于肿瘤组织，单次的LV脉冲的场强为100至200伏特/cm之间，优选在120至160伏特/cm之间，典型是大约140伏特/cm。在本发明的另一优选方面，对于肌肉和肿瘤组织而言，单次的LV脉冲的持续时间为300至800ms，优选350至600ms，典型为大约400mso所述LV脉冲与HV脉冲可以是相同极性。然而，根据本发明一个优选方面，所述LV脉冲与HV脉冲的极性相反。优选地，所述单次的LV脉冲是平方脉冲(squaredpulse)。其也可以是梯形或者不连续的。不受理论的限制，据认为本发明的单次LV脉冲至少改善了核酸电泳迁移。在本文中揭示可以有多次HV脉冲，即2-10次HV脉冲。在这种情况中更便利的是具有相同的HV脉冲。然而，已经证实了具有本文揭示特征的单次HV脉冲足以使细胞膜通透。因此，在优选的实施方案中，应用单次的HV脉冲。在本发明的另一优选方面中，对于但非限于肌肉而言，HV脉冲的场强为300至1300、优选400至1200伏特/cm，更优选为500-900、更优选为600-800伏特/cm，典型是大约700伏特/cm。在本发明的另一优选方面中，对于但非限于肿瘤组织而言，HV脉冲的场强为600至2000、优选800至1600伏特/cm，更优选为900-1200、典型是大约1000伏特/cm。在本发明的另一优选方面中，对于肌肉或肿瘤组织而言，HV脉冲的持续时间为10-1000(^s，优选50-200|iis，典型为大约lOOjas。在单次HV脉冲的情况中，优选方波脉冲。在多次HV脉冲的情况中，应用单极或双极脉冲，或者具有不同方向和/或极性的脉冲，优选方波类型脉冲。所述HV和LV脉冲可以由延迟隔开，这种延迟可优选为300ms至3000s，优选500ms至1000s，典型为大约1000ms。在一个具体实施方案中，没有延迟或者仅为很短的延迟，即低于300ms，所述HV脉冲的场强为300至1000伏特/cm，优选为400至800伏特/cm。核酸可用于基因治疗中，通过表达感兴趣的分子或者通过调节或阻断宿主内的基因而具有治疗作用。优选地，本发明转染的目的是-使得肌肉成为具有直接或间接治疗作用包括免疫刺激或疫苗作用的分子的分泌器官，-纠正组织细胞、特别是肌细胞的功能失调。在一个优选方面，核酸包含能在体内在转染的组织细胞中表达一或多种治疗活性分子、优选感兴趣的一或多种蛋白质的核酸序列。这种活性分子可以自身是治疗活性的，或者通过所述分子的代谢物而间接具有活性。其可以在组织自身和/或机体内所述组织外另一部位发挥作用，例如如果所述表达的分子具有抗肿瘤活性，则其对位于机体内任何部位的肿瘤均具有活性。感兴趣的治疗分子的例子可以是WO-A-99/01158中列出的那些。本领域技术人员意识到对于根据本发明可以表达的分子的种类无限制，因此本领域技术人员能使用己知编码序列的感兴趣的分子以及选择最佳的构建或表达载体常规实验而进行本发明。可以使用任何核酸，例如质粒DNA、线性DNA、反义DNA和RNA。在一个优选的实施方案中，核酸是本领域熟知的DNA表达载体。通常地，表达载体含有与编码感兴趣的蛋白质的DNA序列可操纵地连接的启动子，随后是终止信号如聚腺苷酸化信号。本领域技术人员意识到本发明的应用涵盖了其中能在体内表达不同活性的分子的两或多种核酸用于制备药物的情况。优选对核酸进行选择以在治疗疾病中发挥补充和/或协同作用。本发明还涵盖了能在体内表达至少两种活性分子的至少一种核酸的应用，所述活性分子优选在治疗疾病中起补充和/或协同作用。在这种情况中，编码不同分子的核苷酸序列可以在相同启动子或不同启动子的控制下。根据本发明的不同方面，所述核酸表达一或多种(至少两种)选择的活性分子，以便-所述药物有效降低、抑制或退行(regressing)肿瘤血管发生，-所述药物降低或抑制肿瘤生长，-所述药物抑制肿瘤转移，-所述药物是抗癌的。本发明的一个实施方案是使用包含ADAM-15基因的重组人Desintegrin结构域(RDD基因)的构建体转染组织细胞特别是肌细胞。这个基因、其序列及有用构建体(例如表达载体pBi-RDD)已经在本领域技术人员可查阅的文章Trochon-JosephV.etal.2004中充分描述。RDD基因和蛋白质序列分别示于SEQIDNo.l和SEQIDN0.2。RDD可作为抗癌剂，可以降低或抑制肿瘤生长，和/或作为抗血管发生和/或抗肿瘤转移剂。本发明的一个特异方面因此是编码RDD蛋白质或其有效片段(有效是指由所述片段编码的蛋白质与完整的RDD多肽引起相同或相似的治疗活性)的核酸在制备用于在体内转移进组织细胞中并在此产生具有治疗活性的RDD多肽或其片段的药物中的应用，其中所述药物被注射进组织中，并对所述组织如下进行电刺激-首先用至少一次200至2000伏特/cm高压(HV)场强脉冲刺激，—其次用单次的50至200伏特/cm及持续300至2000ms的低压(LV)场强脉冲刺激。根据本发明的一个实施方案，所述组织是肌肉。