专利名称：：作为新的局部用抗出血剂的活化的因子X(FXa)的刺激剂的制作方法作为新的局部用抗出血剂的活化的因子X(FXa)的刺激剂发明领域本发明涉及通过使用FXa刺激剂来局部治疗个体的出血。本发明是基于脂化的组织因子(TF)表现出新的调节作用的发现，该调节作用刺激两种形式的FXa，即可溶性FXa及与凝血酶原酶复合物结合的FXa的所有蛋白水解活性(酰胺水解活性及凝血酶原水解活性)。
背景技术：
：1.凝血生理学止血是生物体对出血作出应答的机制，其涉及两种在损伤后立即起作用且长时间保持活性的过程的参与。第一个过程被称为原发性止血，其特征在于在血管损伤部位发生血管收缩并形成血小板聚集。第二个过程称为继发性止血，在此阶段由于不同凝血级联(coagulationcascade)蛋白水解酶的作用，形成纤维蛋白凝块。血小板聚集在毛细血管止血中起关键作用，这对黏膜皮肤出血特别重要。相反的，纤维蛋白凝块形成对大血管止血更重要，尤其对内出血(胃肠道、脑出血等)更重。在血小板聚集形成过程中，可区分为下列阶段(i)血小板黏附至由损伤暴露的内皮下层表面；(ii)释放血小板的颗粒内容物作为对血小板活化的应答；(iii)血小板聚集造成随后更多的血小板在损伤部位螯合(sequestering)并集中；以及(iv)纤维蛋白原及其它凝血蛋白与血小板表面结合，以产生凝血酶并形成纤维蛋白凝块，该纤维蛋白凝块允许血小板融合并固化，从而使止血凝块稳固。另外，公知血小板计数对纤维蛋白凝块形成起关键作用；血小板计数低于20,000每微升会伴随严重的出血事件。多种辅因子及蛋白水解酶参与凝血过程的第二阶段，它们皆称为凝血因子，以及这个阶段由多个阶l史组成，以由于凝血酶的作用由纤维蛋白原水解形成纤维蛋白作为结束。另外，凝血酶的产生通过增加更多的血小板被活化及聚集来增强血小板聚集。凝血酶最先由脱辅基酶，凝血酶原进行蛋白水解形成。此蛋白水解作用是由与活化的血小板的表面结合的丝氨酸蛋白酶FXa进行，且只有当其辅因子，活化的凝血因子V(FVa)及钩离子存在时，此丝氨酸蛋白酶才能够水解凝血酶原。FXa可由两种单独的途径产生，即内源途径及外源途径。内源途径由一系列的主要涉及凝血因子VIII(FVIII)、凝血因子IX(FIX)及凝血因子XI(FXI)的反应组成，其中各个酶原被水解，产生其活性蛋白酶形式(FVIIIa、FIXa及FXIa)。在各步骤中，新形成的蛋白水解酶将下一酶原催化活化以相继产生活性形式。在内源途径中所涉及的不同凝血因子被活化；因此，内源途径中任何蛋白质的缺乏将以级联方式阻断下一步骤的活化，阻止凝块形成并增加出血趋势。不同凝血因子的缺乏将造成严重的出血综合征，例如FVIII、FIX或FXI的缺乏分别造成血友病A、B和C。在血液凝固的外源途径中，在损伤部位的外膜细胞上暴露的TF结合循环凝血因子VII/活化的凝血因子VII(FVII/FVIIa)，以形成TF::FVIIa复合物，以及当钙离子存在时以用作使FX活化的底物。夕卜源途径目前被认为在血液凝固中是最相关的途径，公认如果发生由血管损伤导致的出血，则由于外源途径活化涉及TF与其配体-FVII/FVila的相互作用，将启动凝血。TF::FVIIa复合物在凝血中的另一项作用是用作底物，使得因FVIIa而发生FX活化。结果，最初不足以使纤维蛋白凝块形成的基础FXa水平(〈150pM)增加。在其辅因子，FVa及细胞的促凝表面的存在下，这种基础FXa浓度的增加将能够产生纤维蛋白凝块形成所需要的凝血酶。目前公认的是一旦血小板被活化，它们在凝血过程起关4囊作用。它们提供了富含阴离子磷脂的促凝表面，另一方面它们使储存其内的FVa及FXa暴露。所有这些都使参与凝血的不同物质在其质膜表面正确组合，形成公知的凝血酶原酶复合物(其包括FXa、FVa、凝血酶原及阴离子促凝血性血小板磷脂表面)。外源途径活化的理论能够解释凝血反应是如何通过TF::FVIIa复合物开始的。说明TF::FVIIa复合物在凝血过程中的生物相关性的一个例子，就是弥散性血管内凝血(DIC)综合征。此临床疾病状态与TF的血管内释放有关，并可出现在严重的临床疾病状态的病程中(休克、脓毒病、心脏停搏、严重创伤、肝病、大外科、烧伤等)。显然在FVIIa缺乏的情况下，例如先天性缺乏此因子时，理论上不发生凝血，因为无法活化足够水平的FX，因而出血现象将是致命的。鼠模型证实这一理论，FVII缺乏是威胁生命的并伴随着严重的致命性出血。然而，到目前为止在人类中描述的先天性FVII缺乏症并非总是伴随着出血。曾经4艮道了无任何临床症状并发生在无任何出血并发症的健康人身上的FVII完全缺乏的病例。这些均显示，人体内一定存在不依赖于FVII的其它引发凝血的机制。TF是属于特异性结合FVII/FVIIa的II类细胞因子受体超家族的完整的膜糖蛋白，以及在外源性凝血途径中起重要作用。TF的生理作用是公知的；一方面它是对FVIIa有特异性的受体，并且一旦形成TF::FVIIa复合物，其便起底物的作用，从而发生FX活化。事实上，在血管损伤后，通常被隔离在血管外围的外膜细胞表面上的TF与其配体，存在于血液中的FVII接触并相互作用，形成TF::FVII复合物。一旦形成该复合物，便发生FVII自体活化，产生其活化形式FVIIa。目前关于TF::FVII复合物的结构有了广泛的信息。参与FVII与TF的相互作用的主要的FVII结合部位位于与表皮生长因子(EGF)的第一结构域类似的第一结构域内及蛋白酶结构域中。另一方面，还报道了参与其中的其它较次相关的结合部位(富含4-羧基谷氨酸酯的结构域(Gla结构域)及第二EGF结构域)。TF中存在的结合部位位于两个类型III纤连蛋白结构域及这两个结构域之间的中间区。最近的研究已经发现，TF的赖氨酸165和赖氨酸166残基与活化形式及非活化形式的FX的Gla结构域相互作用。然而与关于TF::FVIIa复合物的信息不同的是，我们对TF与FX及FXa的相互作用所知甚少。首先，数据表明赖氨酸(165和166)残基作为FX活化的底物起作用。另一方面，最近的研究描述TF可用作FXa辅因子以活化FVII。也就是说，FVII与TF的结合刺激FVIIa自体活化及FX活化。之后，结合TF的FXa刺激FVII活化，进而增加FX活化，并致使凝血酶原水解及纤维蛋白凝块形成。发明人发现，TF作为FXa的辅因子的假设角色更为重要，对止血至关重要。虽然TF公认的角色是FVII的膜受体，发明人证实TF也是有效的FXa刺激剂。作为FXa刺激剂，TF显著提高其蛋白水解活性。本说明书中使用的"FXa刺激剂"是指所有形式的FXa,诸如可溶性FXa及结合凝血酶原酶复合物的FXa。公知，皮摩尔浓度的FXa对凝血不能够产生任何作用，即使其公知的辅因子FVa的存在时也亦然(见表9)。因此在这种情况下，凝血酶原酶复合物是无活性的。令人意外的是，当TF存在时(即，受伤或外源性给药)，皮摩尔浓度的FXa(即，生理基础浓度或外源性给药)仍能引起凝血酶原水解，导致纤维蛋白凝块形成，即使没有FVII/FVIIa存在下也亦然(表7)。在本专利申请中，发明人描述了TF::FXa相互作用是不依赖于TF::FVIIa复合物及外源性凝血途径的新的引发凝血才几制。最后，公知存在着一些血小板疾病，其伴随着血小板聚集异常及具有较高的发生出血事件的趋势，其中格兰茨曼病(Glanzmann，sdisease)及贝-苏综合4i(Bernard-Souliersyndrome)尤为突出，^>开了在这些疾病中先天性缺陷分别影响纤维蛋白原受体及Gplb受体。另一方面，当血小板计数下降在20,000/jliI以下时，在先天性及后天性血小板减少症中将存在严重的出血事件。在本专利申请中，发明人证实脂化的TF也有效治疗存在于先天性、后天性血小板疾病或严重的血小板减少症中(低于9,000//11)的出血。2.凝血病理学先天性缺乏各种凝血因子可以与出血的发生相关，以及它们通常涉及单一蛋白；因此，例如血友病A是缺乏FVIII的遗传性出血性疾病。后天性凝血疾病发生在先前无出血史的个体，并可能有多种来源；举例来说，在接受多次输血的个体中可能存在对凝血因子有特异性的抑制剂。虽然后天性凝血因子缺乏在病因学上未知，其也引起严重的止血问题，但是它们也是患有先天性凝血病的患者在接受多次输血时会发生的最严重的问题之一。后天性凝血障碍的其它重要来源是抗凝血剂治疗，例如肝素及华法林药物。显著比例(5至10%)的用抗凝血药物治疗的患者存在出血事件，这些事件大多数都不易治疗。如前所述，先天性及后天性血小板疾病还可以与出血相关。血小板计数降低(低于20,000//xl)可能引起经常与严重出血事件一同发生的纤维蛋白凝块形成障碍(fibrinclotimpairment),目前用于轻度/中度或严重/致命出血(由手术或外部创伤造成)的可利用的治疗方法非常有限。存在能够加速凝血及防止出血的不同止血剂，例如(l)人来源的血液制品，如凝血因子浓缩物，及局部止血剂，如纤维胶原、纤维蛋白胶及凝血酶原复合物浓缩物；(2)人重组蛋白；(3)抗纤维蛋白溶解的药物，例如氨基己酸、氨甲环酸；及(4)无机局部止血剂，i口石圭石及陶土表面)。下列重要的局限性曾被报道(1)静脉给药(2)给药需要特殊装置(3)治疗目标狹窄(4)对特定的出血事件无法给予适当或简便的治疗(5)缺乏急性作用(6)纤维蛋白凝块不稳定(7)副作用非常危险(8)治疗昂贵人来源的血液制品(凝血因子及血小板浓缩物)这是一种非常昂贵的且可利用性低的治疗，其必须一直静脉给药药。该治疗具有非常狭窄的治疗目标，及只能用于治疗特定的因子缺乏症。该治疗不适用于局部治疗任何种类的出血事件。其也无法用于急性治疗出血，因为其需要长期的给药方案才能有效，并且最重要的是这是非常危险的治疗20。/。的血友病患者感染肝炎、5%的患者感染HIV、高达15%的患者出现抗FVIII或IX的血浆抗体(后天性血友病)，这需要使用特殊且非常昂贵的替代治疗(免疫抑制剂、高剂量的凝血因子、血浆去除术等)。因为这些原因，z^共卫生组织(WHO、FDA、EMEA等)极欲发展优于凝血因子浓缩物的新的止血剂。局部止血剂这是一种昂贵的治疗，其不适合在某些出血事件(即，鼻出血)中给药，对于牙科治疗也是麻烦的，形成不稳定的纤维蛋白凝块，并和凝血因子浓缩物一样具有潜在的危险副作用。它们不应被用于从未接受人来源的血液制品的患者中，以及不应被用于由于潜在的人类病毒传4番风险而4妄受用重组FVIII或IX进4亍治疗的患者。人重组蛋白这是最昂贵的治疗(平均费用为6,000欧元)，只在发达国家使用。与凝血因子浓缩物一样，其必须一直要静脉给药，因为只能用于治疗特定的因子缺乏症，因此治疗目标非常狭窄，不适合局部治疗出血，因为其也需要长期给药方案才有效，因此不能用于急性治疗出血，以及虽然不曾有人类病毒传播的报道，但是有相同比例的后天性血友病(高达15。/。出现抗FVin或IX的抗体)。与凝血因子浓缩物一样，政府当局非常限制它的应用。抗纤维蛋白溶解的药物抗纤维蛋白溶解的药物最主要的限制在于其具有狭窄的治疗目标。这些药物需要预先形成纤维蛋白凝块才有效。因此，其只能用于健康个体，但是，当不适当地形成纤维蛋白凝块时(即，先天性凝血病，如血友病、FVII缺乏症)，其疗效显著降低。另外它们无法用于急性治疗出血，因为其也需要长期给药方案才有效。无才几局部止血剂这些止血剂的最重要的使用限制在于其不适于在多种类型的出血中进行给药，例如鼻出血、牙科及外科手术。另外，曾报道有疼痛放热反应，因此明显减少了它的应用，将其用途仅限于危急状况(如战争)下的勦膜皮肤出血。总而言之，令人意外的是目前没有可利用的药物来适于局部治疗筒单的鼻出血，刷牙后牙龈出血，或单纯因为刮胡子、抽血时静脉穿刺或在街上意外跌倒所导致的日常伤口。这个问题在如下患者中更为严重具有出血素质的患者，例如患有血友病类型的或血管性血友病(vonWillebranddisease)的先天性凝血病的患者，患有格兰茨曼病类型的或贝-苏综合征的先天性血小板疾病的患者，或患有后天性凝血病的患者。这些患者在日常生活中就会遇到严重的问题，并且对于简单的拔牙或任何导致出血伤口的小创伤，他们都没有可利用的医药治疗来改善他们的生活质量。当这些患者受到外伤或严重的出血意外时，这个问题显然变得更加严重，因为他们的生命受到严重的威胁。在所有这些情况中，唯一可以使用的医药工具是给予含有所缺乏的因子的人类血浆，或给予对每一凝血因子特异的的人重组因子。但是这些疗法都意味着使用非肠胃外途径给药，因此无法象例如在日常轻微或中度出血的情况下那样被频繁使用。最后，广泛认为无上述限制的新的局部止血剂将显著改善目前的疗法，其既可降低成本又能减少副作用的高发生率。3.
