专利名称：用于癌症治疗的抗-CTLA-4抗体和含有CpG基序的合成寡脱氧核苷酸联合治疗的制作方法
用于癌症治疗的抗-CTLA-4抗体和含有CpG基序 的合成寡脱氧核苷酸联合治疗相关申请本申请要求享有2005年7月7日提交的标题为"ANTI-CTLA-4 ANTIBODY AND CpG-MOTIF-CONTAINING SYNTHETICOLIGODEOXYNUCLEOTIDE COMBINATION THERAPY FOR CANCER TREATMENT" 的美国临时申请系列号60/697082的优先权，其完整内容通过参考引 用并入本文。发明领域本发明涉及抗-CTLA-4抗体与CpG寡核苷酸组合在癌症治疗中 的应用。发明背景癌症治疗的一个替代方案是靶向免疫系统("免疫疗法")，替代和/ 或附加至靶向肿瘤本身。免疫疗法的一个潜在益处是，通过增强患者 自身对肿瘤的免疫应答，同时使对正常细胞的有害作用最小化，提供 提高的功效。细胞毒性T淋巴细胞-相关抗原4 (CTLA-4; CD152)是一种在激 活的T细胞上表达的细胞表面受体。CTLA-4的天然配体是B7.1 (CD80) 和B7.2 (CD86)，它们存在于抗原呈递细胞(APC，包括树突细胞，激 活的B-细胞，和单核细胞)上。CTLA-4是起下调节T-细胞激活和维持 免疫体内稳态作用的免疫球蛋白(Ig)超家族蛋白的一个成员。更具体 地，认为在决定对抗原的应答时，CD28和CTLA-4输送由T细胞整合 的相对信号。抗原刺激T细胞受体的结果受CD28共刺激信号以及源自 CTLA-4的抑制信号的调节。它也由T细胞上的CD28或CTLA-4与在抗原呈递细胞上表达的B7分子的相互作用决定。实验证据表明，B7与CTU-4的结合，会向T细胞递送负调节信 号，在动物模型中阻断该负信号会导致增强的T细胞免疫功能和抗肿 瘤活性(Thompson和Allison, 1997， Immunity 7: 445-450; McCoy和 LeGros， 1999， Immunol. & Cell Biol. 77:1—10)。几项研究已经证 实，用抗鼠CTLA-4阻断mAb治疗小鼠，会显著增强T细胞-介导的对 多种鼠实体瘤的杀伤，包括已建立的肿瘤，且可以诱导抗肿瘤免疫性 (Leach等，1996， Science 271:1734-1736; Kwon等，1997， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 8099-8103; Kwon等，1999， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:15074-15079; Yang等，1997 , Cancer Res. 57: 4036-4041; Hanson等的美国专利号6,682, 736)。此外，人类中 CTLA-4的多态性已经与自身免疫病如类风湿性关节炎和I型糖尿病的 风险增高相关联。另外，Allison等的美国专利5, 811, 097涉及施用CTLA-4阻断 剂来降低肿瘤细胞生长。国际公开号W0 00/37504 (在2000年6月29 日公开)涉及人抗-CTLA-4抗体，和那些抗体在治疗癌症中的应用。WO 01/14424 (在2001年3月1日7〉开)涉及其它人抗-CTLA-4抗体， 和这些抗体在治疗癌症中的应用。WO 93/00431 (在1993年1月7日 公开)涉及用能与CTLA-4-Ig融合蛋白反应的单克隆抗体调节细胞相 互作用。W0 00/32231 (在2000年6月8日公开)涉及CTLA-4阻断剂 与肿瘤疫苗的组合用于刺激T-细胞。W0 03/086459涉及使用CTLA-4 抗体促进记忆应答的方法。因而，本领域已经证实了治疗开发的潜力， 所述治疗包含抑制CTLA-4结合，以增强和/或延长抗肿瘤应答。细菌DM具有激活B细胞和天然杀伤细胞的免疫刺激作用 (Tokunaga, T.， 等，1988. Jpn. J. Cancer Res. 79:682-686; Tokunaga, T.,等，1984, JNCI 72: 955-962; Messina, J. P.，等， 1991， J. Immunol. 147: 1759-1764;综述见Krieg, 1998， In: Applied Oligonucleotide Technology, CA. Stein和A.M. Krieg,(编.)， John Wiley和Sons, Inc. ， New York, NY, pp. 431—448)。细菌DNA的免疫刺激作用，是在特定碱基背景(CpG基序)中存在未甲基化的 CpG二核苷酸的结果，它们在细菌DM中常见，但是在脊推动物DM中 甲基化且表现不足(underrepresented ) (Krieg等，1995 Nature 374:546-549; Krieg， 1999 Biochim, Biophys. Acta 93321 :1-10)。 用含有这些CpG基序的合成寡脱氧核苷酸(ODN)，可以模仿细菌DNA 的免疫刺激作用。这样的CpGODN对人和鼠白细胞具有高度刺激作用， 会诱导B细胞增殖、细胞因子和免疫球蛋白分泌、天然杀伤(NK)细胞 溶解活性、ifn-y分泌、和树突细胞(dc)和其它抗原呈递细胞的激活 以表达共刺激分子和分泌细胞因子(尤其在促进Thl样T细胞应答的 发展中重要的Thl样细胞因子)。天然磷酸二酯主链CpG ODN的免疫 刺激作用，是高度CpG特异性的，在于如果CpG基序被甲基化、改变 成GpC或以其它方式消除或改变，该作用会急剧降低(Krieg等，1995 Nature 374: 546-549; Hartmann等，1999 Proc, Natl. Acad. Sci USA 96: 9305-10)。以前认为，免疫刺激作用需要在嘌呤-噪呤-CpG-嘧啶-嘧啶序列的 背景中的CpG基序(Krieg等，1995 Nature 374: 546-549; Pisetsky， 1996 J. Immunol. 156:421-423; Hacker 等，1998 EMBO J. 17:6230—6240; Lipford等，1998 Trends in Microbiol. 6:496-500)。 但是，现在清楚了，小鼠淋巴细胞会非常好地应答不在该背景中的磷 酸二酯CpG基序(Yi等，1998 J. Immunol. 160: 5898-5906)，这也 适用于人B细胞和树突细胞(Hartmann等，1999 Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:9305-10; Liang， 1996 J. Clin. Invest. 98:1119-1129)。一类CpG 0DN能有效地激活B细胞，但是相对较弱地诱导IFN-a 和NK细胞激活；该类型被称作B类。B类CpG寡核苷酸通常被完全稳 定化，且包括在某些优选的碱基背景内的未甲基化的CpG二核苷酸。 参见，例如，美国专利号6， 194， 388; 6, 207, 646; 6, 214, 806; 6， 218， 371; 6， 239, 116;和6， 339， 068。尽管抗-CTLA-4抗体或0DN的诱导抗肿瘤应答的单独应用在癌症 治疗中具有巨大前景，仍然需要开发用这样的免疫治疗方案治疗肿瘤更特别是实体瘤的新疗法。 发明概述新治疗方案的开发，尤其能增加或增强患者免疫系统的抗肿瘤活 性、同时减少现有化疗剂的细胞毒性副作用的新治疗方案的开发，是 必要的。本发明提供了这样的方案。因而，在一个实施方案中，本发明提供了治疗需要这样的治疗的 患者的癌症的方法，所述方法包含，给所述患者施用治疗有效量的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合部分，与治疗有效量的CpG 0DN PF3512676 (CpG 7909 (也称作ProMune); TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT; SEQ ID NO: 37)相组合。在一个实施方案中，该方法是非疫 苗方法。在一个实施方案中，每天、隔天、每周2次或每周施用所述CpG0DN,在一个实施方案中，所述治疗是选自下述的疗法新辅助疗法， 辅助疗法， 一线疗法，二线疗法，和三线疗法。根据实施方案，所述癌症选自脑癌，乳腺癌，子宫颈癌，结肠 直肠癌，皮肤T-细胞淋巴瘤，胃癌，头颈部癌，肝癌，肺癌，黑素瘤， 急性髄细胞白血病，非霍奇金淋巴瘤，卵巢癌，胰腺癌，前列腺癌， 肾细胞癌，和肉瘤。在其它实施方案中，所述人抗-CTLA-4抗体的所述治疗有效量范 围是约0.1 mg/kg-50 mg/kg，或约0. 3 mg/kg-20 mg/kg，包括但不限 于选自下述的所述人抗-CTLA-4抗体的治疗有效量至少1 mg/kg， 至少3 mg/kg，至少6 mg/kg，至少10 mg/kg，和至少15 mg/kg。在一个实施方案中，所述抗-CTLA-4抗体或其抗原结合部分，是 选自下述的至少一种抗体(a)具有约10—s或更大的对CTLA-4的结合 亲和力的人抗体，且其会抑制CTLA-4与B7-l之间的结合和CTLA-4 与B7-2之间的结合；(b)具有包括至少一种人CDR序列的氨基酸序列 的人抗体，所述人CDR序列对应源自选自以下的抗体的CDR序列4.1.1， 4.8.1， 4.10.2, 4.13.1， 4.14.3, 6.1.1， 11.2.1, 11.6.1， 11.7.1， 12. 3.1.1， 12. 9.1. 1，和10D1; (c)具有选自4.1.1， 4.8.1， 4. 10. 2， 4. 13. 1， 4. 14. 3， 6. 1. 1， 11. 2, 1, 11. 6. 1, 11. 7, 1， 12. 3. 1. 1， 12. 9.1. l，和10D1的抗体的重链和/或轻链的氨基酸序列的人抗体；(d) 抗体或其抗原结合部分，其与至少一种具有选自4.1.1， 4.8.1， 4. 10. 2， 4. 13. 1， 4.14, 3， 6. 1. 1， 11. 2. 1， 11. 6. 1, 11. 7. 1， 12. 3. 1.1， 12. 9. 1. 1，和10D1的抗体的氨基酸序列的抗体竟争结合CTLA-4;和(e) 抗体或其抗原结合部分，其与至少一种具有选自4.1.1, 4.8.1， 4. 10. 2， 4. 13. 1, 4. 14. 3， 6. 1. 1， 11. 2. 1, 11. 6. 1， 11. 7.1， 12. 3. 1. 1， 12. 9. 1. l，和10D1的抗体的氨基酸序列的抗体交叉竟争结合CTLA-4。在另一个实施方案中，所迷抗体是具有选自4.1.1， 4.13.1， 11. 2. l，和10D1的抗体的氨基酸序列的人抗体。在相关的实施方案中， 所述抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链，其中所述重链的重链可 变域和所述轻链的轻链可变域的氨基酸序列选自(a) SEQ ID NO: 3 的氨基酸序列和SEQ ID NO: 9的氨基酸序列；(b) SEQ ID NO: 15的氨 基酸序列和SEQ ID NO: 21的氨基酸序列；(c) SEQ ID NO: 27的氨基 酸序列和SEQ ID NO: 33的氨基酸序列；(d) SEQ ID NO: 1的核酸序列 编码的氨基酸序列和SEQIDNO:7的核酸序列编码的氨基酸序列；(e) SEQ ID NO: 13的核酸序列编码的氨基酸序列和SEQ ID NO: 19的核酸 序列编码的氨基酸序列；(f) SEQ ID NO:25的核酸序列编码的氨基酸 序列和SEQ ID NO: 31的核酸序列编码的氨基酸序列；和(g)抗体 10D1的可变域的氨基酸序列。在另一个相关的实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分是选自 下述的抗体(a)包含SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5， SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10， SEQIDNO. 11和SEQIDN0:12所述氨基酸序列的抗体;(b) 包含SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17， SEQ ID NO: 18， SEQ ID NO: 22， SEQ ID NO: 23和SEQ ID NO: 24所述氨基酸序列的抗体；和(c)包含SEQ ID NO: 28， SEQ ID NO: 29， SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 34， SEQ ID NO: 35 和SEQ ID NO: 36所述氨基酸序列的抗体。在另一个相关的实施方案中，所迷抗体或其抗原结合部分包含具有SEQ ID NO: 27所述氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO: 33 所述氨基酸序列的轻链可变区。在另一个相关的实施方案中，所述抗体选自(a)包含SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 8所述氨基酸序列的抗体；(b)包含SEQ ID NO: 14 和SEQ ID N0:20所述氨基酸序列的抗体；和(c)包含SEQ ID NO: 26和 SEQ ID NO: 32所述氨基酸序列的抗体。在一个实施方案中，在施用所述CpGODN之前1-7天，施用所述 抗体。在该实施方案和其它实施方案中，在施用所述抗体后约1-100 天，施用所述CpG ODN。在一个实施方案中，皮下施用所述CpG ODN。在另一个实施方案中，以lmg-50mg/天的量，施用所述CpGODN。在另一个方面，本发明提供了用于治疗癌症的药物组合物，所述 组合物包含治疗有效量的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合部分，和治疗 有效量的CpG ODN PF3512676，以及药学可接受的栽体。本文将更详细地描述本发明的这些和其它实施方案。本发明的每个限定可以包括本发明的多种不同实施方案。因此预 见到，涉及任意一个元素或元素的组合的本发明的每个限定，可以包 含在本发明的每个方面中。本发明的应用不限于下面说明书所述的或 附图解释的构造和组分排列的细节。本发明能包括其它实施方案，且 能以多种方式实施或实现。本文使用的措辞和术语用于描述目的，不应当视作限制，"包括"、 "包含，，、或"具有"、"含有"和其变体在本文中的应用，意在包 括其后面列出的项目和其等同物以及另外的项目。附图简述结合附图可以更好地理解本发明的之前概述、以及下面的详细说 明。为了说明本发明，在附图中显示了目前优选的实施方案。但是应 当理解，本发明不限于所示的精确排列和手段。在附图中
图1,包括图1A—1D，显示了抗-CTLA-4抗体4. l.l的核苷酸和 氨基酸序列。图1A显示了 4. 1. 1重链的全长核苷酸序列(SEQ ID NO: 1)。图1B显示了 4. 1. 1重链的全长氨基酸序列(SEQ IDNO: 2)，以及 在括号"[]"之间指明的4. 1. 1重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO: 3)。每个4. 1. 1重链CDR的氨基酸序列加下划线。CDR序列如下CDR1: GFTFSSHGMH (SEQ ID NO: 4); CDR2: VIWYDGRNKYYADSV (SEQ ID NO: 5); 和CDR3: GGHFGPFDY (SEQ ID NO: 6)。图IC显示了 4. 1. 1轻链的核苷 酸序列(SEQ ID NO: 7)。图ID显示了全长4. 1. 1轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO: 8)，以及在括号"[]"之间指明的可变区(SEQ ID NO: 9)。 每个CDR的氨基酸序列指明如下CDR1 : RASQSISSSFLA (SEQ ID NO: 10); CDR2: GASSRAT (SEQ ID NO: 11);和CDR3: CQQYGTSPWT (SEQ ID NO: 12)。图2，包括图2A-2D，显示了抗-CTLA-4抗体4.13.1的核苷酸和 氨基酸序列。图2A显示了 4. 13. 1重链的全长核苷酸序列(SEQIDN0: 13)。图2B显示了 4. 13. 1重链的全长氨基酸序列(SEQ ID NO: 14)， 以及在括号"[]"之间指明的4. 13. 1重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO: 15)。每个4.13.1重链CDR的氨基酸序列加下划线。CDR序列如 下CDR1: GFTFSSHGIH (SEQ ID NO:16); CDR2: VIWYDGRNKDYADSV (SEQ IDNO:12);和CDR3: VAPLGPLDY (SEQ ID NO: 18)。图2C显示了 4.13.1 轻链的核苷酸序列(SEQ IDNO: 19),图2D显示了全长4. 13.1轻链的 氨基酸序列(SEQ ID NO: 20)，以及在括号"[]"之间指定的可变区 (SEQ IDN0:21)。每个CDR的氨基酸序列指明如下CDR1 : RASQSVSSYLA (SEQ ID NO: 22); CDR2: GASSRAT (SEQ ID NO: 23);和CDR3: CQQYGRSPFT (SEQ ID NO: 24)。图3，包括图3A-3D，显示了抗-CTLA-4抗体11. 2. 1的核苷酸和 氨基酸序列。图3A显示了 11.2.1重链的全长核苷酸序列(SEQIDN0: 25)。图3B显示了 11.2. l重链的全长氨基酸序列(SEQ ID NO: 26)， 以及在括号"[]"之间指明的11. 2. 1重链可变区的氨基酸序列(SEQ IDNO: 27)。每个11.2. 1重链CDR的氨基酸序列加下划线。CDR序列如 下CDR1: GFTFSSYGMH (SEQ ID NO: 28); CDR2: VIWYDGSNKYYADSV (SEQ ID NO:29);和CDR3: DPRGATLYYYYYGMDV (SEQ ID NO: 30)。图3C显示 了 11. 2. 1轻链的核苷酸序列(SEQ ID NO: 31)。图3D显示了全长11.2.1 轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO: 32)，以及在括号"[]"之间指明的 可变区(SEQ ID NO: 33)。每个CDR的氨基酸序列指明如下CDR1 : RASQSINSYLD (SEQ ID NO: 34); CDR2: AASSLQS (SEQ ID NO:35);和 CDR3: QQYYSTPFT (SEQ ID NO:36)。发明详述本发明涉及治疗癌症的新治疗方法，其包含共同施用抗-CTLA-4 抗体和CpG ODN (即，CpG ODN PF3512676)的组合。根据本发明要治 疗的癌症包括、但不限于，膀胱癌，脑肿瘤，乳腺癌，子宫颈癌，结 肠直肠癌，胃肠癌，头颈部癌，肝细胞癌，霍奇金病，卡波西肉瘤， 急性和慢性白血病，皮肤T-细胞白血病，髓细胞和淋巴细胞白血病， 肺癌(包括非小细胞肺癌)，黑素瘤，非霍奇金淋巴瘤，卵巢癌，胰腺 癌，前列腺癌，肾细胞癌，皮肤鳞状细胞癌，甲状腺癌，和其它类型 的癌和肉瘤(例如，脂肪肉瘤，骨肉瘤)，以及许多其它。