对于这种但非限于这种组织，优选对所述组织首先用至少一次200至1400伏特/cm的HV场强脉冲进行电刺激。根据本发明的另一个实施方案，所述组织是肿瘤组织。对于这种但非限于这种组织，优选对所述组织首先用至少一次400至2000伏特/cm的HV场强脉冲进行电刺激。前述本发明的各个特点和方面、特别是关于电转移特征和核酸组合物，确实是以与这种特定应用相同的方式应用，因此这方面参考上述内容以进一步鉴定这种特定用途。这种药物可有利地用作抗血管发生和/或抗肿瘤转移剂。在另一感兴趣的方面，作为治疗活性分子，所述核酸编码在宿主体内能诱导免疫应答的一或多种免疫原(或者免疫原性肽、多肽或蛋白质，包括糖蛋白)。在一个实施方案中，所述免疫应答对于宿主是保护性免疫应答。在这个实施方案中，本发明涉及生产直接对抗微生物例如病毒或细菌或者对抗癌症的免疫原性组合物或者疫苗或治疗性疫苗。例如所述核酸编码如下一或多种(至少两种)免疫原HIV、HBV、Epstein-Barr病毒、伪狂犬病病毒、syndtiaforming病毒。本领域技术人员可以使用编码最感兴趣的分子的核酸进行选择性应用，例如针对特定疾病应用最有效的免疫原或免疫原组合。在另一个实施方案中，所述免疫应答引起抗体、特别是多克隆抗体产生，这些抗体从产生的血清中回收并以通常的方式应用。因此，本发明的一个目的是提供治疗人或动物的方法，所述方法包括将核酸注射进组织中，并对该组织如下进行电刺激-首先用至少一次200至2000伏特/cm高压(HV)场强脉冲刺激，-其次用单次的50至200伏特/cm及持续300至2000ms的低压(IAO场强脉冲刺激，通过这种电刺激使得所述核酸被转移进所述组织细胞中。根据本发明的一个实施方案，所述组织是肌肉。对于这种但非限于这种组织而言，优选所述组织首先用至少一次200至1400伏特/cm的HV场强脉冲进行电刺激。根据本发明的另一个实施方案，所述组织是肿瘤组织。对于这种但非限于这种组织而言，优选所述组织首先用至少一次400至2000伏特/cm的HV场强脉冲进行电刺激。如前所述，根据本发明一个优选方面，所述核酸一旦被体内转移进组织细胞中，则能在此产生治疗活性分子，即在肌细胞中和/或在机体另一部位或者仍在肿瘤组织细胞中直接或间接发挥治疗作用。优选地，如上所述，所述核酸是在应用单次LV脉冲及更优选在应用HV脉冲之前注射。前文关于本发明的应用描述的各个特征和方面确实以与所述治疗方法相同方式应用，因此加以参考以进一步鉴定这种方法。本发明的一方面因此是这样一种方法，其中所述核酸编码RDD基因或其有效片段，所述方法旨在降低或抑制肿瘤生长，和/或作为抗血管发生和/或抗肿瘤转移剂本发明的另一方面因此是这样一种方去，其中所述核酸编码如本文所述一种免疫原，所述方法旨在对人或动物进行免疫，或者产生准备回收的抗体。本发明的另一方面是电穿孔方法，所述方法包括将电极置于在组织间隙内含有核酸的组织附近，然后对该组织如下进行电刺激-首先用至少一次200至2000伏特/cm高压(HV)场强脉冲刺激，-其次用单次的50至200伏特/cm及持续300至2000ms的低压(LV)场强脉冲刺激，通过这种电刺激使得所述核酸被转移进所述组织细胞中。根据本发明的一个实施方案，所述组织是肌肉。对于这种但非限于这种组织而言，优选对该组织首先用至少一次200至1400伏特/cm的HV场强脉冲进行电刺激。根据本发明的另一个实施方案，所述组织是肿瘤组织。对于这种但非限于这种组织而言，优选对该组织首先用至少一次400至2000伏特/cm的HV场强脉冲进行电刺激。所述核酸对于机体而言是异源的，其类型如前述。优选核酸包含能在体内在转染的肌细胞或肿瘤组织中表达一或多种治疗活性分子、优选感兴趣的一或多种蛋白质的核酸序列。一方面，将电极放置于与皮肤接触位置，即机体外部，这不需要进行任何手术即可实现。另一方面，将电极放置于与自身所述组织接触位置，特别是肌肉或肿瘤组织。在这种情况中，所述电极可以由既可以注射核酸又可以进行电刺激的设备携带。所述电极也可以与注射设备分开。电极被置于注射部位附近，由此电流通过电极流经注射部位或注射的液体在注射时扩散到的区域。前文关于电转移特性和核酸组合物描述的各个特性和方面以与电穿孔相同方式应用，因此参考上述内容以进一步鉴定这种方法。本发明也可以被定义为能表达分子的核酸在生产用于将所述核酸输送至组织细胞、特别是肿瘤或非肿瘤组织细胞例如肌细胞的方法中的药物中的应用，其中a)所述核酸被注射进组织中，b)对所述组织如下进行电刺激-首先用至少一次200至2000伏特/cm高压(HV)场强脉冲刺激，_其次用50至200伏特/cm及持续300至2000ms的单次低压(LV)场强脉冲刺激。从上所述可以得知，所述应用可以是-通过在宿主的肌细胞、特别是骨骼肌细胞中转染所述核酸而对宿主进行免疫，其中所述核酸编码降低宿主中免疫应答的免疫原；-或者通过在肌细胞、特别骨骼肌细胞或者在肿瘤组织细胞中转染所述核酸，而在宿主体内全身性输送治疗活性分子。