对胎盘生长因子(pigf)介导的肿瘤转移和/或血管生成的抑制的制作方法

专利名称：：对胎盘生长因子(pigf)介导的肿瘤转移和/或血管生成的抑制的制作方法
技术领域：
：本发明涉及抑制血管生成、尤其是病理性血管生成和/或肿瘤的生长和转移的方法和组合物。在具体实施方案中，所述组合物和方法涉及靶向胎盘生长因子-2(PIGF)和/或其受体Flt-l的抑制剂，包括但不限于肽、抗体、抗体片段、人源化抗体、嵌合抗体、抗体类似物、适体、有机化合物和/或本领域已知的可以用来抑制PIGF介导的血管生成和/或转移的任何其他分子或化合物。在更具体的实施方案中，所述抑制剂可以是通过针对PIGF的噬菌体展示分离的肽。相关技术介绍高表达的血管生成生长因子是众多癌症生长发展所必需的(Caoetal.,1998,JClinInvest101:1055-1063)。在这样的血管生成生长因子中，高表达的血管内皮生长因子(VEGF)与肿瘤恶性程度和转移增加的相关性受到最高泛的关注(Abdulraufetal.,1998,JNeurosurg88:513-52;Ahmedetal.,2000,Placenta21SupplA,S16-24)。然而，VEGF和VEGF家族生长因子的其他成员在肿瘤复发或转移性生长中的作用还未完全清楚。许多治疗，包括放疗、细胞因子和细胞毒性药物，它们的治疗作用部分归因于抗血管生成机制，其中一种才几制为向下调节VEGF(Tayloretal.,2002a,ClinCancerRes8:1213-1222;Jiangetal.,1999,MolCarcinog26:213-225;Macheinetal.,1999,NeumpatholApplNeurobiol25:104-112)。而且，显著抑制VEGF够恢复血液供应使肿瘤细胞存活。因此本领域需要直接针对有效抑制肿瘤血管生成和/或生长和转移以及其他疾病伴有的血管生成的方法和组合物。发明概述本发明通过提供用于抑制、遏制、阻断和/或消除血管生成和/或肿瘤转移的方法和组合物，满足了本领域一项未被满足的需要。在某些实施方案中，组合物和/或方法可涉及胎盘生长因子-2(P1GF)的配体和/或既与Flt-l结合又与PlGF结合的配体。这类配体可包括但不限于肽、抗体、抗体片段、人源化抗体、嵌合抗体、抗体类似物、适体(aptamers)、有机化合物和/或本领域已知是P1GF配体的任何其它分子或化合物。在各种实施方案中，P1GF配体可为肽。用于鉴定与特定靶标结合的肽的方法是本领域众所周知的，包括例如如下所述的噬菌体展示技术。在噬菌体展示中，产生在噬菌体(例如丝状噬菌体)表面表达的肽文库，并且可通过针对目标靶进行选择来筛选肽文库。在一轮或多轮针对靶的筛选(淘选)后，可以分离含有与靶结合的展示肽的噬菌体，并且可通过例如对噬菌体核酸中编码肽的DNA插入片段测序，确定肽序列。其它实施方案涉及用于治疗患者(例如患有癌症和/或例如黄斑变性等血管生成相关疾病的患者)的方法和/或组合物。受治疗者可包括但不限于人、动物、猫、狗、牛、绵羊、山羊、马、羊驼和哺乳动物。方法和组合物可包括给予受治疗者一种或多种P1GF配体。在优选的实施方案中，可以给予通过针对P1GF的噬菌体展示鉴定为配体的肽。可以通过本领域已知的任何途径给予，例如口服、经鼻、口腔、吸入、直肠、阴道或局部。或者可以通过原位(orthotopic)、真皮内、皮下、肌内、腹膜内、动脉内、鞘内、静脉内注射给予。在优选的实施方案中，P1GF配体(抑制剂)经口服给予。在更优选的实施方案中，P1GF配体可包含下述实施例中所公开的(结合蛋白)BP-1、BP-2、BP-3或BP-4的序列。给予P1GF配体可以有效抑制或消除胂瘤转移、实体瘤中的血管生成、肿瘤细胞存活和/或胂瘤细胞移动。在优选的实施方案中，给予一种或多种P1GF配体可以阻止肺瘤转移，或者可以导致现有肿瘤消退或抑制生长。本领域技术人员应当了解的是，一种或多种P1GF配体可以单独给予，或者可与其它已知的癌症和/或血管生成的治疗性疗法联用，例如化学疗法、放射疗法、免疫疗法、抗VEGF药物和/或其它已知的抗血管生成药物等。在一些实施方案中，P1GF配体可与双特异性抗体一起给予，该抗体具有一个针对P1GF配体的结合部位及第二个针对肿瘤抗原或其它靶标的结合部位。在其它实施方案中，P1GF配体可与抗体、抗体片段、单克隆抗体、Fc片段、Fc结合蛋白或抗体结合蛋白共价连接，或者作为与抗体、抗体片段、单克隆抗体、Fc片段、Fc结合蛋白或抗体结合蛋白的融合蛋白提供。在替代实施方案中，P1GF配体可用于治疗除癌症以外的血管生成相关疾病。血管生成相关疾病的实例包括但不限于类风湿性关节炎、炎性肠病、节段性回肠炎(Crohn'sdisease)、溃疡性结肠炎、结节病、译喘、水肿、肺动脉高压、肿瘤的形成与发展、牛皮癣、糖尿病性视网膜病、黄斑变性、角膜移植排斥、新生血管性青光眼、心肌血管生成、斑块新血管形成、再狭窄、血管创伤后新内膜形成、毛细管扩张、血友病性关节、血管纤维瘤、慢性炎症相关的纤维化、肺纤维化、深部静脉血栓形成和伤口肉芽形成。在其它替代实施方案中，本文所公开的P1GF配体可以例如通过与复合物或治疗药物缀合，用作寻靶肽。P1GF配体(例如BP-1、BP-2、BP-3和/或BP-4)可以通过本领域众所周知的方法，例如4吏用共价交联剂，与各种部分共价或非共价连接。已知并可以使用多种这类试剂，例如碳二亚胺、双亚氨酸酯(bisimidate)、辛二酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯、二甲基-3,3'-二石克-双亚氨丙酸酯(dimethyl-3,3'-dithio-bispropionimidate)、叠氮基乙二醛、1,5-二氟-2,4-(二硝基苯)和其它用于蛋白质和/或肽的交联剂。在各种实施方案中，P1GF配体可与以下部分连接抗体、抗体片段、化疗药物、抗血管生成药、促凋亡药、掺有这些药物的或任何其它已知治疗用化合物。在另一些实施方案中，PlGF配体可以用作诊断和/或成^象目的添加剂。例如，P1GF配体用任何已知的造影剂或检测剂标记，或者可以采用任何已知方法(例如ELISA等)检测。可以离体使用P1GF配体，例如通过组织切片的免疫组织化学，来检测表达P1GF的肿瘤或其它组织。或者，P1GF配体可以给予受治疗者用于体内检测表达P1GF的组织。例如，可以使用这些组合物和方法检测或诊断表达P1GF胂瘤的存在，和/或鉴定患有以下疾病的患者血管生成或可受益于针对P1GF靶向疗法的细力包移动相关疾病。附图简述下面的附图构成本说明书的组成部分，；波用来进一步it明本发明具体实施方案的某些方面。结合本文提供的发明详述，参照一个或多个附图可以更好地理解实施方案。图l.BPl与Flt-l的肝素结合区的相互作用。按图中的下图部分所述，将试剂加到Flt-l包被的孔中。在本实验中所用的BP1在其C端含有接头和的FLAG表位。通过探测FLAG表位来评价肽结合。A:仅ljiMBPl;B:仅2.5/25U/ml肝素；C:2.5U/ml肝素后加入linMBP1;D:lpMBPl后加入2.5U/ml肝素。所示数值是两个独立实验一式两份孔的平均值士SD。肝素后加入1iliMBP1(C)相对于仅BP1(A)<0細2(ANOVA)。图2.P1GF体外刺激MDA-MB-231细胞的侵袭。该图表示累积结果士SD(i^3-5次实验)。图中所用缩写词'P1'表示P1GF;'VE'表示VEGF。承P〈0.05(ANOVA)。图3.BP1抑制MDA-MB-231异种移植物生长和转移。肺瘤体积对时间，皮下才莫型。所示结果得自两个实验之一士SD(n二3-4只小鼠/治疗)。对于才莫拟品治疗或CPA(肿瘤体积变化(ANOVA))*P<0.05。图4A-4C.外源P1GF刺激肿瘤细胞存活力提高。在低血清浓度(1%)条件下，乳腺肿瘤细胞系用P1GF(2nM)或PlGF及指定肽(l-2^M)处理。24小时后，用MTT评价细胞的存活力。弁表示P1GF处理细胞与未处理对照相比i3<0.04。星号("表示与仅P1GF相比尸<0.03(ANOVA)。图4A-MCF-7人乳腺癌细胞。图4B-MDA-MB-468人乳腺癌细胞。图4C-MDA-MB-231人乳腺癌细胞。图5A-5B.带有MDA-MB-468异种移植物的小鼠用肽BP1或BP3治疗。按方法部分中所述，小鼠每隔3-4天用200吗BP治疗。每周2次测量肿瘤体积。在第10天、第14天、第17天和第24天*尸<0.05(月中瘤体积变化(ANOVA))。图5A-用结合肽1治疗的肿瘤。图5B-用结合肽3治疗的肿瘤。图6.hFc的表达载体。该图提供示例性载体(pdHL2-sCD20-hFc)的示意图，该载体用作构建表达hFc的载体(pdHL2-hFc)的冲莫板。重组hFc可按实施例4所述方法与BPl进行化学缀合，或者按实施例5所述方法与hFc融合。说明性实施方案的描述本申请引用的所有文献或文献选段包括但不限于专利、专利申请书、文章、书籍和论文，通过引用全部特别结合到本文中。定义本文所用不定冠词"a"或"an"可指一项中的一个或多个。本文所用术语"和"与"或"可用来既指连接词又指转折连词。即除非另有说明二者应理解为等同于"和/或，，。"配体"是指能够与靶结合的任何分子、化合物或组合物。例如，P1GF配体是可与P1GF结合的配体。结合能力可以通过本领域已知的任何方法直接测定，例如使用标记配体或靶的放射性检测、亲和层析、免疫沉淀法、点渍法、狭线印迹、蛋白质印迹、ELISA、微阵列结合(microarraybinding)等。或者，可以通过间接方法，例如用噬菌体展示技术，淘选针对靶的携带肽的噬菌体，来测定结合。所使用的缩写词为BSA，牛血清白蛋白；ELISA，酶联免疫吸附测定；FGF，成纤维细胞生长因子；FGFR，成纤维细胞生长因子受体；FITC，异硫氰酸荧光素；flk-l，VEGF受体II;FIt-l，fms样酪氨酸激酶-l,VEGF受体I;FLAG,检测靶蛋白或耙肽的表位附加标记系统；HEC,人微血管内皮细胞；HRP，辣根过氧化物酶；IHC,免疫组织化学；MTT,基于3-(4,5-二甲基噻唑基-2)-2,5-二苯基溴化四唑镜的存活力测定法；PBS，磷酸盐緩沖盐水；P1GF，胎盘生长因子；RT,室温；RTK，受体酪氨酸激酶；UT，未处理对照；VEGF，血管内皮生长因子。肿瘤血管生成和转移中的胎盘生长因子(P1GF)P1GF与VEGF的血小板衍生生长因子样区有53%同一性(Maglione等，1991，尸rac淑"ca"c/园88:9267-9271)。产生两种主要的同工型，PlGF-l和PlGF-2。以二聚体分泌，二聚体由132个^J^酸或153个氨基酸单体组成，通过二硫键以首尾方式连接(Maglione等，1991),总分子量为46-50kD。由mRNA剪切变异体产生三种同工型，但是仅PlGF-l和PlGF-2得到充分表征(Ahmed等，2000;Cao等，1997，倫c/z削肠;—y4cto235，493-498)。PlGF最早从胎盘中克隆(Maglione等，1991)，P1GF通常由滋养层、正常曱状腺表达以及在伤口愈合期间进行表达(Viglietto等，1995，Owcogewe11:1569-1579;Failla等，2000，J/"ve对Derwato/115:388-395)。在滋养层中，P1GF的表达被低氧应激消除(Gleadle等，爿w.J.尸/y^zo/.268:C1362-8,1995)，但是曾在下列情形中发现低氧驱动的表达至少一种原发性肿瘤(Yonekum等，J.Biol.Chem.274:35172-8,1999)、肺瘤异种移植物(Taylor等，Clin.CancerRes.61:2696-703,2001)和成纤维细胞(Green等，CancerRes.61:2696-703,2001)。