在多种不同 的实施方案中，该方法包含，施用与所述抗体组合的CpG ODN PF3512676,用于癌症的新辅助疗法、辅助疗法、 一线疗法、二线疗法 或三线疗法。在本发明中可釆用的抗体和生产它们的方法，描述在2000年6 月29日公开为WO 00/37504的国际申请号PCT/US99/30895, 2002年 4月12日公开的欧洲专利申请号EP 1262193 Al，现在授权为美国专 利号6, 682, 736的美国专利申请号09/472, 087，现在公开为美国专利 申请公开号2002/0086014的美国专利申请号09/948， 939中(例如， MDX-OIO， Medarex， Princeton, NJ)，它们各自整体通过参考引用并 入本文。尽管本文提供了与这些抗体有关的氨基酸和核酸序列的信息， 进一步的信息可以参见美国专利号6, 682, 736，以及公开的申请WO00/37504， EP 1262193，和US2002/0086014;在那些申请中所述的序 列通过参考引用并入本文。在现在公开为美国专利申请公开号2003/0086930的美国专利申 请号10/153， 382中，讨论了这些抗体治疗多种不同癌症的某些应用， 该申请如同整体阐述一样通过参考引用并入本文。在本发明中使用的CpG免疫刺激寡核苷酸是B类CpG免疫刺激寡 核苷酸。B类CpG免疫刺激寡核苷酸已经描述在USP 6， 194， 388 Bl和 6， 239， 116 Bl中，它们分别在2001年2月27日和2001年5月29日 授权。本发明的CpG免疫刺激寡核苷酸称作CpG 0DN PF3512676,并 通过下述核苷酸序列定义5' TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT 3' (SEQ ID NO:37) CpG ODN PF3512676会强烈激活人B细胞，并对干扰素-oti秀导具 有微小作用。如本文更详细描述的，CpG ODN PF3512676可具有同质 的或嵌合的主链，包括但不限于磷酸二酯和硫代磷酸酯主链连接。在另一个实施方案中，抗体-CpG ODN PF3512676组合与至少一种 其它治疗剂一起施用，所述其它治疗剂例如、但不限于不针对CTLA-4 的其它单克隆抗体(例如，AVASTIN (贝伐单抗)，MYELOTARG (吉姆单 抗)，BEXXAR (托西莫单抗)，RITUXAN (美罗华)，HERCEPTIN (曲妥 单抗))，或具有类似作用的蛋白配体；激活抗原呈递细胞(树突细胞， 巨噬细胞，B细胞，单核细胞)的试剂，包括l型干扰素(例如，干扰 素oc和P);干扰素y; bcg;提供任意和所有形式的肺瘤抗原的试 剂，包括蛋白抗原，肽抗原，全细胞裂解物和其衍生物；遗传编码的 抗原(例如，腺病毒编码的抗原)；已经在体内或离体被改变以增强其 免疫性质的免疫系统的细胞組分(例如，自体树突细胞，淋巴细胞，热 激蛋白，等)；化疗剂，例如、但不限于，环磷酰胺，甲氨蝶呤，依托 泊苷，阿霉素，紫杉烷，氟尿嘧啶，阿糖胞苷(AraC)，和含铂试剂，以 及许多其它试剂。抗原的实例包括PSA抗原(例如，PR0STVAC/TRIC0M) 和黑素瘤-衍生的gpl00抗原。该组合还可以与细胞因子或生长因子 (例如但不限于GM-CSF)联合施用。在一个实施方案中，治疗方法是非疫苗方法。本文使用的非疫苗方法是指，CpG ODN PF3512676和抗-CTLA-4抗体的组合不与外源抗 原一起使用以刺激对抗原的免疫应答。但是，非疫苗方法可以包括刺 激对内源抗原的免疫应答。内源抗原包括由癌细胞或肿块在体内表达、 释放或脱落的那些抗原。 1.定义除非在本文中另外限定，本发明所使用的科学和技术术语应具有 本领域普通技术人员所通常理解的意义。而且，除非上下文另外需要， 单数形式术语应包括复数形式，复数形式术语应包括单数形式。通常， 本文所述与细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传 学和蛋白核酸化学和杂交相关的术语以及这些技术，是本领域所熟知 和通常使用的。除非另外说明，本发明的方法和技术通常根据本领域所公知的方 法进行，并且在本说明书通篇引用和讨论的各种通用和更专业的参考 文献中有所描述。这样的参考文献包括，例如，Sambrook和Russell， Molecular Cloning, A Laboratory Approach, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (2001)， A廳bel et al. ， Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (2002)， 以及Harlow和Lane Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1990)，通过 参考引用并入本文。如本领域通常的做法或如本文所述，酶促反应和 纯化技术根据厂商的说明进行。本文描述的与分析化学、合成有机化 学以及药物和药剂化学相关的术语及其实验室操作和技术，是本领域 所公知的并在本领域中通常使用。标准技术用于化学合成、化学分析、 药物制备、配制和递送以及对患者的治疗。如本文所用的，下列每个术语具有在该节中伴随其的含义。 本文所使用的冠词"一个(种)"指一个(种)或多于一个(种)(即， 至少一个(种))该冠词的语法对象。作为实例，"一种成分"指一种成 分或一种以上成分。如本文所使用的，20种常规氨基酸和它们的缩写遵从常规的用 法。参见Immunology-A Synthesis (2nd Edition, E. S. Golub和 D. R. Gren，编.，Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991))， 它通过参考引用并入本文。在本文中使用常规表示法描述多肽序列多肽序列的左手端是氨 基末端；多肽序列的右手端是羧基末端。"保守的氨基酸置换"是指，其中氨基酸残基被具有相似化学特 性(例如电荷性或者疏水性)的侧链R基的另 一氨基酸残基所置换。通 常，保守的氨基酸置换不会实质性地改变蛋白质的功能特性。在两个 或者多个氨基酸序列通过保守置换而彼此不同的情况下，序列同一性 百分比或者相似程度可被上调，以校正置换的保守性质。进行这种调 节的方法，对于本领域的技术人员是已知的。参见，例如Pearson, Methods Mol. Biol. 243: 307-31 (1994)。具有相似化学特性的侧链的氨基組的实例包括，1)脂肪族侧链 甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2)脂肪族一羟基侧链 丝氨酸和苏氨酸；3)含有酰胺的侧链天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳香 族侧链苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)碱性侧链赖氨酸、精氨酸 和组氨酸；6)酸性侧链天冬氨酸和谷氨酸以及7)含硫侧链半胱 氨酸和蛋氨酸。优选的保守氨基酸置换組是缬氨酸-亮氨酸-异亮氨 酸，苯丙氨酸-酪氨酸，赖氨酸-精氨酸，丙氨酸-缬氨酸，谷氨酸-天 冬氨酸、以及天冬酰胺-谷氨酰胺。或者，保守替换是在Gonnet等，Science 256:1443-45 (1992) (通过参考引用并入本文)中公开的PAM250对数似然矩阵 (log-likelihoodmatrix)中具有正值的任意改变。"中度保守的"替 换是在PAM250对数似然矩阵中具有非负值的任意改变。优选的氨基酸置换是如下这些(l)减少对蛋白水解的敏感性，(2) 减少对氧化作用的敏感性，(3)改变形成蛋白复合物的结合亲和力，以 及(4)赋予或者修饰该类似物的其它物理化学或功能特性。包含置换、 缺失和/或插入的类似物可以包括除了天然存在的肽序列外的序列的各种突变型蛋白。例如，单个或者多个氨基酸置换(优选保守的氨基酸的多肽部分中)进行。保守的氨基酸置换应不实质性改变母序列的结构 特征(例如，替代氨基酸应不倾向于打破母序列中出现的螺旋或者破坏 表征母序列的其它类型二级结构)。现有技术公认的多肽的二级和三级结构的例子描述于Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton， Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden和J. Tooze编， Garland Publishing,New York,N. Y. (1991));和Thornton等，Nature 354:105 (1991)，各自通过参考引用并入本文。多肽的序列相似性(也称作序列同一性)通常使用序列分析软件 测定。蛋白分析软件利用对各种置换、缺失和其它修饰(包括保守的氨 基酸置换)赋予的相似性衡量来匹配类似序列。例如，GCG含有"Gap" 和"BestfU"等程序，其可以使用缺省参数来测定紧密相关的多肽(例 如来自不同生物物种的同源多肽)之间的、或野生型蛋白质与其突变型 蛋白质之间的序列同源性或序列同一性。参见例如GCG 6. l版本。多 肽序列也可以通过使用GCG 6. 1版本中的FASTA程序，使用默认参数 或推荐参数进行比较。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)提供了查询和研 究的序列之间的最佳重叠区域的比对和序列同一性百分比(Pearson, Methods Enzymol. 183: 63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132: 185-219 (2000))。当将本发明的序列与含有来自不同有机体的大 量序列的数据库进行比较时，另外一种优选的算法是使用默认参数的 计算机程序BLAST,尤其是blastp或tblasm。参见例如Altschul等， J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990); Altschul等，Nucleic Acids Res. 25: 3389-402 (1997)，通过参考引用并入本文。完整的"抗体"包括通过二硫键相互连接的至少两个重链(H)和两 个轻链(U。概述参见Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W.， ed. ， 2nd ed. Raven Press, N. Y. (1989))(为所有目的，整体通过参考引用并入本文)。每一重链由重链可变区(HCVR或VH)和重链恒定 区(Ch)組成。重链恒定区由CH1、 CH2和CH3三个结构域构成。每个轻 链由轻链可变区(LCVR或Vl)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由 一个结 构域G构成。Vh和W区可以进一步划分为高变区(称作互补性决定区 (CDR))以及散布于其中的更为保守的区域(称为构架区(FR))。每个 Vh和Vl由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端到羧基末端按照下列顺 序排列FR1、 CDR1， FR2、 CDR2， FR3、 CDR3， FR4。氨基酸到各个结 构域的分配根据下列定义Kabat， Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health , Bethesda， MD (1987和1991))，或Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia等，Nature 342: 878-883 (1989)。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定 区可以介导免疫球蛋白向宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各 种不同细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。术语"抗体"可包括完整抗体的抗原结合部分，它保留了完整抗体 的特异性结合抗原(例如CTLA-4)的能力。抗原结合部分可以通过重组 DNA技术或通过对完整抗体的酶法或化学切割来生产。抗原结合部分的实例包括(i)Fab片段，即由VL、 VH、 CL和CHl 结构域组成的单价片段；(ii)F(ab。2片段，即包括由铰链区的二硫键 连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CHI结构域组成的Fd 片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)由VH 结构域组成的单域抗体("dAb")，如Ward等，Nature 341:544-546 (1989)所述；和(vi)分离的互补性决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段 的两个结构域(VH和VL)是由分开的基因编码，但是它们可以使用重组 技术通过合成的连接物结合在一起，使它们可制备成为单一蛋白链， 其中Vh和VL区域配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv));参见例如 Bird等Science 242:423-426 (1988);和Huston等Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 (1988))。这种单链抗体也包括在术 语"抗体"之内。"双特异性抗体"具有2种不同的结合特异性，参见，例如，美 国专利号5， 922， 845和美国专利号5, 837, 243; Zeilder J. Immunol. 163:1246-1252 (1999); Somasundaram Hum. Antibodies 9:47-54 (1999); Keler Cancer Res. 57:4008-4014 (1997)。例如，本发明 提供了双特异性抗体，其具有一个对细胞表面抗原(例如人CTLA-4) 的结合位点，和对效应细胞表面上的Fc受体的第二个结合位点。本发 明也提供了多特异性抗体，其具有至少3个结合位点。术语"双特异性抗体"还包括"双体"。双体是二价的、双特异性抗 体，其中Vh和^结构域在单一多肽链上表达，但是使用连接物，该连 接物太短而不允许同一链上的2个结构域之间配对，从而迫使结构域 与另一条链上的互补结构域配对，并建立2个抗原结合位点(参见，例 如，Holliger等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993); Poljak等，Structure 2: 1121-1123 (1994))。本文中可互换使用的术语"人抗体"或者"人序列抗体"，包括 具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区(如果存在)的抗 体。本发明的人序列抗体可包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨 基酸残基(例如通过体外随机或位点专一诱变或者体内体细胞突变所 引入的突变)。但是，本文所使用的术语"人抗体"不意在包括"嵌合" 抗体，所述"嵌合"抗体中来源于其它哺乳类物种的种系(例如小鼠) 的CDR序列已经被嫁接到人构架序列上(即"人源化的"或者primatizedtm抗体)。本文所使用的术语"嵌合抗体"指含有来自两种或者多种不同抗 体的区域的抗体。在一个实施方案中， 一个或者多个CDR来源于人抗 -CTLA-4抗体。在另一个实施方案中，所有的CDR来源于人抗-CTLA-4 抗体。在另一个实施方案中，来源于一种以上的人抗-CTLA-4抗体的 CDR组合在嵌合人抗体内。例如，嵌合抗体可以包括来源于笫一人抗 -CD40抗体的轻链的CDR1 、来源于第二人抗-CTLA-4抗体的轻链的CDR2 和来源于第三人抗-CTLA-4抗体的轻链的CDR3，并且重链的CDR可以 来源于一种或者多种其它抗-CD40抗体。此外，构架区可以来源于同样的抗-CTLA-4抗体之一或者来源于一个或者多个不同的人。而且，正如前述所讨论的，嵌合抗体包括含有来源于一个以上物 种的种系序列的部分的抗体。本文关于抗体使用的术语"竟争"是指，第 一抗体或其抗原结合部 分与第二抗体或其抗原结合部分竟争结合，其中在有第二抗体存在下 第一抗体与它的同源表位的结合，与在没有第二抗体存在下第一抗体 的结合相比，可检测地下降。或者，在有第一抗体存在下第二抗体与 它的表位的结合也可检测地下降，可以如此，但不需要如此。也就是 说，第一抗体可以抑制第二抗体与它的表位的结合，而第二抗体不抑 制第一抗体与它的相应表位的结合。但是，当每种抗体可检测地抑制 另一种抗体与它的同源表位或配体的结合时，无论是相同程度、更大 或更小程度，都认为抗体彼此"交叉竟争"与它们各自表位的结合。 例如，交叉竟争抗体可以结合本发明的抗体(例如，3.1.1， 4.1.1， 4.8.1， 4.10.2， 4.13.1， 4.14.3, 6.1.1, 11.2.1， 11.6.1, 11.7.1， 12. 3. 1.1，和12.9.1.1)所结合的表位或表位的一部分。竟争和交叉 竟争抗体都包含在本发明中。无论这种竟争或交叉竟争的发生机理如何(例如，位阻，构象变化，或结合共同表位或其一部分，等)，技术人 员基于本文提供的教导会明白，这样的竟争和/或交叉竟争抗体都包括 在内且可以用于本文公开的方法中。术语"表位"包括能够特异性结合免疫球蛋白或T细胞受体的任 何蛋白质决定簇。表位决定簇通常由具有化学活性的表面分子结群例 如氨基酸或糖侧链组成，并且通常具有特异性的三维结构特征以及特 异性的电荷特征。构象和非构象表位的区别在于，在有变性溶剂存在 下，与前者的结合会丧失，但是与后者的结合不会，本文所使用的短语"特异性结合"指如蛋白质、核酸、抗体等化 合物识别和结合样本中的特定分子，但实质上不识别或结合其它分子。 例如，识别和结合样本中的同源配体的抗体或者肽抑制剂(例如结合其 同源抗原CTLA-4的抗-CTLA4抗体)，但实质上不识别和结合样本中的 其它分子。因此，在指定的检测条件下，指定的结合部分(例如，抗体或其抗原结合部分)优先与特定目标分子结合，而不以显著量与测试样 本中存在的其它成分结合。许多检测形式可用于选择能与目标分子特异性结合的抗体。例如，使用固相ELISA免疫检测、免疫沉淀反应、 BIAcore以及蛋白印迹分析来识别能与CTLA-4特异性反应的抗体。典 型地，特异性或者选择性的反应至少是背景信号或噪声的两倍，更典 型超过10倍背景，更为具体地，当平衡解离常数(K。) <1 )iM、优选 <100 nM和最优选《10 nM时，称抗体"特异性结合"抗原。 术语"KD"指特定抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。 本文所使用的"基本上纯的"指，目标物种是存在的占优势的物 种(即，基于摩尔，它比组合物中的任何其它单独的物种更丰富)，优 选基本上纯的级分是这样的组合物，其中目标物种(例如抗-CTLA-4抗 体)占存在的所有大分子物种的至少约50%(基于摩尔)。通常，基本 上纯的组合物含有超过约80%的组合物中存在的所有大分子物种，更 优选超过约85%、 90%、 95%和99%。最优选地，目标物种纯化到基中组:物基本上由单一^分子物种^成。