这一应用可以进一步用上述定义的各种特征而定义，特别是电刺激条件、核酸给予条件、核酸组成、宿主性质等等。本发明的另一目的是生产抗体、特别是多克隆抗体的方法，所述方法包括将免疫原编码核酸注射进活体动物的组织、特别是肌肉中，对该组织如下进行电刺激-首先用至少一次200至2000伏特/cm高压(HV)场强脉冲刺激，-其次用50至140伏特/cm及持续300至2000ms的单次低压(LV)脉冲刺激，通过这种电刺激使得所述核酸被转移进组织细胞中，并且在所述宿主中表达能激发宿主免疫应答的免疫原，并回收所述抗体。所述动物可以是小鼠、大鼠或兔或者任何其它动物，特别是通常用于产生抗体的啮齿动物。回收血清和抗体、纯化和/或浓縮所述抗体可以使用本领域技术人员已知的常规方法进行。这一方法可以进一步用上述定义的各种特征而定义，特别是电刺激条件、核酸给予条件、核酸组成、宿主性质等等。现在通过如下非限制性实验并参考附图进一步详细描述本发明。图1:组合使用1或8次HV脉冲(800V/cm;0.1、0.2或0.5ms)及4次LV脉冲(80V/cm;100ms)(xHV+4LV脉冲组合)，在DNA电转移之后的萤光素酶表达。数据以平均值士SD表示。使用T检验计算每个xHV+4LV组之间的统计学差异，NS表示无显著性。图2:组合使用1次HV脉冲(800V/cm;100ps)及各种次数LV脉冲(80V/cm;100ms)(HV+xLV脉冲组合)，在DNA电转移之后的萤光素酶表达。数据以平均值士SD表示。图中显示的相邻组之间的统计学差异是使用T检验计算的，以星号表示(**PO.01;***PO.001;NS表示无显著性)。图3:组合使用1次HV脉冲(800V/cm;100ns)及各种次数LV脉冲(80V/cm;50ms)(HV+xLV脉冲组合)，在DNA电转移之后的萤光素酶表达。数据以平均值士SD表示。图中显示的相邻组之间的统15计学差异是使用T检验计算的，以星号表示(*PO.05;**PO.01;NS表示无显著性)。图4:组合使用一次HV脉冲(800V/cm，100ns)和作为LV脉冲的脉冲次数与脉冲持续时间的函数的LV脉冲在DNA电转移之后萤光素酶表达，其中所述函数为保持LV总持续时间恒定。数据以平均值土SD表示。1HV+1LV(400ms)组与其它每组之间的统计学差异使用T检验计算，以星号表示(^PO.05;**P<0.01;***P<0.001)。图5:在pBi(对照组)或pBi-RDD电转移之后小鼠中肿瘤转移的数目。图6:组合使用不同HV脉冲(200至1800V/cm，IOOiis)并在HV之后1秒钟进行一次LV脉冲(80V/cm;400ms)，在DNA电转移进胫骨肌之后萤光素酶表达。数据以平均值士SD表示。图7:组合使用不同HV脉冲(200至1800V/cm，100ps)并在HV之后立即进行一次LV脉冲(80V/cm;400ms)，在DNA电转移进胫骨肌之后萤光素酶表达。数据以平均值土SD表示。图8:组合使用不同HV脉冲(400-2000V/cm;100ps)并随后一次LV脉冲(80V/cm;400ms)，在DNA电转移进肿瘤中之后的萤光素酶表达。数据以平均值士SD表示。图9:组合使用1次HV脉冲(800V/cm;IOOiis)并随后一次LV脉冲(60、80、100、120或140V/cm;400ms)或无LV脉冲，在DNA电转移进肿瘤中之后的萤光素酶表达。数据以平均值士SD表示。图10:在兔和大鼠中产生的抗-RDDIgG抗体的测量。实施例1材料和方法质粒DNA使用质粒pXL3031(pCMV-Luc+)，其含有插入在编码萤火虫萤光素酶(Soubrierefal.,1999)的经修饰的胞质luc+基因的编码序列上游的巨细胞病毒启动子(pcDNA3的第229-890位核苷酸，Invitrogen)。使用通常的方法制备质粒DNA(Ausubeletal.,1994)。或者，使用pEGFP-Nl质粒(BDBiosciencesClontech,SaintQuentinYvelines,France),特征在于绿色荧光蛋白(GFP)的基因在CMV启动子控制下，用EndoFreePlasmidGiga试剂盒(QIAGEN，Courtabeuf,France)在PBS(磷酸盐缓冲盐水，Gibco，Cergy-Pontoise,France)中制备。动物对于所有实验方法而言，将雌性7-9周龄的C57BI/6小鼠通过腹膜内给予麻醉剂氯胺酮(IOOmg/kg;Ketalar,Pa叩harma,France)和赛拉嗪(40mg/kg;Rompun,Bayer,Fmnce)进行麻醉。在进行实验之前，将腿部用电动剃须刀刮剃。为了进行萤光素酶测定，每个实验组包括至少10块肌肉(5只小鼠)。在GFP定性数据情况中，每个实验条件使用4块肌肉。DNA注射为了进行萤光素酶实验，注射于的0.9%NaCl中制备的3叱质粒DNA。