许多恶性月中瘤表达PlGF受体Flt-l(Luttun等，Nat.Med.8:831-40,2002)。在正常血清中发现P1GF的水平低，但是在妊娠后期无先兆子痫的女性血清中发生9-10倍的增加(1^13]^等，2001,7^0///"附7:205-210;Re訓kamp等，1999，G，aeco/106:1019-1022;Vuorela-Vepsalainen等，1999，Hwmieprac/14:1346-1351)。即使正常脑组织中不表达P1GF，但却在成胶质细胞瘤和脑膜瘤中检测出P1GF(Gleadle等，1995，J尸/^wo/268:C1362-1368;Donnini等，1999，JPaAo/189:66-71)。在许多其它的原发性恶性肿瘤中也检测出P1GF(Nomura等，1998，丄胸腦歸/.40:123-30;Taylor等，2003a，v4^ocCawcer44:4-5[摘要R22];Matsumoto等，2003,爿""cawcer23:3767-3773;Chen等，2004，Ca"cwLe"213:73-82;Wei等，2005，666-672;Lacal等，2000,J/騰WDe匿to/115,1000-1007)。曾经还观察到P1GF表达与伴有新血管增生的糖尿病性视网膜病有关(Khaliq等，1998,丄a6/"ve对.78:109-16)。在动物沖莫型中，用P1GF的缺失实验显示抑制肿瘤生长，降低视网膜新血管形成(Carmeliet等，2001,胸U.7:575-83)。缺少肝素结合区的PlGF-l，仅与Flt-l(亦称VEGFR1)结合，而在COOH端有21个氨基酸肝素结合区的PlGF-2，则与神经毡蛋白-l(neuropilin-l)和Flt-l结合(Migdala等，1998，J说o/C/zem273:22272-22278;Hauser和Weich，1993，Oow&Factor9:259-268)。当与Flt-l结合时，PlGF-2能够诱导内皮细胞分化、增殖和迁移(Landgren等，1998，O"coge"e16:359-367)。在滋养层中，P1GF的表达被低氧应激消除(Gleadle等，1995),但是曾在下列情形中发现低氧驱动的表达至少一种原发性肿瘤(Yonekura等，1999，丄CVew.274:35172-8)、肿瘤异种移植物(Taylor等，2004，Pnc爿mO"cwM45:981[摘要4255])和成纤维细胞(Green等，2001，O脏r板61:2696-2703)。P1GF-1和P1GF-2两者都天然与VEGF形成异型二聚体。异型二聚体的相对活性可能取决于与VEGF结合的P1GF的形式。由P1GF-1异构体和VEGF组成的异型二聚体在体外或体内都几乎没有活性或者无活性(Eriksson等，2002,C"""rCe/H:99-108)。另一方面，PlGF-2/VEGF异型二聚体几乎与VEGF同型二聚体一样有效(Clauss等，1996，J历o/C/ew271:17629-17634;Cao等，1996,/说o/Ozem271:3154-3162;DiSalvo等，1995，J&o/C/em270:7717-7723)。P1GF(和VEGF)的受体Flt-l是酪氨酸激酶家族受体(RTK)的成员。以当被活化配体结合时其胞质域上酪氨酸残基的自身磷酸化为特征。Flt-l具有7个胞外Ig样结构域和一个分隔开的胞内酪氨酸激酶结构域。Flt-1与P1GF的相互作用主要依赖于第二胞外域。Flt-l的第四结构域与二聚化有关，包含有效使Flt-l与其配体紧密締合的肝素结合区(Park和Lee，1999,5,oc/ze/w祝o//z"W"Owww"264:730-734)。反向平行P1GF二聚体确保了结合区在二聚体的相对两端上，因此，当结合时，Flt-l最可能使受体紧密締合，使受体连接使之活化(Fuh等，1998，J胸C/2，273:11197-11204;Wiesmann等，1997，Ce//91:695-704)。肝素与PlGF和Flt-l的肝素结合区的相互作用可能是P1GF使Flt-l完全活化必不可少的。肝素结合的作用在成纤维细胞生长因子(FGF)-成纤维细胞生长因子受体(FGFR)配体-酪氨酸激酶受体对中已得到充分表征(Schlessinger等，2000,Mo/ecw/wCW/6:743-750)。在该实例中，肝素与配体和受体两者都多重接触，促进FGF-FGFR彼此间的结合和受体二聚化作用，这是活化中的必需步骤。肝素结合区存在于PlGF的更高活性形式(PlGF-2)中，提示肝素可能在经PlGF的Flt-l活化中具有作用。在我们的紳瘤复发研究中，我们在用》文射性标记抗体进行细胞毒处理后，检测出由存活肿瘤细胞产生的PlGF(Taylor等，2002a;Taylor等，2003;Taylor等，2002b,Proc爿m/4^ocC朋cwi^y43:10-11[摘要51])，即使在处理前，也无法检测到P1GF表达。现已确认的是，P1GF是内皮细胞的存活因子(Adini等，2002，Q/"cer62:2749-2752)，但是经处理诱导经肺瘤细胞表达P1GF是未曾预料到的发现(Taylor等，2002a;Taylor等，2003b，/WJC""cw105:158-169)。进一步的研究将P1GF表达与细胞毒处理后回收量提高联系了起来(Taylor等，2003b)。还发现某些肿瘤细胞系经处理诱导的表达以及组成型表达。缺氧-一种肿瘤中因代谢活动或处理所致的普遍情况，导致角质形成细胞和肿瘤细胞的PlGF表达增加(Ahmed等，2000;Taylor等，2002a;Taylor等，2003b)。某些恶性细胞在其表面的Flt-l表达水平低，然而通过配体-受体的直接信号转导作用未得到充分表征。这些发现提示P1GF可能对肿瘤细胞及在肿瘤环境下发挥作用。本说明书研究了PlGF和Flt-l对人乳腺癌细胞和异种移植物的直接作用。P1GF和VEGF在血管生成中的相对作用PlGF和VEGF都与Flt-l受体结合，而且据报道两者都刺激肿瘤和正常组织的血管生成。已经对VEGF与Flt-l受体结合对血管生成的作用进行了研究(El-Mousawi等，2003，,说o/.C/zem278:46681-91;美国专利申请公布号20040266694)。El-Mousawi等人(2003)使用随机16-mer噬菌体展示系统对重组Flt-l进行淘选以分离几种明显的VEGF结合肽。观察到称为V5.2的肽有最强的相互作用。据报道，将V5.2加到用VEGF或P1GF刺激的HUVEC和HCEC内皮细胞中抑制内皮细胞增殖，另据报道称在Matrigel中抑制VEGF介导的HCEC迁移和VEGF诱导的毛细管形成(El-Mousawi等，2003)。有研究表明V5.2的这些作用是通过与Flt-l受体结合介导的(出处同上)。然而，这些作者没有表征与V5.2结合的Flt-l的结构域，并且没有确定V5.2的作用是否与Flt-l的肝素激活拮抗。在各种实施方案中，如果涉及P1GF配体与另一种抗血管生成药(例如抗VEGF药物)联用时，则肽V5.2和类似的VEGF抑制剂可能是有用的。Malik等人研究了VEGF-A、VEGF-B和P1GF在血管生成中的作用(Malik等,"RedundantrolesofVEGF-BandP1GFduringselectiveVEGF-Ablockadeinmice"，Blood,2005年9月27日在线发表)。这些作者报道了缺少VEGF-B或P1GF的小鼠只显示较小的发育缺陷。VEGF-A活性的抑制与VEGF-A、VEGF-B和P1GF的抑制相比，对新生小鼠的生长和存活产生类似的作用，包括血管生成减少。得出的推论AP1GF和VEGF-B不能补偿阻断VEGF-A,表明VEGF-B和P1GF激活的VEGFR-l受体比起VEGF-A激活的VEGFR-2，在出生后的发育和成人血管稳态中起着相对较小的作用。这些结果与其它报道相冲突，其它才良道称在抑制异种移植物肿瘤生长和血管生成中，抗VEGFR-l抗体几乎与抗VEGFR-2抗体同样有效(Carmeliet等，2001，」VW.7:575-83;Stefanik等，2001,J.A^wra朋co/.55:91-100)。有研究提出VEGF陽B和P1GF可能参与调节成人病理性血管生成期间的炎性活动(Malik等，2005)。本领域技术人员应当了解的是，本文所公开的PIGF配体可与一种或多种VEGF抑制剂联用。可以使用的VEGF抑制剂包括新伐司他(Neovastat⑧)(Falardeau等，2001，0"co/28:620-25)、IM862(Tupule等，2000，丄C"".0"co/.18:716-23)，Angiozyme(RPI國4610)(Weng和Usman，2001，Cw/r.0"co/.3:141-46)、贝伐单抗(Gordon等，2001，J.C/z"O"co/.19:843-50)、Semaxanib(SU-5416)(Fong等，1999，Owcer/化59:99)和TNP-470(Figg等，1997，P/2amjocW/2era/7y17:91-97)。通过抑制血管生成治疗性治疗患者在各种实施方案中，涉及可以阻断或抑制P1GF介导的血管生成的P1GF配体的方法和组合物应用于治疗以病理性血管生成为特征的这些疾病中。这些疾病的实例包括但不限于类风湿性关节炎、炎性肠病、节段性回肠炎、溃疡性结肠炎、结节病、译喘、水肿、肺动脉高压、肺瘤的形成与发展、牛皮癬、糖尿病性视网膜病、黄斑变性、角膜移植排斥、新生血管性青光眼、心肌血管生成、斑块新血管形成、再狭窄、血管创伤后新内膜形成、毛细管扩张、血友病性关节、血管纤维瘤、慢性炎症相关的纤维化、肺纤维化、深部静脉血栓形成、伤口肉芽形成和肿瘤血管生成、生长和存活。不是所有患血管生成或细胞移动相关疾病状态的患者在患病组织中表达P1GF,本领域技术人员应当了解的是，在某些实施方案中，可以利用离体和/或体内PlGF表达测定法，鉴定最可能从靶向P1GF的治疗性干预中获益的患者。本领域技术人员应当了解的是，抗血管生成疗法可以使用一种或多种本文所公开的P1GF配体，在某些替代实施方案中，可包括给予本领域已知的其它抗血管生成药，例如内皮生长抑素(endostatinTM)、血管生长抑素、层粘连蛋白肽、纤连蛋白肽(包括ED-B纤连蛋白)、纤溶酶原激活物抑制剂、组织金属蛋白酶抑制剂、干扰素、白介素12、IP-10、Gro-P、血小板应答蛋白、2-曱氧基雌二醇、增殖蛋白相关蛋白、carboxiamidotriazole、CM101、马立马司4也、戊聚斗唐多聚硫酸酯、促血管生成素2、干扰素-a、除莠霉素A、PNU145156E、16K催乳素片段、利诺胺、沙利度胺、己酮可可碱、染料木碱、TNP-470、紫杉醇、accutin、血管生长抑素、西多福韦、长春新碱、博来霉素、AGM-1470、血小板因子4或二甲胺四环素。技术人员还应理解的是，在治疗肿瘤患者的情况中，本文所公开的P1GF配体可与将在下面更为详细讨论的任何已知的癌症疗法联用。已知的癌症疗法包括但不限于给予化疗药物、放射疗法、手术切除、局部高温、抗肺瘤抗体和其它抗血管生成药。给予肽要求保护的方法和/或组合物的各种实施方案可涉及给予患者一种或多种治疗用肽。可通过本领域已知的任何途径给予，包括但不限于口服、经鼻、口腔、吸入、直肠、阴道、局部给予、原位(orthotopic),真皮内、皮下、肌内、腹膜内、动脉内、鞘内或静脉注射给予。