^ ',"', 、 本文使用的术语"有效量"或"治疗有效量"是指，当施用给哺乳动 物、优选人时，与在没有该化合物的情况下检测到的反应相比会介导 可检测的治疗反应的量。通过许多本领域公知的方法，包括，例如， 本文公开的这些方法，可以容易地评价治疗反应，例如、但不限于， 肿瘤生长的抑制和/或减小(包括肿瘤大小停滞)，肿瘤大小，转移等。 本领域技术人员会明白，本文施用的化合物或组合物的有效量可 以变化，且可以基于许多因素容易地确定，例如所治疗的疾病或病症， 疾病的阶段，治疗的哺乳动物的年龄和健康和身体状况，疾病的严重 性，施用的具体化合物，等。"治疗有效量"或"有效量"意在定量将瘤形成病症的一种或多种 症状可检测地减轻至一定程度所需的试剂量，包括、但不限于1)癌 细胞数的减少；2)肿瘤大小的减小；3)对癌细胞向周围器官中浸润 的抑制(即，减慢至一定程度，优选停止)；3)肿瘤转移的抑制(即，减慢至一定程度，优选停止)；4)抑制肿瘤生长至一定程度；5)在一 定程度上緩解或减轻与病症有关的一种或多种症状；和/或6)緩解或 减轻与施用抗癌剂有关的副作用。结合本文提供的教导，通过选择各种活性化合物和加权因子(例 如效力，相对生物利用度，患者体重，不利副作用的严重性和优选的 给药模式)，可以计划有效的预防性或治疗性处理方案，它不会造成 实质的毒性，且仍然能完全有效地治疗特定患者。任意特定应用的有 效量，可以取决于所治疗的疾病或病症、疾病或病症的严重性、和患 者的健康和大小等因素而变化。本领域普通技术人员可以经验为主地确定CpGODNPF3512676、抗-CTLA-4抗体和/或其它治疗剂的有效量， 不需要过度实验。0DN和/或抗体单独或一起的治疗有效量，可以从动物模型最初确 定。治疗有效剂量也可以从特定ODN和/或特定抗体的人数据确定，或 从已知会表现出类似的药理学活性的其它化合物的人数据确定。肠胃 外给药可能需要更高的剂量。应用的剂量可以根据施用的化合物的相 对生物利用度和效力来调节。在上述方法和本领域熟知的其它方法的 基础上调节剂量来达到最大效能，是在普通技术人员的能力范围内。本文使用的术语"指导材料"包括出版物、录音、图表、或任意其 它表达介质，它们可以用于传达本发明的化合物、组合/或组合物在用 于影响、减轻或治疗本文所述的各种疾病或病症的药盒中的有用性。 任选地或可选地，指导材料可以描述一种或多种减轻细胞、组织或哺 乳动物的疾病或病症的方法，包括本文别处公开的方法。药盒的指导材料可以例如附着在装有本发明的化合物和/或组合 物的容器上，或可以与装有化合物和/或组合物的容器一起运输。或者， 指导材料可以与容器分开运输，意图使接受者协作地使用指导材料和 化合物。本发明的ODN和/或抗体可以在药剂分配器中提供。药剂分配器是 限定多个药物贮存隔室的包装，每个隔室用于容纳单个单元的药剂。 完整的药物疗程装在多个药物贮存隔室中。限定多个药物贮存隔室的包装可以是任意类型的一次性药物包装 或卡片，其将药剂容纳在单个隔室中。例如，包装是从卡片构建的泡 軍包装，其可以从坚硬的纸材料、泡罩片和背衬板制备。这样的卡片 是本领域普通技术人员众所周知的。作为一个实例，药剂分配器可以盛装整个药物疗程。分配器可以 包括日期标记，以指明哪一天服用单个药剂单元。它们可以沿着药剂 包装的第一侧面进行标记。也可以标示剂量标记，例如沿着与药剂包 装第 一侧面垂直的药剂包装第二侧面，从而指明服用单个药剂单元的 时间。单位剂量可以包含在泡軍式分配器中。除特别指出外，术语"患者，'或"受试者"可互换使用，指哺乳动物 例如人患者和非人灵长类动物，以及兽医对象例如兔、大鼠和小鼠， 以及其它动物。优选地，患者指人类。本文使用的"治疗"指，降低患者经历的疾病症状(即，肿瘤生长和 /或转移，或由免疫细胞的数量和/或活性介导的其它作用等)的频率。 该术语包括，施用本发明的化合物或试剂来预防或延迟疾病的症状、并发症或生化标记(例如，前列腺癌中PSA水平的升高)的发生，减轻 症状，或阻止或抑制疾病、病症或障碍的进一步发展。治疗可以是预 防性的(预防或延迟疾病的发生，或预防其临床或亚临床症状的出现) 或在疾病出现后治疗性抑制或减轻症状。"联合治疗"包括施用CpG 0DN PF3512676和CTLA-4抗体，作为 意在提供这些治疗剂共同作用的有益作用的特定治疗方案的一部分， 组合的有益作用包括、但不限于，源自治疗剂组合的药代动力学的或 药效学的共同作用。这些治疗剂的联合给药，通常在限定的时间段内 进行(通常是几分钟，几小时，几天或几周，这取决于选择的组合)。" 联合治疗"通常无意包括施用2种或多种这样的治疗剂作为偶然地和 任意地导致本发明组合的分开单一治疗方案的一部分。"联合治疗"包括以顺序方式施用这些治疗剂，也就是说，其中在 不同时间施用每种治疗剂，以及以基本上同时的方式施用这些治疗剂 或至少2种治疗剂。基本上同时给药可以如下实现，例如，通过给受试者施用具有固定比例的每种治疗剂的单个胶嚢，或多个每种治疗剂 的单独胶嚢。每种治疗剂的顺序的或基本上同时的给药，可以通过任 意适当途径来实现，包括、但不限于，经口途径，静脉内途径，肌肉 内、皮下途径，和通过粘膜组织直接吸收。治疗剂可以通过相同途径或不同途径来施用。例如，第一种治疗剂(例如，CpG 0DN PF3512676) 可以通过皮下注射来施用，第二种试剂(例如，抗-CTLA-4抗体)可以 静脉内施用。此外，选定组合中的第一种治疗剂可以通过静脉内注射 来施用，而组合中的其它治疗剂可以经口施用。或者，例如，2种治 疗剂均可以经口施用，或2种治疗剂均可以通过静脉内注射施用。"联合治疗"也可以包括上述治疗剂进一步与其它生物活性成分 (例如、但不限于，第二种不同的抗肿瘤试剂，树突疫苗或其它肿瘤疫 苗)和非药物治疗(例如、但不限于，手术或放射治疗)联合施用。当联 合治疗还包含放射治疗时，放射治疗可以在任意适当的时间进行，只 要达到治疗剂和放射治疗组合的共同作用的有益效果即可。例如，在 适当情况下，当从治疗剂给药中暂时去除放射治疗(可能几天或甚至 几周)时，仍然达到有益效果。II.抗-CTLA-4抗体如本文前面别处所述，优选的抗-CTLA-4抗体是特异性结合人 CTLA-4的人抗体。示例性的人抗-CTLA-4抗体详细描述在2000年6 月29日公开的公开号为W0 00/37504的国际申请号PCT/US99/30895, 2002年4月12日公开的欧洲专利申请号EP 1262193 Al，和现在授权 给Hanson等美国专利号6, 682, 736的美国专利申请号09/472,087， 以及公开为US2002/0086014的美国专利申请号09/948, 939中，它们 的所有公开内容特此通过参考引用并入本文。这样的抗体包括、但不 限于，3.1. 1， 4.1.1， 4. 8.1， 4.10. 2， 4.13.1， 4.14. 3， 6.1.1， 11. 2.1， 11.6,1, 11.7.1， 12. 3.1. l，和12.9. 1.1，以及MDX-010。人抗体会 在本发明的治疗方法中提供实质的优势，因为预见到它们会使人患者 中与非人抗体的使用有关的免疫原性和变应性反应最小化。在WO 00/37504, EP 1262193，和美国专利号6, 682, 736以及美 国专利申请公开号US2002/0086014和US2003/0086930中，广泛地讨 论了本发明的有用的人抗-CTLA-4抗体的特征，其中所述的氨基酸和 核酸序列整体通过参考引用并入本文。简而言之，本发明的抗体包括 具有以下抗体的氨基酸序列的抗体例如、但不限于，抗体3.1.1， 4.1.1， 4.8.1， 4.10.2， 4.13.1, 4.14.3， 6.1.1， 11.2.1， 11.6.1， 11.7.1， 12.3.1.1， 12. 9. 1. l，和MDX-010.本发明也涉及具有这些抗 体的重链和轻链的CDR的氨基酸序列的抗体，以及上述申请和专利所 述的具有CDR区中的变化的抗体。本发明也涉及具有这些抗体的重链 和轻链的可变区的抗体。在另一个实施方案中，抗体选自具有抗体 3.1.1， 4.1.1， 4.8.1， 4,10.2， 4. 13. 1, 4. 14. 3, 6.1.1， 11.2.1， 11.6.1， 11.7.1， 12. 3. 1.1，和12. 9. l，l，和MDX-010的重链和轻链的 全长、可变区或CDR氨基酸序列的抗体。在一个实施方案中，本发明包含抗体-治疗剂组合，其包含在>^开 为美国专利申请公开号2002/0086014和2003/0086930的美国专利申 请号09/M8， 939和其中引用的参考文献中公开的人抗-CTLA-4抗体， 包括、但不限于，MAb 10D1 (MDX-OIO， Medarex， Princeton, NJ)。 更优选地，抗-CTLA-4抗体是MDX-Q1G。或者，抗-CTLA-4抗体是 11.2.1 (Ticilim画b; CP-675, 206)。在另一个实施方案中，VH的氨基酸序列包含SEQ ID NO: 3， 15和 27所述的氨基酸序列。在另一个实施方案中，t包含SEQ ID N0:9， 21和33所述的氨基酸序列。更优选地，Vh和Vl分別包含SEQIDN0:3 (VH 4.1. l)和SEQ ID NO: 9 (VL4.1. l)所述的氨基酸序列;SEQ ID NO: 15 (VH 4. 13. l)和SEQ ID NO: 21 (VL4.13.1)所述的氨基酸序列；和SEQ ID NO: 27 (VH 11.2. l)和SEQ ID NO: 33 (VL11. 2.1)所述的氨基酸序列。在另一个实施方案中，重链的氨基酸序列包含由包含SEQ ID NO: 1， 13，和25所述核酸序列的核酸编码的氨基酸序列。在另一个实施方 案中，轻链包含由包含SEQIDN0:7， 19和31所述核酸序列的核酸编 码的氨基酸序列。更优选地，重链和轻链分别包含由包含下述核酸序列的核酸编码的氨基酸序列SEQIDN0:1 (重链4. 1. 1)和SEQ ID NO: 7 (轻链4. 1. l)所述核酸序列；SEQ ID NO: 13 (重链4.13. 1)和SEQ ID NO: 19 (轻链4. 13. l)所述核酸序列;和SEQ ID NO: 25 (重链11. 2. 1) 和SEQ ID NO: 31 (轻链11. 2. 1)所述核酸序列。此外，抗体可以包含重链氨基酸序列，后者包含源自VH 3-30或 3-33基因、或其中的保守置换或体细胞突变的人CDR氨基酸序列。抗 体也可以在它的轻链中包含CDR区，其源自A27或012基因，即，小 于5个、或小于IO个这样的突变。抗体也可以包含来自这些基因的构 架区，包括相差小于5个、或小于IO个氨基酸的那些。也包括具有本 文所述构架区的抗体，它们已经突变来反映原始种系序列。在本发明的其它实施方案中，抗体会抑制CTLA-4和B7-1之间的 结合，CTLA-4和B7-2之间的结合，或二者。优选地，抗体可以以约 100 nM或更低、更优选约10 nM或更低，例如约5 nM或更低，更优 选约2 nM或更低，或更优选例如约1 nM或更低的IC5。，抑制与B7-l 的结合。类似地，抗体可以以约100nM或更低、更优选约10nM或更 低，例如更优选约5 nM或更低，更优选约2 nM或更低，或更优选例如 约1 nM或更低的IC5。，抑制与B7-2的结合。此外，在另一个实施方案中，抗-CTLA-4抗体具有对CTLA-4约 10—s的结合亲和力，或更大的亲和力，更优选约10—9或更大的亲和力， 更优选约10—"或更大的亲和力，更优选约10—"或更大的亲和力。抗-CTLA-4抗体可以与具有选自4.1.1， 6.1. 1， 11.2, 1， 4.13.1 和4. 14. 3的抗体的重链和轻链氨基酸序列的抗体竟争结合。此外，抗 -CTLA-4抗体可以与MDX-010抗体竟争结合。在另一个实施方案中，抗体优选地与具有抗体4.1.1， 4.13.1， 4. 14. 3， 6. 1.1.或11. 2. 1的重链和轻链序列、可变重链和可变轻链序 列、和/或重链和轻链CDR序列的抗体交叉竟争。例如，抗体可以结合 具有选自4.1.1， 4,13.1， 4.14.3， 6.1.1，或11.2. l的抗体的重链和 轻链氨基酸序列、可变序列和/或CDR序列的抗体所结合的表位。在另 一个实施方案中，抗体与具有MDX-010的重链和轻链序列或抗原-结合序列的抗体交叉竟争。在另一个实施方案中，使用包含下述重链和轻链的抗-CTLA-4抗 体实施本发明包含选自3.1.1， 4.1.1， 4.8.1, 4.10.2, 4.13.1， 4.14.3， 6.1.1， 11.2.1， 11.6.1, 11.7.1， 12. 3. 1. 1，和12.9.1.1 的抗体的CDR-l、CDR-2、和CDR-3氨基酸序列的重链，包含选自3. 1. 1， 4.1.1, 4.8.1， 4.10.2， 4.13.1， 4.14.3， 6.1.1， 11.2.1， 11.6.1， 11.7.1， 12. 3. 1. l，和12. 9. 1. 1的抗体的CDR-1、 CDR-2、和CDR-3氨 基酸序列的轻链，或具有选自以下的所述CDR序列变化的序列保守 变化，其中所述保守变化选自将非极性残基替换为其它非极性残基， 将极性带电荷的残基替换为其它极性不带电荷的残基，将极性带电荷 的残基替换为其它极性带电荷的残基，和结构类似的残基的置换；非 保守置换，其中所述非保守置换选自将极性带电荷的残基置换为极 性不带电荷的残基，和将非极性残基置换为极性残基，添加和缺失。在本发明的另一个实施方案中，抗体在构架区或CDR区中含有从 种系序列小于IO， 7， 5，或3个氨基酸变化。在另一个实施方案中， 抗体在构架区中含有小于5个氨基酸变化，在CDR区中含有小于10 个变化。在一个优选的实施方案中，抗体在构架区中含有小于3个氨 基酸变化，在CDR区中含有小于7个变化。在一个优选的实施方案中， 构架区中的变化是保守的，CDR区中的变化是体细胞突变。在另一个实施方案中，抗体在重链和轻链CDR-1、 CDR-2和CDR-3 序列中与抗体3. 1. 1， 4. 1. 1， 4. 8. 1, 4. 10. 2， 4. 13. 1， 4. 14. 3， 6. 1. 1， 11.2.1， 11,6.1， 11.7.1， 12. 3. 1. l，和12. 9. 1. 1的CDR序列具有至 少80%、更优选至少85%、更优选至少90%、更优选至少95%、更优选 至少99%序列同一性。更优选地，抗体在重链和轻链CDR-1、 CDR-2 和CDR-3序列中与抗体3.1.1,4.1.1,4. 8.1,4.10. 2,4.13.1,4.14. 3， 6.1.1， 11.2.1， 11.6.1， 11.7.1， 12.3.1. l，和12.9.1.1的序列具 有100%序列同一性。在另一个实施方案中，抗体在重链和轻链可变区序列中与抗体 3.1.1， 4.1.1， 4.8.1， 4.10.2， 4.13.1， 4,14.3， 6.1.1， 11.2.1，11.6.1， 11.7.1, 12. 3. 1. l,和12. 9. 1. 1的可变区序列具有至少80%、 更优选至少85%、更优选至少90%、更优选至少95°y4、更优选至少99% 序列同一性。更优选地，抗体在重链和轻链可变区序列中与抗体 3.1.1， 4.1.1， 4.8.1， 4.10.2， 4.13.1， 4.14.3， 6.1.1， 11.2.1， 11. 6. 1, 11. 7. 1， 12. 3. 1. l，和12. 9. 1. 1的序列具有100%序列同一性。尽管可能优选本文前面讨论的抗-CTLA-4抗体，本领域的技术人 员基于本文所提供的公开内容，将会理解本发明包括多种抗-CTLA-4 抗体，且不限于这些特定的抗体。更具体地，尽管优选人抗体，但是 本发明不限于人抗体；相反，本发明包括各种有用的抗体而不管物种 起源，并且尤其包括嵌合人源化和/或灵长动物源化抗体。而且，尽管 本文示例的抗体通过使用转基因哺乳动物(例如，含有人免疫所有组成 部分的小鼠)获得，本领域的技术人员基于本文所提供的公开内容，可 以理解本发明不限于通过这种方法或者通过其它任何特定方法产生的 抗体。取而代之的是，本发明包括通过任何方法产生的抗-CTLA-4抗 体，包括但不限于本领域已知的方法(例如筛选噬菌体展示文库等)或 者在将来开发的用于产生本发明的抗-CTLA-4抗体的方法。基于本文 所提供的、以及在例如Bedian等的美国专利第6， 682， 736号、和美 国专利申请公开第2002/0088014号中广泛公开的内容，本领域的技术 人员能够轻易地产生和鉴定对于使用本文公开的新方法与治疗剂联合 治疗乳腺癌有用的抗体。本发明包括用转基因非人哺乳动物产生的人抗体，即，公开于 Hanson等的U. S. 6, 682, 736中的XenoMouse (Abgenix， Inc., Fremont, CA)。另一个产生"人"抗体的转基因鼠系统称为"HuMAb-Mouse " (Medarex， Princeton, NJ)，它含有编码非重排的人重链(jn和y)和 K轻链免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因小基因座，连同使内源性 的jj和K链基因座失活的把向突变(Lonberg等Nature 368:856-859 (1994)以及美国专利第5,770,429号)。但是，本发明使用通过用任意转基因哺乳动物制成的人抗-CTLA-4抗体，所述转基因哺乳动物例如但不限于Kirin TC Mouse (Kirin Beer Kabushiki Kaisha， Tokyo, Japan),例如Tomizuka等，Proc Natl Acad Sci USA 97: 722 (2000); Kuroiwa等，Nature Biotechnol 18: 1086 (2000);Mikayama等的美国专利申请公开第2004/0120948号 所述以及前述的HuMAb-Mouse (Medarex， Princeton, NJ)和 XenoMouse (Abgenix， Inc. ， Fremont, CA)。因此，本发明包括4吏 用通过用任意转基因或者其它非人动物制成的抗-CTLA-4抗体。此外，尽管生产人抗-CTLA-4抗体的优选方法包含，使用含有人 免疫所有组成部分的非人转基因哺乳动物制备抗体，本发明不限于该 方案。相反，本领域技术人员会明白，在本文提供的公开内容的基础 上，本发明包括使用对CTLA-4特异性的人或任何其它抗体的任意生产 方法，根据本领域已知的任意方法或者在将来开发的用于产生特异性 结合目标抗原的抗体的方法制备。人抗体可以通过下述方法制备，包括、但不限于，使用噬菌体展 示抗体文库。使用这些技术，可以针对CTLA-4表达细胞、CTLA-4本 身、CTLA-4形式、其表位或肽、和其表达文库产生抗体(见例如美国 专利5， 703， 057),然后可以筛选它们的上述活性。在另一个实施方案中，本发明的方法所使用的抗体不是完全的人 抗体，而是"人源化"的抗体。更具体地，鼠抗体或者源自其它物种 的抗体能通过用本领域公知的技术而被"人源化，，或者"灵长动物源 化"。参见例如Winter和Harris Immunol. Today 14: 43-46 (1993)， Wright等 Crit. Reviews in Immunol. 12:125-168 (1992)，和 Cabilly等的美国专利第4， 816， 567号，以及Mage和Lamoyi in Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications pp. 79-97， Marcel Dekker，Inc. , NewYork， NY (1987)。