在大多数实验中(图l-5)，为所述DNA溶液补充120IU/ml月干素(LaboratoiresLeo，SaintQuentinenYvelines,France;lmg肝素(MW10-12kDa)相当于大约137IU)。使用具有26号针头的Hamilton注射器将所述DNA注射进前胫骨肌(tibialcranialmuscles)。对于GFP实验，在每个处理的胫骨肌中注射于20^1的PBS中4吗质粒DNA，始终没有肝素。DNA电转移HV和LV脉冲组合通过由用于HV的方波电脉冲仪PS-15(Jouan，StHerblain，France)禾口用于LV的UniversityofLjubljana,FacultyofElectricalEngineering,Slovenia制造的微处理器驱动的开关/功能(switch/flinction)发生器组成的设备产生。该设备可以精确控制HV+LV脉冲组合中的每个电学参数(Satkauskasetal.，2002)。HV和LV脉冲组合在肌内注射DNA之后(40+15秒)立即发送。在所有实验中，HV与LV之间的延迟固定为ls。为了为肌肉输送脉冲，使用间隔4.4mm的不锈的板状电极。所述lcm的电极板环绕小鼠的整个腿部。为了保证暴露的腿部前胫骨肌与电极板之间良好的接触，使用导电凝胶。电场值(V/cm)总是以施加的电压(V)与电极之间的距离(cm)的比值表示。为了进行GFP实验，使用CLINIPORATOR(IGEA，s.r.I.，Carpi(MO),Italy)发生器和同一公司生产的5mm间隔电极发送脉冲组合。萤光素酶活性测定在DNA电转移之后2天处死小鼠。取下肌肉(净重为大约60mg)，在lml细胞培养裂解试剂溶液(IOml细胞培养裂解试剂(PromegaCharbonniferes,France),用40ml蒸馏水稀释并补充BoehringerMannheim,Mannheim,Germany生产的1片蛋白酶抑制剂混合物)中均质。在4。C在12,000rpm离心10分钟后，对lOpl上清测定萤光素酶活性，使用WalacVictor2发光计，通过积分(integration)在向所述肌肉裂解物中加入50^11萤光素酶分析底物(Promega)之后开始的1秒钟期间产生的光而确定。从发光计中收集相对光单位(relativelightunits,RLU)结果。使用纯化的萤火虫萤光素酶蛋白质的标准显示106RLU，相当于大约70ng表达的萤光素酶。最终结果以pg萤光素酶/肌肉表示。GFP荧光观测小鼠在注射pEGFP-Nl质粒3天后被处死，使用具有LeicaGFPPlus滤光装置的LeicaMZ12荧光立体显微镜(Art.No.10446143:发射滤片480/40nm，分色镜505nmLP，二次滤片510nmLP)(Leica，RueilMalmaison,France)观测转染的组织。使用冷却的数码彩色摄像机(AxioCamHRc,Zeiss,LePecq，France)采集图像，综合由摄像机检测的光通过软件(AxioVisionLightEditionRelease4丄1.0)量化GFP表达。统计学分析为了对几组进行统计学比较，对不成对的数值使用双尾Student'st-检验。在图中，萤光素酶表达数据以平均值士SD表示。结果在萤光素酶实验情况中，由于测量的高敏感性，注射补加了少量肝素(120IU/ml)的质粒DNA溶液。在此剂量的肝素使得肌肉对DNA的自发吸收大大降低，但是不明显削弱DNA电转移进肌纤维中的效率(Satkauskaseta1.，2001)。因此，在存在肝素的条件下，可以更精确地分析HV和LV脉冲各自对DNA电转移效率的作用。另夕卜，HV与LV脉冲之间的延迟固定为ls。HV脉冲持续时间和次数的影响为了分析电通透化(HV)脉冲的作用，使用根据先前数据(Satkauskasetal.，2002)提供最佳水平基因表达的LV脉冲。根据这种教导，这项实验的LV组成参数固定为4次80V/cm和100ms持续时间的LV，在脉冲之间延迟l秒钟。尝试通过增加HV脉冲次数(l-8次)或者HV持续时间(100p至500las)而改善肌肉通透性。如图1所示，HV持续时间的增加及HV次数的增加均不明显增强肌肉转染。LV脉冲次数的影响从图1所示结果可以看出，总是使用一次单次的800V/cm的HV和100w来分析LV组成的作用。首先，捡验LV次数的影响。将LV脉冲强度固定在80V/cm，持续100ms及在LV之间延迟ls。当LV次数从1增加至4次时，萤光素酶表达明显增加(图2)。与先前的数据(Satkauskasetal.，2002)—致，使用4次LV较1次LV使得萤光素酶表达高10倍。使用更多次数(6或8次)LV脉冲未观测到显著增加(图2)。随后使用50ms持续时间LV进行脉冲次数对基因转移效力的影响的实验(图3)。