口服给予患者的未修饰肽可在消化道内降解，且根据序列和结构可显示穿过肠内层的吸收不佳。但是，众所周知的是用化学方法修饰肽从而赋予其对内源性蛋白酶降解较低的敏感性或者增加其通过消化道的吸收(参见例如Blondelle等，1995,Biophys.J.69:604-11;Ecker和Crooke,1995,Biotechnology13:351-69;Goodman和Ro,1995,BURGER'SMEDICINALCHEMISTRYANDDRUGDISCOVERY,笫I巻，主编Wollf,JohnWiley&Sons;Goodman和Shao,1996,Pure&Appl.Chem.68:1303-08)。可在与所选择目标(例如PIGF)结合的肽上实施这些方法。文献中已经描述了制备肽类似物(例如含有D-氨基酸的肽)的文库、由模拟肽结构的有机分子组成的肽模拟物、或拟肽例如插烯(vinylogou)拟肽的方法，且可用于构建适于口服给予患者的PIGF结合肽。在某些实施方案中，可以在要求保护的方法和组合物的范围内，应用模拟已知P1GF配体(例如BP-1、BP-2、BP-3或BP-4)结构的肽模拟物的制备和给药方法。在这些化合物中，标准的肽键连接可被一种或多种备选连接基团置换，例如CH2-NH、CH2-S、CH2-CH2、CH=CH、CO-CH2、CHOH-CH2等。用于制备肽才莫拟物的方法是众所周知的(例如Hruby,1982,h/e31:189-99;Holladay等，1983,re^a/^firow24:4401-04;Jennings-White等,1982，rwra/zefirow23:2533;Almquiest等，1980,丄AfedC/iem.23:1392-98;Hudson等，1979,/W.J.尸e;f.i^s.14:177-185;Spatola等，1986,Z^/e38:1243-49;美国专利号5,169,862、5,539,085、5,576,423、5，051,448、5,559,103，各所述文献通过引用结合到本文中)。与其肽类似物相比，肽模拟物表现出稳定性提高和/或体内吸收增加。或者，可经口服给予治疗用肽，使用N端和/或C端封端(capping)以防止外肽酶活性。例如，C端可以用酰胺肽封端，而N端可以通过肽的乙酰化封端。也可将肽环化以阻断外肽酶，例如通过形成环酰胺、二硫化物、醚、硫化物等。也可通过用D-氨基酸替代天然存在的L-氨基酸，而使肽稳定化，尤其是在已知内肽酶起作用的位置上发生取代。内肽酶结合和切割序列是本领域已知的，掺入D-氨基酸的肽的制备和使用方法已有记载(例如美国专利申请公布号20050025709,McBride等，2005年3月2日申请，所述文献通过引用结合到本文中)。另一个替代方法可使用包含两端与半胱氨酸残基相接的BP-1、BP-2、BP-3或BP-4序列并且由全部D-氨基酸组成的环肽。这样的D-氨基酸环状类似物可具有与L型相同的折叠构象，这可用本领域已知技术，通过计算机建才莫研究进行评价。在优选的实施方案中，修饰肽显示出以纳摩尔或更低范围的P1GF结合。通过标准测定法(例如ELISA),可以测定修饰肽的P1GF结合。技术人员应当了解的是，肽修饰后应测定靶结合活性以指导肽修饰过程。在某些实施方案中，肽和/或蛋白质可以通过与蛋白酶抑制剂和/或肽酶抑制剂共同配制，经口服给予。口服递送治疗用肽的其它方法公开于Mehta("OraldeliveryandRecombinantproductionofpeptidehormones",2004年6月，5/o尸/2arm/加ema"owcr/)。可以肠溶衣的固体剂型给予肽，该剂型的赋形剂调节肠道蛋白水解活性并增加肽穿过肠壁而转运。应用该技术，完整肽的相对生物利用度范围为给药剂量的1%-10%。使用含有胆酸钠和蛋白酶抑制剂的肠溶衣微胶嚢剂，已经成功将比本文所公开的P1GF结合肽大得多的蛋白质(胰岛素)给予狗(Ziv等，l"4,丄A/,"eri仏18(增刊2):792-94。用酰基肉毒碱作为渗透增强剂和肠溶衣，已经实现了口服给予肽(EudragitL30D-55,RohmPharmaPolymers,参见Mehta,2004)。用于口服给予肽的赋形剂通常包括一种或多种肠道蛋白酶抑制剂/肽酶抑制剂以及去垢剂或其它试剂，以提高肽的溶解度或吸收，它们可以包装在肠溶衣胶嚢或片剂中(Mehta,2004)。肠溶衣是抗酸的，允许肽穿过胃进入肠道吸收。胶嚢中可以包含有机酸，一旦胶嚢在肠道中溶解时，有机酸就可酸化肠道并抑制肠道蛋白酶活性(Mehta,2004)。口服递送肽的另一替代方法包括与基于聚乙二醇(PEG)的两亲寡聚体缀合，该两亲寡聚体增加吸收和对酶促降解的抗性(Soltero禾口Ekwuribe,2001，尸/zar附.rec/wo/.6:110)。在又一些实施方案中，可以通过与某些蛋白质(例如IgGl的Fc区)缀合而修饰肽(例如PlGF结合肽)，用于口服或吸入给药(参见实施例3-7)。肽-Fc缀合物的制备和使用方法公开于例如Low等(2005,i^pracf.20:1805-13)和Dumont等(2005,丄v4eraso/.A/W.18:294-303),所述各文献通过引用结合到本文中。Low等(2005)公开了采用在CHO细胞中的重组表达，将FSH的a和(3亚基与IgGlFc区以单链或异型二聚体的形式缀合。Fc缀合的肽通过新生Fc受体介导的转运系统穿过肺或肠道的上皮细胞吸收。与天然肽相比，Fc缀合的肽表现出体内稳定性提高，吸收增加。还观察到异型二聚体缀合物的活性要比单链形式的高。应用Fc缀合，通过吸入法还可有效地递送较大的蛋白质，例如红细胞生成素(Dumont等，2005)。在替代实施方案中，可以通过吸入途径给予治疗用肽(例如Sievers等，2001,jpp/C/iem.73:1299-1303)。超临界二氧化碳雾化已经用来从包括蛋白质和肽的各种药物中产生纳米尺度或微米尺度的颗粒(出处同上)。可通过将超临界二氧化碳与水性蛋白质或肽溶液混合所形成的微气泡，在比形成药物粉剂的备选方法低的温度(25-65。C)下干燥，仍保持治疗用肽的结构和活性(出处同上)。在某些情况下，可以将例如海藻糖、蔗糖、其它糖类、緩沖剂或表面活性剂等稳定性化合物加到溶液中以进一步保持功能活性。所形成的颗粒足够小，可通过吸入法给药，避免了肠道蛋白酶/肠道肽酶和穿过胃肠内层吸收的某些问题。给予患者治疗用肽的剂量可以变化，取决于药代动力学特征、给药方式和途径、患者年龄、体重和健康状态、症状的性质和程度、并用疗法和治疗频率。肽剂量的范围介于约lmg/50kg体重和3000mg/50kg体重之间，优选10-1000mg/50kg，更优选25-800mg/50kg。介于8mg/50kg和800mg/50kg的剂量可以分成每天l-6剂给药，或者以緩释形式给药。在一项研究中，给予病人单次500ng的肽剂量导致90-180分钟内的峰值血浆浓度范围约150-600pg/ml(Mehta，2004)。噬菌体展示要求保护的组合物和/或方法的某些实施方案涉及各种蛋白质靶标(例如P1GF)的结合肽和/或肽模拟物。可以通过本领域已知的任何方法筌定P1GF结合肽(BP)，该方法包括但不限于噬菌体展示技术。用于产生多样化肽群体的各种噬菌体展示方法和技术是本领域众所周知的。例如，美国专利第5,223,409、5,622,699和6,068,829号(所述各专利通过引用结合到本文中)公开了制备噬菌体文库的方法。噬菌体展示技术包括对噬菌体进行遗传操作，使得小肽可以在其表面表达(Smith和Scott,1985,Science228:1315-1317;Smith和Scott,1993，Meth.Enzymol.21:228-257)。过去十几年来，在噬菌体展示肽文库的构建和用该肽文库分离肽配体的筛选方法的开发方面已取得很大进展。例如，使用肽文库可以表征许多蛋白质内的相互作用位点和受体-配体结合基序，所述蛋白质例如参与炎症反应的抗体或介导细胞粘附的整联蛋白。该方法也已用于鉴定新的肽配体，这可用作对肽^^拟药物或造影剂开发的前导(Arap等，1998a,Science279:377-380)。除了肽之外，更大的蛋白质结构域(例如单链抗体)也可展示在噬菌体颗粒表面(Arap等，1998a)。可以通过淘选，来分离对给定的器官、组织、细胞类型或靶分子具有选择性的寻靶氨基酸序列(Pasqualini和Ruoslahti，1996,Nature380:364-366;Pasqualini,1999,TheQuart.J.Nucl.Med.43:159-162)。简而言之，将含有推定寻靶肽的噬菌体文库给予完整生物体或给予分离的器官、组织、细胞类型或靶分子，收集含有结合噬菌体的样品。可以从靶器官、靶组织、靶细胞类型或靶分子上洗脱出与靶标连接的噬菌体，然后通过在宿主菌中培养而扩增。在某些实施方案中，可以在几轮淘选中使噬菌体在宿主菌中增殖。细菌不被噬菌体裂解，而是分泌多拷贝噬菌体，这些噬菌体展示特定插入物。如有必要，可再次将扩增的噬菌体暴露给靶器官、草巴组织、靶细胞类型或靶分子，并收集起来用于进一步多轮淘选。可以进行多轮淘选，直至得到选择性或特异性结合物群体。可以对噬菌体基因组中靶向肽插入物的相应DNA进行测序，从而确定肽的氨基酸序列。然后可通过标准蛋白质化学技术产生经鉴定的靶向肽作为合成肽(Arap等，1998a，Smith等，1985)。在一些实施方案中，可以应用减法方案(subtractionprotocol)以进一步降低本底噬菌体结合。减法的目的是从与不是目标耙的靶标结合的文库中去除噬菌体。在替代实施方案中，可针对对照细胞、组织或器官对噬菌体文库进行预篩选。例如，在针对对照正常细胞系对文库进行预筛选后，可以鉴定出肿瘤结合肽。减去以后，可以针对目标分子、细胞、组织或器官筛选出文库。减法方案的其它方法是已知的，可以用于实施要求保护的方法中，例如参见美国专利笫5,840,841、5,705,610、5,670,312和5,492,807号，所述专利通过引用结合到本文中。蛋白质和肽在本文要求保护的方法和组合物的范围内，可以使用各种多肽或蛋白质。在某些实施方案中，蛋白质可包含抗体或含有抗原结合位点的抗体片段。在其它实施方案中，把标(例如P1GF)的短肽配体，可用于各种目的，例如检测细胞、组织或器官中P1GF受体的存在，抑制或阻断P1GF与其受体结合，促进或激活PlGF与其受体结合或者^f莫拟部分P1GF分子或其受体。本文所用的蛋白质、多肽或肽通常是指但不限于大于约200个氨基酸多至自基因翻译的全长序列的蛋白质；大于约IOO个氨基酸的多肽；和/或约3至约100个氨基酸的肽。为了方便起见，术语"蛋白质"、"多肽"和"肽"在本文可互换使用。因此，术语"蛋白质或肽"包括氨基酸序列，所述序列包含天然蛋白质中存在的20种常见氨基酸中的至少一种，或至少一个修饰氨基酸或稀有氨基酸。本文所用的"氨基酸残基"是指本领域已知的任何天然存在的氨基酸、任何氨基酸衍生物或任何氨基酸模拟物。在某些实施方案中，蛋白质或肽残基是连续的，没有任何非氨基酸间插在氨基酸残基序列中。在其它实施方案中，序列可包含一个或多个非氨基酸部分。在具体实施方案中，蛋白质或肽残基序列可以间插一个或多个非氨基酸部分。因此，术语"蛋白质或肽"包括氨基酸序列，该序列包含天然蛋白质中存在的20种常见氨基酸中的至少一种，或者至少一个修饰氨基酸或稀有氨基酸，包括但不限于下表4所列氨基酸。