背景技术：
：直到目前为止，公认TF是引发凝血的主要要素。要开始凝血，绝对需要将FX活化为FXa,以启动凝血酶原水解。FXa的来源主要来自FVIIa与其受体(TF)的相互作用。虽然有报告指出FXa存在于血小板颗粒中，当它开始活化时可能被暴露于表面，但是血液中存在的FXa的生理浓度(<150pM)不足以启动凝血酶形成，即使其辅因子FVa及血小板促凝表面存在时也亦然(图1)。因此，目前公认只有当FXa基础浓度显著上升时才会开始凝血。FXa基础浓度上升的来源一向被归因于两点，TF::FVIIa复合物及FIXa的蛋白水解活性(图2)。脂化的TF重组蛋白只能够体外条件下促进健康和血友病血液样品的凝血，此作用归因于TF作为FVIIa受体的典型作用。但是在相同的实验条件下，非脂化的TF表现出完全缺乏这种作用，这表示脂化对于实现TF的功能性是必需的(见结果的6.1部分)。脂化的TF作为局部止血剂的用途从未被描述其能单独用于轻微、严重或致命性出血(外伤或手术性动脉及静脉出血)的治疗。欧洲专利EP266993公开了非脂化的TF作为肠胃外治疗出血综合征的止血剂的用途。然而，这个相同的专利公开了EP266993所请求保护的非脂化的TF与本专利申请的脂化的TF之间有重要的活性差异。事实上，公知脂化的TF在体外条件下具有活性，并且其肠胃外给药立即引起具有致命性后果的弥散性血管内凝血。相反，非脂化的TF在体外条件下不具有活性，但是其已被要求保护通过肠胃外给药来治疗凝血病(EP266993)。到目前为止，没有关于脂化和非脂化的TF单独局部治疗出血事件的作用的数据。在本专利申请中，发明人利用大鼠断尾模型证实非脂化的TF不能够使出血停止。相反，发明人首次证实，脂化的TF是局部治疗所有类型的出血的有用的止血剂，该出血包括病理状况下(用肝素及华法林处理的动物)及健康状况下(没有改变凝血的对照大鼠)的出血。整体来说，这表示脂化的TF与非脂化的TF是明显不同的化合物。因此，脂化的TF作为单独局部治疗出血的试剂的用途对于本领域所属技术人员来说是非显而易见的。另一方面，EP266993是根据现有技术来实施的，该技术假设只有当丝氨酸蛋白酶FVII与其受体TF结合时，其才能被活化。因此，根据EP266993及现有技术，当FVII/FVIIa不存在时，TF—定不具有活性。本领域任何技术人员不能显而易见地想到，TF(脂化及非脂化的)可以有效地治疗FVII缺乏的患者。发明人发现，即使FVIIa不存在，TF也可作为FXa的辅因子。这项发现对于了解非脂化的TF也可用作肠胃外止血剂来治疗FVII缺乏的患者的出血是非常重要的。国际专利申请WO94/02172教导，通过全身给予天然抗凝血剂的抑制剂(抗体)来暂时抑制一种或多种天然抗凝血剂，能够抑制微血管出血。该抑制剂可任选地与凝血酶或脂化的TF的局部给药相组合来进行给药。需要指出的是，这两种化合物的用途一直是作为任选的辅助治疗，从未作为单独治疗。另外，WO94/02172主张这些协同治疗的用途仅用于治疗毛细血管出血(微血管出血，即烧伤、发炎的内脏表面、出血的肝脏表面...)，并且从未用于因外科手术或涉及动脉及静脉损伤的外伤造成的严重或致命性出血。然而，WO94/02172的发明人承认，虽然他们观察到当局部给予凝血酶与全身性治疗相结合时有协同作用，但是当局部给予TF时并未发现这类协同作用(WO94/02172,图3及第22页，第14至15行)。另外，WO94/02172中所主张的剂量范围非常高，从0.1mg至10mg。和WO94/02172相反，本专利申请主张单独使用脂化的TF，以单一治疗轻微/中度至严重/致命的动脉或静脉出血，实施例显示这种治疗在1.2/ig/ml的活性蛋白剂量下对于创伤性出血是有效的(见表24及25中的严重模型)。这种令人惊讶且格外有效的治疗迄今为止未曾被描述，因为脂化的TF用作FXa蛋白水解活性的刺激剂对于本领域所属技术人员而言是非显而易见的。发明人发现当FVIIa不存在时，TF作为FXa的辅因子，甚至在其公知的辅因子FVa不存在下也亦然。这项发现对于了解脂化的TF能够单独用作止血剂以治疗健康及病理状况下的严重出血是非常重要的。美国专利第4,721,618号教导静脉给予磷脂(PCPS)与高浓度的FXa(0.2至0.5U/Kg)的协同混合物，可以越过血友病哺乳动物的因子vm:c缺乏，使得凝血级联过程可以继续进行。所述建议的高浓度的FXa不需要PCPS脂质嚢(其可提高活性)就具有活性。WO02/086118还教导包括至少一种特殊磷脂与至少一种丝氨酸蛋白酶活化的凝血因子的混合物的组合物用于治疗凝血障碍，减少给予凝血因子的需求。另外，WO02/30479主张并使用鞣花酸及诸如沸石、硅石及无机氧化物的其它促进剂促进凝血。根据WO02/086118，凝血因子定义为丝氨酸蛋白酶活化的凝血因子(第5页第13至15行)。因此TF可能不被认为是凝血因子，因为TF不是丝氨酸蛋白酶，而是因子Vila的特异性细胞表面受体。在本专利申请中，发明人证实磷脂(不同百分比及摩尔浓度的磷脂酰丝氨酸及磷脂酰胆碱)不提高由脂化的TF介导的促凝效果(表21)，这表示美国专利第4,721,618号及WO02/086118所主张的协同作用仅限于丝氨酸蛋白酶活化的凝血因子，不适用于诸如TF的膜受体。令人意外的是，当脂化的TF同时结合负电荷的无机表面(NCIS)时，在体外及体内实验条件下观察到显著的协同作用。本说明书中所用的NCIS是由脂质与血液凝固促进剂-鞣花酸的混合物组成。该脂质具有净负电荷，这意味着该脂质混合物可包括中性或两性离子脂肪，但一定包含一定量的使该混合物具有阴离子特性的负电荷的脂质。举例来说，但不限于此例，负电荷的脂质可以是鞘脂(诸如神经酰胺-l-磷酸盐、糖基化的磷脂酰乙醇胺、羟基化或非羟基化的硫苷脂、神经节苷脂)或基于甘油的脂质(诸如磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰肌醇磷酸、磷脂酸、磷脂酰甘油、心磷脂)。市售的NCIS，诸如DadeActin(DadeBehring)商标，例如DadeActinFS。总而言之，本专利申请描述了新的局部用止血剂，其特征在于与市售的药物相比其具有下列优点(1)容易局部给药(2)局部给药不需要使用特殊的装置(3)治疗目标广泛(FV、FVII、FVIII、FIX、FX、FXI、FXII及FXIII缺乏症)(4)对所有的出血事件均可给予适当治疗(鼻出血、牙出血、黏膜皮肤出血、创伤性出血及外科手术出血)(5)发挥有效的急性作用(6)形成生理性纤维蛋白凝块(凝块稳定性极端高)(7)无副作用(8)治疗费用低WHO、FDA、MEA及其它/^共卫生才几构的主要目标是减少与使用人来源的血液制品相关的危险的副作用。本发明的设计符合这些未被满足的需求。发明概述TF::FVIIa复合物在凝血中的作用是公知的。TF::FVIIa复合物用作底物，使得发生FX活化。最近的研究已经鉴定了TF赖氨酸165残基及赖氨酸166残基与活化形式及非活化形式的FX的Gla结构域相互作用。不同于TF::FVIIa复合物的是，TF与FX及FXa的相互作用所知甚少。仅描述了TF可用作FXa的刺激剂以便FVII活化。也就是说，FXa与TF的结合将刺激FVII活化，进而增加FX活化。发明人发现TF作为FXa的刺激剂的作用对于止血是更为重要的关键(图3)。公知皮摩尔浓度的FXa对凝血及血小板聚集不能够产生任何作用。虽然TF公认的角色是作为FVII的膜受体，但是发明人证实TF也用作FXa的刺激剂，以增强其主要的蛋白水解活性、水解凝血酶原、导致纤维蛋白凝块形成。令人惊讶的是，当TF存在时(即，受伤或外源性给予)，皮摩尔浓度的FXa引起凝血酶原水解，导致纤维蛋白凝块形成，甚至在其配体FVII/VIIa不存在时也亦然。整体结果显示TF用作FXa的刺激剂，并且FXa与TF的特异性结合是引发凝血的第一步。发明人的数据表明凝血发生的速度取决于TF与先前叙述的所有形式的FXa之间的相互作用。在存在不能独自启动凝血的生理浓度的FXa(<150pM)时，脂化的TF由于其作为辅因子的作用而能够快速启动凝血酶形成。令人惊讶的是这些止血作用不依赖于FVII和FVIIa的存在，所以由内源性TF::FXa复合物(FXa〈150pM)所介导的促凝作用在缺乏FVII的样品中特别有效且重要。然而，在来自患有先天性缺乏其它凝血因子的患者的样品中，该其它凝血因子例如FVIII(血友病A)、FIX(血友病B)、FXI(血友病C)、FV、FX、FXII及FXIII，以及患有先天性血小板疾病的个体的样品中，该先天性血小板疾病例如贝-苏综合征及格兰茨曼病和血小板减少症，也发现了强效的止血作用。因此，本发明是基于单独的或与FXa和/或与NCIS组合的脂化的TF作为FXa的新刺激剂用于局部治疗健康个体或具有出血素质的患者中存在的出血的用途。发明人得到的结果开启了使用非脂化的TF或其功能片段治疗缺乏Fvn个体的出血。所述治疗可通过使用用于肠胃外给予非脂化的TF的适当药物给药形式来完成。因此一方面，本发明涉及脂化的TF或其功能片段在制备用于局部治疗个体出血的药物中的用途。另一方面，本发明涉及包含单独的脂化的TF或脂化的TF与FXa和/或NCIS的组合的产品。该产品作为药物的用途或在制备用于治疗个体出血的药物中的用途构成了本发明的另一方面。另一方面，本发明涉及由脂化的TF与选自FXa、NCIS或二者的组合的化合物形成的复合物。该复合物作为药物的用途或在制备用于治疗个体出血的药物中的用途构成本发明的另一方面。另一方面，本发明涉及包含脂化的TF和药物可接受的载体的药物组合物。在特定的实施方案中，该药物组合物还包含FXa和/或NCIS。另一方面，本发明涉及包含所述药物组合物及载体的产品。在特定的实施方案中，所述药物组合物还包含FXa和/或NCIS。另一方面，本发明涉及非脂化的TF或其功能片段在制备用于治疗缺乏FVII的个体出血的药物中的用途。在特定实施方案中，所述药物被配制为适于肠胃外给予非脂化的TF的药物给药形式。附图的简单说明图l是显示FXa基础浓度与纤维蛋白凝块形成的示意图。图2是显示典型的内源凝血途径及外源凝血途径的示意图。图3是显示本发明的脂化的TF作为FXa的刺激剂的新调节作用的示意图。本发明的详细说明本文所描述的发现首次显示，脂化的TF在其配体-FVII/VIIa不存在时，其用作FXa的刺激剂，使得此酶启动凝血酶原水解，进而使凝血发生。这项新的机制在FXa浓度水平非常低时(低于生理浓度150pM)特别重要。公知有一些血小板疾病会造成血小板聚集异常及具有更高的出血倾向。因此外源性给予脂化的TF不仅用于先天性凝血病，而且还在先天性及后天性血小板疾病中进行止血，如格兰茨曼病、贝-苏综合征及血d、板减少症。因此，发生凝血的速度并非如目前为止所认为的取决于TF::FVIIa复合物的形成及随后的FX活化，而是取决于TF与生理基础浓度(〈150pM)的FXa的相互作用。形成此相互作用的最重要的生物结果是快速地引起凝血开始，并且这仅需要血液中存在生理浓度的FXa及FXa与其刺激剂TF的相互作用。不论是因为TF::FVIIa复合物或因为凝血酶本身，此过程因为复合物初期所形成的凝血酶及大量产生的FXa而^皮立刻才广大。因此发明人的发现明确地显示，当不存在FVIIa，但是存在不能独自启动凝血的生理浓度(〈150pM)的FXa时，脂化的TF因为其作为FXa的刺激剂的新作用而快速地启动凝血酶形成，促使凝血酶原开始水解。另一方面，发明人的发现显示，当同时给予脂化的TF及低浓度的FXa(对于独自发挥抗出血作用是无效的)时，脂化的TF及低浓度的FXa能够快速地引起纤维蛋白凝块开始形成。使用TF::FXa组合所观察到的作用，尤其是使用FXa浓度〈150pM时所观察到的作用，远优于单独给予脂化的TF时所观察到的作用。FXa及脂化的TF与NCIS的组合更可以增强止血作用。所得到的结果支持了这一观点，即血浆中存在不能独自产生初步的促凝反应的基础浓度的FXa时(<150pM)，当TF用作FXa的刺激剂4吏该反应发生。因此，脂化的TF可单独地或与FXa和/或NCIS联合用作新的局部止血剂，以用于治疗健康个体或具有出血素质的患者中存在的出血。