观测到与在100ms持续时间LV情况(图2)中相同的趋势。在这两种情况中，萤光素酶基因表达达到平台时的幵始时间均是在整个400ms脉冲持续时间幵始时。同样，使用更多次数(12或16次)LV脉冲未观测到进一步明显增加。进一步使用和对比4种不同LV次数和持续时间的组合，所有结果均显示低压脉冲的总持续时间等于400ms(图4)。发现伴随各个脉冲持续时间减少和脉冲次数增加，萤光素酶基因表达的渐进性降低趋势(图4)。显然并出乎意料地，使用单次的400msLV的HV和LV组合导致萤光素酶基因表达进一步增加并到达最佳，例如较使用8次50ms的LV高大约2倍(p〈0.001)。GFP荧光观测在使用1次100ps和800V/cm的HV及在延迟1秒钟后使用1次400ms、60、80或100V/cm的LV的GFP基因电转移之后，使用荧光立体显微镜定性及半定量测定肌肉内荧光的分布和强度。在恒定曝光时间(IOOms，A、B和C组)或者在可变曝光时间采集图像，所述可变曝光时间即使得摄像机调节曝光时间以获得图像与图像之间的光量相等(D、E和F组)。采集的图像代表在每个实验条件下4个肌肉中观测到的图像。采集的两个系列图片显示所述结果的可再现性以及随着LV脉冲场强度的增加荧光明显增加(A、B和C组)。对这些图像中绿色的平均密度进行定量分析证实了定性数据在256个强度水平的相对数值范围中，第41级(左侧肌肉)和33级(右侧肌肉)达到60V/cm(A组)，而第111级和89级达到80V/cm(B组)，第138级和127级达到100V/cm(C组)。这些图片显示无论LV场强如何，荧光"光学表面(opticalsurface)"是相同的(D、E和F组)。荧光的这种增加得自每个纤维较多的荧光，但是受电转移影响的组织的体积相同。电转移进纤维中的质粒分子的数目增加解释了观测到的在各个纤维中荧光的增加。实施例2这个实验中使用的表达载体根据Trochon-JosephV.etal.2004所述制备。将20昭的pBi(对照)或者pBi-RDD(实验处理)与10昭的Tet-tTS和20吗的Tet-On质粒于无菌0.9%NaCl(终体积30jal)中一起注射进前胫骨肌(Tibialiscranialismuscles)中。对每只动物的两条腿进行电转移。如下所述进行电转移。在进行电转移之前当天用电动剃须刀刮剃C57BL/6小鼠的腿部。在进行电转移之前，通过腹膜内注射氯胺酮(100mg/kg体重)和赛拉嗪(40mg/kg)混合物对动物进行麻醉。使用Hamilton注射器注射质粒混合物。应用导电凝胶以保证腿部皮肤与两个不锈板状电极之间的良好接触(电极之间间隔5mm)。随后，首先应用1次经皮方波700V/cm和100ps(1Hz)的HV电脉冲以使膜通透化。在暂停1000ms之后，不移动电极，应用l次经皮方波100V/cm和400ms的LV电脉冲，以使得DNA通过电泳迁移进入细胞中。使用电脉冲仪Cliniporator(IGEA，Italy)进行电转移。对于每组动物和每条腿进行相同程序处理。每组使用IO只小鼠。在植入肿瘤之前3天通过在动物饮用水中加入强力霉素诱导电转移的肌肉中RDD产生。在实验期间维持强力霉素诱导。将对数期培养的B16F10黑素瘤细胞用0.02%EDTA分离，重悬于无菌0.9。/。NaCl中，终浓度为4Xl()S/ml。将lOOpl悬浮液I.V.注射进小鼠的眶后窦(retro-orbitalsinus)中。细胞注射7天后，处死小鼠，切下肺，在解剖显微镜下计数转移淋巴结。如图5所示，在存在RDD的条件下，在实验组中检测到较对照组少70.5%的转移淋巴结。RDD抑制黑素瘤B16F10的发展。实施例3图6禾Q7显示了使用不同HV脉冲(200至1800V/cm，100ps)及在HV脉冲之后1秒后(图6)或者在HV脉冲之后立即(图7)使用1次LV脉冲(80V/cm，400ms)的组合，在DNA经电转移进小鼠胫骨肌之后的萤光素酶表达。这些实验己经如在实施例1中针对萤光素酶方案进行，每组6只小鼠，使用CUNIPORATORTM发送冲动，萤光素酶活性以pg/mg肌肉表示。实施例4:肿瘤实验使用传统方法和补充了100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素和8。/。胎牛血清的MEM培养基，在体外培养B16F10黑素瘤细胞。为年幼的(6-8周)C57BI/6雌性小鼠左侧腰部皮下接种1X106同源B16细胞(于100^1的MEM培养基中)。当肿瘤达到平均直径为6-7mm时(接种后7-8天)，对其进行处理。使用具有4型、26号、长度为16mm的针头的RN型Hamilton注射器将的50吗的DNA(质粒pCMV-Luc+)局部注射进肿瘤中。在15-25秒钟内进行注射。将两个宽lcm、厚lmm外用不锈钢板状电极间隔5mm(IGEA,Carpi，Italy)置于肿瘤每一侧的皮肤上，以环绕整个肿瘤。