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>表4<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>可采用本领域技术人员已知的任何方法制备蛋白质或肽，所述方法包括通过标准分子生物学技术表达蛋白质、多肽或肽，从天然来源分离出蛋白质或肽，或者化学合成蛋白质或肽。先前已经公开了对应于不同基因(例如P1GF基因)的核苦酸和蛋白质、多肽和肽序列，并且可以在本领域普通技术人员已知的计算机数据库中查询。一个这样的数据库就是国立生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)的Genbank和GenPept数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/)。采用本文所7>开的4支术或本领》或普通才支术人员已知技术，可以扩增和/或表达已知基因的编码区。或者，各种市售的蛋白质、多肽和肽制剂为本领域技术人员所知。肽模拟物多肽制备的另一实施方案是采用肽模拟物。模拟物是含肽分子，其才莫拟蛋白质二级结构组件。参见例如Johnson等，"PeptideTurnMimetics"载于万/(97EC7fiV(9丄(9Gy"AVZ)尸/L4M"CT,Pezzuto等主编，ChapmanandHall,NewYork(1993)，所述文献通过引用结合到本文中。使用肽模拟物的基本原理是，蛋白质肽主链的存在，主要能适应氨基酸侧链，以便于分子的相互作用，例如抗体与抗原的相互作用。预期肽模拟物允许类似于天然分子的分子相互作用。可以采用这些原理来改造第二代分子，所述分子具有本文所公开的结合肽的许多天然特性，但也具有改变或改进的特性，例如通过胃或肠的吸收增加和/或体内稳定性或活性提高。融合蛋白不同实施方案可涉及融合蛋白。这些分子通常具有肽的全部或重要部分，其在N-端或C-端与第二多肽或蛋白质的全部或部分连接。例如，融合可用来自其它物种的前导序列，以便在异源宿主中进行蛋白质的重组表达。另一可用的融合包括加入免疫活性区，例如抗体表位。而另一有用的融合形式可包括连接用于纯化的部分，例如FLAG表位(Prickett等，1989,Wofechm'gwes7:580國589;Castrucci等，1992,JFzra/66:4647-4653)。融合蛋白的制备方法是本领域技术人员熟知的。这些蛋白质可通过如下方式制备例如通过使用双官能交联剂的化学连接，通过从头合成完整的融合蛋白，或者通过将编码第一蛋白质或肽的DNA序列与编码第二肽或蛋白质的DNA序列连接在一起，再进行完整融合蛋白的表达。蛋白质纯化在一些实施方案中，可以分离或純化蛋白质或肽。蛋白质纯化技术为本领域技术人员所熟知。这些技术在一个水平上包括将细胞、组织或器官匀浆并粗略分级分离出多肽和非多肽部分。可以采用层析技术和电泳技术进一步纯化目标蛋白或多肽，达到部分纯化或完全纯化(或者纯化至同质)。特别适于制备纯肽的分析方法是离子交换层析、凝胶排阻层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳、亲和层析、免疫亲和层析和等电聚焦。一个特别有效的肽的纯化方法是快速蛋白液相层析(fplc)或甚至Ahplc。适用于蛋白质纯化的各种技术为本领域技术人员所熟知。这些方法包括例如与硫酸铵沉淀、PEG、抗体等，或者通过热变性，紧接着离心；层析步骤例如离子交换层析、凝胶过滤层析、反相层析、羟磷灰石层析和亲和层析；等电聚焦；凝胶电泳；及这些技术和其它技术的结合。如本领域通常所知，一般认为可以改变各种纯化步骤的操作顺序，或者可以省略某些步骤，仍可得到用于制备基本纯的蛋白质或肽的合适方法。通常不要求总是以最纯状态提供蛋白质或肽。实际上，在某些实施方案中，预期不太纯的产物是有用的。可以用较少的纯化步骤组合，或者采用同一通用纯化流程的不同形式，实现部分纯化。例如，要理解的是，用HPLC仪进行的阳离子交换柱层析，一般导致纯化"倍数"比用低压层析系统相同技术的高。显示纯化程度相对较低的方法，可在蛋白质产物的总回收或者在维持表达蛋白质的活性方面具有优势。亲和层析是依赖于被分离物质与其可特异性结合分子之间的特异性亲和力的层析方法。这是一种受体-配体类型的相互作用。通过将结合配偶体之一与不溶性基质共价偶联，不溶性基质例如磁珠(Dynal)或琼脂糖凝胶(Sepharose)或交联葡聚糖珠(Pharmacia)，来合成柱材料。然后柱材料能够特异性地吸收溶液中的物质。通过改变条件使得不再结合而洗脱出来(例如pH、离子强度、温度等改变)。基质应该是本身不以任何显著程度吸收分子并且具有大范围的化学、物理和热稳定性的物质。配体应该以不影响其结合性能的方式偶联。配体还应该冲是供相对牢固的结合。而且应该可以洗脱出物质而又不石皮坏样品或配体。合成肽按照常规技术，可以在溶液中或在固相支持体上，合成完整或部分的蛋白质或肽。各种自动合成仪是市售的，可按照已知方案来使用。参见例如Stewart和Young,(1984,尸e;"t/e5>"^^,》，第2版，PierceChemicalCo.);Tam等(1983,J.C/zew.Soc,105:6442);Merrifield(1986，Sc/e"ce,232:341-347);和Barany和Merrifield(1979,尸e/7"cfes,Gross和Meienhofer主编，AcademicPress,NewYork,第l-284页)。按照这些方法，可以容易地合成通常约6至约35-50个氨基酸的短肽序列。或者，可以采用重组DNA技术，其中将编码目标肽的核苷酸序列插入表达载体中，转化或转染到合适宿主细胞内，并在适于表达的条件下进行培养。抗体不同实施方案可涉及靶标的抗体配体(例如抗P1GF抗体)。本文所用的术语"抗体"是指具有抗原结合区的抗体样分子，包括抗体片段，例如Fab'、Fab、F(ab')2、单域抗体(DAB)、Fv、scFv(单链Fv)等。各种基于抗体的构建体和片段的制备和使用技术是本领域众所周知的。抗体的制备和表征方法也是本领域众所周知的(参见例如Harlowe和Lane,1988,/4础h^es:jZ^ora〖or少Af朋wa/,ColdSpringHarborLaboratory)。所用的抗体也可以是市售的，得自各种已知来源。例如，各种分泌抗体的杂交瘤系可得自美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,ATCC,Manassas,VA)。多克隆抗体可以通过用免疫原免疫动物，从免疫动物中收集抗血清，来制备多克隆抗体。许多动物物种可用于产生抗血清。通常用于产生抗血清的动物为非人类动物，例如兔、小鼠、大鼠、仓鼠、猪或马。因为兔的血量相对较大，所以兔是产生多克隆抗体的优选选择。可以采用常规免疫技术制备多克隆和单克隆抗体。可以用含有抗原表位的组合物免疫一种或多种实验动物，例如兔或小鼠，然后用来继续产生特异性抗体。在抗体产生的许可时间之后，只要通过给动物放血，从全血中制备血清样品，便可获得多克隆抗血清。给定的组合物可以改变其免疫原性。因此，加强宿主免疫系统常常是必需的，因为可通过将免疫原与载体偶联获得。示例性和优选的载体是匙孔血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)。其它白蛋白例如卵清蛋白、小鼠血清白蛋白或兔血清白蛋白也可以用作载体。将抗原与载体蛋白缀合的方法是众所周知的，包括交联剂例如戊二醛、间马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯、碳二亚胺和双重氮联苯胺(bis-biazotizedbenzidine)。可以通过使用免疫应答的非特异性刺激物(称为佐剂)，增强具体免疫原组合物的免疫原性。示例性和优选的佐剂包括完全弗氏佐剂(Freund'sadjuvant)(—种含有杀死结核分支杆菌(A^co6a"ehwwrt^wcw/o^O的免疫应答非特异性刺激物)、不完全弗氏佐剂和氢氧化铝佐剂。用于产生多克隆抗体的免疫原组合物的量随免疫原的性质以及用来免疫的动物而变化。可采用多种途径给予免疫原(皮下、肌内、真皮内、静脉内和腹膜内)。可在免疫之后不同时间点上采集免疫动物血样而监测多克隆抗体的产生。还可给予第二次(加强)注射。重复加强和滴定过程直到达到合适滴度。当获得所需的免疫原性水平时，可给免疫动物放血，分离并保存血清，和/或动物可用来产生单克隆抗体。单克隆抗体通过应用众所周知的技术(例如美国专利4,1%,265中所例举的技术)，可容易地制备单克隆抗体。通常这种技术包括用选定的免疫原组合物免疫合适的动物。按有效刺激抗体产生细胞的方式给予免疫组合物。优选得自啮齿动物(例如小鼠和大鼠)的细胞。更优选小鼠，最优选BALB/c小鼠，因为这是最常用的，一般提供较高百分比的稳定融合物。免疫后，筛选可产生抗体、具体地讲B淋巴细胞(B细胞)的体细胞，用于mAb产生方法。可以从脾、扁桃腺或淋巴的活检组织中，或者从外周血样品中得到这些细胞。优选脾细胞和外周血细胞，后者则是因为外周血易于获得。通常免疫一组动物，取出具有最高抗体滴度的动物脾脏，脾脏用注射器匀浆，获得脾淋巴细胞。通常得自免疫小鼠的脾大约含有5x107-2x108个淋巴细胞。然后，将得自免疫动物的产生抗体的B淋巴细胞与无限增殖化骨髓瘤细胞融合，一般该细胞与被免疫的动物是同一物种。适用于杂交瘤生成融合物方法的骨髓瘤细胞系优选不产生抗体，具有高融合效率，因酶缺陷故不能在仅供所需要的融合细胞(杂交瘤)生长的特定选择性培养基中生长。可以使用本领域技术人员已知的多种骨髓瘤细胞的任一种。例如，如果免疫动物是小鼠，则可以使用P3-X63/Ag8、P3-X63-Ag8.653、NSl/l.Ag41、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC國ll、MPC11-X45-GTG1.7和S194/5XX0Bul;对于大鼠，则可以使用R210.RCY3、Y3-Ag1.2.3、IR983F和48210;U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2和UC729-6也都可用于与细胞融合。抗体生成脾细胞或淋巴结细胞与骨髓瘤细胞杂合的产生方法通常包括将体细胞与骨髓瘤细胞按比率2:1相混合，在促进细胞膜融合的一种或多种成分(化学或电)存在下，所述比率可分别在约20:1至约1:1间变化。有文献记载了用仙台病毒和用聚乙二醇(PEG)的融合方法，例如37。/。(体积/体积)PEG。采用电诱导融合方法也是适合的。在低频度下(大约lxlO-s至lxl(T8),融合方法通常产生活的杂合体。然而，这并不构成问题，因为通过在选择性培养基中培养，的未融合骨髓瘤细胞)区分开来。选择性培养基一般是含有阻断组织培养基中核香酸从头合成的药剂的培养基。示例性和优选的药剂为M蝶呤、甲氨蝶呤和重氮丝氨酸。氨基蝶呤和甲氨蝶呤阻断嘌呤和嘧啶从头合成，而重氮氨基酸仅阻断噪呤合成。如果使用氨基蝶呤或甲氨蝶呤，则培养基补充次黄噤呤和胸苷作为核苷酸来源(HAT培养基)。如果使用重氮丝氨酸，则培养基补充次黄嘌呤。优选的精选培养基^HAT。仅能够进行核苷酸补救途径的细胞能够在HAT培养基中存活。骨髓瘤细胞缺少补救途径的关键酶，例如次黄噪呤-畴酸核糖转移酶(HPRT)，因此他们不能存活。B细胞可以进行该途径，但是它们在培养中的寿命有限，一般两周内死亡。因此，仅可在选择性培养基中存活的细胞是由骨髓瘤和B细胞形成的杂合细胞。这种培养提供一群杂交瘤，从中筛选特异性杂交瘤。