可以理解，基于本文所提供的公开内容，用于本发明的抗体能从 转基因非人类哺乳动物以及源自它们的杂交瘤获得，但也能在除了杂交瘤之外的细胞系中表达。可得到的作为表达宿主的哺乳动物细胞系为本领域所公知，包括许多可获自美国典型培养物中心(ATCC)的永生化细胞系，包括但不限 于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，NSO, HeLa细胞，幼仓鼠肾(BHK)细胞， 猴肾细胞(COS)和人肝细胞癌细胞(例如Hep G2)。也可使用非哺乳动 物原核和真核细胞，包括细菌、酵母、昆虫和植物细胞。可以使用本领域所公知的各种表达系统，例如但不限于，在例如 Sambrook和Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Approach, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (2001)，和 Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons， NY (2002)中所描述的那些。这些表达系统尤其包括基于二氢 叶酸还原酶(DHFR)的系统。谷氨跣胺合成酶表达系统在欧洲专利号EP 216 846， EP 256 055,和EP 323 997以及欧洲专利申请号89303964 中有全部或部分讨论。在一个实施方案中，所使用的抗体在NS0细胞 中用谷氨酰胺合成酶系统(GS-NSO)制成。在另一个实施方案中，抗体 在CH0细胞中用DHFR系统制成。这两种系统都为本领域所公知，尤其 在Barnes等的Biotech & Bioengineering 73: 261—270 (2001)和其 中引用的参考文献中有所描述。对抗体CH2结构域定点诱变以消除糖基化可能是优选的，以便阻 止由非人糖基化引起的免疫原性、药代动力学功能和/或效应功能变 化。此外，通过酶(参见，例如，Thotakura等Meth. Enzymol. 138: 350 (1987))和/或化学方法(参见，例如，Hakimuddin等，Arch. Biochem. Biophys. 259:52 (1987))，可以将抗体去糖基化。此外，本发明包括使用含有改变的糖基化方式的抗-CTLA-4抗体。 基于本文所提供的公开内容，本领域的技术人员能够理解，与天然存 在的抗体相比，抗-CTLA-4抗体能被修饰成包括额外的、更少的或者 不同的糖基化位点。这种修饰在例如美国专利申请公开第 2003/0207336和2003/0157108号、以及国际专利公开第WO 01/81405 和00/24893号中有所描述。此外，本发明包括使用抗-CTLA-4抗体，而不论抗体上存在的糖 形(如果存在)。而且，用于广泛地重新塑造存在于糖蛋白上的糖形的方法，在现有技术中已知，包括，例如在国际专利公开第WO 03/031464、 W098/58964和W099/22764号，以及美国专利申请公开笫 2004/0063911、 2004/0132640、 2004/0142856、 2004/0072290号，以 及Umana等的美国专利第6， 602， 684号中描述的那些。而且，本发明包括使用含有任何现有技术中已知的共价和非共价 修饰的抗-CTLA-4抗体，所述修饰包括但不限于，将多肽与各种非蛋 白质聚合物(例如聚乙二醇、聚丙二醇、或聚氧化烯)之一按照例如美 国专利申请公开第2003/0207346和2004/0132640号、以及美国专利 第4， 640， 835、 4， 496， 689、 4,301， 144、 4, 670, 417、 4， 791， 192、 4, 179， 337号中描述的方式连接。此外，木发明包括使用抗-CTLA-4抗体、或其抗原结合部分、嵌 合蛋白质(包括，例如人血清白蛋白多肽)、或其片段。不论嵌合蛋白 质是否使用重组方法来生产，例如通过编码嵌合蛋白质的嵌合核酸的 克隆、或通过两个肽部分的化学鍵连，本领域的技术人员一旦具有本 发明提供的教导便可以理解，该嵌合蛋白质在现有技术是已知的，并 且该嵌合蛋白质能够赋予希望的生物特性，例如但不限于，增加本发 明的抗体的稳定性和血清半衰期，因此这类分子也包括在本文中。用于本发明而生产的抗体不需要开始便具有特定的需要的同种 型。而是，所产生的抗体可以具有任何同种型，并且可以是此后使用 常规技术转换的同种型。这些包括直接重组技术(参见，例如美国专利 4，816， 397)、和细胞-细胞融合技术(参见例如美国专利第5， 916,771 号)。本发明的抗体的效应功能可以通过同种型转换至IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgD、 IgA、 IgE或IgM来改变，而用于多种治疗用途。 而且，通过4吏用例如双特异物(bispecifics)、免疫毒素、或放射性标 记，可以避免细胞杀伤的补体依赖性。因此，尽管用于本发明的优选抗体由具有3.1. 1， 4.1.1， 4.8.1， 4. 10. 2， 4. 13. 1， 4. 14. 3， 6. 1. 1， 11. 2.1， 11. 6.1， 11. 7. 1， 12. 3.1. 1， 12. 9. 1. 1，和MDX-010的氨基酸序列或例如其V区或CDR的序列的抗体例示，本发明绝不限于使用这些或任何其它特定的抗体。本发明包括组合施用本发明的任意抗-CTLA-4抗体和至少一种激素治疗剂。优选 地，抗体是4. 1.1， 4.13.1， 11. 2. 1，和/或MDX-OIO。但是，在本发明 的方法中，可以使用在本文别处所述的或本领域已知的或将来开发的 任意抗-CTLA-4抗体或其抗原结合部分。更具体地，人源化嵌合抗体， 源自任意物种的抗-CTLA-4抗体(包括在例如Casterman和Hamers的 美国专利号5， 759， 808和6， 765， 087中描述的从camel ids得到的单 链抗体)，以及任意人抗体，可以与治疗剂相组合，用于实现本文公开 的新方法。本发明也包括尤其在国际专利公开号W0 00/37504 (2000年6月 29日公开);W0 01/14424 (2001年3月1日公开)；WO 93/00431 (1993 年1月7日公开)；和W0 00/32231 (2000年6月8日公开)中公开的这 样的抗体。尽管抗体4.1.1, 4. 13. 1和11. 2. 1为lgG2抗体，且所述抗体 的可变区的序列提供在本文(图1 — 3)，在本文参考和引入的申请和专 利中，可以理解，本文包括这些抗体的全长序列，以及包括SEQIDNO: 1一36中所列的序列并进一步包括任何恒定区的任意抗体的应用，而 不论在本文别处更充分讨论的同种型。同样，包括MDX-010的全长序 列或其任意部分(包括编码MDX-010的抗原结合部分的序列)的任意抗 体，可以与至少2种激素治疗剂组合施用，从而治疗前列腺癌。因而，本领域技术人员在获知本文提供的教导后会容易地明白， 本发明的抗-CTLA-4抗体-治疗剂组合可以包含众多的抗-CTLA-4抗 体。而且，本领域的技术人员基于本文提供的内容可以理解，本发明 不限于仅仅单一抗体的给药相反，本发明包括与治疗剂组合施用至 少一种抗-CTLA-4抗体，例如4.1. 1， 4.13. l和11. 2,1。而且，本发 明包括施用任意已知抗-CTLA-4抗体的任意组合，包括、但不限于， 施用治疗剂与例如4，1.1， 4.13.1， 11.2. 1和MDX-010组合。因而， 抗-CTLA-4抗体的任意组合可以与至少一种治疗剂组合，本发明包括任意这类组合及其改变。III. CpG 0DNCpG寡核苷酸含有被发现会引起免疫应答的特定序列。这些特定 序列称作"免疫刺激基序"，含有免疫刺激基序的寡核苷酸称作"免疫刺 激寡核苷酸分子"和等同地"免疫刺激寡核苷酸"。免疫刺激寡核苷酸包 括至少一个免疫刺激基序，优选地该基序是内部基序。术语"内部免 疫刺激基序"指比基序序列长至少一个核苷酸(在5'和3'末端)的寡 核苷酸序列内基序序列的位置。CpG寡核苷酸包含至少一个未甲基化的CpG二核苷酸。含有至少 一个未甲基化的CpG 二核苷酸的寡核苷酸是含有胞嘧啶-鸟嘌呤二核 苷酸序列的寡核普酸分子(即，"CpGDNA"或含有通过磷酸键连接到3' 鸟嘌呤上的5'胞嘧啶的DNA)，且激活免疫系统。整个CpG寡核苷酸 可以是未曱基化的，或部分可以是未甲基化的，但是至少5' CG 3'的 C必须是未甲基化的。B类CpG寡核苷酸用下式表示5' X!CGX2其中X,和X2是核苷酸。在有些实施方案中，Xt可以是腺噪呤， 鸟嘌呤，或胸腺嘧啶，和/或l可以是胞嘧啶，腺嘌呤，或胸腺嘧咬。 B类CpG寡核苷酸也用下式表示其中X" X2， X3，和X4是核苷酸。X2可以是腺噪呤，鸟嘌呤，或胸 腺嘧啶。x3可以是胞嘧啶，腺嘌呤，或胸腺嘧啶。B类CpG寡核苷酸包括由至少下式代表的寡核苷酸其中Xn X2, l，和X4是核苷酸，且N是任意核苷酸，N,和R是 各自由约0-25个N组成的寡核苷酸序列。XJ2可以是选自下述的二 核苷酸GpT, GpG, GpA， ApA， ApT， ApG， CpT， CpA, CpG, TpA， TpT， 和TpG;XX可以是选自下述的二核苷酸TpT， ApT， TpG， ApG， CpG，TpC， ApC， CpC, TpA， ApA、和CpA。B类CpG寡核苷酸公开在PCT公开专利申请PCT/US95/01570和 PCT/US97/19791，和分别在2001年2月27日和2001年5月29日授 权的USP 6， 194， 388 Bl和USP 6， 239， 116 Bl中。免疫刺激寡核苷酸分子可以具有同质主链(例如，完全磷酸二酯或 完全硫代磷酸酯)或嵌合主链。为本发明的目的，嵌合主链是指部分稳 定的主链，其中至少一个核普酸间连接是磷酸二酯或磷酸二酯样连接， 且其中至少一个其它核苷酸间连接是稳定的核苷酸间连接，其中所述至少一个磷酸二酯或磷酸二酯样连接和所述至少一个稳定的连接是不 同的。由于已有报道boranophosphonate连接相对于磷酸二酯连接来 说是稳定的，为所述主链的嵌合性质的目的，boranophosphonate连 接可以分类为磷酸二酯样或分类为稳定的，这取决于其所处环境。例 如，在一个实施方案中，根据本发明的嵌合主链可包括至少一个裤酸 二酯(确酸二酯或磷酸二酯样)连接和至少一个boranophosphonate (稳定的)连接。在另一个实施方案中，根据本发明的嵌合主链可以包 括boranophosphonate (磷酸二酯或磷酸二酯样)连接和硫代磷酸酯 (稳定的)连接。"稳定的核苷酸间连接"是指与砩酸二酯核苷酸间连 接相比，相对能够抵抗体内降解(例如通过核酸外切酶或核酸内切酶) 的核苷酸间连接。优选的稳定的核苷酸间连接包括但不限于硫代磷酸 酯，二硫代磷酸酯，膦酸甲酯，和曱基硫代彿酸酯。其它稳定的核苷 酸间连接包括但不限于肽，烷基，去磷酸类型的连接，和其它上述连 接。修饰的主链例如硫代磷酸酯可以用亚磷酰胺或H-膦酸化学方法 用自动技术合成。可以用例如美国专利号4， 469， 863中描述的方法制 备芳基-和烷基-膦酸；烷基磷酸三酯(其中带电荷的氧部分烷基化)， 例如美国专利号5, 023， 243和欧洲专利号092, 574中所述，可以使用 商业可获得的试剂用自动固相合成方法制备。制备其它DNA主链修饰 和取代的方法已有描述。Uhlmann E等(1990) Chem Rev 90: 544; Goodchild J (1990) Bioconjugate Chem 1:165。制备嵌合寡核苷酸的方法也是已知的。例如Uhlmann等的专利中已经描述了这些技术。混和主链修饰的ODN可以使用商业可获得的DNA合成仪和标准亚 磷酰胺化学合成。(F. E. Eckstein, "Oligonucleotides and Analogues-A Practical Approach" IRL Press, Oxford, UK, 1991, 和M. D. Matteucci和M. H. Caruthers， Tetrahedron Lett. 21. 719 (1980))。偶联以后，通过用Beaucage试剂(R. P. Iyer， W. Egan， J. B. Regan and S. L. Beaucage, J. Am. Chem. Soc. 112， 1253 (1990))(在乙腈中浓度为0. 075 M)或苯乙酰二硫化物(PADS)进行硫化 反应，然后用乙酸酐，2，6-卢剔啶的四氢呋喃溶液(1:1:8; v:v:v)和 N-甲基咪唑(在四氢呋喃中浓度为16%)加帽，引入PS连接。该加帽 步骤在硫化反应之后进行，以使在应是硫代磷酸酯的位置上不希望的 磷酸二酯(P0)连接的形成降到最低限度。在磷酸二酯连接的引入过程 中，例如在CpG二核苷酸上，中间体磷-III通过用碘的水/吡咬溶液 处理被氧化。从固体支持物上切割下来并通过浓氨水的处理进行最后 的去保护(15小时，50n)以后，通过用NaCl梯度(例如緩沖液A:乙 腈/水=1: 4/v: v中NaH2P04浓度为10mM， pH6. 8; 緩沖液B:乙腈 /水=1: 4/v: v中NaH2P04浓度为10mM, NaCl浓度为1. 5M;在30分钟 内5到60。/。B，速度为1 ml/min)在Gen-Pak Fax柱(Millipore-Waters) 上进行HPLC，或通过毛细管凝胶电泳，分析0DN。可以用HPLC或在 Source High Performance柱 (Amersham Pharmacia)上用FPLC纯化 0DN。将HPLC—同质级分合并，并通过C18柱或超滤进行脱盐。用 MALDI-TOF质谦对ODN进行分析，以证实计算的质量。本发明的寡核苷酸还可以包括其它修饰。它们包括非离子的DNA 类似物，例如烷基-和芳基-磷酸(其中带电荷的膦酸氧被烷基或芳基取 代)，磷酸二酯和烷基磷酸三酯，其中带电荷的氧部分被烷基化。在任 一末端或两个末端含有二醇(例如四乙二醇或六乙二醇)的寡核苷酸， 还已显示能基本上抵抗核酸酶降解。在有些实施方案中，所述寡核苷酸可以是柔性或半柔性寡核苷酸。 柔性寡核苷酸是具有部分稳定主链的免疫刺激寡核苷酸，其中只在至少一个内部嘧啶-噪呤二核普酸(YZ)的内部或其紧邻处存在磷酸二酯 或磷酸二酯样核苷酸间连接。优选YZ是YG，嘧啶-鸟嘌呤核苷(YG)二 核苷酸。所述至少一个内部YZ 二核苷酸本身具有磷酸二酯或磷酸二酯 样核苷酸间连接。紧邻所述至少一个内部YZ 二核苷酸存在的磷酸二酯 或磷酸二酯样核苷酸间连接可以是在所述至少一个内部YZ 二核苷酸 的5， ， 3，或同时在5，和3，。更具体地，磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接涉及"内部二核 苷酸"。通常内部二核苷酸是指任意一对通过核苷酸间连接相连的相 邻核苷酸，其中该对核苷酸中的任何一个核苷酸都不是末端核苷酸， 即，该对核苷酸中没有一个核苷酸是限定寡核苷酸的5，或3，末端的 核苷酸。因此n个核苷酸长的线性寡核苷酸具有总共n-l个二核苷酸， 只有n-3个内部二核苷酸。内部二核苷酸的每个核苷酸间连接都是内 部核苷酸间连接。因此n个核苷酸长的线性寡核苷酸具有总共n-l个 核苷酸间连接，只有n-3个内部核苷酸间连接。因此，策略性放置的 磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接指位于寡核香酸序列中任意一对 核苷酸之间的磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接。在一些实施方案 中，所述磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接不位于最接近5，或3， 末端的任何一对核苷酸之间。优选紧邻所述至少一个内部YZ 二核苷酸存在的磷酸二酯或磷酸 二酯样核苷酸间连接本身是内部核苷酸间连接。因此对于序列NJZN" 其中^和N2每一个独立于另一个是任意单个核苷酸，所述YZ 二核苷 酸具有磷酸二酯或磷酸二酯样核普酸间连接，此外(a)当Ni是内部核 苷酸的时候，^和Y通过磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接相连， (b)当N2是内部核苷酸的时候，Z和N2通过磷酸二酯或砩酸二酯样核苷 酸间连接相连，或者(c)当K是内部核苷酸的时候，Ni和Y通过砩酸二 酯或磷酸二酯样核苷酸间连接相连，并且当N2是内部核苷酸的时候， Z和A通过磷酸二酯或砩酸二酯样核苷酸间连接相连。据信根据本发明的柔性寡核苷酸与完全稳定的寡核苷酸相比，对 核酸酶切割相对敏感。不受特定理论或机制的限制，认为本发明的柔性寡核苷酸相对于全长柔性寡核苷酸可被切割产生具有降低的或没有 免疫刺激活性的片段。据信引入至少一个对核酸酶敏感的核苷酸间连 接，特别是在所述寡核苷酸中部附近，可以提供一个"关闭开关"， 它可以改变所述寡核苷酸的药代动力学，以便减少所述寡核苷酸的最 大免疫刺激活性的持续时间。这在希望避免与慢性局部炎症或免疫刺 激相关的损伤的组织和临床应用(例如肾)中可具有特殊的价值。半柔性寡核苷酸是具有部分稳定主链的免疫刺激寡核苷酸，其中仅仅在至少一个内部嘧咬一嘌呤(YZ) 二核苷酸内存在磷酸二酯或磷酸 二酯样核苷酸间连接。半柔性寡核苷酸与相应的完全稳定的免疫刺激 寡核苷酸相比，通常具有增强的免疫刺激效力。由于半柔性寡核苷酸 的更大效力，在一些实例中，为达到所希望的生物效果，与常规的完 全稳定的免疫刺激寡核苷酸相比，半柔性寡核苷酸可以以更低的有效 浓度使用，并且具有更低的有效剂量。认为半柔性寡核苷酸的上述性质通常随着涉及内部YZ 二核苷酸 的磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接的"剂量"的增加而增强。因 此认为，例如，通常对给定的具有4个内部YZ二核苷酸的寡核苷酸序 列来说，具有4个内部磷酸二酯或磷酸二酯样YZ核苷酸间连接的寡核 苷酸比具有3个内部磷酸二酯或磷酸二酯样YZ核苷酸间连接的寡核苷 酸更具免疫刺激效果，后者又比具有2个内部磷酸二酯或砩酸二酯样 YZ核苷酸间连接的寡核普酸更具免疫刺激效果，后者又比具有1个内 部磷酸二酯或磷酸二酯样YZ核苷酸间连接的寡核苷酸更具免疫刺激 效果。重要的是，包括甚至1个内部磷酸二酯或磷酸二酯样YZ核普酸 间连接，经常可优于没有内部磷酸二酯或磷酸二酯样YZ核苷酸间连 接。除了磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接的数目，沿着寡核普酸 长度上的位置分布也可影响效力。除了在优选的内部位置上的磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接 之夕卜，柔性和半柔性寡核苷酸通常还包括能抵抗降解的5，和3，末端。相应的未修饰末端增强的适当修饰。例如，所述5，和3，末端可以通过在其中包括主链的至少一个磷酸修饰来稳定。在优选的实施方案中， 在每个末端所述主链的至少一个磷酸修饰独立地是硫代磷酸酯，二硫 代磷酸酯，膦酸甲酯，或甲基硫代磷酸酯核苷酸间连接，在另一个实施方案中，所述可抵抗降解的末端包括一个或多个在3，末端通过肽 或酰胺键连接起来的核普酸单元。磷酸二酯核普酸间连接是在自然界中发现的寡核苷酸特征性的连 接类型。磷酸二酯核苷酸间连接包括磷原子，其侧翼是两个桥接的氧 原子，另外还通过两个额外的氧原子结合， 一个带电荷，另一个不带 电荷。当缩短寡核苷酸的组织半衰期是重要的时候，磷酸二酯核苷酸 间连接是特别优选的。磷酸二酯样核苷酸间连接是含有磷的桥接基团，其在化学上和/或非对映异构方面与砩酸二酯类似。