利用超声波扫描术使用的导电凝胶(EKO-GEL，Egna，Italy)保证电极接触。当使用固定的LV组成时(l次400ms、140V/cm的LV)，作为HV场强函数获得的结果与在骨骼肌上获得的那些结果相似，不同之处是需要应用较高的场强以达到最佳表达平台。见图8。当使用固定的HV组成时(l次100ns、800V/cm的HV)，作为LV场强函数获得的结果与在骨骼肌上获得的那些结果相似，不同之处是再一次需要应用较高的场强以达到最佳表达平台。发现最佳HV+LV脉冲的最大效率较在先前公布的最佳条件(相同方波脉冲序列(train))下使用相同脉冲序列的效率高10倍。实施例5:多克隆抗体的产生材料和方法质粒DNA将在鼠尿激酶分泌信号控制下的人RDD基因插入含有巨细胞病毒(CMV)启动子和牛生长激素聚腺苷酸化信号的pVAXl质粒(Invitrogen,V260-20)中，产生pVAX-RDD质粒。空白载体pVAXl用作阴性对照。使用EndoFreeNucleoSpin质粒试剂盒(MachereyNagel)在无菌0.9%NaCl中制备质粒。动物雌性Wistar大鼠通过腹膜内给予麻醉剂氯胺酮(40mg/kg)和赛拉嗪(5.5mg/kg)麻醉。雌性新西兰兔首先经皮下注射Calmivet(1ml/kg)处理，然后通过静脉内注射戊巴比妥麻醉。在进行实验之前，将动物腿部用电动剃须刀刮剃。DNA注射和电转移将穿透针头电极导入兔的股薄肌和大鼠的臀肌中。在三个时间点在电极线之间注射于10(^1的0.9%NaCl中制备的100吗每种质粒DNA。在肌内注射DNA之后立即用CLINIPORATORTM进行如前述肌肉电转移1次700V/cm和100|us电脉冲(lHz)，暂停1000ms，然后不移动电极进行1次100V/cm和400ms电脉冲。对于每只动物的两条腿均进行该程序，兔的每块肌肉进行2次(即每只动物注射4次)，大鼠的每块肌肉进行1次(即每只动物注射2次)。动物在第0、6和12周免疫。抗体应答的测量在第一次免疫之前收集血液，然后在第4、9(兔的处死时间)和16周(大鼠的处死时间)收集血液。通过离心收集血清。抗-RDD抗体(IgG)通过如下ELISA测定。将96孔微滴定平板(NuncMaxisorb，Roskilde，Denmark)的每个孔均用在大肠杆菌(E.coli)中产生的100ng重组RDD包被。在4'C保温过夜后，将孔用TBST(Tris-缓冲盐水TBS，0.02%Tween20)洗涤6次，然后与TBST-5y。牛奶在室温摇动保温3h。如上述洗涤一次后，将孔与于TBST-5。/。牛奶中的100pl血清系列稀释液(1:125至l:8000)保温。由肽免疫(Neosystem)而产生的抗-RDD兔多克隆血清用作阳性对照。在摇动保温2h后，洗涤孔并与于TBST-5%牛奶中1:5000稀释的lOOpl过氧化物酶缀合的抗体保温1小时，结合的兔抗体使用过氧化物酶缀合的抗兔IgG(ref.NA934,Amersham)检测，结合的大鼠抗体使用山羊F(ab')2片段大鼠IgG(H+L)过氧化物酶(ref.IM0825，Beckmanlmmunotech)检测。如上述洗涤后，将孔与200Hl底物o陽二氢氯化苯二月安(SigmaFastOPDperoxidasesubstratetabletset)保温30分钟。通过加入50^1的3NHC1终止反应，在490nm获得分光光度计读数。用作阳性对照的抗-RDD兔多克隆血清是根据标准肽免疫方案产生的(由NeosystemSA，Strasbourg,France生产)。选择的肽包含RDD序列(SEQIDN0.2)第57-68位氨基酸残基，与Gluta-KLH(匙孔血蓝蛋白，一种增强小肽免疫原性的载体蛋白)缀合。在第0、2、4和8周将2mg这种肽经皮下注射进兔体内。在第一次注射之前收集血液，然后在第6、10和12周(处死时间)收集血液。在第12周收集的血清用作阳性对照。结果如图10所示，在通过肌肉电转移对兔和大鼠进行免疫之后第9周，产生抗RDDIgG抗体。这种通过电转移进行的免疫诱导抗RDD抗体产生，与将肽注射进兔中进行的传统免疫具有同样效力(见对照组兔曲线)。在第16周对于大鼠获得相同结果。另外，在兔和大鼠中获得的这些多克隆抗RDD血清在western印迹实验中能特异性检测重组RDD。参考文献AIHARA,H.,andMIYAZAKI,J.(1998).Nat.Biotechnol.16,867-870.ANDRE,F.，andMIR,L.M.(2004).GeneTher.11Suppl1,S33-S42.Ausubel，RM.etal.(1994).CurrentProtocolsinMolecularBiology-Wiley,NewYork.BETTAN，M.etal.(2000).Mol.Ther.2,204-210.BUREAU,M.F.etal.