非脂化的TF或其功能片段同样可以用作新的止血剂，以用于治疗，优选通过肠胃外给药来治疗FVII缺乏的患者中存在的出血。I.脂化的TF在局部治疗出血中的用途发明人意外地发现脂化的TF增加FXa的蛋白水解活性，进而促进凝血酶产生[见本说明书中所包括的实施例结果的第1节]。发明人还观察到脂化的TF在体外[见本说明书中所包括的实施例结果的第1至5节]和体内[见本说明书中所包括的实施例结果的第6至7节]，使健康个体及凝血因子缺乏患者和抗凝血患者(使用药物进行抗凝处理，该药物诸如肝素、低分子量肝素或香豆素衍生物，这些都是非限制性实例)的血浆和血液凝固，所述凝血因子缺乏患者包括FV、FVII、FVin、FIX、FX、FXI、FXII及FXIII缺乏患者。发明人还发现脂化的TF使患有血小板疾病的患者的血液凝固[见本说明书中所包括的实施例结果的第5节]。这些结果清楚显示，脂化的TF是用于局部治疗个体出血的4元出血剂。以现有技术而言，无法显而易见地想到将TF作为健康个体或血友病患者(FVin、FIX和FXI缺乏)的促凝血的局部单一治疗。在如下患者中均是绝对不可能想到的FVII缺乏患者，因为不能形成TF-FVII复合物；FV或FX缺乏患者，因为不能使凝血酶原酶复合物集合；肝素处理的患者，因为凝血酶和FXa均;陂抗凝血酶III阻断；及华法林处理的患者，因为所有的维生素K依赖性凝血因子(FVII、FIX及FX)的合成均被完全破坏。因此，一方面，本发明旨在脂化的TF或其功能性脂化片段在制备用于局部治疗个体出血的药物中的用途。TF是广泛存在于动物界的完整的膜糖蛋白。TF蛋白具有结构域结构，也就是说其是具有独立的功能区的蛋白。人TF脱辅基蛋白的每一结构域具有独特的结构及功能特征(l)具有32个氨基酸前导序列的信号肽或区域，当该蛋白从未成熟形式被加工为成熟形式时，该信号肽或区域被翻译后加工；(2)包含约219个末端氨基酸的N-糖基化的亲水性胞外结构域；(3)约23个氨基酸的片段，主要为疏水性，这些氨基酸被认为是跨膜结构域氨基酸；及(4)21个氨基酸的羧基端，其被认为是蛋白胞质片段的氨基酸形成部分。这种人TF蛋白质的结构域结构允许产生，例如，蛋白或其功能片段的胞外结构域。人TF蛋白的氨基酸序列是已知的，并可在诸如NCBI的蛋白质数据库中查到(hTF，访问号码(Accessnumber):P13726)。本文所使用的术语"脂化的TF"指任何来源的完全或部分嵌入脂质嚢泡或细胞膜中的TF。示例性地，"脂化的TF"来源的非限制性实例是含脂化的TF的提取物(其可从多种组织中分离出，例如脑、胎盘组织和肺组织、来自不同动物的组织，例如绵羊、母牛、兔、犬、人等)；纯化的及(再)脂化的TF蛋白质组分(从提取物或从重组TF中纯化)，也就是在其纯化后将脂质组分加入，并可通过示例性地非限制性实例，如根据Morrisey先前所述的方案进行制备[见本说明书中所包括的实施例]。在该方案中，使用非离子清洁剂将非脂化的TF并入磷脂嚢泡内，该非离子清洁剂例如N-辛基-Z3-D-葡萄吡喃糖苷。根据本发明，可在脂化的TF中使用的脂质可能具有任何来源(动物、植物或合成性)。几乎所有的脂质均可被用来制备本发明的脂化的TF。可在脂化的TF的制备中使用的脂质的示例性、非限制性实例包括磷脂(诸如磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺等)、鞘脂(诸如神经酰胺、鞘胺醇-l-磷酸、肌醇磷酸神经酰胺、甘露糖基-肌醇磷酸神经酰胺、甘露糖基-二肌醇磷酸神经酰胺等)、磷脂酰肌醇(诸如L-a-磷脂酰肌醇、L-a-溶血磷脂酰肌醇等)或磷脂酰肌醇磷酸(诸如L-a-[磷脂酰肌醇-4-磷酸]、1，2-二辛醇-sn-甘油基-3-[磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸]等)。TF蛋白质组分:脂质的比(摩尔比、重量比或体积比)可能在广泛的范围内变化，例如约1:50,000至约1:3,000。本文所使用的术语TF包括多种野生型TF变异体及突变体，它们保留了野生型TF功能中的至少一种功能，有利的是保留至少一种涉及凝血的野生型TF功能。在特定实施方案中，用于实现本发明的脂化的TF是脂化的人TF，并由得自组织提取物的TF组成；或TF存在于组织提取物的纯化的蛋白质组分中并嵌入到脂质组分中(蛋白质:月旨质的摩尔比为约1:8700);或者TF由通过仅作为示例并非限制性实例的美国专利第6,261,803号所述的方法得到的重组TF(rTF)组成。提取物的取得及TF的纯化可在不同组织中，例如脑、胎盘组织和肺组织，以及不同动物中，例如绵羊、母牛、兔、犬、人中进行。本说明书中所使用的术语"脂化的TF的功能片段"包括但不限于TF的肽衍生物，特别是TF的蛋白质组分，包括野生型TF的蛋白质组分的突变体及变异体，其保留一或多种TF功能，优选地保留涉及凝血的功能，例如结合FXa和/或NCIS的能力以及在伤口愈合期间产生其抗出血功能及血管形成功能的能力。所述TF的功能片段的氨基酸序列可以与野生型TF的蛋白质组分片段的氨基酸序列完全相同，或可以插入、删除或修饰一个或多个氨基酸，前提是保留野生型TF功能中的至少一种功能，有利的是保留至少一种涉及凝血的功能。为了简单起见，本文所使用的术语"脂化的TF"包括脂化的TF的任何功能片段。实施本发明所^f吏用的TF的蛋白质组分还可是融合蛋白的一部分。就这方面而言，所述融合蛋白可含有与由TF的其它片段组成的区域B结合的、由TF蛋白或所述TF蛋白的功能片段组成的区域A。所述区域B结合所述TF蛋白或所述TF蛋白片段的氨基端区域，或可选地，所述区域B可能结合所述TF蛋白或所述TF蛋白片段的羧基端区域。区域A及区域B均可直接结合，或通过所述区域A与所述区域B之间的连接物多肽进行结合。所述融合蛋白可通过化学合成，或利用编码所述融合蛋白的核苦酸序列在适当的宿主细胞中进行基因表达来获3曰付。本文所使用的术语"局部治疗"是指在所需要的部位直接应用治疗，例如在皮肤的不连续部分(割伤等)和血管组织(血管破裂等)应用治疗。用作FXa的刺激剂以提高其蛋白水解活性，并因此产生凝血酶原，所以其可以被用来治疗或医治出血性疾病，特别是那些与出血素质有关的出血性疾病。术语"出血素质，，是指引起止血障碍的过程，并由此导致出血综合征的发生，该出血综合征有时可能发生长期的大量出血。出血素质可能由先天性或后天性凝血病和/或先天性或后天性血小板疾病引起。术语"凝血病，，是指凝血因子异常。这种异常可能是因为特定的凝血因子缺乏或不足引起的，该凝血因子缺乏或不足的结果是发生出血综合征，或是因为凝血因子异常所致。凝血病通常可以是先天性凝血病或后天性凝血病。先天性凝血病的示例性及非限制性实例可以是选自FV、FVII、FVIII、FIX、FX、FXII、FXIII或其组合的凝血因子的缺乏。后天性凝血病可能有不同来源。示例性实例包括在严重的肝衰竭中凝血因子合成不足及抗凝血剂治疗(诸如肝素、低分子量肝素、华法林、香豆素衍生物、双香豆素等)。另一机制是基于过度消耗凝血因子，使得在出血损伤中无可利用的凝血因子来形成凝块。这种机制发生在如下情况中弥散性血管内凝血综合征，因多重疾病消耗所致的凝血病，该多种疾病诸如损害微循环内皮、活化血小板及凝血因子、形成多重微血栓的严重脓毒病；TF入侵血液中，如胎盘释放；死胎滞留；具有组织碎裂的多重损伤；毒蛇咬伤等等。在血管炎中，血管壁及内皮损伤释放出凝血活化剂。由于为抗血小板剂及抗凝血剂的胞浆素的作用及PDF释放，凝血因子的消耗因许多微血栓的纤维蛋白的溶解而加剧。术语"血小板疾病"是指血小板的数量及功能上的疾病，其结果是发生出血综合征。所述血小板疾病可能是先天性或后天性。在特定实施方案中，所述血小板疾病是先天性血小板疾病。先天性血小板疾病的示例性、非限制性的实例包括格兰茨曼病、贝-苏综合;f正、Bolin画Jamieson，s综合征、维誦奥综合4正(Wiskott-Aldrichsyndrome)、Paris-Trousseau-Jacobsen综合^正、X染色体血小4反减少症、灰色血小板综合征(Grayplateletsyndrome)、Sebastian综合征及范科尼贫血(Fanconianemia)。在另一特定实施方案中，所述血小板疾病是后天性血小板疾病。后天性血小板疾病的示例性、非限制性实例包括骨髓增生性疾病，诸如血小板增多、红细胞增多或慢性粒细胞白血病等；骨髓外化生中的功能性血小板疾病，伴随出血时间延长、玻璃珠滞留缺陷(retentiondefects)、血小板聚集缺陷、异常释放及血小板因子III缺陷。已在坏血病、先天性心脏疾病和肝硬化中的异常蛋白血症发现了功能性血小板缺陷。术语"后天性凝血病，，及"后天性血小板疾病"指疾病的来源，其可能为医源性或继发于其它疾病。本文所使用的术语"个体"包括动物种类的任何成员，包括人类；举例来说(但不限于该例)，所属个体可以是哺乳类，诸如灵长类、家畜、啮齿类等，所述个体优选为以任何年龄和种族的男人或女人。在特定实施方案中，所述个体是无止血障碍史的人，诸如无凝血病或血小板疾病的个体。在另一特定实施方案中，所述个体是有止血障碍史的人，诸如具有出血素质的个体，例如凝血病，如先天性或后天性凝血病，或血小板疾病，诸如先天性或后天性血小板疾病。因此在特定实施方案中，本发明涉及脂化的TF在制备用于局部治疗无止血障碍史的人类出血的药物中的用途。在另一实施方案中，本发明涉及脂化的TF在制备用于局部治疗具有出血素质的人类出血的药物中的用途。为了对个体给药，所述脂化的TF将被配制成为适于其局部给药以局部治疗出血的药物形式。所述药物形式的示例性、非限制性实例包括气溶胶、溶液、悬浮液、乳剂、凝胶、软膏、乳膏、敷料、贴片、油膏、漱口液等。为此，含有脂化的TF的药物制剂将包括为制备所选定的药物给药形式所需的药物可接受的载体及赋形剂(更多信息请见本说明书中关于"药物组合物"一节)。待向个体给药的脂化的TF的剂量可在非常广泛的范围内变化，例如约0.01/ig活性蛋白质/ml至100/ig活性蛋白质/ml。待给药的脂化的TF的剂量将取决于多种因素，其中包括所使用的TF蛋白的特性，例如其活性及生物半衰期，制剂中TF蛋白的浓度，个体或患者的临床状态，待治疗的出血性疾病等(更多信息请见本说明书中关于"药物组合物"一节)。II.组合产品及其应用II.1月旨4匕的TF+FXa公知的是在血液凝固的外源途径中，TF结合循环的FVII/FVIIa以形成TF::FVII复合物，并且在4丐离子存在时用作底物使得FX活化发生。外源途径的活化涉及TF与其配体，FVII/FVIIa的相互作用。此TF::FVIIa复合物用作底物，使得FX通过FVIIa发生活化。现在发明人意外发现，脂化的TF与FXa—起诱导凝血，即使在FVII缺乏个体中也亦然，因此脂化的TF用作FXa的刺激剂，使这个丝氨酸蛋白酶启动凝血酶原水解以产生凝血酶原，并^f吏凝血的起源得以发生。本文所使用的"FXa"是指一种蛋白质，特别是丝氨酸蛋白酶，其活化形式负责启动凝血酶原水解，进而使凝血开始发生。这种蛋白水解是通过FXa结合活化的血小板表面，以及当FVa及4丐离子存在时水解凝血酶原来进行。更具体的说，发明人意外地发现即使FXa浓度如此低以至不能够独自诱导凝血的情况下，脂化的TF与FXa的组合也使血浆凝固[例如见本说明书中所包括的实施例结果的第1(1.5)及2节]。因此另一方面，本发明涉及包含(i)脂化的TF及(ii)FXa的产品。根据先前所提到的结果，所述产品可以用作药物，特别是其可以被用于治疗个体出血，例如局部治疗个体出血。所述组分(i)及(ii)可以是一起的或是分开的。在特定实施方案中，用于制备本产品的脂化的TF是脂化的人TF。在特定实施方案中，本发明提供了包含(i)脂化的TF及(ii)FXa的产品。这两种组分在对个体给药前可以^皮组合或一起在同一组合物中。在另一特定实施方案中，本发明提供了分别包含(i)脂化的TF及(ii)FXa的产品。在另一特定实施方案中，本发明提供了分别包含(i)脂化的TF及(ii)FXa的产品，该脂化的TF和FXa作为组合用于对个体同时或相继给药。所述组分(i)及(ii)对个体的联合给药可以同时进行或按任何顺序、间隔一段时间相继进行，也就是先给予脂化的TF再给予FXa，或反之亦然。或者，所述脂化的TF及FXa可同时给药。