与磷酸二酯相似性的衡量，包括 对核酸酶消化的易感性以及激活RNA酶H的能力。因此，例如磷酸二 酯(而不是硫代磷酸酯)寡核苷酸易被核酸酶消化，但是磷酸二酯和 硫代磷酸酯寡核苷酸都能够激活RM酶H。在优选的实施方案中，所 述磷酸二酯样核苷酸间连接是boranophosphate (或等同地 boranophosphonate)连接。美国专利号5, 177, 198; 美国专利号 5, 859, 231;美国专利号6,160,109;美国专利号6, 207, 819; Sergueev等，(1998) J Am Chem Soc 120:9417-27。在另一个优选 的实施方案中，所述磷酸二酯样核苷酸间连接是非对映纯的Rp硫代磷 酸酯。认为非对映纯的Rp硫代磷酸酯比混合的或非对映纯的Sp硫代 磷酸酯更容易被核酸酶消化且更好地激活RNA酶H。 CpG寡核苷酸的立 体异构体是公开的PCT申请PCT/US99/17100(WO00/06588)的主题。应当注意，为本发明的目的，术语"磷酸二酯样核苷酸间连接"特别排 除二硫代磷酸酯和膦酸甲酯核苷酸间连接。如上所述，本发明的柔性和半柔性寡核苷酸可在C和G之间具有 磷酸二酯样连接。磷酸二酯样连接的一个例子是Rp构象的硫代磷酸酯 连接。寡核苷酸P手性对于CpG寡核苷酸的免疫活性具有明显相反的 影响，这取决于活性测量的时间点(Krieg等，2003 ，Oligonucleotides, 13 (6): 491-499)。在40分钟的早期时间点，硫 代磷酸酯CpG寡核苷酸的Rp(而不是Sp)立体异构体在鼠脾细胞中诱导 JNK磷酸化。相反，当在44小时的晚期时间点测定时，Sp(而不是Rp) 立体异构体具有刺激脾细胞增殖的活性。这种Rp和Sp立体异构体的动力学和生物活性差异并不是由于细胞摄入的任何差异造成的，而很 可能是由于p手性的两种相对的生物学作用。首先，Rp立体异构体与 Sp相比在早期时间点具有增强的刺激免疫细胞的活性，表明Rp可能 更有效地与CpG受体TLR9相互作用或诱导下游信号传导途径。另 一方 面，RpPS-寡核苷酸与Sp相比更快的降解，会导致信号传导的持续时 间短得多，使得在较晚时间点检测的时候Sp PS-寡核苷酸表现出更具 生物活性。CpG 二核苷酸本身的p手性可获得惊人强烈的效果。与立体随机 的CpG寡核苷酸相比，其中单个CpG 二核苷酸以Rp相连的同源物活性 稍强，但是含有Sp连接的同源物对于诱导脾细胞增殖几乎没有活性。因此，寡核苷酸可以在主链组成上是异质的，从而含有连接到一 起的聚合物单元的任何可能的组合。术语"寡核苷酸"还包括具有取代或修饰(例如在糖上)的寡核 苷酸。例如，它们包括具有在2，部位与除羟基以外的低分子量有机 基团共价结合和在5，部位与除磷酸基团或羟基以外的低分子量有机 基团共价结合的主链糖的核酸。因此，修饰的寡核普酸可以包括2'-0-烷基化核糖基团。此外，修饰的寡核苷酸可以包括取代核糖的阿拉伯 糖或2'-氟代阿拉伯糖等糖。本发明的免疫刺激寡核苷酸与天然RNA和DNA相比，可以包括各 种化学修饰和取代，涉及磷酸二酯核普酸间桥，或p-D-核糖单元。化 学修饰的实例是技术人员所公知的，描述在例如UhlmannE等(1990) Chem Rev 90:543; "Protocols for Oligonucleotides and Analogs" Synthesis and Properties & Synthesis and Analytical Techniques, S. Agrawal， Ed， H咖ana Press, Totowa， USA 1993; Crooke ST等, (1996) Amiu Rev Pharmacol Toxicol 36:107—129; and Hunziker J等(1995) Mod Synth Methods 7: 331-417。与由天然DNA或RNA组 成的相同序列的寡核苷酸相比，根据本发明的寡核苷酸可以具有一个 或多个修饰，其中每个修饰位于特定的磷酸二酯核苷酸间桥接和/或特 定的P-D-核糖单元。例如，本发明涉及寡核苷酸，其可能含有一个或多个修饰，其中 每个修饰独立地选自a) 用修饰的核苷酸间桥接代替位于核苷酸3，和/或5，端的磷酸 二酯核苷酸间桥接，和b) 用去磷酸桥接代替位于核苷酸3，和/或5，端的磷酸二酯桥接。c) 用另一个单元代替糖磷酸主链的糖磷酸单元，和d) 用修饰的糖单元代替P-D-核糖单元。 寡核苷酸的化学修饰的更详细的实施例如下所述 位于核苷酸3，端和/或5，端的磷酸二酯核苷酸间桥接可以被修饰的核苷酸间桥接替代，其中所述修饰的核苷酸间桥接例如选自硫 代磷酸酯，二硫代磷酸酯，NRW-亚磷酰胺，boranophosphate， ct-羟千基膦酸酯，磷酸盐(d-Cj-O-烷基酯，磷酸盐-[(C6-CJ芳基 -(d-CJ-0-烷基]酯，(d-Cs)烷基膦酸酯和/或(C6-C12)芳基膦酸酯桥 接，(C广d2)-口-羟曱基-芳基(例如W095/01363中公开的)，其中(C6-C12) 芳基，(C6-C2。)芳基和(C「CH)芳基可选地被g素，烷基，烷氧基，硝基，氰基取代，且其中r和w彼此独立地是氢，(d-CJ-烷基，(C6-C2。)-芳基，(C6-C14)-芳基-(d-Cs)-烷基，优选的是氢，(d-Cs)-烷基，优选 的是(d-")-烷基和/或甲氧乙基，或者W和112与携带它们的氮原子一 起形成5-6-元杂环，所述杂环可以另外含有选自0, S和N的其它杂 原子.位于核苷酸3，端和/或5，端的磷酸二酯桥接被去磷酸桥接替代 (去磷酸桥接描述在例如Uhlmann E和Peyman A "Methods in Molecular Biology", Vol. 20, "Protocols for Oligonucleotides and Analogs", S. Agrawal， Ed. ， Humana Press, Totowa 1993， Chapter 16， pp. 355 ff)，其中去磷酸桥接例如选自去磷酸桥接formacetal，3'-thioformacetal，甲基羟胺，將，亚甲基二甲基-亚肼基，二亚甲 基砜和/或甲硅烷基。糖磷酸主链(即糖磷酸主链由糖磷酸单元组成)上的糖磷酸单元 (即P -D-核糖和磷酸二酯核普酸间桥接一起形成糖磷酸单元)可以被 另一个单元替代，其中另一个单元例如适合于构建"吗啉代-衍生物" 寡聚物(如例如Stirchak EP等(1989) Oligonucleotides Res 17: 6129-41中所述)，也就是说，例如用吗啉代-衍生物单元替代；或者 构建聚酰胺寡核苷酸("PNA";如例如Nielsen PE等 (1994) Bioconjug Chem 5:3-7中所述)，也就是说，例如用PM主链单元例 如用2-氨乙基甘氨酸替代。P -核糖单元或P -D-2，-脱氧核糖单元可以被修饰的糖单元替代， 其中修饰的糖单元例如选自P-D-核糖，ot-D-2'-脱氧核糖，L-2'-脱 氧核糖，2'-F-2'-脱氧核糖，2'-F-阿拉伯糖，2'-0-(C「C6)烷基-核 糖，优选地，2'-0-(CrC6)烷基-核糖是2'-0-曱基核糖，2'-0-(C2-C6) 链烯基-核糖，2'-
-核糖，2'-冊2-2'-脱氧核糖，木-呋喃糖，oc-阿拉伯呋喃糖，2，4-二脱氧-p-D-赤-己-他喃糖， 和碳环(在例如Froehler J (1992) Am Chem Soc 1H:8320中所述)和/或开链糖类似物(在例如Vandendriessche等 (l"3) Tetrahedron 49: 7223中所述)和/或二环糖类似物(在例如 Tarkov M等(1993) Helv Chim Acta 76: 481中所述)。在有些实施方案中，所述糖是2， -O-甲基核糖，特别对于通过磷 酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接相连的一个或两个核苷酸。在本文所述的特定序列中，定义了一组修饰的碱基，例如字母Y 用于表示含有胞嘧啶或修饰的胞嘧啶的核苷酸，本文使用的修饰的胞 嘧啶是天然存在的或非天然存在的胞嘧啶的嘧咬碱基类似物，它可以 替代该碱基而不会削弱所述寡核苷酸的免疫刺激活性。修饰的胞嘧啶 包括但不限于5-取代的胞嘧啶(例如5-曱基-胞嘧啶，5-氟代-胞嘧咬， 5-氯代-胞嘧啶，5-溴代-胞嘧啶，5-硪代-胞嘧啶，5-羟基-胞嘧咬， 5-羟曱基-胞嘧啶，5-二氟甲基-胞嘧啶，和未取代的或取代的5-炔基-胞嘧啶)，6-取代的胞嘧啶，N4-取代的胞嘧啶(例如N4-乙基-胞嘧 啶)，5-氮杂-胞嘧啶，2-巯基-胞嘧啶，异胞嘧啶，假-异胞嘧啶，具 有稠环系统的胞嘧啶类似物(例如N， N，-亚丙基胞嘧啶或吩噁溱)， 和尿嘧啶和它的衍生物(例如5-氟代-尿嘧啶，5-溴代-尿嘧啶，5-溴 乙烯基-尿嘧啶，4-硫代-尿嘧啶，5-羟基-尿嘧啶，5-丙炔基-尿嘧啶)。 一些优选的胞嘧啶包括5-甲基-胞嘧啶，5-氟代-胞嘧啶，5-羟基-胞 嘧啶，5-羟甲基-胞嘧啶，和N4-乙基-胞嘧啶。在本发明的另一个实 施方案中，所述胞嘧咬碱基被通用碱基(例如3-硝基吡咯，P-碱基)， 芳香环系统(例如氟苯或二氟苯)或氢原子(dSpacer)取代。字母Z用于表示鸟噪呤或修饰的鸟噪呤碱基。本文使用的修饰的 鸟嘌呤是天然存在的或非天然存在的鸟嘌呤的嘌呤碱基类似物，它可 以替代该碱基而不会削弱所述寡核苷酸的免疫刺激活性。修饰的鸟嘌 呤包括但不限于7-去氮鸟嘌呤，7-去氮-7-取代的鸟嚷呤(例如7-去氮 -7-(C广C6)炔基鸟嘌呤)，7-去氮-8-取代的鸟嘌呤，次黄嘌呤，N广取 代的乌嘌呤(例如N2-甲基-鸟嘌呤)，5-氨基-3-曱基-3H， 6H-噻唑并 [4，5-d]嘧啶-2， 7-二酮，2， 6-二氨基噪呤，2-氨基嘌呤，嘌呤，吲 哚，腺嘌呤，取代的腺嘌呤(例如N6-甲基-腺嘌呤，8-氧-腺嘌呤)8-取代的鸟嘌呤(例如8-羟基鸟嘌呤和8-溴代鸟嘌呤)，和6-硫代鸟嘌 呤。在本发明的另一个实施方案中，所述鸟噪呤碱基被通用碱基(例如 4-曱基-吲哚，5-硝基-吲哚，和K-碱基)，芳香环系统(例如苯并咪唑 或二氟-苯并咪唑，i-甲基-lH-[1, 2，4]三唑-3-羧酸酰胺)或者氢原子 (dSpacer)取代。所述寡核苷酸可以具有一个或多个可及的5，末端。能够制备具 有两个这样的5，末端的修饰的寡核苷酸。这可以通过例如将两个寡 核苷酸通过3， -3，连接相连起来产生具有一个或两个可及的5，末端 的寡核苷酸来实现。所述3， -3，连接可以是彿酸二酯，硫代磷酸酯 或任意其它修饰的核苷酸间桥接。获得这种连接的方法是本领域已知 的。例如，这种连接描述在Seliger，H.;等，01igonucleotide analogs with terminal 3'-3'-and 5'-5'-internucleotidic linkages asantisense inhibitors of viral gene expression, Nucleotides & Nucleotides (1991)， 10 (1-3), 469-77和Jiang,等，Pseudo-cyclic oligonucleotides: in vitro and in vivo properties, Bioorganic & Medicinal Chemistry (1999)， 7(12)， 2727-2735。此外，其中3，末端核苷酸之间的连接并非磷酸二酯、硫代磷酸 酯或其它修饰桥接的3， -3，连接的寡核苷酸可以用另外的间隔物制 备，例如三-或四-乙二醇磷酸部分(Durand， M.等，Triple-helix formation by an oligonucleotide containing one (dA)12 and two (dT)12 sequences bridged by two hexaethylene glycol chains, Biochemistry (1992)， 31(38)， 9197-204，美国专利号5658738，和 美国专利号5668265)。或者，非核苷酸连接物可以用标准的亚磷酰胺 化学，从乙二醇、丙二醇获得，或得自脱碱基脱氧核糖(dSpacer)单元 (Fontanel, Marie Laurence 等,Sterical recognition by T4 polynucleotide kinase of non-nucleosidic moieties 5'-attached to oligonucleotides; 01igonucleotides Research (1994)， 22(11)， 2022-7)。非核苷酸连接物可以引入一次或多次，或者彼此组合，以使 要被连接的两个0DN的3，末端之间具有任意希望的距离。所述寡核苷酸对降解具有部分抗性(例如是稳定的)。"稳定的寡 核苷酸分子"指对于体内降解(例如通过外切或内切核酸酶)相对具有 抗性的寡核苷酸。寡核苷酸稳定可以通过主链修饰获得。具有硫代磷 酸酯连接的寡核苷酸提供最大的活性，且保护寡核苷酸不被细胞内的 外切或内切核酸酶降解。其它修饰的寡核苷酸包括磷酸二酯修饰的寡 核苷酸，磷酸二酯和硫代鳞酸酯寡核苷酸的组合，膦酸甲酯，甲基硫 代磷酸酯，二硫代磷酸酯，对乙氧基，及其组合。在任一或两个末端 含有二醇(例如四乙二醇或六乙二醇)的寡核苷酸，也已经显示可以基 本上抵抗核酸酶降解。所述免疫刺激寡核苷酸还可以在核苷酸或核苷酸类似物部分之间 含有一个或多个非常规连接。通常的核苷间连接是3'5'-连接。所有 其它连接都认为是非常规的核苷间连接，例如2'5'-， 5'5'-， 3'3'-,2'2'-， 2。'-连接。因此，命名2，到5，是根据核糖的碳原子选择的。 但是，如果使用的是非天然糖部分，例如环扩大的糖类似物(例如己糖， 环己烯或吡喃糖)或双环或三环糖类似物，则该命名根据单体的命名而 变化。在3，-脱氧-P-D-吡喃核糖类似物(也称为p-DNA)中，单核普 酸例如通过4， 2，-连接相连。如果所述寡核苷酸含有一个3， 3，-连接，那么这种寡核苷酸可 具有两个未连接的5，-末端。类似地，如果所述寡核苷酸含有一个5， 5，-连接，那么这种寡核苷酸可具有两个未连接的3，-末端。未连接 的核苷酸末端的可及性可更好地被它们的受体接入。这两类非常规的 连接(3， 3， -和5， 5， -)描述在Ramalho 0rtigao等 (Antisense Research and Development (1992) 2, 129-46)，其中具有3， 3，-连接的寡核苷酸据报道对核酸酶切割显示出增强的稳定性。在一个分子中也可以组合不同类型的连接，这可能导致寡聚物的 分枝。如果所述寡核苷酸的一部分在3，-末端通过3， 3，-连接与第 二寡核苷酸部分相连，在2，-末端通过2， 3，-连接与所述分子的第 三部分相连，会得到例如具有三个5，-末端的分枝(3， 3， -， 2， 3， -分枝)的寡核苷酸。x是例如<formula>formula see original document page 44</formula>x是例如 <formula>formula see original document page 44</formula>Y是例如:<formula>formula see original document page 44</formula>IV. CpG ODN PF3512676和抗-CTLA-4抗体联合治疗 本发明涉及联合治疗，其包含共同施用CpG ODN PF3512676和抗 -CTLA-4抗体，优选包含尤其是抗体4. 1.1， 4. 13. 1，和11.2. 1， 10D1(MDX-OlO)的抗原-结合部分的抗体。在一个实施方案中，将抗-CTLA-4 抗体和CpG 0DN PF3512676的组合共同施用给患者来治疗癌症。 癌症类型抗-CTLA-4抗体和CpG 0DN PF3512676的组合可以用于治疗原发 性和继发性(即，转移性)癌症。更具体地，在许多潜在的治疗选择中， CpG 0DN PF 3 512 6 7 6和抗-CTLA-4联合治疗可以用于治疗肾细胞癌，乳 腺癌，结肠直肠癌，卵巢癌，非小细胞肺癌，黑素瘤，皮肤T-细胞淋 巴瘤，和NHL (包括緩慢进展的和侵袭性的)，以及许多其它。尽管这 些癌症是优选的，本发明涉及对许多种恶性细胞增殖障碍的治疗，包 括、但不限于癌和肉瘤。其它实例包括卡波西肉瘤，滑膜肉瘤，幼红 细胞瘤，间皮瘤，肝胆管(肝和胆管)瘤，原发性或继发性脑瘤，肺癌 (NSCLC和SCLC),骨癌，皮肤癌，头或颈癌，皮肤或眼内黑素瘤，骨 癌，肛门区癌，胃癌，胃肠(胃，结直肠，和十二指肠)癌，结肠癌， 子宫癌，输卵管癌，子宫内膜癌，子宫颈癌，阴道癌，外阴癌，霍奇 金病，食道癌，小肠癌，内分泌系统癌，.甲状腺癌，甲状旁腺癌，肾 上腺癌，软组织肉瘤，尿道癌，前列腺癌，阴茎癌，睾丸癌，慢性或 急性髄细胞白血病，慢性或急性淋巴细胞性白血病，淋巴细胞性淋巴 瘤，膀胱癌，肾或输尿管癌，肾盂癌，胰腺癌，中枢神经系统(CNS) 肿瘤，包括原发性或继发性CNS肿瘤，原发性CNS淋巴瘤，脊推肿瘤， 脑干胶质瘤，成胶质细胞瘤，脑膜瘤，成肌细胞瘤，星形细胞瘤，垂 体腺瘤，肾上腺皮质癌，胆嚢癌，多发性骨髄瘤，胆管癌，纤维肉瘤， 神经母细胞瘤，视网膜母细胞瘤，或一种或多种前述癌症的组合。待治疗的癌症可以是难治的癌症。本文使用的难治的癌症是，对 开处的普通护理标准抵抗的癌症。这些癌症可能表现得最初对治疗有 反应(然后复发)，或者它们可以对治疗完全不反应。普通护理标准 随癌症类型和在受试者中的进展程度而异。它可以是化疗，免疫疗法， 手术，或放射，或其组合。本领域普通技术人员知道这样的护理标准。 因此，根据本发明治疗难治癌症的受试者可能已经暴露于对其癌症的 另一种治疗。或者，如果癌症可能是难治的(例如，鉴于对癌细胞的分析或受试者的病史)，则受试者可能未暴露于另一种治疗。难治癌症的实例包括、但不限于白血病，黑素瘤，肾细胞癌，结肠癌，肝癌，胰腺癌，非霍奇金淋巴瘤，和肺癌。 治疗类型本领域技术人员会明白， 一旦获知本文公开的教导，本发明包括CpG 0DN治疗，联合抗-CTLA-4抗体，连同或序贯(在前或在后)连 同手术、放疗或二者，用于治疗癌症。也就是说，各种不同的治疗可 以与抗-CTLA-4抗体-CpG 0DN PF3512676联合治疗相组合，本领域技 术人员在获知本文提供的教导后会明白。在某些情况下，本发明的方法可以用于替代现有的手术操作或药 物治疗，尽管在其它情况下，本发明可以用于提高现有的治疗这些疾 病的疗法的功效。因此，联合治疗可以用于治疗正在或将会接受尤其 是癌症治疗的受试者。例如，所述试剂可以与另一种抗增殖(例如，抗 癌)治疗组合地施用给受试者。合适的抗癌治疗包括手术操作来去除肺 瘤块，化疗或局部放射。其它抗增殖治疗可以在本发明的CpG 0DN PF3512676/抗-CTLA-4抗体组合治疗之前、同时或之后施用。在施用 不同治疗之间，也可以延迟几小时、几天，在有些情况下延迟几周， 以便可以在其它治疗之前或之后施用CpG 0DN PF3512676/抗-CTLA-4 抗体组合。本发明还预见到，在手术、放射或化疗之前和之后，CpG 0DN PF3512676/抗-CTLA-4抗体组合在癌症患者中的应用。因而，本发明包括抗-CTLA-4抗体与CpG 0DN PF3512676组合作 为新辅助疗法、辅助疗法、 一线疗法、二线疗法和/或三线疗法，在癌 症的緩解诱导或维持治疗中的应用。也就是说，在一个实施方案中， 抗体-CpG ODN PF3512676组合可以作为新辅助疗法，在例如肿瘤(例 如，前列腺癌，乳腺癌和肺癌)的手术切除之前共同施用。在另一个实 施方案中，抗体-CpG ODN PF3512676组合可以作为新辅助疗法(即， 在手术前)和在手术后作为辅助疗法施用。