(2000).Biochim.Biophys.Acta1474,353-359.GEHL,J.,andMIR，L.M.(1999).Biochem.Biophys.Res.Commun.261,377-380.GEHL,J"SKOVSGAARD,T.，andMIR，L.M.(1998).AnticancerDrugs9,319-325.GEHL,J.etal.(1999).Biochim.Biophys.Acta1428,233-240.GLASS,L.F.etal.(1997).J.Am.Acad.Dermatol.37，596-599.GOLZIO,M.etal.(2002).Proc.Natl.Acad.Sci.USA99，1292-1297.HELLER,L.etal.(2000).GeneTher.7，826-829.HELLER,L.G.,andCOPPOLA,D.(2002).GeneTher.9，1321-1325.HELLER，R.etal.(1996).FEBSLett.389,225-228.KLENCHIN，V.A.etal.(1991).Biophys.J.60，804-811.MATS而OTO,T.etal.(2001).GeneTher.8,1174-1179.MIKLAVCIC，D.etal.(2000).Biochim.Biophys.Acta1523,73-83.MIR，LM.etal.(1991a).C.R.Acad.Sci.Ill313，613-618.MIR,L.M.etal.(1999).Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A96，4262-4267.MIR，L.M.etal.(1998a).C.R.Acad.Sci.Ill321,893-899.MIR,L.M.etal.(1998b).Br.J.Cancer77，2336-2342.MIR，LM.etal.(1991b).Eur.J.Cancer27，68-72.MURAMATSU，T，etal.(1997).Biochem.Biophys.Res.Commun.233,45-49,NEUMANN,E.etal.(1996).Biophys.J.71,868-877.PODDEVIN,B.etal.(1991).Biochem.Pharmacol.42Suppl，S67-S75.etal.，BARROSO,B.etal.(2002).Arch.Med.Res.32，273-276.ROLS,M.P.etal.(1998).Nat.Biotechnol.16，168-171.SATKAUSKAS,S.etal.(2001).Mol.Ther.4,317-323.SATKAUSKAS，S.etal.(2002).Mol.Ther.5，133-140.SERSA，Getal.Z.(1998).Eur,J.Cancer34，1213-1218.SOUBRIER,Retal.(1999).GeneTher.6,1482-1488.SUKHAREV，S.I.etal.(1992).Biophys.J.63,1320-1327.SUZUKI,T.etal.(1998).FEBSLett.425，436-440.TITOMIROV,A.V.etal.(1991).Biochim.Biophys.Acta1088,131-134.TROCHON-JOSEPH,V.etal.,CancerResearch2004,64:2062-2069.WELLS，J.M.etal.(2000).GeneTher.7，541-547.ZAHAROFF，D.A.etal.(2002).GeneTher.9,1286-1290.ZAHAROFF,D.A.，andYUAN,F.(2004).Bioelectrochemistry62,37-45.ZHANGL.etal.(1996).Biochem.Biophys.Res.Commun.220,633-636.权利要求1.核酸在制备用于在体内转移进组织细胞中的药物中的应用，其中如下所述将所述药物与组织细胞接触，并对所述组织进行电刺激-首先用至少一次200至2000伏特/cm的高压场强脉冲刺激，-其次用单次的50至200伏特/cm及持续300至2000ms的低压场强脉冲刺激。2.权利要求l的应用，其中所述单次的低压脉冲的场强为50至140伏特/cm。3.权利要求l的应用，其中所述单次的低压脉冲的场强为80至120伏特/cm。4.权利要求l的应用，其中所述单次的低压脉冲的场强为90至110伏特/cm。5.权利要求1的应用，其中所述单次的低压脉冲的场强为100伏特/cm。6.权利要求1-4任一项的应用，其中使用200至1400伏特/cm的高压场强。7.权利要求6的应用，其中使用400至1200伏特/cm的高压场强。8.权利要求6的应用，其中使用600至800伏特/cm的高压场强。