通常在微量滴定板中通过单克隆稀释培养细胞后，检测符合所需反应性的单克隆的上清液(约2-3周后)，进行杂交瘤的筛选。该测定应该是灵敏、简易和快速的，例如放射免疫测定、酶免疫测定、细胞毒性测定、噬菌斑测定、免疫酶斑测定等等。然后，将选出的杂交瘤连续稀释，克隆成单种抗体产生细胞系，然后将该克隆无限繁殖以提供mAb。可以两种基本方式利用细胞系产生mAb。可将杂交瘤样品注射到组织相容性动物类型体内(通常为腹膜腔内)，该类型的动物用来提供最初融合的体细胞和骨髓瘤细胞。经注射动物出现分泌由融合杂合细胞产生的特异性单克隆抗体的肿瘤。然后，可以放出动物体液(例如血清或腹水)以提供高浓度的mAb。也可以体外培养单个细胞系，其中mAb自然分泌到培养基中，从培养基中可容易地获得高浓度的mAb。如有需要，可以用过滤、离心和各种层析方法(例如HPLC或亲和层析)，对由两种方法产生的mAb进行进一步纯化。抗体片段的产生要求保护的方法和/或組合物的某些实施方案可涉及抗体片段。这类抗体片段可用常规方法由胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化完整抗体而获得。例如，抗体片段可通过将抗体用胃蛋白酶酶促切割而得到，以提供5S片段(称为F(ab')2)。该片段还可用巯基还原剂切割，并且任选使用针对二硫键断裂得到的巯基的封闭基团，以产生3.5SFab'单价片段。或者，用胃蛋白酶的酶促切割产生两个单价Fab片段和一个Fc片段。抗体片段的示例性制备方法^^开于美国专利第4,036,945号；美国专利第4,331,647号；Nisonoff等，1960,Arch.Biochem.Biophys.,89:230;Porter,1959,Biochem.J.,73:119;Edelman等，1967,METHODSINENZYMOLOGY,第422页(AcademicPress)和Coligan等(编著)，1991,CURRENTPROTOCOLSINIMMUNOLOGY,(JohnWiley&Sons)。也可釆用切割抗体的其它方法，例如分离重链以形成单价轻链-重链片段、进一步切割片段或其它酶促、化学或遗传技术，只要片段能结合被完整抗体识别的抗原。例如，Fv片段包括VH和Vi链的締合。该締合可以是非共价的,参见Inbar等，1972，Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA,69:2659。或者，可变链可以由分子间二硫4定连接或由化学试剂(例如戊二醛)交联。参见Sandhu,1992,Crit.Rev.Biotech.，12:437。优选Fv片段包含由肽接头连接的VH链和Vt链。通过构建包含DNA序列的结构基因，制备这些单链抗原结合蛋白(sFv)，所述DNA序列编码VH区和VL区，这两区由寡核普S臾接头序列连接。将结构基因插入到表达载体中，随后导入宿主细胞例如大肠杆菌内。重组宿主细胞合成单一多肽链，其具有接头肽连接两个V区。sFv的制备方法是本领域众所周知的。参见Whitlow等，1991,Methods:ACompaniontoMethodsinEnzymology2:97;Bird等，1988,Science,242:423;美国专利第4,946,778号；Pack等，1993,Bio/Technology,11:1271和Sandhu，1992,Crit.Rev.Biotech.,12:437。另一形式的抗体片段是编码单个互补决定区(CDR)的肽。通过构建目标抗体CDR的编码基因可以得到CDR肽("最小识别单元")。通过例如用聚合酶链式反应，由抗体生成细胞的RNA合成可变区，来制备这类基因。参见La订ick等，1991,Methods:ACompaniontoMethodsinEnzymology2:106;Ritter等(编著)，1995,MONOCLONALANTIBOD正S:PRODUCTION,ENGINEERINGANDCLINICALAPPLICATION,第166-179页(CambridgeUniversityPress);Birch等(编著)，1995,MONOCLONALANTIBODIES:PRINCIPLESANDAPPLICATIONS,第137-185页(Wiley-Liss,Inc.)。嵌合抗体和人源化抗体嵌合抗体是其中人抗体可变区被例如抗P1GF小鼠抗体可变区，包括小鼠抗体的互补决定区(CDR)置换的重组蛋白。当给予受试者时，嵌合抗体表现出免疫原性降低，稳定性增加。嵌合抗体的构建方法是本领域众所周知的(例如Leung等，1994,Hybridoma13:469)。可以使嵌合单克隆抗体人源化，即通过将来自小鼠免疫球蛋白重链和轻链可变区的小鼠CDR转移到人抗体相应可变区。嵌合单克隆抗体中的小鼠构架区(FR)也用人FR序列置换。为了保持人源化单克隆的稳定性和抗原特异性，一种或多种人FR残基可以用小鼠相应残基置换。人源化单克隆抗体可用于患者的治疗性治疗。通过选择性修饰CDR序列也可提高人源化抗体对耙标的亲和性(W00029584A1)。产生人源化单克隆抗体的技术是本领域众所周知的。(参见例如Jones等,1986,Nature,321:522;Riechmann等，Nature,1988,332:323;Verhoeyen等，1988,Science,239:1534;Carter等,1992,Proc.Nat'lAcad.Sci.USA,89:4285;Sandhu,Crit.Rev.Biotech.,1992,12:437;Tempest等，1991,Biotechnology9:266;Singer等，J.I薩un.,1993,150:2844)。其它实施方案可涉及非人类灵长类抗体。在狒狒中产生治疗用抗体的通用技术可参见例如Goldenberg等，WO91/11465(1991)和Losman等，Int.J.Cancer46:310(1990)。在另一个实施方案中，抗体可以是人单克隆抗体。这类抗体得自已经过改造、在响应抗原性攻击时产生特定人抗体的转基因小鼠。在该项技术中，将人重链和轻链基因座元件导入源自胚胎干细胞系的小鼠品系中，该类胚胎干细胞系含有定向破坏的内源重链和轻链基因座。转基因小鼠可合成对人抗原具有特异性的人抗体，而且小鼠可用于产生分泌人抗体的杂交瘤。从转基因小鼠获得人抗体的方法参见Green等，NatureGenet.7:13(1994),Lonberg等，Nature368:856(1994)和Taylor等，Int.Immun.6:579(1994)。人抗体用组合方法或经人免疫球蛋白基因座转化的转基因动物来产生完整人抗体的方法是本领域已知的(例如Mancini等，2004,WewA/,'cra6/0/.27:315-28;Conrad和Scheller,2005,ComZ).C&m.招g/jr/2rawg/戸fScree".8:117-26;Brekke禾口Loset,2003,Cwn*.尸/wmaco/.3:544-50;所述各文献通过引用结合到本文中)。与嵌合抗体或人源化抗体相比，这样的完整人抗体有望表现出更少的副作用，并且基本象内源性人抗体一样在体内起作用。在某些实施方案中，要求保护的方法和过程可使用通过这类技术而产生的人抗体。在一个替代方案中，如上所述的噬菌体展示技术可用于产生人抗体(例如Dantas-Barbosa等，2005，Ge"ef.A/o/.ie义4:126-40,所述文献通过引用结合到本文中)。人抗体可以由正常人或表现出特定疾病状态(例如癌症)的病人产生(Dantas-Barbosa等，2005)。由患病个体来构建人抗体的优点是循环抗体库(circulatingantibodyrepertoire)可偏向4十只于疾病相关抗原的抗体。在该方法的一个非限制性实例中，Dantas-Barbosa等(2005)构建了来自骨肉瘤患者的人Fab抗体片段的噬菌体展示文库。一般来说，总RNA得自循环血淋巴细胞(出处同上)。从ja、Y和K链抗体库克隆重组Fab库，并将其插入噬菌体展示文库(出处同上)。采用针对重链和轻链免疫球蛋白序列的特定引物，将RNA转化为cDNA并用于制备FabcDNA文库(Marks等，1991，/Mo/.说o/.222:581-97,所述文献通过引用结合到本文中)。按照以下文献所述方法构建文库Andris-Widhopf等(2000,载于P/2ageD/'5/7/a;;丄Worato^yA/am^r/,Barbas等(主编)，第l版,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY第9.1-9.22页，所述文献通过引用结合到本文中)。最终Fab片段用限制性内切核酸酶消化，插入到噬菌体基因组中，制备噬菌体展示文库。这样的文库可以用如上所述的标准噬菌体展示方法来筛选。技术人员应了解该技术仅仅是示例性的，可以使用任何通过噬菌体展示来制备和筛选人抗体或抗体片段的已知方法。在另一替代方案中，使用如上所述的标准免疫方案，经基因工程改造以产生人抗体的转基因动物可用于产生针对几乎任何免疫原性靶标的抗体。这类系统的非限制性实例是来自Abgenix(Fremont,CA)的XenoMouse⑧(例如Green等，1999,丄/mw训o/.A/"/od231:11-23,所述文献通过引用结合到本文中)。在XenoMouse⑧和类似动物中，小鼠抗体基因已经被钝化并被功能性人抗体基因取代，而小鼠免疫系统的其余部分仍保持完整。用种系配置的YAC(酵母人工染色体)转化XenoMouse⑧，所述YAC含有部分人IgH和IgK基因座，包含大部分可变区序列、辅助基因和调节序列。人可变区库可用于产生能产生抗体的B细胞，所述细胞可用已知^支术加工成杂交瘤。用靶抗原免疫的XenoMouse⑧将通过正常免疫应答产生人抗体，可以收获这类抗体和/或通过如上所述的标准技术来制备。XenoMouse⑧的各种品系都是可得的，它们每个都能产生不同类别的抗体。这类人抗体可以通过化学交联或其它已知方法与例如P1GF配体偶联。转基因产生的人抗体已经显示出具有治疗潜力，同时又保留正常人抗体的药代动力学特性(Green等，1999)。技术人员应了解的是，要求保护的组合物和方法不限于使用XenoMouse系统，也可使用经基因工程改造产生人抗体的任何转基因动物。双特异性抗体和缀合物在某些实施方案中，本文所公开的P1GF配体可与另一个连接配体的分子联合使用。连接可以是共价或非共价的。在一些实施方案中，P1GF配体可与双特异性抗体连接，双特异性抗体即具有两个不同结合部位的抗体，一个用于P1GF配体，另一个用于疾病相关靶抗原。可以靶向任何与血管生成、癌症、转移或细月包移动相关的疾病或病症，包括但不限于原发性癌、转移癌、增生、类风湿性关节炎、炎性肠病、节段性回肠炎、溃病性结肠炎、结节病、哞喘、水肿、肺动脉高压、肿瘤的形成与发展组织、牛皮癣、糖尿病性视网膜病、黄斑变性、角膜移植排斥、新生血管性青光眼、心肌血管生成、斑块新血管形成、再狭窄、血管创伤后新内膜形成、毛细管扩张、血友病性关节、血管纤维瘤、慢性炎症相关的纤维化、肺纤维化、深部静脉血栓形成和伤口肉芽形成。双特异性抗体和多特异性抗体的构建和使用方法公开于例如2004年2月11日申请的美国专利申请7>布号20050002945，该申请的全部内容通过引用结合到本文中。既然双特异性抗体部分把向肿瘤相关抗原，因此预期可如此耙向任何类型的肺瘤和任何类型的肺瘤抗原。