为了对个体给药，将所述先前定义的产品配制成药物给药形式，优选适合其局部给药的药物给药形式，为此将包含适于制备所需要的药物给药形式的药物可接受的载体及赋形剂。有关所述载体及赋形剂的信息，以及关于适于给予本发明所述产品的给药形式，可参考格林药学论述(galenicpharmacytreatises)。更多信息请见本说明书中关于"药物组合物"一节。对所述个体给药的脂化的TF及FXa的剂量可在广泛的范围内变化。举例来说，脂化的TF的给药剂量可能是约0.01/tg活性蛋白/ml至lOOpg活性蛋白/ml。同样的，FXa的给药剂量可能是约17pM至17nM(0.00lMg活性蛋白/ml至10/ig活性蛋白/ml)。一般来说，脂化的TF及FXa的给药剂量将取决于多种因素，包括所使用的TF蛋白及FXa的特性，例如其活性及生物半衰期，制剂中FXa及TF蛋白的浓度，该个体或患者的临床状态、待治疗的出血性疾病等(更多信息请见本说明书中关于"药物组合物"一节)。所述产品中存在的脂化的TF与FXa的重量比可在广泛的范围内变化；举例来说，该TF:FXa的重量比为106:1至10:1，虽然其它重量比也是可以的；在特定实施方案中，本发明所述产品包含重量比为1比0.001的脂化的TF及FXa，也就是说对于每毫克的TF蛋白，该混合物中存在l微克的FXa蛋白。本发明的其它方面涉及先前所定义的产品作为药物的用途，尤其是所述产品在制备用于治疗个体出血，特别是局部治疗个体出血的药物中的用途。II.2脂化的TF+NCIS发明人也意外地发现，脂化TF与负电荷无机表面(NCIS)的组合在体外[见本说明书中所包括的实施例结果第1(1.4)、2(2.2)、3(3.4)、4(4.2)及5(5.2及5.4)节]和体内[见本说明书中所包括的实施例结果第6.1节]，均使健康个体及凝血因子缺乏患者的血浆及血液凝固。本文所使用的术语"负电荷无机表面，，或"NCIS，，是由脂质及血液凝固促进剂的混合物组成，所述血液凝固促进剂例如鞣花酸、沸石、硅石、无机氧化物等。所述脂质具有净负电荷，这意味着该脂质混合物可包括中性或两性离子脂质，但一定包含一定量的使该混合物具有阴离子特性的负电荷脂质。举例来说，但不限于此例，负电荷脂质可以是鞘脂(诸如神经酰胺-l-磷酸盐、糖基化的磷脂酰乙醇胺、羟基化或非羟基化硫苷脂、神经节苷脂等)或基于甘油的脂质(诸如磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰肌醇磷酸、磷脂酸、磷脂酰甘油、心磷脂)。在本专利申请中，市售的DadeActin⑧产品(DadeBehring，商标)用作NCIS的来源。因此另一方面，本发明涉及包含(i)脂化的TF及(ii)NCIS的产品。根据先前提到的结果，所述产品可用作药物，其可特别用于治疗个体出血，例如局部治疗个体出血。所述组分(i)及(ii)可以是一起的或是分开的。在特定实施方案中，本发明提供包含(i)脂化的TF及(ii)NCIS的产品。这两种组分在对个体给药之前可以被组合或一起在同一组合物中。在另一特定实施方案中，本发明提供了分别包含(i)脂化的TF及(ii)NCIS的产品。在另一特定实施方案中，本发明提供了分别包含(i)脂化的TF及(ii)NCIS的产品，该脂化的TF和NCIS作为组合用于对个体同时给药或相继给药。所述组分(i)及(ii)对个体的联合给药可以同时进行或按任何顺序、间隔一段时间相继进行，也就是说先给予脂化的TF再给予NCIS,或反之亦然。或者，该脂化的TF及NCIS可同时给药。为了对个体给药，将所述先前定义的产品配制成药物给药形式，优选适合其局部给药的药物给药形式，为此将包含适于制备所需要的药物给药形式的药物可接受的载体及赋形剂。有关所述载体及赋形剂的信息，以及关于适于给予本发明所述产品的给药形式，可参考格林药学论述。更多信息请见本说明书中关于"药物组合物"一节。对所述个体给药的脂化的TF及NCIS的剂量可在广泛的范围内变化。举例来说，脂化的TF的给药剂量可能是约O.Ol]Ltg活性蛋白/ml至100/xg活性蛋白/ml。同样的，举例来说，就每Mg脂化的TF活性蛋白而言，NCIS的给药剂量(体积)可能是约0.1/d至100^1。一般来说，脂化的TF及NCIS的给药剂量将取决于多种因素，包括所使用的TF蛋白及NCIS的特性，例如其活性及生物半衰期、制剂中TF蛋白及NCIS的浓度、该个体或患者的临床状态、待治疗的出血性疾病等(更多信息请见本说明书关于"药物组合物"一节)。所述产品中存在脂化的TF与NCIS的重量/体积比(w/v)可在广泛的范围内变化；举例来说，所述脂化的TF:NCIS的w/v比为1:1至1:106，虽然其它w/v比也是可以的；在特定实施方案中，对于每微克的脂化的TF活性蛋白，本发明所述产品包含O.l至100微升的NCIS。本发明的其它方面涉及先前所定义的产品作为药物的用途，尤其是该产品在制备用于治疗个体出血，特别是局部治疗个体出血的药物中的用途。II.3月旨化的TF+FXa+NCIS发明人还意外地发现，脂化的TF、FXa与NCIS的组合在体外使健康个体及凝血因子缺乏患者的血浆及血液凝固[见本说明书中所包括的实施例结果第1(1.6)及2(2.2)节]。因此另一方面，本发明涉及包含(i)脂化的TF、(ii)FXa及(iii)NCIS的产品。根据先前提到的结果，所述产品可用作药物，其可特别用于治疗个体出血，例如局部治疗个体出血。所述组分(i)、(ii)及(iii)可以是一起的或是分开的。或者，两种组分是一起的，例如(i)+(ii)、(i)+(iii)或(ii)+(iii)，第三种组分是单独的。在特定实施方案中，本发明提供包含(i)脂化的TF、(ii)FXa及(iii)NCIS的产品。这些组分在对个体给药前可以^皮组合或一起在同一组合物中。在另一特定实施方案中，本发明提供分别包含(i)脂化的TF、(ii)FXa及(iii)NCIS的产品。在另一特定实施方案中，本发明提供分别包含(i)脂化的TF、(ii)FXa及(iii)NCIS的产品，所述脂化的TF、FXa及NCIS作为组合用于对个体同时给药或相继给药。所述组分(i)、(ii)及(iii)对个体的联合给药可以同时进行或按任何顺序、间隔一段时间相继进行，也就是说先给予脂化的TF、再给予FXa、然后给予NCIS，或先给予脂化的TF、再给予NCIS、然后给予FXa,或先给予FXa、再给予脂化的TF、然后给予NCIS,或先给予FXa、再给予NCIS、然后给予脂化的TF，或先给予NCIS、再给予FXa、然后给予脂化的TF,或先给予NCIS、再给予脂化的TF、然后给予FXa。或者，所述组分中的任意两种组分可以混合在同一组合物中并同时全会药，而第三种组分则在所述双重组分组合物给药前或给药后给予。在另一可选择的实施方案中，该脂化的TF、FXa及NCIS同时给药。为了对个体给药，将所述先前定义的产品配制成药物给药形式，优选适合其局部给药的药物给药形式，为此将包含适于制备所需要的药物给药形式的药物可接受的载体及赋形剂。有关所述载体及赋形剂的信息，以及关于适于给予本发明所述产品的给药形式，可参考格林药学论述。更多信息请见本说明书中关于"药物组合物"一节。对所述个体给药的脂化的TF、FXa及NCIS的剂量可在广泛的范围内变化。举例来说，脂化的TF的给药剂量可能是约O.OljLtg活性蛋白/ml至100/ig活性蛋白/ml。同样的，举例来说，FXa的给药剂量可能是约17pM至17nM(0.00lMg蛋白/ml至10gg蛋白/ml)。另外，举例来说，NCIS的给药剂量(体积)可能是对于每微克脂化的TF活性蛋白而言，给予约O.lpd至IOO;aI。一般来说，月旨化的TF、FXa及NCIS的给药剂量将取决于多种因素，包括所使用的TF蛋白、FXa及NCIS的特性，例如其活性及生物半衰期，制剂中TF蛋白、FXa及NCIS的浓度、该个体或患者的临床状态、待治疗的出血性疾病等(更多信息请见本说明书中关于"药物组合物"一节)。所述产品中存在的脂化的TF、FXa及NCIS的重量比可在广泛的范围内变化，如先前在IU及IL2节中所述；然而在特定实施方案中，本发明所述产品包含l:0.001:100(w:w:v)的脂化的TF:FXa:NCIS。本发明的其它方面涉及先前所定义的产品作为药物的用途，尤其是所述产品在制备用于治疗个体出血，特别是局部治疗个体出血的药物中的用途。III.复合物及其应用III.1TF::FXa复合物如先前所述(见本说明书的II.l节)，发明人发现即使FXa浓度如此低以至不能够独自诱导凝血的情况下，脂化的TF与FXa的组合仍使血浆凝固。虽然不旨在与任何理论联系，但不论是联合给予或分开(按任何顺序)给予所述脂化的TF及FXa，均导致复合物的形成，所述复合物能够在应该发挥治疗效果的部位发挥所述治疗效果(抗出血，特别是局部抗出血)。因此，另一方面，本发明涉及本说明书中称为TF::FXa的复合物，其包含脂化的TF及FXa。虽然为了简单起见将该复合物表示为TF::FXa，但是该复合物事实上可以由多个单位的每一所述组分形成；所有这些可能性均包含在本发明的范围内。根据先前提到的结果，该复合物可以用作药物，其可特别用于治疗个体出血，例如局部治疗个体出血。在特定实施方案中，用于制备此复合物的脂化的TF是脂化的人TF。为了对个体给药，将该先前定义的产品配制成药物给药形式，优选适合其局部给药的药物给药形式，为此将包含适于制备所需要的药物给药形式的药物可接受的载体及赋形剂。有关所述载体及赋形剂的信息，以及关于适于给予本发明所述产品的给药形式，可参考格林药学论述。更多信息请见本说明书中关于"药物组合物"一节。对所述个体给药的所述复合物中存在的脂化的TF及FXa的剂量可在广泛的范围内变化。一般来说，所述剂量对应于在涉及包含脂化的TF及FXa的产品的II.l节中先前提到的剂量。该TF::FXa复合物中存在的脂化的TF与FXa的重量比可在广泛的范围内变化；不过通常对应于在涉及包含脂化的TF及FXa的产品的II.l节中先前提到的重量比。本发明的其它方面涉及先前所定义的所述复合物作为药物的用途，尤其是该复合物在制备用于治疗个体出血，特别是局部治疗个体出血的药物中的用途。III.2TF::NCIS复合物如前所述(见本说明书的II.2节)，发明人发现脂化的TF与NCIS的组合可在体外及体内使健康个体及凝血因子缺乏患者的血浆及血液凝固。虽然不旨在与任何理论联系，但不论是联合给予或分开(按任何顺序)给予该脂化的TF及NCIS,均导致复合物的形成，该复合物能够在应该发挥治疗效果的部位发挥所述治疗效果(抗出血，特别是局部抗出血)。因此，另一方面，本发明涉及本说明书中称为TF::NCIS的复合物，200680036920.2说明书第25/57页其包含脂化的TF及NCIS。虽然为了简单起见将该复合物表示为TF::NCIS,但是该复合物事实上可以由多个单位的每一所述组分形成；所有这些可能性均包含在本发明的范围内。根据先前提到的结果，该复合物可以用作药物，其可特别用于治疗个体出血，例如局部治疗个体出血。在特定实施方案中，用于制备此复合物的脂化的TF是脂化的人TF。为了对个体给药，将该先前定义的产品配制成药物给药形式，优选适合其局部给药的药物给药形式，为此将包含适于制备所需要的药物给药形式的药物可接受的载体及赋形剂。有关所述载体及赋形剂的信息，以及关于适于给予本发明所述产品的给药形式，可参考格林药学论述。更多信息请见本说明书中关于"药物组合物"一节。对所述个体给药的该复合物中存在的脂化的TF及NCIS的剂量可在广泛的范围内变化。一般来说，该剂量对应于在涉及包含脂化的TF与NCIS的组合的产品的IL2节中先前提到的剂量。该TF::NCIS复合物中存在的脂化的TF与NCIS的w/v比可在广泛的范围内变化；不过通常对应于在涉及包含脂化的TF及NCIS的产品的II.2节中先前提到的w/v比。本发明的其它方面涉及先前所定义的该复合物作为药物的用途，尤其是该复合物在制备用于治疗个体出血，特别是局部治疗个体出血的药物中的用途。III.3脂化的TF::FXa::NCIS复合物如前所述(见本说明书中的II.3节)，发明人发现脂化的TF、FXa与NCIS的组合使血浆凝固。虽然不与任何理论联系，但不论是联合给予或分开(按任何顺序)给予该脂化的TF、FXa与NCIS，均导致复合物形成，该复合物能够在应该发挥治疗效果的部位发挥所述治疗效果(抗出血，特别是局部抗出血)。