9.权利要求7的应用，其中使用700伏特/cm的高压场强。10.权利要求l-9任一项的应用，其中所述组织是肌肉。11.权利要求l的应用，其中单次的低压脉冲的场强为100至200伏特/cm。12.权利要求l的应用，其中单次的低压脉冲的场强为120至160伏特/cm。13.权利要求1的应用，其中单次的低压脉冲的场强为140伏特/cm。14.权利要求1及11-13任一项的应用，其中使用400至2000伏特/cm的高压场强。15.权利要求14的应用，其中使用800至1600伏特/cm的高压场强。16.权利要求14的应用，其中使用900至1200伏特/cm的高压场强。17.权利要求14的应用，其中1000伏特/cm的高压场强。18.权利要求1和11-17任一项的应用，其中所述组织是肿瘤组织。19.权利要求l-18任一项的应用，其中所述单次的低压脉沖的持续时间为300至800ms。20.权利要求19的应用，其中所述单次的低压脉冲的持续时间为350至600ms。21.权利要求19的应用，其中所述单次的低压脉冲的持续时间为400ms。22.权利要求要求1-21任一项的应用，其中所述单次的低压脉冲的极性与高压脉冲的极性相反。23.权利要求l-22任一项的应用，其中使用单次的高压脉冲。24.权利要求1-23任一项的应用，其中使用的高压场脉冲的持续时间为10至1000(is。25.权利要求24的应用，其中使用的高压场脉冲的持续时间为50至200|is。26.权利要求25的应用，其中使用的高压场脉冲的持续时间为100|is。27.前述任一项权利要求的应用，其中高压脉冲和低压脉冲由延迟隔开。28.权利要求27的应用，其中所述延迟为300ms至3000s。29.权利要求28的应用，其中所述延迟为500ms至1000s。30.权利要求29的应用，其中所述延迟是1000ms。31.前述任一项权利要求的应用，其中所述核酸在组织细胞中能产生一种治疗活性分子或一些治疗活性分子。32.前述任一项权利要求的应用，其中使用在组织细胞中能产生不同治疗活性的两或多种核酸。33.前述任一项权利要求的应用，其中所述核酸编码RDD蛋白质或其有效片段。34.前述任一项权利要求的应用，其中所述药物有效降低或抑制肿瘤血管发生。35.前述任一项权利要求的应用，其中所述药物降低或抑制肿瘤生长。36.前述任一项权利要求的应用，其中所述药物抑制肿瘤转移。37.前述任一项权利要求的应用，其中所述药物是抗癌的。38.权利要求l-10和19-32任一项的应用，其中所述组织是肌肉，所述核酸编码一或多种免疫原。39.权利要求38的应用，其中所述一或多种免疫原是HIV免疫原。40.权利要求l-10和19-37任一项的应用，其中所述组织是肌肉。41.一种电穿孔方法，其包括将电极置于接触皮肤的组织附近，其中所述组织在组织间隙含有核酸，然后如下对所述组织进行电剌激-首先用至少一次200至2000伏特/cm的高压(HV)场强脉冲刺激，-其次用50至140伏特/cm及持续300至2000ms的单次的低压(LV)场强脉冲刺激，通过这种电刺激使得所述核酸被转移至组织细胞中。42.权利要求41的方法，其中所述刺激如权利要求2-29任一项所述。43.权利要求41或42的方法，其中所述核酸如权利要求31、32或33所述。44.权利要求41-43任一项的方法，其中所述组织是肌肉。45.权利要求41-43任一项的方法，其中所述组织是肿瘤组织。46.能表达分子的核酸在生产药物中的应用，所述药物用于将所述核酸输送至组织细胞、特别是肿瘤或非肿瘤组织细胞例如肌细胞中的方法中，其中a)将所述核酸注射进组织中，b)如下对所述组织进行电刺激-首先用至少一次200至2000伏特/cm的高压(HV)场强脉冲刺激，_其次用单次的50至200伏特/cm及持续时间为300至2000ms的低压(LV)场强脉冲刺激。47.产生抗体、特别是多克隆抗体的方法，所述方法包括将免疫原编码核酸注射进活体动物的组织、特别是肌肉中，对组织进行如下电刺激-首先用至少一次200至2000伏特/cm的高压(HV)场强脉冲刺激，一其次用单次的50至140伏特/cm及持续时间为300至2000ms的低压(LV)场强脉冲刺激，通过这种电刺激使得所述核酸被转移进组织细胞中，在所述宿主中表达能激发宿主免疫应答的免疫原，并回收所述抗体。全文摘要通过如下所述对组织进行电刺激而将核酸电转移进组织细胞、特别是肌肉或肿瘤组织中首先用至少一次优选单次的200至2000伏特/cm高压场强脉冲刺激，其次用单次的50至200伏特/cm并持续300ms至2000ms的低压场强脉冲刺激。文档编号A61K48/00GK101252953SQ200680031640公开日2008年8月27日申请日期2006年9月1日优先权日2005年9月2日发明者D·米克拉夫契奇,L·米尔申请人:生物联盟制药公司;国立科学研究中心;古斯塔夫·鲁西研究所