可^^皮耙定胂瘤的示例性的类型包括急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞性白血病、胆管癌、乳腺癌、宫颈癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、结肠直肠癌、子宫内膜癌、食管癌、胃癌、头颈部癌、霍金奇淋巴瘤(Hodgkin'slymphoma)、肺癌、甲状腺髓质癌(medullarythyroid)、非霍金奇淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、神经胶质瘤、黑素瘤、肝癌、前列腺癌和膀胱可以被靶定的胂瘤相关抗原包括但不限于A3、A33抗体特异性抗原、BrE3-抗原、CD1、CDla、CD3、CD5、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD45、CD74、CD79a、CD80、HLA國DR、NCA95、NCA90、HCG及其亚基、CEA(CEACAM-5)、CEACAM-6、CSAp、EGFR、EGP-1、EGP曙2、Ep-CAM、Ba733、HER2/neu、低氧诱导因子(HIF)、KC4-抗原、KS-l-抗原、KSl-4、Le-Y、巨噬细胞抑制因子(MIF)、MAGE、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、PAM曙4-抗原、PSA、PSMA、RS5、SIOO、TAG-72、p53、生腱蛋白、IL-6、IL-8、胰岛素生长因子-1(IGF-1)、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、肿瘤坏死抗原、VEGF、17-lA-抗原、血管生成标记(例如ED-B纤连蛋白)、癌基因标记、癌基因产物和其它肿瘤相关抗原。目前对肿瘤相关抗原的报道包括Mizukami等(2005,AtowreAfW.11:992-97);Hatfield等(2005,Cw厅.Ca"cwZ>wg7^ge"5:229-48);Vallbohmer等(2005，丄C//".0"co/.23:3536-44)和Ren等(2005,v4朋.Swrg.242:55-63),所述各文献通过引用结合到本文中。可以使用各种重组方法产生双特异性抗体和抗体片段。例如，双特异性抗体和抗体片段可在转基因家畜乳汁中产生(参见例如Colman,A.,Biochem.Soc.Symp.,63:141-147,1998;美国专利第5,827,690号，所述各文献通过引用结合到本文中)。制备两个DNA构建体，分别含有编码成对免疫球蛋白重链和轻链的DNA节段。将该片段克隆到表达载体中，该表达载体含有在乳腺上皮细胞中优先表达的启动子序列。实例包括但不限于得自兔、牛和绵羊酪蛋白基因、牛a-乳球蛋白基因、绵羊P-乳球蛋白基因和小鼠乳清酸性蛋白基因的启动子。优选插入片段在其3'侧与得自乳腺特异性基因的同源基因组序列连接。这就提供了聚腺苷酸化位点和转录稳定序列。将表达盒共注射入哺乳动物受精卵的前核，然后将卵植入雌性接受者子宫，使之孕育。出生后，通过DNA分析，筛选出存在两个转基因的子代。为了抗体存在的目的，重链和轻链两个基因必须在同一细胞中同时表达。用本领域已知的标准免疫方法，分析得自转基因雌性动物乳汁的抗体或抗体片段的存在和功能。用本领域已知的标准方法从乳汁中纯化出抗体。预寻把(Pre-Targeting)使用双特异性抗体的一个策略包括预寻草巴方法，其中在给予患者双特异性抗体后，给予患者效应分子，例如抗血管生成或抗肺瘤P1GF配体。包括一个P1GF配体结合部位和一个患病组织结合部位的双特异性抗体，定位到患病组织上，并且增加效用分子P1GF配体定位到患病组织上的特异性(美国专利申请号20050002945)。因为效应分子可以比双特异性抗体更快地从循环中清除，所以使用该预寻靶方法与如果效应分子与疾病寻靶抗体直接连接相比，则正常组织暴露在效应分子的情况减少。已经开发出增加检测剂或治疗药物的靶:本底比率的预寻耙方法。预寻耙和生物素/抗生物素蛋白方法的实例参见例如Goodwin等，美国专利第4,863,713号；Goodwin等,J.Nucl.Med.29:226，1988;Hnatowich等，J.Nucl.Med.28:1294，1987;Oehr等,J.Nucl.Med.29:728，1988;Klibanov等，J.Nucl.Med.29:1951，1988;Sinitsyn等，丄Nucl.Med.30:66,1989;Kalofonos等，J.Nucl.Med.31:1791，1990;Schechter等，Int.J.Cancer48:167,1991;Paganelli等，CancerRes.51:5960，1991;Paganelli等，Nud.Med.Commim.12:211，1991;美国专利第5,256,395号；Stickney等，CancerRes.51:6650，1991;Yuan等，CancerRes.51:3119,1991;美国专利第6,077,499号；美国顺序号09/597,580;美国顺序号10/361,026;美国顺序号09/337,756;美国顺序号09/823,746;美国顺序号10/116,116;美国顺序号09/382,186;美国顺序号10/150,654;美国专利第6,090,381号；美国专利第6,472,511号；美国顺序号10/114,315;美国临时申请号60/386,411;美国临时申请号60/345,641;美国临时申请号60/3328,835;美国临时申请号60/426,379;美国顺序号09/823，746;美国顺序号09/337,756;和美国临时申请号60/342，103，所有这些文献通过引用结合到本文中。在某些实施方案中，双特异性抗体和可寻耙构建体可用于治疗正常或患病的组织和器官和/或使之成像，例如使用方法参见美国专利号6,126,916、6,077,499、6,010,680、5,776,095、5,776,094、5,776,093、5,772,981、5,753,206、5,746,996、5,697,902、5,328,679、5,128,119、5,101,827和4,735,210,所述各专利通过引用结合到本文中。其它方法参见1999年6月22日申请的美国申请顺序号09/337,756和2001年4月3日申请的美国申请顺序号09/823,746。寻把肽在其它实施方案中，肽P1GF配体例如BP-1、BP-2、BP-3或BP-4可以用作寻靶肽以将一种或多种药剂递送给患病组织。在这种情况下，药物可以与P1GF结合肽共价或非共价连接。可能使用的药剂包括药物、前药、毒素、酶、寡核苷酸、放射性同位素、免疫调节剂、细胞因子、激素、结合分子、脂质、多聚物、胶束、脂质体、纳米粒子或其组合。示例性的治疗药物和使用方法参见美国专利公布号20050002945、20040018557、20030148409和20050014207，所述各专利通过引用结合到本文中。在示例性实施方案中，有用的药物可包含一种或多种以下药物aplidin、阿扎立平、阿那曲唑、氮杂胞苷、博来霉素、硼替佐米、苔藓抑素-1、白消安、加利车霉素(calicheamycin)、喜树碱、10-羟基喜树碱、卡莫司汀、西乐葆、苯丁酸氮芥、顺铂、伊立替康(CPT-11)、SN-38、卡铂、克拉曲滨、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴溱、多西他赛、放线菌素D、葡糖苷酸道诺霉素、柔红霉素、地塞米松、己烯雌酚、多柔比星、2-二氢吡咯多柔比星(2P-DOX)、氰基吗啉代多柔比星、葡糖苷酸多柔比星、葡糖苷酸表柔比星、炔雌醇、雌莫司汀、依托泊苷、葡糖苦酸依托泊苷、磷酸依托泊芬、氟尿香(FUdR)、3',5'-0-二油酰基-FudR(FUdR-do)、氟达拉滨、氟他胺、氟尿嘧啶、氟曱睾酮、吉西他滨、己酸羟孕酮、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、L-天冬酰胺酶、亚叶酸、洛莫司汀、氮芥、醋酸甲羟孕酮、醋酸曱地孕酮、美法仑、巯基噪呤、6-巯基噪呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、普卡霉素、丝裂霉素、米托坦、丁酸苯酯、泼尼松、丙卡巴肼、紫杉醇、喷司他丁、PSI-341、司莫司汀、链佐星、他莫昔芬、紫杉烷类、泰素、丙酸睾酮、沙利度胺、硫鸟嘌呤、塞替派、替尼泊苷、托泊替康、乌拉莫司汀、velcade、长春碱、长春瑞滨、长春新碱、蓖麻毒蛋白、相思毒蛋白、核糖核酸酶、onconase、rapLRl、脱氧核糖核酸酶I、葡萄^求菌肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、gelonin、白喉毒素、假单胞菌外毒素、假单胞菌内毒素、反义寡核苦酸、干扰RNA或其组合。适体在某些实施方案中，有用的P1GF配体可以适体。构建和测定适体结合特性的方法是本领域众所周知的。例如，这类技术参见美国专利第5,582,981、5,595,877和5,637,459号，所述各专利通过引用结合到本文中。可用包括合成、重组和纯化方法在内的任何已知方法制备般而言，最少需要约3个核苷酸、优选至少5个核苷酸以达到特异性结合。可以使用序列短于10个石成基的适体，优选IO、20、30或40个核苷酸的适体。适体需含有赋予结合特异性的序列，但也可以用侧翼区来延伸，或者可以用其它方式衍生。在优选的实施方案中，适体的P1GF结合序列可以邻接引物结合序列，以便用PCR或其它扩增技术促进适体扩增。在另一个实施方案中，侧翼序列可包含这样的特定序列该序列优先识别或结合一个部分，使适体更牢固地固定在基体上。适体可以作为常规DNA或RNA分子进行分离、测序和/或扩增或合成。或者，目标适体可包含经修饰的寡聚体。适体中通常存在的任何羟基都可被膦酸酯基、磷酸酯基取代，被标准保护基保护起来，或者被活化以便与其它核苷酸额外连接、或者可以与固体支持物缀合。一种或多种磷酸二酯键可以被其它连接基团置换，例如P(O)O寻皮以下基团置4奐P(O)S、P(0)NR2、P(O)R、P(O)OR'、CO或CNR2，其中R^JH或烷基(1-20C)，而R'是烷基(1-20C);另外，该基团可通过O或S与相邻核苷酸连接。寡聚体中并非所有连接都要相同。在本发明测定特异性结合序列方法中用作原料的适体可以是单链或双链DNA或RNA。在一个优选的实施方案中，序列是单链DNA，对核酸酶降解比RNA较不敏感。在优选的实施方案中，起始适体含有随机序列部分，一^:包括约10-400个核苷酸，更优选20-100个核苷酸。随机序列邻接引物序列，该引物序列使得与輩巴结合适体扩增。为了合成随机区，在合成中，可在需要随机化的位置加入核普酸混合物。能结合特定目标靶的适体的制备和篩选方法是众所周知的，例如美国专利第5,475,096号和美国专利第5,270,163号，各专利通过引用结合到本文中。该技术通常包括从候选适体混合物中进行选择并逐步重复结合，将结合的适体与未结合适体分离开来并扩增。因为在混合物中，对应于最高亲和力适体来说只有少量序列(可能仅有一分子适体)存在，通常需要设定划分标准，使得在分离期间，混合物中大量的适体(约5-50%)保留下来。每轮都浓缩了对靶标具有高亲和性的适体。可重复3-6轮选择和扩增循环，以产生能以高亲和力和高特异性结合靶标(例如P1GF)的适体。疾病组织检测、诊断和成〗象的方法基于蛋白质的体外诊断本发明提供使用包括P1GF结合肽、P1GF融合蛋白、P1GF抗体或片段、双特异性抗体和抗体片段在内的P1GF配体，体外和/或体内筛选生物样品P1GF抗原的存在。