因此，另一方面，本发明涉及本说明书中称为TF::FXa::NCIS的复合物，其包含脂化的TF、FXa及NCIS。虽然为了筒单起见，将该复合物表示为TF::FXa::NCIS，但是该复合物事实上可以由多个单位的每一所述组分形成，以及由所述组分之间的任何可能的相互作用形成，例如TF::NCIS::FXa、FXa::NCIS::TF、FXa::TF::NCIS、NCIS::TF::FXa或NCIS::FXa::TF;所有这些可能性均包含在本发明的范围内。根据先前提到的结果，该复合物可以用作药物，其可特别用于治疗个体出血，例如局部治疗个体出血。在特定实施方案中，用于制备此复合物的脂化的TF是脂化的人TF。为了对个体给药，将该先前定义的产品配制成药物给药形式，优选适合其局部给药的药物给药形式，为此将包含适于制备所需要的药物给药形式的药物可接受的载体及赋形剂。有关所述载体及赋形剂的信息，以及关于适于给予本发明所述产品的给药形式，可参考格林药学论述。更多信息请见本说明书中关于"药物组合物"一节。对所述个体给药的该复合物中存在的脂化的TF、FXa及NCIS的剂量可在广泛的范围内变化。一般来说，该剂量对应于在涉及包含脂化的TF、FXa及NCIS的组合的产品的II.3节中先前提到的剂量。该TF::FXa::NCIS复合物中存在的脂化的TF、FXa与NCIS的比例可在广泛的范围内变化；不过通常对应于在涉及包含脂化的TF、FXa及NCIS的产品的II.3节中先前提到的比例。本发明的其它方面涉及先前所定义的该复合物作为药物的用途，尤其是该复合物在制备用于治疗个体出血，特别是局部治疗个体出血的药物中的用途。IV.药物组合物如前所述，脂化的TF可用作止血剂，特别是用作用于局部应用的止血剂。因此，在另一方面，本发明涉及药物组合物，下文称为本发明的药物组合物，其包含脂化的TF及药物可接受的载体。在特定实施方案中，该脂化的TF是脂化的人TF。为了对个体给药，将该先前定义的产品配制成药物给药形式，优选适合其局部给药的药物给药形式，为此将包含适于制备所需要的药物给药形式的药物可接受的载体及赋形剂。有关所述载体及赋形剂的信息，以及关于适于给予本发明所述产品的给药形式，可参考格林药学论述。一般药物的不同药物给药形式及其制备方法的论述，可参见"TratadodeFarmaciaGal6nica"("GWem'c尸^r则cy7Vea"W)—书,C.FauliiTrillo编著，第1版，1993,Luzdn5,S.A.ofEdicione。虽然可以使用脂化的TF的不同药物给药形式，但局部给予所述化合物在实践中是最有利的，因此将该脂化的TF被配制成适于其局部给药的药物形式。该药物形式的示例性、非限制性实例包括气溶胶、溶液、悬浮液、乳剂、凝胶、软膏、乳膏、敷料、贴片、油膏、漱口液等。为此，含有脂化的TF的药物制剂将包括为制备用于局部给予脂化的TF的药物给药形式所需要的、药物可接受的载体及赋形剂。因此，在特定实施方案中，本发明的药物组合物是用于局部给予脂化的TF的药物组合物，其包含脂化的TF及适于局部给予该脂化的TF的药物可接受的载体。本发明的药物组合物中存在治疗有效量的脂化的TF。该量可在广泛的范围变化，例如，约0.01jUg活性蛋白/ml至100/ig活性蛋白/ml。在另一特定实施方案中，本发明的药物组合物a)包含含有(i)脂化的TF及(ii)FXa的产品与药物可接受的载体；或b)分别包含(i)脂化的TF与药物可接受的载体，及(ii)FXa与药物可接受的载体；或c)包含含有(i)脂化的TF及(ii)NCIS的产品与药物可接受的载体；或d)分别包含(i)脂化的TF与药物可接受的载体，及(ii)NCIS与药物可接受的载体；或e)包含含有(i)脂化的TF、(ii)FXa及(iii)NCIS的产品与药物可接受的载体；或f)分别包含(i)脂化的TF与药物可接受的载体、(ii)FXa与药物可接受的载体，及(iii)NCIS与药物可接受的载体；或g)包含TF::FXa复合物及药物可接受的载体；或h)包含TF::NCIS复合物及药物可接受的载体；或i)包含TF::FXa::NCIS复合物及药物可接受的载体。由此可见，先前定义的本发明的药物组合物包含脂化的TF作为活性成分，该脂化的TF单独存在或与FXa和/或NCIS组合，或与FXa和/或NCIS形成复合物。在特定实施方案中，先前定义的本发明的药物组合物中存在的脂化的TF是脂化的人TF。同样的，在特定实施方案中，将先前定义的本发明的药物组合物配制成用于局部给予所述活性成分(单独的脂化的TF或与FXa和/或NCIS组合的脂化的TF，或与FXa和/或NCIS形成复合物的脂化的TF)的药物形式。该药物形式的示例性、非限制性实例包括气溶胶、溶液、悬浮液、乳剂、凝胶、软膏、乳膏、敷料、贴片、油膏、漱口液等。为此，含有前述活性成分的药物制剂包括为制备局部给予所述活性成分的药物给药形式而需要的、药物可接受的载体及赋形剂。本发明的药物组合物中存在治疗有效量的活性成分。对所述个体给药的活性成分的剂量将取决于所述个体所患疾病的严重性、选择的药物给药形式等因素。由于此原因，本发明中提到的剂量应只作为对本领域所属技术人员的指导，本领域所属技术人员应根据先前提到的变量调整剂量。然而，本发明的药物组合物可以一天给药一次或多次，以用于预防或治疗性目的。本发明的药物组合物可以与其它用于预防和/或治疗出血素质的另外的药物(例如凝血因子、人血浆等)一起使用，以提供联合疗法。该另外的药物可以是同一药物组合物的一部分，或者以单独组合物的形式提供，以便与本发明的药物组合物同时给药或相继(间隔一段时间)给药。V.支持药物组合物(supportedpharmaceuticalcomposition)本发明的药物组合物可以被放置在支持体上。因此，另一方面，本发明涉及包含本发明的药物组合物及支持体的产品。本文所使用的术语"支持体"是指合适材料的基质，其允许本发明的药物组合物沉积其上，将组合物运载至所需要的部位并在此部位释放，所述部位例如本发明的药物组合物发挥其治疗作用的部位。所述支持体可以是固体支持体或非固体支持体，例如液体支持体或气体支持体。固体支持体的示例性、非限制性实例包括敷料、急救绷带、敷布、胶布等。液体支持体的示例性、非限制性实例包括凝胶、喷雾、漱口液等。气体支持体的示例性、非限制性实例包括空气、推进剂等。在特定实施方案中，沉积于所述支持体上的本发明的药物组合物包括(a)(i)支持体、(ii)包含脂化的TF和FXa的产品及药物可接受的载体、(iii)包含脂化的TF和NCIS的产品及药物可接受的载体、以及(iv)包含脂化的TF、FXa和NCIS的产品及药物可接受的载体；或(b)TF::FXa复合物及药物可接受的载体，或(c)TF::NCIS复合物及药物可接受的载体，或(d)TF::FXa::NCIS复合物及药物可接受的载体。在特定实施方案中，本发明的药物组合物中存在的脂化的TF是脂化的人TF。包含沉积在支持体上的本发明药物组合物的产品，可通过常规方法获得，例如通过将本发明的药物组合物与支持体混合得到。本发明用，这取决于本发明的药物组合物成分的性质及所使用的支持体。VI.非脂化的TF在治疗出血中的用途由发明人实施的测定中得到的结果清楚地显示TF:-增加FXa的蛋白水解活性，进而产生凝血酶，-使健康个体及凝血因子缺乏患者的血浆及血液凝固，包括缺乏FVII的血液-使患有血小板疾病的患者的血液凝固，及-在不同动物模型中体内停止严重的致命性出血。因此，整体看来这些结果明确显示，脂化的TF是用于治疗健康个体及凝血因子缺乏患者的出血的抗出血剂，该凝血因子缺乏患者包括Fvni、fix、fxi、fxiii、fvii、f及fx缺乏患者。欧洲专利EP266993公开了非脂化的TF在治疗出血中的用途，特别是用于治疗因凝血因子缺乏所致的出血，特别是选自FVIII、FIX、FXI或FXIII的凝血因子。然而，该专利并未公开及建议使用非脂化的TF来治疗FVII缺乏所导致的出血的可能性。发明人目前的发现是涉及TF作为FXa蛋白水解活性刺激剂的作用，无论所述个体是否缺乏FVII，该作用允许非脂化的TF或其功能性非脂化片段可以用于治疗FVII缺乏个体的出血。因此，本发明的另一方面涉及非脂化的TF或其功能性非脂化片段在制备用于治疗FVII缺乏个体的出血的药物中的用途。本文所使用的术语"非脂化的TF"是指纯化的TF(无细胞质脂膜)。本文所使用的术语TF包括野生型TF的变异体及突变体，该变异体和突变体保留了野生型TF功能中的至少一种功能，有利的是保留至少一种涉及凝血的野生型TF功能。可从许多组织中，例如脑、胎盘组织及肺组织，以及从不同动物的组织中，例如绵羊、母牛、兔、犬、人等中实施TF的分离及纯化。TF也可以是重组TF(rTF),其通过仅作为示例并非限制性实例的美国专利第6,261,803号所述的方法得到。在特定实施方案中，为实现本发明所使用的非脂化的TF是非脂化的人TF，并由完全去除细胞质脂膜的从人组织中分离并纯化的TF的蛋白质组分组成。本说明书中所使用的术语"非脂化的TF的功能片段"，包括但不限于TF的肽衍生物，特别是TF的蛋白质组分，包括野生型TF的蛋白质组分的突变体及变异体，其保留一种或多种TF功能，优选涉及凝血的功能，例如结合FXa和/或NCIS的能力，以及在伤口愈合期间产生其抗出血功能及血管形成功能的能力。所述TF的功能片段的氨基酸序列可以与野生型TF的蛋白质组分片段的氨基酸序列完全相同，或可以插入、删除或修饰一个或多个氨基酸，前提是保留野生型TF功能中的至少一种功能，有利的是保留至少一种涉及凝血的功能。为了简单起见，本文所使用的术语"非脂化的TF"包含非脂化的TF的任何功能片段。非脂化的TF可通过常规方法得到。举例来说，通过用有机溶剂提取，从脂质组分中分离出TF的蛋白质组分。该有机溶剂的示例性实例包括吡啶、乙醇、庚烷-丁醇混合物等。TF的蛋白质组分可通过常规化学方法纯化。该化学方法的实例包括用清洁剂处理，该清洁剂例如脱氧胆酸盐、TritonX-100等，在十二烷基硫酸钠存在下在聚丙烯酰胺凝胶上实施凝胶过滤及制备电泳，使用与琼脂糖凝胶柱结合的刀豆素A(concavalinA)、使用利用抗TF蛋白质组分(蛋白质)的抗体的亲和柱等。为了对FVII缺乏个体给药，将非脂化的TF配制成适于将其通过任何适当途径进行给药的药物形式。虽然实际上可以使用任何药物形式，但用于肠胃外给予该非脂化的TF的药物形式的应用是有利的。因此，在特定实施方案中，本发明涉及非脂化的TF或其非脂化片段在制备用于肠胃外给予该非脂化的TF或其非脂化片段的药物中的用途。在这种情况下，该含有非脂化的TF及药物可接受的赋形剂或载体的药物组合物，将被调配成如下形式以用于其肠胃外给药例如适当剂型的无菌溶液、悬浮液或冷冻干燥产品；在这种情况下，该药物组合物将包括适当的赋形剂，诸如緩冲剂、表面活性剂等。在任何情况下，根据所选定的药物给药形式来选择赋形剂。有关所述载体及赋形剂的信息，以及关于适于给予本发明所述产品的给药形式，可参考格林药学论述。一般药物的不同药物给药形式及其制备方法的综述，可参见"TratadodeFarmaciaGal6nica"("Ga/em'c尸Aar附acy7"mz"W)—书，C.FauliiTrillo编著，第1版，1993,Luzdn5,S.A.ofEdiciones。对FVII缺乏个体给药的非脂化的TF的剂量可在广泛的范围内变化，例如约O.Ol]tig活性蛋白/ml至100/ig活性蛋白/ml。非脂化的TF的给药剂量将取决于如下因素，包括所使用的TF蛋白的特性，例如其活性及生物半衰期、制剂中TF蛋白的浓度、该患者的临床状态、待治疗的出血性疾病等。实施例为了评估脂化的TF作为FXa的刺激剂的能力，实施一系列的体外及体内测定，具体是1.证实脂化的TF(单独的和组合的)用作FXa的直接刺激剂，在FVII不存在时(由不存在、不足或免疫阻断引起)，引起纤维蛋白凝块形成及血液凝固的体外测定。1.1脂化的TF增加FXa的蛋白水解活性，进而在FVII不存在时促使凝血酶产生(溶液及洗涤血小板悬浮液中的显色测定)。1.2脂化的TF能够使来自FVII缺乏患者的血浆及血液凝固(血浆及无抗凝全血中的凝固分析)。1.3脂化的TF能够在抗FVII的单克隆抗体存在下使健康个体的血浆凝固(凝固分析)。1.4脂化的TF与NCIS的组合协同增强缺乏FVII血浆的凝血(凝固分析)。