该组合可以用作一线治疗， 替代其它试剂(例如，干扰素-ot)。本发明的方法和组合物不仅可以用于未治疗的患者，而且可以用于治疗对其它抗癌疗法(例如但不限于单独(或与其它抗癌剂组合)施用的CpG ODN PF3512676,或单独(或与其它抗癌剂组合)施用的抗 -CTLA-4抗体)部分地或完全地无反应的患者。在不同的实施方案中，本发明提供了可以用于治疗患者的已经显示是或可能是难治的或对治 疗不反应的疾病或病症的方法和组合物，其包含施用抗-CTLA-4抗体 和/或CpGODNPF3512676中的任一种或二者，其中治疗被增强的免疫 应答所改善。在一个实施方案中，该方法包含组合CpGODNPF3512676 和抗-CTLA-4抗体(优选，抗体4.1.1，抗体4.13.1，抗体11.2.1， 抗体MDX-OIO，或其任意组合)。因而，例如，所述组合可以用于治疗转移性肾细胞癌，在细胞因 子-难治的患者中作为二线疗法，在緩慢进展NHL中作为二线疗法(与 美罗华进一步组合)，并在进展的NHL中在CHOP-R (环磷酰胺，多柔 比星，长春新碱，和泼尼松，与美罗华)中作为二线疗法，以及其它。 当共同施用抗-CTLA-4抗体-CpG 0DN PF3512676组合时，这些疗法的 组合也包含在本发明中，例如、但不限于，其中所述组合用于新辅助疗 法、辅助疗法、 一线疗法、二线疗法和三线疗法或其任意组合。CpG ODN PF3512676可以与抗-CTLA-4抗体(如上所述)一起用于 緩解诱导，然后用单独的CpG 0DN PF3512676进行维持治疗。因而， 緩解诱导疗法可能需要一个或多个重复循环的联合CpG 0DN PF3512676/抗-CTLA-4抗体疗法。但是， 一旦观察到緩解(这将是医 学从业人员显而易见的)，受试者可以进行维持治疗。这样的维持治疗 可以包含CpGODNPF3512676的单一疗法。为了维持治疗的目的，CpG ODN PF3512676可以每周施用1次或2次，或两周1次，优选皮下。尽管通过涉及辅助疗法、 一线疗法、二线疗法和/或三线疗法的方 法例示了本发明，包括施用包含共同施用CpG ODN PF3512676和抗 -CTLA-4抗体的组合，本领域技术人员在获知本文提供的教导后会明 白，本发明不限于任何特定疗法。相反，包含组合的CpG ODN PF3512676 和抗-CTLA-4抗体疗法的方法包括在整个疾病和治疗持续期间施用该 组合。更具体地，本文公开的新方法可以在转移之前和之后以及为已经变成化疗剂难治的患者提供治疗益处，因为抗体可以增强免疫应答，包括由治疗介导的任意应答以及由CpG 0DN PF3512676介导的任意应 答。因而，本发明不限于使用本发明的组合仅用于新辅助疗法；相反, 本发明包括整个治疗谱，包括、但不限于，癌症的辅助疗法、 一线疗 法、二线疗法和/或三线疗法。这是因为，本文公开的数据表明，在治 疗过程中的任意时间点，包含抗-CTLA-4抗体的免疫疗法可以单独地 或与至少一种其它试剂组合地提供治疗益处。也就是说，通过施用本 发明的抗-CTLA-4抗体，可以增强介导肿瘤特异性抗原释放的方法的 效力，例如细胞毒性疗法(例如，放射，化疗，等)，其中这样的抗原暴 露于免疫系统。实际上，本文公开的数据还表明，所述抗体和CpGODN PF3512676的組合施用会介导协同效应，用于治疗癌症，更具体地， 前列腺癌，乳腺癌，CRC，黑素瘤，胰腺癌，肺癌，NSCLC， NHL, RCC， 以及其它癌症。因此，本发明提供了用于治疗癌症的重要的新治疗剂， 从而增强患者的免疫系统，以提供抗肿瘤效果。在另一个实施方案中，共同施用CpG0DNPF3512676和抗-CTLA-4 抗体组合来增强和/或延长对肿瘤的免疫应答。这是因为，本发明的 CpG ODN PF3512676 (作为尤其是TLR9激动剂)的抗肺瘤作用和抗 -CTLA-4抗体-介导的CTLA-4/B7信号传递的阻断之间可能存在相互 作用，这导致比任一种单独的试剂更有效的抗肺瘤效果。因而，不希 望受任何特定理论的约束，CpG ODN PF3512676和抗-CTLA-4抗体的 组合可以在肿瘤内诱导比预期更强大的免疫应答。不希望受任何特定 理论的约束，由例如B淋巴细胞的激活和提高的抗原呈递细胞(例如， DC)功能介导的CpG ODN PF3512676抗肿瘤效果介导的肺瘤抗原的释 放，以及由TLR9的激活介导的其它免疫增强效应，可以增加抗-CTLA-4 的免疫治疗效应，包括减少或破坏对这样的抗原的免疫耐受性。这可 能是因为，已经证实施用抗体阻断CTLA-4和CpG ODN PF3512676的免 疫激活会破坏耐受性(例如，逆转或阻止对肿瘤抗原的无反应性或耐受 性)，从而使肿瘤细胞对免疫攻击更敏感。相反，部分地依赖于CTLA-4的调节性T细胞(Treg)的抑制作用，可能限制CpG免疫疗法的有效性， 所以用抗-CTLA-4抗体阻断这些效应应当会提高CpG的效能。因而， CpG ODN PF3512676和抗-CTLA-4抗体的组合可以提供潜在的累加或 协同效应，从而提供对癌症的重要的新的治疗性处理。在一个实施方案中，本发明提供了使用抗-CTLA-4抗体-CpG 0DN PF3512676组合来产生或增加抗肿瘤应答的组合物和方法，其中CpG ODN PF3512676会增强一定量抗体的抗肿瘤应答，所述抗体量在单独 使用时，对于诱导相同水平的抗肿瘤应答是次优的。在某些实施方案 中，当CpG ODN PF3512676不与引起抗肿瘤应答的抗体联合使用时， 单独施用CpG ODN PF3512676不会产生或增加抗胂瘤应答。在替代实 施方案中，CpG ODN PF3512676和抗-CTLA-4抗体都可以单独地和/ 或在联合施用时引起抗肿瘤应答。在某些实施方案中，CpG ODN PF3512676可以以累加方式增强抗 -CTLA-4抗体的作用(或者反之亦然)。在一个优选的实施方案中，CpG ODNPF3512676会以协同方式增强抗-CTLA-4抗体的作用(或者反之亦 然)。在另一个实施方案中，抗-CTLA-4抗体会以累加方式增强CpGODN PF3512676的作用。优选地，以协同方式增强作用。因而，在某些实 施方案中，本发明包括疾病治疗或预防方法，其能提供比施用单独的 CpG ODN PF3512676和单独的抗-CTLA-4抗体更好的治疗特性。本发明包括具有累加效力或累加治疗效应、同时减少或避免不希 望的或不利的效应的联合治疗。本发明也包括协同组合，其中治疗效 力大于累加，同时减低或避免不希望的或不利的效应。在某些实施方 案中，本发明的方法允许治疗或预防疾病和病症，其中通过使用更低 剂量和/或更低频率剂量的抗-CTLA-4抗体和/或CpG ODN PF3512676 来降低由施用单独的抗-CTLA-4抗体和/或CpG ODN PF3512676造成 的不希望的或不利的效应的发生率，同时维持或增强治疗效力，优选 地增加患者依从性，改善治疗和/或降低不希望的或不利的效应，由增 强的抗肿瘤应答来改善治疗。V.其它联合治疗基于本文提供的公开内容，包括给患者施用抗-CTLA-4抗体的免 疫增强作用，和共同施用这样的抗体与CpG 0DN PF3512676的组合的 组合累加或协同效应，本领域技术人员会明白，本发明包括许多联合 治疗，其中抗体-CpG 0DN PF3512676与至少一种其它治疗剂相组合地 施用给患者，从而提供治疗益处。尽管本领域技术人员在获知本文提 供的教导后会容易地明白许多这样的组合，现在讨论几种组合。但是， 本发明绝不限于这些组合，它们在本文中仅仅用于解释目的。抗体-CpG 0DN PF3512676和其它治疗剂的共同施用(联合治疗)包 括共同施用抗-CTLA-4抗体、CpG 0DN PF3512676和一种或多种其它 治疗剂，也包括共同施用2种或多种分开的药物组合物， 一种包含抗 -CTLA-4抗体，另一种包含CpG 0DN PF3512676，且其它包含至少一 种其它治疗剂。另外，尽管共同施用或联合(共同)疗法通常指抗体、 CpG 0DN PF3512676和其它治疗剂彼此同时施用，它也包括同时、先 后或分开给药该治疗的单个组分。另外，当静脉内施用抗体且经口 (例 如，化疗剂)或通过皮下或肌肉内注射施用抗癌剂时，应当理解，所述 组合优选地作为2种、3种或多种分开的药物组合物来施用。当哺乳动物进行其它化疗时，本领域众所周知的化疗剂可以与抗 -CTLA-4和CpG 0DN PF3512676组合使用。另外，可以使用生长因子 抑制剂，生物反应修饰剂，烷基化试剂，嵌入抗生素，长春花生物碱， 紫杉烷，选择性雌激素受体调控剂(SERMs)，血管发生抑制剂，以及 许多治疗剂，下面描述了它们中的一些。血管发生抑制剂前面在本文别处已经讨论了血管发生抑制剂与抗-CTLA-4抗体的 组合应用。此外，血管发生抑制剂包括、但不限于，贝伐单抗(AVASTIN; Genentech)， VEGF的一种人源化抗体.它可以与5FU组合使用，并用 于结肠或直肠的转移性癌患者的一线治疗。直接靶向血管发生因子或 它们的受体的试剂会通过打断自分泌受体信号传递，提供在受体-感受 性血液恶性肿瘤中的更大活性的前景。贝伐单抗会持续中和循环VEGF，且可以用于治疗骨髄增生异常综合征(MDS)，淋巴瘤，急性髓细 胞白血病(AML)，和实体瘤。受体酪氨酸激酶(RTKI)，包括 PTK787/ZK222584 (Novartis)，正接受治疗AML和其它受体-感受性 血液恶性肿瘤的评估。本发明也包括癌症的治疗，例如，肾癌，乳腺 癌，非霍奇金淋巴瘤，结肠直肠癌，等，其中使用抗-CTLA-4抗体和 CpG 0DN PF3512676的组合以及至少一种其它血管发生抑制剂，这样 的抑制剂是本领域众所周知的，或可以在将来开发。因而，抗血管发生剂，例如醒P-2 (基质-金属蛋白酶2)抑制剂， MMP-9 (基质-金属蛋白酶9)抑制剂，和COX-II (环氧合酶II)抑制 剂，可以与本发明的抗体-CpG 0DN PF3512676组合联合使用。有用的 COX-II抑制剂的实例包括CELEBREX (塞来考昔)，伐地考昔，罗非 考昔，帕瑞考昔，地拉考昔，SD-8381，ABT-963，艾托考昔，lumiracoxib, BMS-347070, NS-398, RS 57067,美洛昔康。有用的基质金属蛋白酶 抑制剂的实例描述在国际专利公开号W0 96/33172; W0 96/27583; W0 98/07697， W0 98/03516， W0 98/34918， W0 98/34915, W0 98/33768， W0 98/30566， W0 90/05719， W0 99/52910, W0 99/52889， W0 99/29667， 欧洲专利申请号780386 (1997年6月25日公开)，97304971. 1 (1997 年7月8日提交)，99308617. 2 (1999年10月29日提交)，606046 (1994 年7月13日公开)，931788 (1999年7月28日公开)，99302232. 1 (1999 年3月25日提交)，国际申请PCT/IB98/01113 (1998年7月21日提 交)，英国专利申请号9912961.1 (1999年6月3日提交)，美国临时专 利申请号60/148,464 (1999年8月12日提交)，和美国专利号 5， 863， 949，和5,861,510中。优选的MMP-2和醒P-9抑制剂是具有微小的抑制MMP-1活性或没 有该活性的那些。更优选的是相对于其它基质-金属蛋白酶(即，MMP-l， 醒P-3，醒P-4，醒P-5，醒P-6,醒P-7，醒P-8, MMP-IO，醒P-ll，醒P-12， 和醒P-13)会选择性地抑制醒P-2和/或匪P-9的那些。信号转导抑制剂可将本文所述的治疗和信号转导抑制剂一起使用，例如可抑制EGFR (表皮生长因子受体)反应的试剂，例如EGFR抗体、EGF抗体， 和作为EGFR抑制剂的分子；VEGF(血管内皮生长因子)抑制剂，例如 VEGF受体和可抑制VEGF的分子；和erbB2受体抑制剂，例如可结合 erbB2受体的有机分子或抗体，例如HERCEPTIN (Ge謹tech， Inc., San Francisco, CA)。在例如国际专利公开号WO 95/19970， WO 98/14451, WO 98/02434， 和美国专利号5， 747， 498中描述了 EGFR抑制剂，这些物质可用于此处 所描述的本发明。EGFR抑制剂包括，但不限于，单克隆抗体C225、 抗-EGFR 22Mab (ImClone Systems Inc., New York, NY)和ABX-EGF (Abgenix Inc., remont ， CA)、化合物ZD-1839 (AstraZeneca)、 BIBX-1382(Boehringer Ingelheim) 、 MDX-447 (Medarexjnc ， An,dale， NJ)、和0LX-103 (Merck & Co. ， Whitehouse Station, NJ)，、 VRCTC-310 (Ventech Research)和EGF融合毒素(Seragen Inc., Hopkinton， MA)。这些EGFR抑制剂和其它EGFR抑制剂可用于 本发明。旨在抑制表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶(TK)的化合物，代 表了在本发明的方法中有效的一类相对新的抗肿瘤药。许多人类癌症 在细胞表面上表达EGFR家族的成员。当配体与EGFR结合时，会引起 细胞反应级联，导致细胞分裂增加，并影响癌发生和进展的其它方面， 包括血管生成、转移扩散、和抑制细胞凋亡。EGFR-TK抑制剂可以选 择性地靶向EGFR家族(EGFR(也称为HERl或ErbB-1) 、 HER2/neu(也 称为ErbB-2) 、 HER3(也称为ErbB-3)或HER4 (也称为ErbB-4))中的一 员，或者可以靶向其中的两个或多个。适用于本发明的EGFR-TK抑制 剂包括gefitinib (IRESSA) ， erlotinib (TARCEVA) , CI-1033 (Pfizer) ， GW2016 (GlaxoSmi頻ine) ， EKB-569 (Wyeth)， PKI-166(Novartis) ， CP-724,714 (Pfizer), 和 BIBX-1382 (Boeringer-lngelheim)。其它EGFR-TK抑制剂在2001年6月18日 提交的美国专利申请号09/883， 752中有所描述。除了 SU11248 (Sugen Inc. ， San Francisco, CA)以外，VEGF抑制剂也可以与抗体和CpG 0DN PF3512676组合联合使用。VEGF抑制 剂描述在例如国际专利申请号PCT/IB99/00797 (1999年5月3日提 交)、国际专利公开号WO 99/24440; WO 95/21613; WO 99/61422; WO 98/50356; WO 99/10349; W0 97/32856; W0 97/22596; W0 98/54093; W0 98/02438; W0 99/16755; W0 98/02437;美国专利号5,834,504; 5, 883, 113; 5， 886， 020;和5， 792， 783。在本发明中有用的一些特殊的 VEGF抑制剂的其它例子是IM862 (Cytranlnc. ， Kirkland， WA); IMC-lCll Imclone抗体，Genentech， Inc. ， SanFrancisco， CA的 抗-VEGF单克隆抗体；以及angiozyme，来自Ribozyme (Boulder， CO) 和Chiron (Emeryville, CA)的一种合成核酶。此外，ErbB2受体抑制剂，例如GW-282974 (Glaxo Wei 1 come pic), 和单克隆抗体AR-209 (Aronex Pharmaceuticals Inc. ， Woodlands, TX)和2B-1 (Chiron),可以联合抗体-CpG ODN PF3512676组合，例 如在国际专利公开号WO 98/02434; W0 99/35146; WO 99/35132; WO 98/02437; WO 97/13760; WO 95/19970;美国专利号5，587， 458，'和 5， 877， 305中描述的那些。在本发明中有用的ErbB2受体抑制剂还描 述在EP10W853 (在2000年8月23日公开)和国际专利公开第WO 00 / 44728号(2000年8月3日公开)。在前述PCT申请、美国专利、和 美国临时申请中所述的erbB2受体抑制剂化合物和物质、以及抑制 erbB2受体的其它化合物和物质，可以与根据本发明的抗体一起使用。本发明的治疗还可以与其它在治疗异常细胞生长或癌症中有用的 试剂一起使用，包括但不限于，能够增强抗肿瘤免疫应答的其它试剂， 例如其它的不同的CTLA4抗体、以及其它也能够阻断CTLA-4的试剂； 以及抗增殖剂，例如法呢基蛋白转移酶抑制剂(例如，BMS 214662)， 和avP 3抑制剂例如cxvP 3抗体VITAXIN， ocvP5抑制剂，p53抑制 剂等。在将本发明的抗体与其它免疫调节剂联合给药时，免疫调节剂可 以选自例如树突细胞激活剂，以及抗原呈递的增强剂、T-细胞向性的 增强剂、肿瘤相关的免疫抑制因子的抑制剂，例如TGF-P (转化生长因子P)和IL-IO。 IGF-1R抑制剂本发明包括下述方法，其包含CpGODNPF3512676与免疫疗法(抗 -CTLA-4)的组合与其它试剂和疗法进一步组合。也就是说，本领域技 术人员基于本文提供的公开内容能明白，CpG ODN PF3512676疗法和 抗-CTLA-4抗体联合治疗可以进一步与许多治疗、手术、放射和其它 治疗剂相组合，来治疗患者。有许多治疗剂，且已经描述在例如，美国专利申请公开号 2004/0005318 ， 2003/0086930, 2002/0086014，和国际乂>开号W0 03/086459，它们都通过参考引用并入本文，以及其它。这样的治疗剂 包括、但不限于，拓朴异构酶I抑制剂；其它抗体(美罗华，曲妥单 抗等)；化疗剂例如、但不限于，imatinib (GLEEVEC，GLIVEC，或STI571; Novartis) ， sorafenib (BAY 43-9006; Bayer Pharmaceuticals Corp. /Onyx Pharmaceuticals)，受体酪氨酸激酶抑制剂，选择性雌激 素受体调控剂(SERMs)，紫杉烷，长春花生物碱，替莫唑胺，血管发生 抑制剂，EGFR抑制剂，VEGF抑制剂，ErbB2受体抑制剂，抗增殖剂(例 如法呢基蛋白转移酶抑制剂和ocvP 3抑制剂、otv0 5抑制剂、p53抑 制剂等)，免疫调控剂，细胞因子，肿瘤疫苗；肿瘤特异性抗原；树突 细胞和干细胞疗法；烷化剂，叶酸拮抗剂；嘧啶拮抗剂；蒽环类抗生 素；铂化合物；共刺激分子(例如，CD4, CD25， PD-1， B7-H3, 4-lBB， 0X40， IC0S， CD30， HLA-DR， MHCII，和LFA)。放射疗法放射疗法可以与CpG 0DN PF3512676/抗-CTLA-4抗体联合治疗共 同施用。放射疗法可以根据已知的用于治疗乳腺癌的放射疗法来进行。 用于放射疗法的剂量和方案可以由本领域的技术人员轻易地确定，并 且是基于疾病的阶段以及本领域已知的其它因素。治标剂本发明还包括，除了第一和第二成分外，在施用一种或多种这些 成分的同时或先后，施用其它治疗剂。该治疗剂包括镇痛药、癌症疫苗、抗血管剂、抗增殖剂、止吐剂和止泻剂。优选的止吐剂包括盐酸 昂丹司琼、盐酸格拉司琼和甲氧氯普胺。