在示例性免疫测定中，P1GF抗体、融合蛋白或其片段可用于如下所述的液相中或结合到固相载体上。在优选的实施方案中，特别是包括体内给其片段是人源化的。另优选P1GF抗体或其片段是完全人P1GF抗体。还优选P1GF融合蛋白包含人源化P1GF抗体或完全人P1GF抗体。本领域技术人员应当了解的是，已知多种技术用于测定特定基因的表达水平，可以采用任何这类已知方法，例如免疫测定、RT-PCR、mRNA纯化和/或cDNA制备，然后通过与基因表达测定芯片杂交，可以用来测定个体患者和/或组织中P1GF的表达水平。用于确定生物样品中是否含有P1GF抗原的筛选方法的一个实例是放射免疫测定(RIA)。例如在RIA的一种类型中，在放射性标记的P1GF抗原存在下，将待测物质与PlGFMab混合。在这一方法中，测试物质的浓度与结合到MAb的标记PlGF抗原的量成反比，并且与游离的标记P1GF抗原的量正相关。其它合适的筛选方法对于本领域的技术人员而言是极其显而易见的。或者，可以进行体外测定，其中P1GF配体、抗P1GF抗体、融合蛋白或其片段与固相载体结合。例如，为了将MAb与不溶性支持体(例如多聚物包被的小珠、板或管)连接，可将MAb与多聚物(例如氨基葡聚糖(aminodextran))连接。可用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定生物样品中P1GF抗原的存在。在直接竟争ELISA中，将纯或半纯的抗原制剂与不溶于流体或待测细胞提取物的固相支持体结合，加入一定量可检测标记过的可溶性抗体、抗体片段或P1GF配体，以检测和/或定量测定固相抗原与标记P1GF结合分子之间所形成的二元络合物。夹心ELISA需要少量的抗原，该测定法不需要抗原充分纯化。因此，对于检测临床样品抗原的直接竟争ELISA,优选用夹心ELISA。参见例如Field等，4:1463(1989);Spandidos等，^""Ootc^^m.9:821(1989)。在夹心ELISA中，一些未标记的MAb或抗体片段("捕获抗体")与固相支持体结合，使得试验样品与捕获抗体接触，加入一些可检测标记过的可溶性抗体(或抗体片段)，以检测和/或定量测定捕获抗体、抗原与标记抗体间所形成的三元络合物。抗体片段是抗体的组成部分，例如F(ab')2、F(ab)2、Fab'、Fab等。在本文中，抗体片段是与P1GF抗原表位结合的P1GFMAb的组成部分。术语"抗体片段"还包括任何合成或基因改造的、像抗体一样通过与特异性抗原结合形成复合物而起作用的蛋白质。例如，抗体片段包括由轻链可变区组成的分离片段、由重链和轻链可变区组成的"Fv"片段和其中轻链和重链可变区通过狀接头连接的重组单链多肽分子。抗体融合蛋白是经重组产生的抗原结合分子，其中两个以上相同或不同的特异性的相同或不同的单链抗体或抗体片段节段连接。融合蛋白可包含单个抗体组分、不同抗体组分的多价或多特异性组合或相同抗体组分的多个拷贝。融合蛋白还可包含与诊断/检测和/或治疗药剂缀合的抗体或抗体片段。术语P1GF抗体包括人源化抗体、人抗体、鼠抗体、其抗体片段、免疫缀合物及其片段和抗体融合蛋白及其片段。实施夹心ELISA的方法是众所周知的。参见例如Field等，出处同上；Spandidos等，出处同上；Moore等，"Twin-SiteELISAsforfosandmycOncoproteinsUsingtheAMPAKSystem"，载于METHODSINMOLECULARBIOLOGY,第10巻，第273-281页(TheHumanaPress,Inc.1992)。技术人员应当了解的是，可以通过用PIGF配体替换第一未标记抗体或第二标记抗体来进行类似于夹心ELISA的测定。在夹心ELISA中，可溶性抗体或抗体片段必需与PIGF表位结合，该表位与由捕获抗体识别的表位不同。可以进行夹心ELISA以确定P1GF抗原是否存在于活检样品中。或者，进行该测定以定量测定存在于体液临床样品中P1GF抗原的含量。可以通过包括稀释纯化PIGF抗原在内的方法进行定量测定。在其它实施方案中，可以采用蛋白质印迹分析检测和定量测定样品中存在的P1GF。该技术一般包含通过以分子量为基础的凝胶电泳，分离样品蛋白质，将分离的蛋白质转移到合适的固相支持体(例如硝化纤维素膜、尼龙膜或衍生化尼龙膜)，使样品与特异性结合PIGF的抗体或配体温育。在固相支持体上抗P1GF抗体或配体与P1GF特异性结合。这些抗体或配体可以是直接标记的，或者可以随后用特异性结合到抗P1GF抗体或配体的经标记的第二抗体检测。P1GF配体、Mab、融合蛋白及其片段也适于制备药盒。这种药盒可包括装栽物，该装载物被分隔成装栽一种或多种包装容器(例如小瓶、管等)的密实空间，各所述包装容器装有免疫测定的单独成分。例如，可能在一种包装容器中装有固定在固相支持体上的捕获抗体，另外的包装容器则装有可检测标记的抗体溶液。此外包装容器可装有包含P1GF抗原连续稀释的标准溶液。P1GF抗原的标准溶液可用来绘制标准曲线，以P1GF抗原浓度为横坐标，以检测信号为纵座标绘制曲线而得。得自含P1GF抗原样品的结果可插入该曲线图中，求出生物样品中P1GF抗原的浓度。还可以用P1GF配体、抗P1GF抗体、融合蛋白及其片l殳才企测由组织样本制备的组织切片中存在的P1GF抗原。可以采用这种原位检测法测定存在的P1GF抗原，并测定P1GF抗原在被检测组织中的分布。可以将可检测标记的P1GF配体或抗体涂在冷冻或石蜡包埋的组织切片上完成原位检测。原位检测的常规技术为本领域普通技术人员所IA^口。参见侈1^口Ponder，"CellMarkingTechniquesandTheirApplication"，载于MAMMALIANDEVELOPMENT:APRACTICALAPPROACH113-38,Monk(编著)(IRLPress1987)和Coligan,第5.8.1-5.8.8页。P1GF配体、抗P1GF抗体、融合蛋白及其片段可以用任何合适的标记部分进行可检测性标记，标记部分例如》文射性同位素、酶、荧光标记、染料、色原体(chromagen)、化学发光标记、生物发光标记或顺磁标记。这些可检测标记P1GF抗体的制备和检测方法为本领域普通技术人员所熟知，下面将详细介绍。标记部分可以是通过使用Y计数器或(3闪烁计数器或者通过放射自显影这类方法检测的放射性同位素。在一个优选的实施方案中，诊断性缀合物是Y辐射同位素、(5辐射同位素或正电子辐射同位素。标记部分是指在预定条件下会产生信号的分子。标记部分的实例包括;故射性同位素、酶、荧光标记、化学发光标记、生物发光标记和顺f兹标记。标记部分与P1GF抗体的结合用本领域的标准技术完成。关于这方面的典型方法参见Kennedy等，Clin.Chim.Acta70:1(1976),Schurs等，Clin.Chim.Acta81:1(1977),Shih等，Int'lJ.Cancer46:1101(1990)。基于核酸的体外诊断在具体实施方案中，可对核酸进行分析以确定P1GF的表达水平，特别是用核酸扩增方法。可以按照标准方法，从生物样品所含细胞中分离出作为才莫板用于扩增的核酸序列(mRNA和/或cDNA)。该核酸可以是分级分离RNA或是完整细胞RNA。如果使用RNA，则可能需要将RNA转化成互补的cDNA。在一个实施方案中，RNA是全细胞RNA,直接用作模板用于扩增。在一个实例中，用本领域已知的任何方法，通过扩增(例如用PCR)P1GFmRNA或cDNA序列，检测和/或定量测定扩增产物，来进行P1GF表达的测定，所述方法包括但不限于TaqMan测定法(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)、琼脂糖或聚丙酰胺凝月交电泳和溴化乙锭染色、与包含P1GF特异性探针的微阵列杂交、RNA印迹法、点渍法、狭线印迹等。各种形式的扩增法是本领域众所周知的，任何这类已知方法都可以使用。一般来说，扩增包括使用与待扩增的靶核酸序列选择性或特异性杂交的一种或多种引物。皿本文定义的术语引物是指包括能够以模板依赖方法引起新生核酸合成的任何核酸。通常，引物是长度为10-20个石tt对的寡核普酸，但是也可采用更长的序列。可以双链或单链形式提供引物，虽然优选单链形式。根据获自标准Watson-Crick碱基配对(即腺噪呤与胸腺嘧啶或尿嘧啶结合，乌噪呤与胞嘧啶结合)的互补序列设计，设计引物的方法是本领域众所周知的。用于筛选和设计扩增引物的计算机程序可从技术人员熟知的商业和/或公共来源获得。已知用于检测P1GF表达的具体引物序歹'K例如Regnault等，2003，J.550:641-56)。技术人员应当了解的是，本文所公开的特异性序列仅是示例性，在实施要求保护的方法时，可以使用其它的引物和/或探针序列。可得到许多模板依赖方法以扩增给定样品中存在的标记序列。最著名的扩增方法之一是聚合酶链式反应(称为PCR),美国专利第4,683，195、4，683,202和4,800,159号中有详细介绍。本发明的一个实施方案可包括从个体获得合适的样品并检测P1GF信使RNA。一旦获得组织样品，则样品可用标准技术(例如细胞分离、外膜消化、mRNA的寡脱氧胸苷酸分离等)制备分离的核酸。还可用本领域已知试剂盒(Pierce，APBiotech等)进行mRNA分离。为了定量测定mRNA的扩增量，可进行反转录酶PCR扩增方法。RNA反转录成cDNA的方法是众所周知的，参见Sambrook等，1989。其它反转录方法利用热稳定DNA聚合酶。可以应用上述体外和原位;险测方法，辅助_珍断病理病症或对病理病症进行疾病分期。例如，这些方法可用来检测表达P1GF抗原的肺瘤，例如转移癌。体内诊断PlGF配体和/或抗体可用于体内诊断。用标记肽或Mab的诊断成像方法是众所周知的。例如，免疫闪烁照相(immunoscintigraphy)技术，P1GF配体或抗体用Y辐射^:射性同位素标记并导入患者体内。用Y照相机检测Y辐射放射性同位素的位置和分布。参见例如Srivastava(编著)，RADIOLABELEDMONOCLONALANTIBODIESFORIMAGINGANDTHERAPY(PlenumPress1988),Chase,"MedicalApplicationsofRadioisotopes，，，载于REMINGTON'S45PHARMACEUTICALSCIENCES,第18版，Gennaro等(编著)，第624-652页(MackPublishingCo.,1990)和Brown，"ClinicalUseofMonoclonalAntibodies"，载于BIOTECHNOLOGYANDPHARMACY227-49,Pezzuto等(编著)(Chapman&Hall1993)。另外优选使用正电子辐射放射性核素(PET同位素)，例如具有511keV的能量，例如氟-18(18F)、镓-68(^Ga)和碘-124(124I)。这类成像可用以下方式进行通过直接标记P1GF配体，或者用预寻耙成像方法(pretargetedimagingmethod),参见Goldenberg等,"AntibodyPretargetingAdvancesCancerRadioimmunodetectionandRadiotherapy,"(提交手牙高)，另参见美国专利/>布号20050002945、20040018557、20030148409和20050014207,所述各文献通过引用结合到本文中。对于诊断成像，可以用中间官能团，使放射性同位素直接或间接与P1GF配体或抗体结合。