1.5脂化的TF与FXa的组合在抗FVII的单克隆抗体存在时协同增强凝血(缺乏FX血浆的凝固分析)。1.6脂化的TF、FXa与NCIS的组合在抗FVII的抗体存在时协同增强凝血(缺乏FX血浆的凝固分析)。2.证实脂化的TF与低浓度FXa(不能够引起任何促凝作用)的组合引起缺乏FX血浆凝固的体外测定。2.1当FXa以低浓度存在时，脂化的TF用作此丝氨酸蛋白酶的刺激剂。2.2脂化的TF与FXa及NCIS的组合在FXa的刺激下协同作用。3.证实脂化的TF(单独的或组合的)在除FVII以外缺乏其它凝血因子的患者中引起凝血的体外测定。3.1脂化的TF使来自凝血因子FV、FVIII、FVIII、FIX、FX、FXI、FXII及FXIII缺乏的患者的血浆及血液凝固(缺乏凝血因子血浆中及缺乏FVin及FIX的未凝全血中的凝固分析)。3.2脂化的TF使先前被肝素化的全血及血浆凝固。3.3脂化的TF使来自华法林处理的动物的血浆凝固。3.4脂化的TF与NCIS的组合在来自凝血因子FV、FVIII、FVIII、FIX、FX、FXI、FXII及FXIII缺乏患者的血浆(缺乏凝血因子血浆的凝固分析)中及在来自血友病患者的全血中协同增强血液凝固。4.证实脂化的TF(单独的或组合的)引起健康个体血液凝固的体外测定。4.1脂化的TF使来自健康个体的血浆及血液凝固。4.2脂化的TF与NCIS的组合协同增强来自健康个体的血浆及血液的凝血。当脂化的TF结合磷脂时不存在协同作用。5.证实脂化的TF(单独的或组合的)在来自患有先天性及后天性(血小板减少性)血小板疾病的患者的血浆中具有凝血效果的体外测定。5.1脂化的TF使来自患有先天性血小板疾病的患者的血浆凝固。5.2脂化的TF与NCIS的组合增强了来自先天性血小板疾病患者的全血的凝固。5.3脂化的TF使血小板减少的样品凝固。6.在对照大鼠中证实TF是用于局部抗出血治疗的试剂的体内测定(通过直接单独应用于或与NCIS的组合一起应用于预先截断的血管)。6.1脂化的TF(单独的或与NCIS组合的)在大鼠近侧断尾所致的严重出血动物模型中用作局部止血剂。6.2脂化的TF在用肝素或华法林预先处理的严重出血动物模型中用作局部止血剂。6.3脂化的TF在大鼠近侧断尾所致的致死性出血动物模型中用作局部止血剂。I.材料及方法材料人重组组织因子(rTF)，ThromborelS和NeoplastinPlus用作脂化的TF的来源。具体地使用下列商品化制剂人重组组织因子(非脂化的)(AmericanDiagnostica,USA),根据Morrissey所述的方法再脂化；含4丐的冷冻干燥的人胎盘促凝血酶原激酶(ThromborelS,DadeBehringInc);含4丐的；令冻干燥的兔月卤(NeoplastinPlus,DiagnosticaStago-Roche)。4吏用人重组脂化的TF(AmericanDiagnosticsUSA)作为标准物质，由标准曲线确定TF蛋白的促凝活性，该TF蛋白的促凝活性在文中以/ig活性蛋白/ml表示以及在表中以pg/ml表示。为了简单起见，在此实施例中，除非另外说明，术语rTF或TF是指脂化的TF。使用HaematologicTechnologies(血液学技术)的商用化合物作为FXa、因子II及FVa的来源。使用商品化的DadeActinFS试剂(DadeBehring),作为NCIS。商用的缺乏凝血因子血浆(FV、FVII、FVIII、FIX、FX、FXI、FXII及FXIII)是购自DadeBehringMarburgGmbH。方法在脂质嚢泡中利用辛基葡萄糖苷透析使TF再脂化的方法(Morrisey法)使用非离子清洁剂N-辛基-Z3-D-吡喃葡萄糖苷(辛基葡萄糖苷)，将非脂化的TF并入脂质嚢泡中。将TF及脂质均溶于辛基葡萄糖苷中以形成胶束。由于辛基葡萄糖苷的高临界胶束浓度(CMC-20-50mM)，可通过透析将其容易地从溶液中除去。当除去辛基葡萄糖苷时，所述脂质组织成单层嚢泡。TF凭借其跨膜结构域被浸入在这些嚢泡中。一般来i兌，50%至80%的TF分子由嚢泡向外排列。緩冲液及储备溶液来自Calbiochem的辛基葡萄糖苷(n-辛基-(8-D-吡喃葡萄糖苷)。<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>制备辛基葡萄糖苷的脂质溶液(OG)1.使用所需要的脂质摩尔半径(molarradius)，在玻璃管中为每一样品制备2.6微摩尔的总脂质。2.在氩气或氮气流下干燥该脂质混合物。3.当玻璃管呈现干燥时，再真空干燥60分钟。4.向含有干燥脂质的玻璃管中加入400/xl的OG/HBS的新鲜溶液(在室温下)。<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>再脂化向含有400/^1的OG/脂质及足够HBSA的玻璃管中加入所需要量的TF，直至最终体积为lml。在室温下实施此步骤。获得洗涤血小板悬浮液根据RadomskiM.等人所述的方法(RadomskiM,MoncadaS.;1983ThrombRes.此为用前歹'J环素洗涤人血小板的改良方法15;30(4):383-9)，由健康志愿者的血液提取物(3.15%柠檬酸钠)制备洗涤血小板悬浮液。血液提取后总是即刻在室温下对样品实施处理。利用聚集试验，在实施试验前和实施试验过程中测定血小板的活化及功能状态。通过用已知的激动剂(胶原)进行活化，估计自我活化及功能性。琳賴定显色测定在溶液及活化的血小板悬浮液中设计不同的显色测定，以i正实rTF对FXa蛋白水解活性的作用。使用S-2765(Chromogenix)作为FXa的显色底物，通过显色测定确定FXa的酰胺水解活性，而使用S-2238(Chromogenix)作为凝血酶的显色底物，分析凝血酶形成活性。显色测定是在悬浮液(緩冲液)中实施并使用洗涤血d、板悬浮液。将适当体积的待研究的每一因子分配在ELISA板上，如果使用洗涤血小板悬浮液，则所加入的适当体积使培养基中浓度为250,000血小板/]nl。最后加入特异的显色底物，在405nm通过分光光度读数，将所研究的蛋白水解活性定量化。在确定酰胺水解活性的测定中，只需分配FXa及不同的rTF浓缩物，而在确定凝血酶形成活性的测定中，还需要加入因子II(凝血酶原)及FVa(后者只用于在悬浮液中的测定，因为在洗涤血小板测定中这些测定已包含内源性FVa)。血浆凝固分析法在凝血计(FibrintimerBFT-IIclot陽timerDade隱Behring，德国)中，利用特定步骤，通过凝固分析法测量血浆中自发性促凝血活性(未经刺激)。简而言之，向已预热的比色杯中加入50ai1血小板不足的血浆及50/xl蒸馏水。在37。C下静置混合物以孵育此混合物60秒，并立刻加入50/xl的25mM氯化4丐，在凝血计中以秒确定凝血时间(通过)见察凝块形成)。每一样品均测定两次。血小板不足的血浆是通过离心过程获得，血小板数由Coulter测定。全血凝固分析法通过凝固法确定无抗凝全血的促凝活性。将待研究的不同试剂加入到lml的无抗凝全血中，用记时计测量从开始抽血到出现稳固的血块的凝血时间。通过不同试剂缩短或延长凝血时间来评估它们的效果。大鼠近侧断尾的严重出血模型将23只体重为350至450克的Sprage-Dawley雄性大鼠随机分为3个治疗组对照组，由14只4妄受生理盐水溶液局部治疗的动物组成，而另外两组分别由5只接受1.2jtig/mlrTF局部治疗的动物，及4只接受1.2/xg/mlrTF+NCIS(体积:体积4:2)局部治疗的动物组成。利用塑料Eppendorf吸量管，使所有的化合物局部接触动物尾的近侧截面，以发挥止血作用。通过确认不再出血来表明形成稳固的凝块。用抗凝药物处理的动物中大鼠近侧断尾的严重出血模型将27只体重为350至450克的Sprage-Dawley雄性大鼠随机分为5个治疗组对照组，由14只接受生理盐水溶液局部治疗的动物组成。两组在开始截尾操作前15分钟静脉注射接受200U/kg肝素(3只用TF治疗，5只用盐水治疗)，另外两组在开始截尾操作前三天每天口服接受0.1mg/kg的华法林(3只用TF治疗，2只用盐水治疗)。每一治疗组中^f叉一组;波给予1.2ptg/mlrTF的局部治疗。因此对于每一抗凝处理，这是对照治疗组。利用塑料Eppendorf吸量管，使脂化的TF局部接触动物尾的近侧截面以发挥止血作用。通过确认不再出血来表明形成稳固的凝块。大鼠颈动脉穿剌的致死出血模型将4只体重为350至450克的Sprage-Dawley雄性大鼠随机分为2个治疗组，每组包括2只大鼠。对照组动物接受生理食盐水溶液作为治疗，而另一组接受局部给药的脂化的TF(最终剂量为2/ig活性蛋白)。根据标准程序进行大鼠颈动脉穿刺，以建立致死出血模型。在穿刺点覆盖分别含有3ml脂化的TF及3ml生理盐水溶液的敷料，来直接给予脂化的TF和生理盐水溶液。同时在2分钟内施加压力并4妄触相应的治疗。II.结果1.i正实脂化的TF(单独的和组合的)用作FXa的直4^刺激剂，在FVII不存在时(由不存在、不足或免疫阻断引起)，引起纤维蛋白凝块形成及血液凝固的体外测定。1.1脂化的TF增加FXa的蛋白水解活性，进而在FVII不存在时促使凝血酶产生为了评估脂化的TF在FVII不存在时作为因子Xa刺激剂的能力，实施多种体外测定(i)溶液中FXa酰胺水解活性的显色测定；及(ii)洗涤血小板悬浮液中凝血酶形成活性的显色测定。FXa酰胺水解活性的显色测定使用FXa-特异性底物S-2765,在溶液中进4亍FXa酰胺水解活性的直接测定，显示脂化的TF能够非常显著地提高FXa的蛋白水解活性。当存在高浓度的(l/ig/ml)的rTF时，观察到由低浓度及高浓度的FXa产生的活性均增加(pO.OOl)。当存在低浓度的脂化的TF时(0.1gg/ml),也观察到类似的显著刺激作用(pO.OOl)。表1显示5次独立实验得到的结果。表1在FVII不存在时脂化的TF增加FXa的蛋白水解活性无rTF_rTF01jitg/mlrTF1/xg/mlFXa30nM_550±512,108士613,316±89FXa5nM0341士32505士63洗涤血小板悬浮液中凝血酶形成活性的显色测定当使用血小板悬浮液作为促凝表面的来源，并利用特异性底物S-2238测量凝血酶形成时，检测的促凝效果较高(表2)。在外源性FXa不存在时，脂化的TF对凝血酶形成产生显著的刺激作用(pO.OOl)。在低浓度和高浓度的外源性FXa存在时也观察到类似的刺激效果(pO.OOl)。表2存在FI但不存在FVa(已存在于血小板中)和FVII时，脂化的TF诱导洗涤血小板中的凝血酶形成<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>1.2脂化的TF能够使来自FVII缺乏患者的血浆及血液凝固(血浆及无抗凝全血中的凝固分析)实施一系列的体外凝固分析以显示脂化的TF在来自FVII缺乏患者的血浆及无抗凝全血中的凝血作用，因此脂化的TF是用于抗出血治疗的有用试剂。在商品化的缺乏FVII血浆及来自FVII缺乏患者的无抗凝全血中的凝固分析使用商品化的缺乏FVII血浆及来自2名患有FVII缺乏症患者的无抗凝全血，通过凝固分析，研究脂化的TF对凝血的作用(表3)。脂化的TF能够以浓度依赖性方式显著促进缺乏FVII血浆的凝固。同样的，来自FVII缺乏患者的无抗凝全血也可在低浓度、中浓度及高浓度的脂化的TF存在时凝固，这表示即使不存在FVII，也能够通过脂化的TF产生正常的凝固。表3显示对缺乏FVII血浆进行的5次独立实验的结果。表3证实脂化的TF在缺乏FVII血浆中的促凝作用<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>脂化的TF对来自健康志愿者的血液的作用在浓度大于0.01/ig/ml时有显著作用，然而在FVII缺乏患者中需要更高的浓度(表4)。虽然在0.1/xg/ml之后检测到显著的促凝效果(p0.001)，但是脂化的TF能够在浓度为0.01/ig/ml时使凝血时间正常化，在基础状态的正常个体中与在具有所述浓度的脂化的TF的FVII缺乏个体中检测的凝血时间之间并无差异。最后，虽然1/ig/ml的脂化的TF在缺乏FVII血浆中不能引起同样强烈的促凝作用，但观察到了非常显著的效果，这表示脂化的TF可以使这些患者的止血功能正常化。