优选的止泻剂包括地芬诺酯和阿托品(LOMOTIL)、洛哌丁胺(I醒ODIUM)和奥曲肽(SANDOSTATIN)。 基于干细胞的疗法本文公开的抗体-CpG ODN PF3512676疗法组合可以与干细胞移植 相组合，为癌症患者提供治疗益处。干细胞移植可以根据本领域已知 的方法进行。有些这样的方法描述在 Appelbaum in Harrison's Principles of Internal Medicine, Chapter 14， Braunwald等， 编，第15版，McGraw-Hill Professional (2001),它通过参考引用 并入本文。因而，本发明的方法涉及已接受干细胞移植的哺乳动物中 的癌症治疗，该方法包括给哺乳动物施用一定量的人抗-CTLA-4抗体 与CpG ODN PF3512676组合，该抗体-CpG ODN PF3512676疗法组合与 干细胞移植进一步组合，对治疗癌症有效。当所述方法包含千细胞移植时，可在哺乳动物的免疫系统已从移 植中恢复后，例如在移植后1至12个月的时间段，施用第一剂抗体-CpG ODNPF3512676治疗试剂组合。在某些实施方案中，在移植后的1至3 个月、或1至4个月的时间段，施用第一剂。患者可接受干细胞移植 和预备治疗。本发明也涉及哺乳动物中的癌症的治疗方法，其包括步骤(i)在哺 乳动物中进行干细胞移植，和(ii)施用有效量的人抗-CTLA-4抗体与 有效量的CpG 0DN PF3512676组合。优选地，所述哺乳动物是人。干 细胞移植可以是同种异体干细胞移植或自体干细胞移植。此外，细胞 移植包括淋巴细胞从相同患者和/或HLA-匹配供体的过继转移。此外，本发明的方法可以与放射疗法和干细胞移植相组合，以及 与本文所述的、本领域已知的或将来开发的任意治疗的任意组合相组 合。如本文前面别处指出的，当抗-CTLA-4抗体与标准的癌症治疗(例 如，尤其是，化疗方案)相组合时，可以减少施用的化疗剂的剂量 (Mokyr， M.等Cancer Research 58: 5301-5304 (1998))。这是因为，本文公开的用于治疗癌症的抗-CTLA-4抗体和免疫增强核苷酸(例 如CpG ODN PF3512676 )的组合应用，可以介导细胞死亡，或以其它 方式提供CTLA-4阻断和核苷酸的TLR9激动作用之间的协同效应。不 希望受任何特定理论的约束，被抗-CTLA-4抗体、CpGODNPF3512676、 或其组合增强或延长的免疫应答介导的胂瘤细胞死亡，可能在抗原呈 递途径中产生增加水平的肿瘤特异性抗原，且抗-CTLA-4抗体会介导 对其增强的免疫应答，从而CpG ODN PF3512676和抗体的共同施用会介导针对肿瘤抗原的免疫应答的累加或协同的增加。可以通过肿瘤特 异性抗原的细胞死亡释放导致与抗-CTLA-4-CpG ODN PF3512676协同增强免疫应答的其它联合治疗是，放射，手术，化疗，和施用本领域熟 知的和本文例示的多种抗肿瘤剂，以及其它。这些方案和本文别处所 述的其它方案中的每一种，会通过肿瘤细胞死亡(这可能将肺瘤抗原 供给宿主抗原呈递途径)，在宿主中建立肿瘤特异性抗原的来源。因 此，本文公开的联合治疗可以提供增加的肺瘤特异性抗原的来源，从 而提供增加的对肺瘤的免疫应答，这又为患者提供治疗益处。VI.给药方案可调整给药方案以提供最适合的想要的反应。例如，可施用单次 推注，在一段时间可施用几个分开的剂量，或可根据治疗状况的紧急 按比例减少或增加剂量。以剂量单位形式配制肠胃外施用的组合物以 方便施用和统一剂量是特别有利的。此处使用的剂量单位形式是指物 理上分开的单位，其适合作为用于被治疗的哺乳动物受试者的单位剂 量；每一个单位含有经计算可产生想要的治疗效果的预先确定量的活 性化合物以及所需的药物栽体。本发明的剂量单位的规格受制于并直 接依赖于(a)抗体的独特性质和要达到的特定治疗性或预防性效果，和 (b)配制这种活性化合物用于治疗个体内的敏感性领域内内在的限制。因而，本领域技术人员基于本文提供的公开内容会明白，根据治 疗领域众所周知的方法可以调节剂量和给药方案。也就是说，可以容 易地确立最大耐受剂量，也可以确定为患者提供可检测的治疗益处的有效量，正如可确定施用每种试剂来为患者提供可检测的治疗益处的 暂时需要。因此，尽管本文例示了某些剂量和给药方案，这些实例绝 不限制在实践本发明时可以为患者提供的剂量和给药方案。此外，本 领域技术人员在获知本文提供的教导后会明白，通过本领域已知的评 判癌症治疗效能的多种方法，和本文包括的这些方法，以及将来开发 的方法，可以评判治疗益处，例如、但不限于，可检测的肺瘤大小和/ 或转移的减少，和复发时间的增加，以及许多其它参数。要注意的是，剂量值可根据待緩和的病症的类型和严重性来变化， 并且可包括单一或多个剂量。可以进一步理解，对于任何特定受试者， 应该根据个体所需和施用或监督该组合物给药的人的专业判断来随着 时间调整具体的给药方案，这里所列的剂量范围只是用于示例，而并 非要限制要求保护的组合物的范围或实施。例如，可以基于药代动力 学的或药效学的参数来调节剂量，这可以包括临床效应，例如毒性效 应和/或实验室值。因而，本发明包括患者内的剂量增加，如本领域技 术人员所确定的。确定抗体的适宜剂量和给药方案，是相关领域众所 周知的，且本领域技术人员在获知本文公开的教导后可以理解。0DN给药根据本领域众所周知的标准给药方案，可以施用CpG 0DN PF3512676。用于粘膜或局部递送的CpG 0DN PF3512676施用剂量通常 是约1 ng-100 mg/给药，这取决于应用可每天、每周或每月给予， 和其间的任何其它时间量。更典型地，粘膜或局部剂量范围是约100 Mg-50mg/给药，最典型约1-10mg，施用2-4次，间隔数天或数周。用于诱导全身免疫应答目的的肠胃外递送的本文所述化合物的施 用剂量可典型地是有效粘膜剂量的2-1， 000倍，更典型地2-100倍， 最典型地5-50倍。当与其它治疗剂(例如本发明的抗体)组合施用CpG ODN PF3512676时，或在专门的递送栽体中时，用于诱导免疫应答的肠胃 外(包括皮下)递送的CpGODNPF3512676的剂量范围通常是约10 p g-1000 mg/给药，这取决于应用可每天、每周或每月给予，和其间的任何其它时间量。更典型地，用于这些目的的肠胃外剂量范围是约1-500 mg/给药，最典型约5-100mg，施用2-4次，间隔数天或数周。 但是，在有些实施方案中，可以以上述典型剂量的5-10， OOO倍的范围， 使用用于这些目的的肠胃外剂量。在有些实施方案中，以共IO-40mg的量，每周施用ODN—次。可 以以每次5或10 mg的剂量施用ODN，从而导致多次推注或注射，这 取决于要施用的总量。例如，如果要施用的总量是10 mg，这可以通 过例如2 x 5 mg注射剂量来施用。作为另一个实例，如果要施用的 总量是40 mg，这可以通过例如4 x 10 mg注射剂量来施用。抗体给药根据本发明施用的抗体的治疗有效量的示例性非限制性范围是， 至少约0. lmg/kg，至少约0. 3mg/kg，至少约lmg/kg，至少约5mg/kg, 至少约6mg/kg，至少约10mg/kg，至少约15mg/kg，至少约20mg/kg， 至少约30 mg/kg，或至少约50 mg/kg。例如，抗体的治疗有效量范围 可以是约0， 1-30 mg/kg，或例如约0. 3-25 mg/kg，或例如约1-20 mg/kg: 或例如约3-20 mg/kg，或例如约5-20 mg/kg，或例如约10-20 mg/kg， 或约3-15 mg/kg，或约5-15 mg/kg，或约10-15 mg/kg。在另一个实施方案中，抗体的施用剂量是至少0. 3mg/kg，优选 至少1 mg/kg，更优选至少3 mg/kg，更优选至少5 mg/kg，优选至少 6mg/kg,更优选至少10 mg/kg，更优选至少15 mg/kg，和更优选至少 20 mg/kg。此外，通过静脉内输注施用的抗体的剂量范围是约0.1mg/kg-50 mg/kg，更优选约0. 3 mg/kg-20 mg/kg，更优选约1 mg/kg-15 mg/kg、 更优选约3 mg/kg-15 mg/kg，更优选约6 mg/kg-15 mg/kg。在一个 实施方案中，以作为无菌水溶液的静脉内制剂施用抗体，所述溶液含 有在适当緩冲系统中的约5-20 mg/ml抗体。此外，示例性的剂量增加方案可以用于确定最大耐受剂量(MTD), 评判与施用抗体-CpG ODN PF3512676联合治疗有关的剂量限制毒性 (DLT)(如果存在)等，其包含施用递增的剂量，例如、但不限于约0.1 mg/kg， 0.3 mg/kg， 1 mg/kg， 3 mg/kg， 6 mg/kg， 7 mg/kg， 10 mg/kg， 12 mg/kg， 15 mg/kg，或超过15 mg/kg，或其任意组合，更优 选地，施用0. 1 mg/kg， 0. 3 mg/kg， 1 mg/kg， 3 mg/kg， 6 mg/kg， 10mg/kg， 15mg/kg或20mg/kg的连续剂量，并评判患者的毒性(如 果存在)，以及治疗效力，以及其它参数。这样的测定剂量方案的毒 性和效能的研究是本领域众所周知的。 施用时间CpG ODN PF3512676可以与本发明的抗-CTLA-4抗体基本上同时 或先后施用。当同时施用时，ODN和抗体可以在相同或分开的制剂中， 尽管它们在同时施用。术语"基本上同时"是指，化合物在彼此相隔数 分钟内施用(例如，彼此相隔1Q分钟内)，且意在包括间断给药和连 续给药，但是如果连续给药，间隔时间仅仅是短时间段(例如，医学从 业人员分别施用2种化合物所需的时间)。本文使用的同时施用和基本 上同时施用可互换使用。先后施用指在时间上分开施用ODN和抗体。 施用这些化合物之间的时间间隔有意地长于彼此紧接着、没有故意延 迟地分别施用2种药物所需的时间。因而，共同施用包括施用抗体和 CpG ODN PF3512676的任意时间组合，使得二者的施用会介导对患者 的治疗益处，它可检测地大于在没有另一种试剂的情况下施用任一种 试剂。CpGODN可以在施用抗体之前、同时或之后(或其任意组合)施用， 反之亦然。CpGODN可以每天(包括每天施用一次或多次)、隔天、每3 天、每4天、每5天、每6天、或每周、每月、每2个月、每3个月、 每4个月、每5个月、每6个月、或每年施用。抗体可以每天、隔天、 每3天、每4天、每5天、每6天、每周、每2周、每月、或每20 天、每25天、每28天、每30天、每40天、每50天、每2个月、每 70天、每80天、每3个月、每6个月、或每年施用。可以施用单个 剂量或多个剂量的抗体。或者，可以施用至少一个剂量、或至少3、 6、 或12个剂量。例如可以施用多个剂量。ODN和抗体的施用可以交替。在一个实施方案中，部分剂量通过静脉推注给药，剩余的通过抗体制剂的输注给药。例如，抗体的静脉内注射可以以推注实现，剩余 的预定抗体剂量可以通过静脉内注射给药。预定剂量的抗体可以在例如约1.5小时至约5小时的期间内给药。在一个实施方案中，CpG 0DN PF3512676和抗体共同施用，其中 CpG 0DN PF3512676以本文所述的剂量施用，优选肠胃外(例如，通过 皮下或静脉内途径)。在另一个实施方案中，首先施用抗-CTLA-4抗体 来阻断会限制CpG 0DN的效能的抑制作用。在该实施方案中，抗-CTLA-4 抗体的给药优选地在CpG ODN之前1周-1天，最优选在CpG ODN之前 2-3天。在另一个实施方案中，首先施用CpG ODN来引发免疫系统，以具 有对抗-CTLA-4抗体和任意其它免疫疗法或可与其联合施用的其它疗 法(例如，肺瘤疫苗等)更好的免疫激活应答。在该实施方案中，CpG ODN 的给药优选地在抗-CTLA-4抗体之前1周-1天，最优选在抗-CTLA-4 抗体之前2-3天。尽管在施用CpG ODN PF3512676和抗-CTLA-4抗体之间可以使用 任意合适的静止期，本发明不需要等待期，抗体和CpGODNPF3512676 可以基本上同时地共同施用。因而，在一个实施方案中，抗体作为单 次注射来施用，CpGODNPF3512676在抗体之前或之后约1-7天施用。在多天或多周周期中，抗体或抗体片段可以与CpGODNPF3512676 一起施用。多天周期是2， 3， 4， 5, 6， 7， 8， 9， IO或更多天的周期， 或2, 3, 4或更多周的周期。抗体或其片段可以在这样的周期的首日 施用，随后在多周周期的每周的首日施用CpG ODN PF3512676。例如， CpGODNPF3512676可以在3周周期的第1， 7和14天施用。3周周期 可以重复l、 2、 3次或更多次。在整个治疗之前，可以施用单独的ODN 或抗体，例如用于引发免疫系统或使受试者对随后的治疗更有反应。如通过本领域公知的方法所确定的，可以提供额外周期的抗体和 CpG ODN PF3512676。但是，本发明不限于施用CpG ODN PF3512676 与抗-CTLA-4抗体组合的这些或任何特定剂量或给药方案。相反，相 关领域普通技术人员使用众所周知的方法，可以容易地确定施用抗体和CpG 0DN PF3512676的最佳剂量、途径和方案。抗体-CpG 0DN PF3512676组合可以作为新辅助疗法，在手术、放 疗或任何其它治疗之前施用，以便敏化肿瘤细胞或以其它方式赋予患 者治疗益处。另外，该组合可以作为新辅助疗法在局部治疗(例如，手 术，放射，或二者)后共同施用。此外，该组合可以作为二线疗法来施用，例如、但不限于， 一旦 任意一线疗法已经失败。或者，该组合可以与一线疗法同时施用，和 或在一线疗法期间的任意点，其可以在初始治疗后施用。这是因为， 一旦一线疗法已经失败， 一旦全身性的辅助疗法已经 失败等，抗-CTLA-4抗体和CpG 0DN PF3512676的组合可以提供治疗 益处。因而，本发明包括联合施用抗体和CpG 0DN PF3512676，含或 不含其它疗法，包括、但不限于，激素(例如，抗雄激素，芳香酶抑制 剂，等)，放疗，和任意其它治疗剂(化疗，信号抑制疗法，以及其它) 等，本领域技术人员基于本文提供的公开内容会明白。VII.药物组合物本发明也涉及制品(例如适合静脉内施用的剂型)，其包含对治 疗癌症有效量(例如，至少1 mg/kg,至少3 mg/kg，至少5 mg/kg， 至少10 mg/kg，至少15 mg/kg,或至少20 mg/kg)的人抗-CTLA-4抗 体和治疗有效量的CpG 0DN PF3512676。在某些实施方案中，制品包 含装栽人抗-CTLA-4抗体、CpG 0DN PF3512676的一个或多个容器和 用于治疗癌症的标签和/或说明书。本发明包括制备和使用如下药物组合物，其包括本发明的人抗 -CTLA-4抗体作为活性成分，并联合或不联合CpG 0DN PF3512676。 该药物组合物可以由单独的每种活性成分组成，作为至少一种活性成 分的组合(例如，有效剂量的抗-CTLA-4、有效剂量的CpG 0DN PF3512676)，以适合患者给药的形式，或者该药物组合物可含有活性 成分和一种或多种药学可接受的载体、 一种或多种附加(活性和/或非 活性)成分、或其某些组合。CpG 0DN PF3512676可以直接施用给受试者，或可以与核酸递送 复合物联合施用。核酸递送复合物是指与靶向工具(例如导致更高的结 合乾细胞的亲和力的分子)结合的(例如离子地或共价地结合；或包裹 在其中)核酸分子。核酸递送复合物的实例包括与甾醇(例如胆固醇)、 脂质(例如阳离子脂质，病毒颗粒或脂质体)、或靶细胞特异性结合刑 (例如由靶细胞特异性受体识别的配体)结合的寡核苷酸。优选的复合 物在体内足够稳定，以防止在被乾细胞内化之前显著的解偶联。但是， 复合物可以在适当条件下在细胞内切割，使核酸以功能形式释放。已经描述了用于将抗原和寡核苷酸递送至表面的递送栽体或递送 装置。CpG 0DN PF3512676和/或抗原和/或其它治疗剂可以单独施用 (例如，在盐水或緩沖液中)，或使用本领域已知的任意递送栽体。例 如，已经描述了下述递送栽体Cochleates; Emulsomes， ISC0M;脂 质体；活细菌栽体(例如，沙门氏菌，大肠杆菌，Bacillus cal迈atte-guerin,志贺氏菌，乳杆菌)；活病毒栽体(例如，痘苗病 毒，腺病毒，单纯疱渗)；微球；寡核苷酸疫苗；聚合物；聚合物环； 蛋白体；氟化钠；转基因植物；病毒颗粒；病毒样颗粒，和阳离子脂 质，肽，或与多阴离子寡核苷酸具有电荷相互作用的其它载体。其它递 送载体是本领域已知的，有些其它实例在下面载体的讨论中提供。在一个实施方案中，肠胃外(例如，静脉内)施用在含水溶液中的 抗体，而通过皮下注射施用CpG 0DN PF3512676。 CpG 0DN PF3512676 的优选制剂和剂型描述在美国专利申请公开号US2004/0198680，它的 公开内容整体通过参考引用并入本文。但是，基于本文提供的公开内 容，技术人员可以理解本发明不限于这些或任何其它制剂、剂量、给 药途径等。相反，本发明包括施用抗体与CpG 0DN PF3512676组合的 任何制剂或方法，包括但不限于，经过不同的给药途径分别以不同制 剂分开施用每种活性剂，例如，静脉内施用抗-CTLA-4抗体，同时皮 下共同施用CpG 0DN PF3512676,以及其它。因此，接下来的讨论描 述了各种不同的制剂，用于实施本发明的方法，包括联合CpG 0DN PF3512676的任意抗-CTLA-4抗体的给药，但是本发明不限于这些制剂，而是包括本领域技术人员在具有本文所提供的用于本发明的方法 的教导后能轻易确定的任何制剂。可将用于本发明的抗体掺入适合施用给受试者的药物组合物中。一般地，该药物组合物包含抗体和药学可接受的载体。如此处所用的， "药学可接受的载体"包括生理学上相容的任何和所有溶剂、分散介 质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药学可接 受的栽体的例子包括水、盐水、磷酸盐緩冲盐水、葡萄糖、海藻糖、 甘油、乙醇等中的一种或多种及其组合。在许多情况下，优选地在组 合物中包含等渗剂，例如，糖类、多元醇例如甘露糖醇、山梨醇或氯 化钠。药学可接受的物质例如润湿剂或少量辅助物质例如润湿剂或乳 化剂、防腐剂或緩冲剂，会增加抗体或抗体部分的保质期或效力。所述抗体可以各种形式存在。这些形式包括，例如，液体、半固 体和固体剂型，例如液体溶液(例如，可注射和可输注的溶液)、分 散体或悬浮物、片剂、丸剂、粉剂、脂质体和栓剂。优选的形式依赖 于想要的施用和治疗应用模式。 一般优选的组合物以可注射的或可输 注的溶液的形式存在，例如和用于利用其它抗体进行的人被动免疫的 组合物相似的组合物。优选的施用模式是肠胃外(例如，静脉内、皮 下、腹膜内、肌内)模式。在优选的实施方案中，通过静脉内输注或注 射施用抗体。在其它优选的实施方案中，通过肌内或皮下注射施用抗 体。在生产和贮存条件下，治疗性组合物一般必须是无菌的和稳定的。 可将组合物配制为溶液、微乳、分散体、脂质体或其它适合高药物浓 度的有序结构。可通过将抗体以所需要的量掺入具有上面例举的成分 之一或其组合的合适溶剂中，如所要求的，然后进行过滤灭菌来制备 无菌的可注射溶液。 一般地，通过将活性化合物掺入无菌载体中来制 备分散体，所述载体包含基本的分散介质和所需要的来自上述成分的 其它成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂的情况下，优选的 制备方法是真空干燥和冷冻干燥，由事先无菌过滤的溶液产生活性成 分加上任何额外的所需成分的粉末。可通过例如使用包衣例如卵磷脂，在分散体的情况下通过保持所要求的颗粒大小以及通过使用表面活性 剂来保持溶液的合适的流动性。可通过将延迟吸收的试剂例如单硬脂 酸盐或明胶包括入组合物中带来可注射组合物的延长吸收。