表4脂化的TF在来自健康个体及FVII缺乏个体的无抗凝全血中的促凝作用<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>n.d.:未测定1.3脂化的TF能够在抗FVII的单克隆抗体存在下使健康个体的血浆凝固(凝固分析)实施体外凝固分析以显示脂化的TF在抗FVII单克隆抗体(此抗体能够阻断正常血浆的凝固)存在时在健康个体血浆中的凝血作用。在抗FVII单克隆抗体存在时，使用来自健康志愿者的血浆，通过凝固分析研究脂化的TF对血浆凝固的作用(表5)。脂化的TF甚至在抗FVII单克隆抗体存在时能够引起凝固(该抗体能够完全抑制凝血)。在这些实验条件下(类似于缺乏FVII样品)，脂化的TF能够使血浆凝固。表5证实在抗FVII单克隆抗体存在时TF在正常血浆中的促凝作用无rTF有rTFl/Ag/ml正常血浆_126，828，1有抗FVII抗体(400ptg/ml)的正常血浆216,842,51.4脂化的TF与NCIS的组合协同增强缺乏FVII血浆的凝血(凝固分析)实施一系列体外凝固分析以显示脂化的TF与负电荷无机表面[NCIS]的组合在缺乏FVII血浆中的凝血作用。此促凝作用超越了单独使用脂化的TF作为促凝剂时所得到的作用。这些结果显示脂化的TF所介导的作用不依赖于FVII,并且甚至在其特异性配体不存在时能够引起血浆凝固。表6显示5次独立实验获得的结果。<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>1.5脂化的TF与FXa的组合在抗FVII的单克隆抗体存在时协同增强凝血(缺乏FX血浆的凝固分析)在用抗FVII抗体免疫阻断的缺乏FXa血浆中，研究了脂化的TF与低浓度FXa(170pM及1700pM)的组合在FVII不存在时的促凝作用(表7)。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>1.6脂化的TF、FXa与NCIS的组合在抗FVII的抗体存在时协同增强凝血(缺乏FX血浆的凝固分析)还研究了脂化的TF、低浓度FXa(170pM及1700pM)及NCIS的组合在缺乏FXa血浆中的促凝作用(表8)。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>2.证实脂化的TF与低浓度FXa(不能够引起任何促凝作用)的组合引起缺乏FX血浆凝固的体外测定2.1当FXa以低浓度存在时，脂化的TF用作此丝氨酸蛋白酶的刺激剂在凝血FX缺乏的血浆中实施体外凝固分析以显示脂化的TF对FXa的协同作用(向缺乏FX血浆中加入低浓度的FXa(170pM及nOOpM),因此这些血浆不能/人任何凝血途径产生FXa)。脂化的TF与低浓度FXa的组合的促凝作用见表9。表9<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>2.2脂化的TF与FXa及NCIS的组合在FXa的刺激下协同作用还研究了脂化的TF、低浓度FXa(170pM及1700pM)及NCIS的组合在缺乏FX血浆中的促凝作用(表10)。表10脂化的TF与FXa及NCIS的组合在缺乏FXa血浆中的促凝作用缺乏FX血浆凝血时间(秒)__有NCIS(1m1)有NCIS(2j[d)基础状态(5mM4丐离子)_>400_〉400290±10.2rTFlj^g/ml+FXa(170pM)124±6.1*109±4.1*84±3*rTF1/ig/ml+FXa(1700pM)83,1±3.2*65,5±5.2*45,5±3.2*坊值iS五M卩"=5」，*;<0.0W无iVCZS^f才iVCZS/5Vw^"f"一}-發3.证实脂化的TF(单独的或组合的)在除FVII以外缺乏其它凝血因子的患者中引起凝血的体外测定3.1脂化的TF使来自凝血因子FV、FVIII、FVIII、FIX、FX、FXI、fxii及Fxni缺乏的患者的血浆及血液凝固使用通过免疫亲和技术清除凝血因子的商用血浆，以及来自3名被诊断为患有血友病A的患者(FVIII缺乏)及2名被诊断为患有血友病B的患者(FIX缺乏)的血浆，研究脂化的TF(单独使用)对缺乏凝血因子血浆的促凝作用。表ll显示这些结果。在浓度为1/xg/ml时，脂化的TF能够有效凝固所有的缺乏FV、FVIII、FIX、FX、FXI、FXII及FXIII的血浆。另外，在已知的FXa辅因子FVa不存在时，脂化的TF也能产生血浆凝固，虽然只有在高浓度或中浓度时产生血浆凝固。在其它凝血因子缺乏的情况下，所有测试浓度的脂化的TF均有效，在非常低的浓度时获得极好的结果。即使在FX(l。/。)不存在时，脂化的TF仍能够凝血，但仅在高浓度时。所有这些结果经过来自血友病A及血友病B患者的样品的证实。表11脂化的TF在缺乏凝血因子血浆中的促凝作用凝血时间(秒)<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>利用凝固分析，评估脂化的TF(单独使用)在来自血友病A及B患者的人无抗凝全血中的促凝作用。通过估计凝块固结的时间(分钟)来确定凝块形成。脂化的TF在来自健康志愿者的血液中的作用从0.001/xg/ml的浓度开始显著，然而在血友病患者中需要更高的剂量，从0.01]Lig/ml开始检测到显著的促凝效果(p〈0.001)。当浓度为0.1/ig/ml时，脂化的TF能够使凝血时间完全正常化，在正常个体与血友病个体中4企测的凝血时间之间并无差异。表12显示从4名健康个体(样品编号1-4)、3名患有血友病A的患者及2名患有血友病B的患者的样品中得到的结果。表12脂化的TF在来自健康个体及血友病患者的无抗凝全血中的促凝作用<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>凝J^好/《f以々斧《^,'在克我凝A濕摔品,凝块馬潜摩需要的萌3.2脂化的TF使预先被肝素化的全血及血浆凝固脂化的TF能够使预先用高浓度肝素孵育的血浆(表13)及无抗凝全血(表14)凝固，这证实其对FXa的作用不受该抗凝药物介导的抑制作用的影响，即使肝素型抑制剂存在下也亦然。表13脂化的TF对肝素化的血浆的作用(以秒表示凝血时间)无脂化的TF_有脂化的TF对照组_320，4±160_17.2士1肝素3U/ml〉60058±12表14脂化的TF对肝素化的全血的作用(以分钟表示凝血时间)无脂化的TF_有脂化的TF对照组_3.96±0.54_0.4±0.28_肝素0.25U/ml12.45±0.6915.7±0.22肝素1U/ml26.6±5.764.5士2.383.3脂化的TF使来自华法林处理的动物的血浆凝固脂化的TF能够使来自华法林处理的大鼠的血浆凝固，该处理是根据方法中描述的步骤进行。表15所示的结果显示即使当所有维生素K依赖性凝血因子的合成均被阻断，脂化的TF仍能凝固血浆，这证实其对FXa的作用不受此抗凝药物介导的抑制作用的影响。表15脂化的TF对来自华法林处理的动物的血浆的作用(以秒表示的凝血时间)无脂化的TF有脂化的TF(1jgg/ml)对照组_49±10.2_10,9±2.2_华法林处理的血浆60,1±5.612,8±3.2(0.1mg/kg给药3天)_3.4脂化的TF与NCIS的组合在来自凝血因子FV、FVIII、FVIII、FIX、FX、FXI、FXII及FXIII缺乏患者的血浆(缺乏凝血因子血浆的凝固分析)中及在来自血友病患者的全血中协同增强血液凝固实施一系列的体外凝固分析，以显示脂化的TF与NCIS的组合在来自凝血因子缺乏患者(FV、FVII、FVin、FIX、FX、FXI、FXII及FXIII)的血浆中的凝血作用。该促凝作用超越了单独使用脂化的TF作为促凝剂时得到的作用。即使脂化的TF在低浓度(l/ig/ml)时，在此浓度下脂化的TF不能使缺乏FV血浆(FV-D血浆)凝固，但这两种试剂的组合产生显著的促凝作用。同样的，当使用缺乏FVII血浆(FVII-D血浆)时，也可得到类似的协同作用。这些结果显示脂化的TF介导的作用不依赖于FVII,并且即使在FV不存在时该作用仍能够引起血浆凝固。类似的，该组合(脂化的TF+NCIS)也能在来自血友病(A及B)患者的血浆样品中发挥有效的促凝作用。表16显示5次独立实验得到的结果。表16<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>使用来自患有血友病A(3名)及血友病B(2名)患者的血液，通过凝固分析，还研究了脂化的TF与NCIS的组合在无抗凝全血中的促凝作用。通过与单独使用脂化的TF的分析(表12)进行比较，该组合(rTF+NCIS)的促凝效果明显(pO.001)更高(表17)。表17<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>4.证实脂化的TF(单独的或组合的)引起健康个体血液凝固的体外测定4.1脂化的TF使来自健康个体的血浆及血液凝固实施一系列的体外凝固分析，以显示脂化的TF在来自无止血障碍史的健康志愿者的血浆及无抗凝全血中的凝血作用。表18显示在健康血浆中实施5次独立实验获得的结果，表19为在无抗凝全血中实施5次独立实验获得的结果。表18脂化的TF在来自健康个体的血浆中的促凝作用正常血浆凝血时间(秒)<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>表19<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>4.2脂化的TF与NCIS的组合协同增强来自健康个体的血浆及血液的凝血。当脂化的TF结合磷脂时不存在协同作用实施一系列的体外凝固分析，以显示rTF与NCIS的组合在来自健康志愿者的血浆中的凝血作用。表20显示在5次独立实验中得到的结果。通过与单独使用rTF的分析进行比较，该组合(rTF+NCIS)在所使用的每一浓度下均有显著(pO.001)更高的促凝作用。表20脂化的TF和NCIS的组合在正常血浆中的促凝作用<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>表21显示当脂化的TF与磷脂结合时不存在协同作用(0.66mM的PC/PS;不同摩尔比的磷脂酰胆碱/磷脂酰丝氨酸)。表21_磷脂对脂化的TF的促凝活性的影响_脂化的TF凝血时间(秒)56(0.1/ig/ml)无PC/PS37.9有PC/PS90/104480/2039.770/3041.760/4040.150/5043.540/6034.630/7041.520/8044.310/9041.95.证实脂化的TF(单独的或组合的)在来自患有先天性及后天性(血小板减少性)血小板疾病的患者的血液中具有凝血效果的体外测定5.1脂化的TF使来自患有先天性血小板疾病的患者的全血凝固使用来自2名分别患有格兰茨曼病和贝-苏综合征患者的血液，通过凝固分析，研究脂化的TF对患有血小板疾病患者的血液凝固的促凝作用。rTF能够以浓度依赖性方式非常显著地促进患有格兰茨曼病患者和患有贝-苏综合征患者的凝血(表22);因此rTF是用于所述个体的抗出血治疗的有用试剂。表22TF对患有血小板疾病患者的促凝作用基础^l大态rTF0.01/ig/ml0.1jLtg/ml1jtig/ml1号对照样品5.83,32.11,36号格兰茨曼病患者13.67.33.42.97号贝-苏综合征患者11.97.14.13.15.2脂化的TF与NCIS的组合增强了来自先天性血小板疾病患者的全血的凝固实施一系列的体外凝固分析，以显示rTF与NCIS的组合在来自患有先天性血小板疾病患者的全血中的凝血作用。表23显示从2名分别患有格兰茨曼病及贝-苏综合征的患者中得到的结果。通过与单独使用rTF的分析比较，该组合(rTF+NCIS)在每名患者中均有显著(p〈0.001)更高的促凝效果。表23脂化的TF与NCIS的组合在全血中的促凝作用<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>凝j&^/W以》辨^^」.'^无在凝j&该存品哞凝块茵錄摩,要的^河5.3脂化的TF使血小板减少的样品凝固实施一系列的体外凝固分析，以显示脂化的TF在不同血小板计数的血浆中的凝血作用。表24显示从正常血小板计数到血小板减少疾病状态中得到的结果。表24<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>6.在对照大鼠中证实TF是用于局部抗出血治疗的试剂的体内测定(通过直接应用于预先截断的血管)6.1脂化的TF在大鼠近侧断尾所致的严重出血动物模型中用作局部止血剂实施体内测定以显示单独给药或与NCIS联合给药的脂化的TF是用于局部抗出血治疗的有用试剂。采用由大鼠近侧断尾产生的严重出血动物模型，评估脂化的TF作为单独给药或与NCIS联合给药的局部止血剂的用途。表25显示所得结果。由表中所见，在该严重出血模型中，对照动物(PSS对照组，用生理盐水溶液治疗)在18.1±5.98分钟后出血自动凝固；然而，局部给予脂化的rTF(单独)产生显著的减少(ll.l±5.54分钟，pO.OOl)。当rTF与NCIS联合给药时，促凝效果甚至更强(5.0±1.1分钟；pO.OOl)。表25由大鼠近侧断尾产生的严重出血模型的出血凝固时间<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>结果以达到固结的凝固的时间(分钟)表示。在相同的实验条件下评估非脂化的TF(n=3)。观察到无任何作用，出血凝固时间与对照动物类似。这些结果显示，非脂化的TF不用于局部治疗出血事件。6.2脂化的TF在用肝素或华法林预先处理的严重出血动物模型中用作局部止血剂实施体内测定以显示，单独给药的脂化的TF是抗凝状态下用于局部抗出血治疗的有用试剂(表25)。采用由预先处理的大鼠近侧断尾产生的严重出血动物模型评估脂化的TF作为单独给药的局部止血剂的用途，该大鼠在开始截尾操作前15分钟用200U/kg的肝素静脉注射进行预先处理，或在开始截尾操作前三天每天口服0.1mg/kg的华法林进行预先处理。所得结果显示于表26。如该表所示，在该严重出血模型中，用生理盐水溶液治疗的盐水对照组在18.1±5.98分钟后自动凝血。肝素处理对照组无法自动凝血(>90分钟)，华法林处理对照组在41.6±8.5分钟后自动凝血。表26显示脂化的TF(单独)的局部给药在所有治疗组中均产生明显的减少。表26在抗凝处理的动物中由大鼠近侧断尾产生的严重出血模型的出血凝固时间出血凝固时间(分钟)<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>潜果以这到^潜^凝^的^河(^、妒)《^。6.3脂化的TF在颈动脉穿刺所致的致死性出血动物模型中用作局部止血剂实施体内测定以显示单独给药的rTF是直接应用于血管上的用于局部抗出血治疗的有用试剂。采用由颈动脉穿刺产生的致死性出血动物模型，评估单独给药的脂化的rTF的用途。得到的结果显示于表27中并非常显著。如该表所示，在对照动物组中(以生理盐水溶液治疗的PSS对照组)，所有的动物出血致死，但是在脂化的TF组中没有动物死亡，且在所有情况下，伤口均成功愈合及凝血。就实现稳定的凝血及穿刺伤口愈合所需要的时间而言，该治疗是有效的。表27由大鼠颈动脉穿刺产生的致死性出血模型对照SF__1号动物_^_3号动物_1252号动物死亡4号动物135平均值士SD"0土7J潜果"这^/^潜的凝^及,^y^口,會合的^河(^^衷^。如X^摩迷，WF的發^*量为;^/4f冷。结论实施例1的结果清楚显示1)当配体FVII不存在时，脂化的TF能直接与FXa相互作用，从而显著增加其蛋白水解活性(酰胺水解及凝血酶形成活性)，此结果首次显示脂化的TF的新作用，即用作FXa的新的辅因子(与公知的FVa无关)。2)脂化的TF能够使缺乏FVII血浆凝固。因此，脂化的TF是用于这类患者的良好的替代治疗(目前唯一存在的治疗是昂贵的人重组FVIIa)。3)脂化的TF与NCIS及FXa(在不能产生凝血的低浓度下)协同作用。实施例2的结果清楚显示1)脂化的TF使不能产生任何促凝效果的生理浓度的FXa启动凝血酶原水解，/人而发生凝血酶形成。2)脂化的TF具有新的作用，其用作所有形式的FXa(可溶性FXa和与凝血酶原酶复合物结合的FXa)的所有蛋白水解活性的辅因子。3)甚至缺乏FX血浆(含痕量的FX)可被脂化的TF凝固。因此，脂化的TF是用于这类患者的良好的替代治疗。4)在FXa活性的刺激作用方面，脂化的TF与NCIS协同作用。实施例3的结果清楚显示1)脂化的TF能使血友病患者(FVIII、FIX及FXI)凝血。因此，月旨化的TF是用于这类患者的良好的替代治疗。2)脂化的TF甚至在FV不存在时也能引起凝血。这些结果清楚地显示脂化的TF对FXa具有强烈的刺激作用，因为当其辅因子不存在时(缺乏FV血浆)，脂化的TF用作引起相同刺激作用的辅因子。3)甚至在缺乏FX血浆中(含痕量FX)，脂化的TF能引起凝血。因此，脂化的TF是用于这类患者的替代治疗。4)脂化的TF能在肝素及华法林处理的血浆中引起凝血，这表示脂化的TF干扰抗凝血酶III的作用，以及可能通过其对基础浓度的FXa的刺激作用，其甚至可以在华法林处理的血浆中引起凝血。5)最后，脂化的TF与NCIS协同作用，在所有凝血因子缺乏中观察到促凝作用。实施例4的结果清楚显示1)脂化的TF能在健康个体中引起凝血。因此，脂化的TF是用于治疗健康个体的出血事件的良好替代治疗。2)脂化的TF与NCIS协同作用，在健康个体观察到促凝作用，但只含磷脂时无协同作用。实施例5的结果清楚显示l)脂化的TF能在患有血小板疾病的患者中引起凝血，该血小板疾病例如先天性或后天性血小板疾病(即，血小^1减少症)。因此，脂化的TF是用于治疗患有血小板数和/或功能变化的患者的出血事件的良好替代治疗。实施例6的结果清楚显示l)局部给药的脂化的TF能在严重出血(近侧全尾截断)的动物模型中停止出血。2)局部给药的脂化的TF能在严重出血(近侧全尾截断)并用抗凝疗法处理(肝素或华法林)的动物模型中停止出血。3)局部给药的脂化的TF能在致死性出血(颈动脉穿刺)动物模型中停止出血。权利要求1.脂化的组织因子(TF)或其功能片段在制备用于局部治疗个体出血的药物中的用途。2.如权利要求l所述的用途，其中所述个体是健康个体或具有出血素质的个体，其中所述出血素质包括凝血病和/或血小板疾病。3.如权利要求2所述的用途，其中所述凝血病是先天性凝血病或后天性凝血病。4.如权利要求3所述的用途，其中所述先天性凝血病是基于凝血因子缺乏的凝血病，所述凝血因子选自凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子vm、凝血因子ix、凝血因子x、因子xi、凝血因子xn、凝血因子xm或其组合。5.如权利要求4所述的用途，其中所述先天性凝血病是基于凝血因子缺乏的凝血病，所述凝血因子选自凝血因子V。6.如权利要求4所述的用途，其中所述先天性凝血病是基于凝血因子缺乏的凝血病，所述凝血因子选自凝血因子VII。7.如权利要求4所述的用途，其中所述先天性凝血病是基于凝血因子缺乏的凝血病，所述凝血因子选自凝血因子X。8.如权利要求2所述的用途，其中所述个体具有由使用抗凝血剂的抗凝血治疗所产生的后天性凝血病。9.如权利要求8所述的用途，其中所述抗凝血剂是肝素、低分子量肝素、华法林、香豆素衍生物或双香豆素。10.如权利要求2所述的用途，其中所述个体具有先天性血小板疾病或后天'f生血小板疾病。11.如权利要求IO所述的用途，其中所述先天性血小板疾病选自格兰茨曼病、贝-苏综合征、Bolin-Jamieson，s综合征、维-奥综合征、Paris-Trousseau-Jacobsen综合征、X染色体的血小板减少症、灰色血小板综合征、Sebastian综合征或范科尼贫血。12.如权利要求IO所述的用途，其中所述后天性血小板疾病选自骨髓增生性疾病，诸如血小板增多、红细胞增多或慢性粒细胞白血病；骨髓外化生；在坏血病、先天性心脏疾病及肝硬化中的异常蛋白血症。13.如权利要求1所述的用途，其中所述脂化的TF是脂化的人TF。14.包含(i)脂化的TF和(ii)活化的凝血因子X(FXa)的产品。15.分别包含(i)脂化的TF和(ii)活化的FXa的产品。16.分别包含作为组合用于对个体同时给药或相继给药的(i)脂化的TF和(ii)FXa的产品。17.包含(i)脂化的TF和(ii)负电荷无机表面(NCIS)的产品。18.分别包含(i)脂化的TF和(ii)NCIS的产品。19.分别包含作为组合用于对个体同时给药或相继给药的(i)脂化的TF和(ii)NCIS的产品。20.包含(i)脂化的TF、(ii)FXa和(iii)NCIS的产品。21.分别包含(i)脂化的TF、(ii)FXa和(iii)NCIS的产品。22.分别包含作为组合用于对个体同时给药或相继给药的、(i)脂化的TF、(ii)FXa和(iii)NCIS的产品。23.如权利要求14至22中任一权利要求所述的产品，其中所述脂化的TF是脂化的人TF。24.如权利要求14至23中任一权利要求所述的产品，其为药物。25.权利要求14至23中任一权利要求所述的产品在制备用于治疗个体出血的药物中的用途。26.权利要求14至23中任一权利要求所述的产品在制备用于局部治疗个体出血的药物中的用途。27.包含脂化的TF和FXa的复合物(TF::FXa)。28.如权利要求27所述的复合物，其为药物。29.权利要求27所述的复合物在制备用于治疗个体出血的药物中的用途。30.权利要求27所述的复合物在制备用于局部治疗个体出血的药物中的用途。31.包含脂化的TF和NCIS的复合物TF::NCIS。32.如权利要求30所述的复合物，其为药物。33.权利要求31所述的复合物在制备用于治疗个体出血的药物中的用途。34.权利要求31所述的复合物在制备用于局部治疗个体出血的药物中的用途。35.包含脂化的TF、FXa和NCIS的复合物TF::FXa::NCIS。36.如权利要求35所述的复合物，其为药物。37.权利要求35所述的复合物在制备用于治疗个体出血的药物中的用途。38.权利要求35所述的复合物在制备用于局部治疗个体出血的药物中的用途。39.包含脂化的TF和药物可接受的载体的药物组合物。40.用于将脂化的TF局部给药的药物组合物，其包含脂化的TF和适于将所述脂化的TF局部给药的药物可接受的载体。41.药物组合物，其a)包含权利要求14所述的产品及药物可接受的载体；或b)分别包含(i)脂化的TF与药物可接受的载体，及(ii)FXa与药物可接受的载体；或c)包含权利要求17所述的产品及药物可接受的载体；或d)分别包含(i)脂化的TF与药物可接受的载体，及(ii)NCIS与药物可接受的载体；或e)包含权利要求20所述的产品及药物可接受的载体；或f)分别包含(i)脂化的TF与药物可接受的载体、(ii)FXa与药物可接受的载体，及(iii)NCIS与药物可接受的载体；或g)包含权利要求27所述的TF::FXa复合物与药物可接受的载体；或h)包含权利要求31所述的TF::NCIS复合物与药物可接受的载体5或i)包含权利要求35所述的TF::FXa::NCIS复合物与药物可接受的载体。42.如权利要求41所述的药物组合物，其为用于将其局部给药的药物给药形式。43.包含权利要求39至42中任一权利要求所述的药物组合物和支持体的产品。44.包含药物组合物的产品，所述药物组合物包含(i)支持体、(ii)权利要求14所述的产品及药物可接受的载体、(iii)权利要求17所述的产品及药物可接受的载体和(iv)权利要求20所述的产品及药物可接受的载体；或权利要求27所述的TF::FXa复合物及药物可接受的载体，或权利要求30所述的TF::NCIS复合物及药物可接受的载体，或权利要求34所述的TF::FXa::NCIS复合物及药物可4妄受的载体。45.非脂化的TF或其功能片段在制备用于治疗凝血因子VII缺乏个体的出血的药物中的用途。46.如权利要求45所述的用途，所述用途为在制备用于肠胃外给予非脂化的TF或其片段的药物中的用途。全文摘要活化的凝血因子X(FXa)刺激剂可被用于治疗个体出血。本发明描述了特别用于局部治疗健康个体或具有出血素质患者的出血的化合物和组合物。文档编号A61P7/04GK101291686SQ200680036920公开日2008年10月22日申请日期2006年8月2日优先权日2005年8月3日发明者哈维尔·佩德雷尼奥埃赫亚,路易斯·卡韦达卡塔苏斯申请人:斯洛柏塔盖兹欧洲有限公司