可通过各种本领域已知的方法施用抗体和/或CpG ODN PF3512676，所述方法包括，但不限于，口服、肠胃外、粘膜、经吸入、 局部、口含、鼻和直肠。对于许多治疗性应用，优选的施用途径/模式 是经皮下、肌内、静脉内或输注。如果需要，可使用无针注射。如本 领域技术人员所意识到的，施用的途径和/或模式将依所想要的结果而 发生变化。可调整给药方案以提供最适合的想要的反应。例如，可施用单次 推注，在一段时间可施用几个分开的剂量，或可根据治疗状况的紧急 按比例减少或增加剂量。以剂量单位形式配制肠胃外施用的组合物以 方便施用和统一剂量是特别有利的。此处使用的剂量单位形式是指物 理上分开的单位，其适合作为用于被治疗的哺乳动物受试者的单位剂 量；每一个单位含有经计算可产生想要的治疗效果的预先确定量的活 性化合物以及所需的药物载体。本发明的剂量单位的规格受制于并直 接依赖于(a)抗体的独特性质和要达到的特定治疗性或预防性效果，和 (b)配制这种活性化合物用于治疗个体内的敏感性领域内内在的限制。要注意的是，剂量值可根据待緩和的病症的类型和严重性来变化， 并且可包括单一或多个剂量。可以进一步理解，对于任何特定受试者， 应该根据个体所需和施用或监督该组合物给药的人的专业判断来随着 时间调整具体的给药方案，这里所列的剂量范围只是用于示例，而并 非要限制要求保护的组合物的范围或实施。在一个实施方案中，抗体作为含有5或10 mg/ml抗体、以及乙 酸钠、聚山梨酯80和氯化钠的无菌水溶液(pH范围在大约5至6)，以 静脉内制剂的形式给药。优选地，静脉内制剂是含有5或10mg/ml 抗体、以及20mM乙酸钠、0. 2mg/ml聚山梨酯80和140mM氯化钠的 无菌水溶液(pH为5.5)。在一个实施方案中，部分剂量通过静脉内推注给药，剩余的通过抗体制剂的输注给药。例如，0. Olmg/kg抗体静脉注射可以以推注实 现，剩余的预定抗体剂量可以通过静脉注射给药。预定剂量的抗体可 以在例如1. 5小时至2小时至5小时的期间内给药。本文所描述的药物组合物的制剂可以通过药学领域己知或以后将 开发的方法来制备。通常，该制备方法包括如下步骤将活性成分加 入栽体或一种或多种其它助剂，随后，如果需要或希望，将产品定型 或包装成为希望的单一或多剂量单位。本发明的药物组合物可以作为单一单位剂量、或作为多个单一单 位剂量制备、包装或销售。如此处所使用的，"单位剂量，，是含有预 定量的活性成分的药物组合物的离散量。活性成分的量通常相当于要 给予受治疗者的活性成分的剂量或该剂量的适宜部分，例如，该剂量 的一半或三分之一。本发明的药物组合物中的活性成分、药学可接受的载体和任何附 加成分的相对量，根据要治疗的受治疗者的身份、大小和病症而变化， 并进一步根据组合物的给药途径而变化。作为例子，该组合物可含有 介于0.1 %到100% (w/w)的活性成分。除了活性成分之外，本发明的药物组合物可以进一步含有一种或 多种其它的药物活性剂。特别预期的附加活性剂包括止吐剂、止泻剂、 化疗剂、细胞因子等。本发明的药物组合物的控释或持续释放制剂可以使用传统技术来 制备。如本文所使用的，药物组合物的"胃肠外给药"包括以下任何给 药途径，其特征在于物理地突破受治疗者的组织，并将药物组合物 经过组织的破口给药。因此胃肠外给药包括但不限于，药物组合物通 过注射组合物、通过手术切口应用组合物、通过穿透组织的非手术伤 口应用组合物等的给药。特别地，预计胃肠外给药包括但不限于，皮 下、腹膜内、肌内、胸骨内注射、以及肾透析输注技术。适合胃肠外给药的药物组合物的制剂，包含活性成分与药学上可 接受的载体组合，例如无菌水或无菌等渗盐水。这样的制剂可以以适合推注给药或连续给药的形式来制备、包装或销售。注射制剂可以单 位剂量形式制备、包装或销售，例如在安瓿中或在含有防腐剂的多剂 量容器中。用于胃肠外给药的制剂包括但不限于，悬液、溶液、在油 性或水性媒介中的乳液、糊剂、以及可植入的持续释放或生物可降解 的制剂，如下所讨论的。这类制剂可进一步含有一种或多种附加成分， 包括但不限于助悬剂、稳定剂或分散剂。在胃肠外给药的制剂的一个 实施方案中，在重配组合物的胃肠外给药之前，活性成分以干(即，粉 末或颗粒)形式提供，以与合适的媒介(例如，无菌无热原水)进行重配。 本发明的组合物可以通过本领域已知的各种方法给药。给药的途 径和/或模式取决于预期的结果而变化。活性化合物可以与保护化合 物防止快速释放的载体一起制备，例如控释制剂，包括植入剂、透皮 贴剂、和微嚢化递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合 物，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。许多关于这类制剂的制备方法描述在，例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed.， Marcel Dekker， Inc., New York, (1978)。药物组合物优选在GMP 条件下生产。药物组合物可以以无菌可注射水性或油性悬液或溶液的形式制 备、包装或销售。该悬液或溶液可以根据已知技术来配制，并且可含 有除了活性成分之外的添加成分，例如本文所述的分散剂、润湿剂或 悬浮剂。该无菌注射制剂可以使用无毒的胃肠外可接受的稀释剂或溶 剂例如水或1， 3-丁二醇来制备。其它可接受的稀释剂和溶剂包括但 不限于，林格氏溶液、等渗氯化钠溶液、和例如合成的单酸或二酸甘 油酯的不挥发性油。其它有用的胃肠外给药的制剂包括如下制剂其 含有微晶形式、脂质体制剂形式的活性成分，或作为生物可降解聚合 物系统的成分。用于持续释放或植入的组合物可以含有药学上可接受 的聚合性或疏水性材料，例如乳液、离子交换树脂、微溶聚合物、或 微溶盐。本发明的抗-CTLA-4抗体/CpG 0DN PF3512676活性成分组合可以施用给动物，优选人。施用的每种活性成分的准确剂量根据许多因素 而变化，包括但不限于，动物的类型和要治疗的疾病状态的类型、动 物的年龄和给药途径。本发明的抗体-CpG 0DN PF3512676组合可以与多种其它化合物(尤其是抗激素治疗剂、细胞因子、化疗和/或抗病毒药物)共同给药。 或者，化合物可以在抗体-CpGODNPF3512676组合之前一小时、 一天、一周、 一月或甚至更长时间给药，或其任意排列。而且，化合物可以 在给予放射、干细胞移植、或给予任何治疗剂(例如细胞因子、化疗化 合物等)之后一小时、 一天、 一周、 一月或甚至更长时间给药，或其任 意排列。频率和给药方案对于本领域技术人员而言显而易见，并且取 决于许多因素，例如但不限于，要治疗的疾病的类型和严重程度、动 物的年龄和健康状况、要给予的化合物的特性、不同化合物的给药途 径等。提供了展示共同施用抗体-CpG 0DN PF3512676来治疗癌症的方 法的几个有教益的实施例，但是本发明绝不限于这些实施例，它们仅 仅用于解释本发明包括的方法。VIII.药盒本发明包括各种用于治疗癌症的药盒，所述药盒包括治疗有效量 的本发明的人抗-CTLA-4抗体和治疗有效量的CpG ODN PF3512676， 以及施药器和指导材料，该指导材料描述了该组合实现本发明方法的 应用。尽管在下文描述了示例性的药盒，根据本发明公开的内容，其 它有用的药盒的内容物对于本领域技术人员是显而易见的。这些药盒 中的每一种均包括在本发明内。木发明包括用于治疗有此需要的患者的肾细胞癌的药盒。该药盒 包括本发明的人抗-CTLA-4抗体和CpG ODN PF3512676。该药盒还包 括施药器，包括但不限于注射器，用于将药盒的成分给予患者。而且， 该药盒含有指导材料，其列出关于应用该药盒治疗患者的乳腺癌的有 关信息。更优选地，该药盒包括至少一种抗-CTLA-4抗体，其选自4.1.1，4.8.1， 4.10.2， 4.13.1， 4.14.3， 6.1.1， 11.2.1, 11.6.1， 11.7.1， 12.3.1.1， 12. 9. 1. l，和MDX-010，更优选地，抗体是4. 13.1, 11.2.1， 和MDX-OIO。本发明包括，含有抗-CTLA-4抗体和CpG 0DN PF3512676的任意 组合的药盒。尽管这样的药盒是优选的，本发明不限于该特定组合。 此外，所述药盒可以包含许多用于治疗癌症的其它试剂。这样的试剂 如前面所述，包括化疗化合物，癌症疫苗，除了 CpG 0DN PF3512676 以外的TLR激动剂，其它CpG ODN，受体酪氨酸激酶抑制剂(例如、 但不限于，SU11248)，用于治疗异常细胞生长或癌症的试剂，通过结 合IGF-1R来抑制胂瘤生长的抗体或其它配体，化疗剂(紫杉烷，长春 花生物碱，铂化合物，嵌入抗生素，以及其它)，和细胞因子，以及其 它，以及用于治疗例如在治疗过程中产生的任意毒性的治标剂，例如、 但不限于，止泻剂，止吐剂，等。通过参考以下实验实施例来进一步详细描述本发明。这些实施例 仅仅用于解释目的，不是用于限制，除非另有说明。因此，本发明决 不能被解释为限于以下实施例，而应被解释为包括从本文所提供的教 导而显而易见的任何和所有变化。实施例1:抗-CTLA-4抗体与CpG 0DN PF3512676组合用于治疗乳腺癌 在手术/放疗(如果存在)后，按照确立的方案，给至少一个病损 可通过常规CT扫描或螺旋CT扫描精确地二维测量的患有转移性乳腺 癌的患者施用CpG 0DN PF3512676。简而言之，以0. 02-20 mg/kg， 最优选皮下约0.2 mg/kg和静脉内2 mg/kg的剂量，皮下或静脉内施 用CpG 0DN PF3512676。在CpG ODN PF3512676治疗之前7天或之后7天之间，以约10 mg/kg的剂量，另外给患者施用单次静脉内输注(100mL/小时)本文所 述的抗-CTLA-4抗体11. 2. 1。28天后重复抗体治疗，不升高抗-CTLA-4 抗体剂量，此后在没有不可耐受的毒性或疾病进展的情况下，每28天重复一次，最多12个循环。在输注抗-CTLA-4之前至少1.5小时，可给患者预先给药抗组胺 药(H1)。但是，尽管可以施用预先给药，优选地，通常不对患者预先 治疗。更优选地，给经历输注反应的患者施用抗组胺药(Hl)和/或其它 治疗措施。在治疗过程中和之后，在适当时给予止吐剂和止泻剂以及其它治 标疗法。根据所确定的，与人抗-CTLA-4抗体11.2.1先后或同时施用CpG 0DN PF3512676 —次或反复多次。抗-CTLA-4抗体提供在带有橡胶塞子和铝封的10ml透明玻璃小 瓶内。每个小瓶含有5mg/ml(标称装量为50mg/小瓶)抗-CTLA-4抗 体的无菌水溶液，所述水溶液含有20 mM乙酸钠、0. 2mg/ml聚山梨 酯80、和140mM氯化钠，pH 5.5。CpG ODN PF3512676以多种不同浓度提供在药学可接受的无菌的 无防腐剂的磷酸盐緩冲盐水溶液中，用于肠胃外给药。如临床上要求的那样，对于所有患者，在给药前评估ECOG性能状 态、生命体征以及体重，用药后可以重复评估生命体征。在第一天进 行身体检查(包括眼科评估和自身免疫体征)。获得用于血液学板(血细 胞比容、RBC计数、WBC计数、分类)、化学(碱性磷酸酶、钙、氯、GGT、 LDH、镁、磷、随机葡萄糖、钠、尿素、尿酸)、尿分析(血、蛋白)、 其它(活化部分凝血激酶时间[APTT]、凝血酶原时间(PT)、自身抗体板、 C反应蛋白、TSH、 T3、 T4、淀粉酶、脂肪酶、血清C3、 C4、血清Ig 水平)的样品。测定人抗-人抗体(HAHA)滴度基线，并在用药前获得药代动力学 (PK)标本。测量下列端点PK参数、HAHA、反应速率和进展时间。进展时间 和总的生存率用Kaplan-Meier乘积极限法计算。等同方案尽管本发明参照特定的实施方案被公开，但4艮明显，本领域技术 人员可设计本发明的其它实施方案和变化，而不背离本发明的真实实 质和范围。所附的权利要求应当理解为包括所有这些实施方案和等同 的变化。本文引用的每篇专利、专利申请和公开出版物的公开内容，整体 通过参考引用并入本文。
权利要求
1. 治疗需要这样的治疗的患者的癌症的方法，所述方法包括，给所述患者施用治疗有效量的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合部分，与治疗有效量的CpG ODN PF3512676相组合。
2. 权利要求1的方法，其中每天、隔天、每周2次或每周1次施 用所述CpG 0DN PF3512676。
3. 权利要求1或2的方法，其中所述治疗是选自下述的疗法新 辅助疗法，辅助疗法， 一线疗法，二线疗法，和三线疗法。
4. 权利要求1， 2或3的方法，其中所述人抗-CTLA-4抗体的所 述治疗有效量范围是约0.1 mg/kg-50 mg/kg。
5. 权利要求4的方法，其中所述人抗-CTLA-4抗体的所述治疗有 效量范围是约0. 3 mg/kg-20 mg/kg。
6，权利要求5的方法，其中所述人抗-CTLA-4抗体的所述治疗 有效量选自至少1 mg/kg，至少3mg/kg，至少6mg/kg，至少10mg/kg， 和至少15 mg/kg。
7. 权利要求1-5或6的方法，其中所述癌症选自乳腺癌，前列 腺癌，卵巢癌，胰腺癌，黑素瘤，肺癌，急性髄细胞白血病，结肠直 肠癌，肾细胞癌，皮肤T-细胞淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，胃癌，头颈 部癌，肝癌，子宫颈癌，脑癌，和肉瘤。
8. 权利要求1-6或7的方法，其中所述抗-CTLA-4抗体或其抗 原结合部分是选自下述的至少一种抗体(a) 具有约10—8或更大的对CTLA-4的结合亲和力的人抗体，且其 会抑制CTLA-4与B7-l之间的结合和CTLA-4与B7-2之间的结合；(b) 具有包括至少一种人CDR序列的氨基酸序列的人抗体，所述 人CDR序列对应源自选自以下的抗体的CDR序列4.1.1， 4.8.1， 4. 10. 2， 4. 13. 1， 4. 14. 3， 6. 1. 1， 11. 2. 1， 11. 6. 1， 11. 7. 1， 12. 3. 1. 1， 12. 9. 1. l，和10D1;(c) 具有选自4.1.1， 4.8.1， 4,10.2， 4.13.1， 4.14.3， 6.1.1，11.2.1, 11.6.1, 11.7.1， 12.3.1.1， 12. 9. 1. l，和10D1的抗体的重 链和轻链的氨基酸序列的人抗体；(d) 抗体或其抗原结合部分，其与至少一种具有选自4.1.1， 4.8.1， 4.10.2， 4.13.1， 4.14.3， 6.1.1， 11.2.1, 11.6.1， 11,7.1， 12.3.1.1， 12. 9.1.1，和10D1的抗体的氨基酸序列的抗体竟争结合 CTLA-4;和(e) 抗体或其抗原结合部分，其与至少一种具有选自4.1.1， 4.8,1, 4.10.2, 4.13.1, 4.14.3， 6.1.1, 11.2.1， 11.6.1， 11.7.1， 12. 3. 1. 1， 12. 9. 1. l，和10D1的抗体的氨基酸序列的抗体交叉竟争结 合CTLA-4。
9. 权利要求l-7或8的方法，其中所述抗体是具有选自4. 1. 1， 4. 13. 1, 11. 2. l，和10D1的抗体的氨基酸序列的人抗体。
10. 权利要求9的方法，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重 链和轻链，其中所述重链的重链可变域和所述轻链的轻链可变域的氨 基酸序列选自(a) SEQ ID NO: 3的氨基酸序列和SEQ ID N0:9的氨基酸序列;(b) SEQ ID NO: 15的氨基酸序列和SEQ ID NO: 21的氨基酸序列；(c) SEQ ID NO: 27的氨基酸序列和SEQ ID NO: 33的氨基酸序列；(d) SEQ ID N0:1的核酸序列编码的氨基酸序列和SEQ ID NO: 7 的核酸序列编码的氨基酸序列；(e) SEQ ID NO: 13的核酸序列编码的氨基酸序列和SEQ ID NO: 19 的核酸序列编码的氨基酸序列；(f) SEQ ID NO: 25的核酸序列编码的氨基酸序列和SEQ ID NO: 31 的核酸序列编码的氨基酸序列；和(g) 抗体10D1的可变域的氨基酸序列。
11. 权利要求9的方法，其中所述抗体或其抗原结合部分是选自 下述的抗体(a)包含SEQ ID NO: 4， SEQ ID NO: 5， SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10， SEQ ID NO. 11和SEQ ID NO: 12所述氨基酸序列的抗体；(b) 包含SEQ ID NO: 16， SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18， SEQ ID NO: 22， SEQ ID NO: 23和SEQ ID NO: 24所述氨基酸序列的抗体；和(c) 包含SEQ ID NO: 28， SEQ ID NO: 29， SEQ ID NO: 30， SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35和SEQ ID NO: 36所述氨基酸序列的抗体。
12. 权利要求9的方法，其中所述抗体或其抗原结合部分包含具 有SEQ ID NO: 27所述氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO: 33所述氨基酸序列的轻链可变区。
13. 权利要求9的方法，其中所述抗体选自(a) 包含SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 8所述氨基酸序列的抗体；(b) 包含SEQ ID NO: 14和SEQ ID NO: 20所述氨基酸序列的抗体；和(c) 包含SEQ ID NO: 26和SEQ ID NO: 32所述氨基酸序列的抗体。
14. 权利要求1-12或13的方法，其中在施用所述CpG ODN PF3512676之前1-7天，施用所述抗体。
15. 权利要求1-13或14的方法，其中在所述抗体后约1到100 天，施用所述CpG ODN PF3512676。
16. 权利要求1-14或15的方法，其中皮下施用所述CpG ODN PF3512676。
17. 权利要求1-15或16的方法，其中以1 mg-50 mg/天的量， 施用所述CpG ODN PF3512676。
18. 用于治疗癌症的药物组合物，所述组合物包含治疗有效量的 抗-CTLA-4抗体或其抗原结合部分，和治疗有效量的CpG ODN PF3512676,以及药学可接受的栽体。
全文摘要
本发明涉及施用抗-CTLA-4抗体，尤其针对人CTLA-4的人抗体，例如具有抗体3.1.1，4.1.1，4.8.1，4.10.2，4.13.1，4.14.3，6.1.1，11.2.1，11.6.1，11.7.1，12.3.1.1，12.9.1.1，和MDX-010的氨基酸序列的抗体，其与免疫刺激核苷酸即CpG ODN PF3512676相组合，用于治疗癌症。本发明涉及在疾病期间的任意点(例如在癌症的任意阶段)，施用抗-CTLA-4抗体和CpG ODN PF3512676的组合，作为对局限的或转移的癌症的新辅助疗法、辅助疗法、一线疗法、二线疗法和三线疗法。
文档编号A61K39/395GK101268101SQ200680032520
公开日2008年9月17日 申请日期2006年6月30日 优先权日2005年7月7日
发明者A·M·克莱格, D·C·汉森, D·R·J·瑞德特, J·U·B·琼纳利尤斯, J·格梅斯-纳瓦罗 申请人:科利制药集团公司;辉瑞大药厂