有用的中间官能团包括螯合剂例如乙二胺四乙酸和二乙烯三胺五乙酸。例如参见Shih等(出处同上和)美国专利号第5,057，313号。递送给患者的放射剂量，通过选择以下方面最佳组合的同位素，尽可能维持在低水平最小半衰期，最小体内滞留和允许检出和准确测量的最低用量的同位素。与P1GF抗体结合并适于诊断成像的放射性同位素的实例包括"m丁c和111111。为了进行体内诊断，P1GF闺己体、抗体、融合蛋白及其片段还可以用顺磁离子和多种放射造影剂标记。特别用于磁共振成像的造影剂包含轧、锰、镝、镧或铁离子。其它造影剂包含铬、铜、钴、镍、铼、铕、铽、钬或钕。P1GF配体、抗体及其片段还可与超声造影/增强剂缀合。例如，一种超声造影剂是包含人源化PlGFIgG或其片段的脂质体。另优选超声造影剂为充气脂质体。在一个优选的实施方案中，双特异性抗体可与造影剂缀合。例如，双特异性抗体可包含用于超声成像的一种以上的图像增强剂。在一个优选的实施方案中，造影剂为脂质体。优选脂质体包含脂质体外表面共价连接的二价DTPA-肽。另更优选脂质体是充气的。显像剂和放射性同位素在某些实施方案中，要求保护的肽或蛋白质可与用于各种患病器官、组织或细胞类型成像和诊断的显像剂连接。许多合适的显像剂为本领域所知，与蛋白质或肽连接的方法一样为本领域所知(参见例如美国专利5,021,236和4,472,509，所述两项专利通过引用结合到本文中)。某些连接方法包括使用金属螯合物，采用例如有机螯合剂(如DTPA)与蛋白质或肽连接(美国专利4,472,509)。蛋白质或肽还可以在偶联剂(例如戊二醛或高碘酸盐)存在下与酶反应。可以在这些偶联剂存在下，或者通过与异硫氰酸盐反应，来制备带有荧光素标记的缀合物。可能用作造影剂的顺磁离子的非限制性实例包括铬(III)、锰(n)、铁(m)、铁(n)、钴(n)、镍(n)、铜(n)、钕(m)、钐(ni)、镱(ni)、钆(in)、钒(n)、铽(m)、镝(in)、钬(m)和铒(m)，特别优选为钆。用于其它方面的离子(例如x光成像)，包括但不限于镧(ni)、金(ni)、铅(n)，尤其为铋(ni)。可能用作显像剂或治疗药物的放射性同位素包括攻211、14碳、51铬、36氯、57钴、58钴、铜62、铜64、铜67、152Eu、氟18、镓67、镓68、3氬、碘123、碘124、碘125、碘"1、铟川、52铁、59铁、32磷、33磷、铼186、铼188、SC47、75硒、银111、35硫、锝941\锝""1、钇86和钇90。1251常常优选用于某些实施方案，锝^m和铟m由于它们的能量低，并适于长期检测故常常也是优选的。可以按照本领域众所周知的方法制备放射性标记的蛋白质或肽。例如，它们可能通过与^典化钠或碘化钾和化学氧化剂(例如次氯酸钠)或者与酶促氧化剂(例如乳过氧化物酶)接触^皮碘化。蛋白质或肽可以通过配体交换法用锝"1示记，例如用锡溶液还原高锝酸酸盐，使还原锝与交联葡聚糖柱螯合，将肽施于该柱上，或者用直接标记技术，例如将高锝酸盐、还原剂(例如SNCl2)、緩冲溶液(例如邻苯二甲酸钠钾溶液)和肽温育。常常用来使以金属离子形式存在的放射性同位素与肽结合的中间官能团包括二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、DOTA、NOTA、吟啉螯合剂和乙二胺四乙酸(EDTA)。供使用的还有荧光标记，包括罗丹明、异硫氰酸焚光素和肾造影剂。在某些实施方案中，要求保护的蛋白质或肽与第二结合配体或与酶(酶标记)连接，所述第二配体和酶在与显色底物接触时会产生有色产物。合适酶的实例包括脲酶、碱性磷酸酶、(辣根)过氧化氢酶和葡糖氧化酶。优选的第二结合配体为生物素和抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白化合物。这类标记的使用为本领域技术人员所熟知，参见例如美国专利3，817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149和4,366,241,所述专利通过引用结合到本文中。这些荧光标记优选用于体外，但是也可以在体内应用时使用，特别是内窺镜法或血管内4企测法。在替代实施方案中，P1GF配体、抗体或其它蛋白质或肽可以用荧光标记做标记。光检测标记的非限制性实例包括Alexa350、Alexa430、AMCA、^J^吖啶、BODIPY630/650、BODIPY650/665、BODIPY-FL、BODIPY曙R6G、BODIPY國TMR、BODIPY-TRX、5-M^-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素、5-氣基-2',4',5',7'-四氯荧光素、5-#絲荧光素、5-欺基罗丹明、6-羧基罗丹明、6-夢媒四甲基氨基、CascadeBlue、Cy2、Cy3、Cy5,6-FAM、丹石黄酰氯、荧光素、HEX、6-JOE、NBD(7-硝基苯并-2-氧杂-l,3-二唑)、OregonGreen488、OregonGreen500、OregonGreen514、PacificBlue、酞酸、对苯二甲酸、异酞酸、曱酚紫(cresylfastviolet)、甲酚蓝紫(cresylblueviolet)、亮甲酚蓝、对氨基苯曱酸、藻红、酞菁、偶氮甲碱、花青、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、牙希土金属穴状4乜合物、三-耳关吡。定二胺铕(europiumtrisbipyridinediamine)、铕穴状化合物或螯合物、二胺、双花青苷、LaJolla蓝色染料、别藻蓝蛋白(allopycocyanin)、别藻蓝蛋白B(allococyaninB)、藻蓝蛋白C、藻蓝蛋白R、硫胺素、藻红青素、藻红蛋白R、REG、罗丹明绿、异石克氰酸罗丹明、罗丹明红、ROX、TAMRA、TET、TRIT(四曱基罗丹明异硫醇)、四甲基罗丹明及德克萨斯红。这些或其它发光标记可获自商业来源例如MolecularProbes(Eugene,OR)。有用的化学发光标记化合物包括氨基苯二酰肼、异氨基苯二酰肼、芳香族吖咬输酯(acridiniumester)、咪唑、吖咬镜和草酸酯，或生物发光化合物例如萤光素、萤光素酶和水母发光蛋白。可在例如手术中、内窥镜检查或血管内肿瘤或疾病诊断中使用诊断性免疫缀合物。在各种实施方案中，有用的标记可包含金属纳米粒子。已经知道纳米粒子的制备方法(参见例如美国专利第6,054，495、6,127,120、6,149,868号；Lee和Meisel,J.尸/z,C力ew.86:3391-3395,1982)。纳米粒子也可购自商业来源(例如NanoprobesInc.,Yaphank,NY;Polysciences,Inc.,Warrington,PA)。改性纳米粒子是市售的，例如得自Nanoprobes，Inc.(Yaphank,NY)的Nanogold⑧纳米粒子。可以购买用于与蛋白质或肽缀合的官能化纳米粒子。交联剂在某些实施方案中，可以使用本领域已知的各种交联剂，来标记蛋白质或肽，所述交联剂例如同型-双官能交联剂、杂双官能交联剂和/或光活化交联剂。这类试剂的非限制性实例包括双亚氨酸酯；1,5-二氟-2,4-(二硝基苯)；辛二酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯；酒石酸二琥珀酰亚胺酯；二甲基-3,3'-二硫-双亚氨丙酸酯；N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯；4-(溴氨基乙基)-2-硝基苯叠氮；和4-叠氮基乙二醛。在一个示例性的实施方案中，碳二亚胺交联剂，例如DCCD或EDC，可用于将酸性残基与氨基或其它基团交联。这些试剂可以被改性以连4妻不同类型的标记，例如荧光标记。双官能交联剂已经广泛用于各种目的。携带两个相同官能团的同型双官能试剂已经证明能高效诱导相同或不同的大分子或大分子亚基间的交联，并将多肽配体与其特异性结合位点连接。杂双官能试剂含有两个不同官能团。通过利用两个不同官能团的不同反应性，可以有选择性地、按顺序控制交联。按官能团的特异性，可将双官能交联剂分为例如氨基、巯基、胍基、口引咮基、羧基特异性基团。其中，针对游离氛基的试剂尤其常用，因为它们是市售的，容易合成，应用时反应条件温和。大部分杂双官能交联剂都含有伯氨基反应基团和巯基反应基团。在另一实例中，描迷了杂双官能交联剂及其使用方法(美国专利5,889,155，所述专利通过引用结合到本文中)。交联剂将亲核酰肼残基与亲电子马来酰亚胺残基连接起来，在一个实例中使醛与游离巯基偶联。这些交联剂可被改性以交联不同官能团。用于克隆、基因转移和表达的载体在某些实施方案中，可以使用表达载体来表达肽或蛋白质，例如融合蛋白，然后再对其进行纯化和使用。在其它实施方案中，表达载体可用于例如基因疗法。表达需要的合适信号是由载体提供的，载体包括各种调节元件，例如来自病毒或哺乳动物来源的增强子/启动子，它们驱动目标基因在宿主细胞中表达。也已知道设计用于使信使RNA在宿主细胞中的稳定性和可翻译性最优化的元件。调节元件术语"表达构建体"或"表达载体"是指包括含有基因产物编码核酸的任何类型的遗传构建体，其中部分或全部核酸编码序列能够被转录。在优选的实施方案中，编码基因产物的核酸处于启动子的转录控制之下。"启动子"是指由细胞合成机器识别、或者被导入合成机器中的DNA^列，是启动基因特异性转录所必需的。术语"处于转录控制之下"是指相对于核酸来说启动子处于控制RNA聚合酶启动和基因表达的正确位置和方向。—般认为用于控制目标核酸序列表达的具体启动子并不重要，只要它能指导核酸在靶细胞中的表达即可。因此当靶向人体细胞时，优选将核酸编码区放置在启动子附近并使之处于启动子控制之下，使其能在人体细胞中表达。一般来说，这类启动子可包括人或病毒启动子。在不同实施方案中，人巨细胞病毒(CMV)即时早期基因启动子、SV40早期启动子、劳斯肉瘤病毒长末端重复序列、大鼠胰岛素启动子和甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子，都可用于得到目标编码序列的高水平表达。也包括使用本领域熟知的其它病毒启动子或哺乳动物细胞启动子或噬菌体启动子，以达到目标编码序列的表达，只要表达水平足以满足特定目的。当使用cDNA插入序列时，通常包含聚腺苷酸化信号，以《I起基因转录物适当聚腺苷酸化。一般认为聚腺苷酸化信号的性质并不是成功实施本发明的关键，可以使用任何的这类序列，例如人生长激素和SV40聚腺苷酸化信号。另外作为表达构建体元件提供的有终止子。这些元件可起到增加信使水平并使从构建体连读到其它序列的作用减到最小。选择标记在某些实施方案中，可通过在表达构建体中包含标记，在体外或体内鉴定含有核酸构建体的细胞。这类标记可以赋予细胞可鉴定的变化，便于鉴定含有表达构建体的细胞。通常所包含的药物选择标记有助于克隆和转化子的选择。例如，赋予以下药物抗性的基因是有用的选择标记新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、零霉素(zeocin)和组氨醇。或者，可以使用酶，例如单纯疱渗病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。也可使用免疫学标记。一般认为所用的选择标记并不重要，只要它能与编码基因产物的核酸同时表达即可。选择标记的其它实例是本领域技术人员熟知的。表达载体的递送有数种可将表达载体导入细胞的方式。在某些实施方案中，表达构建体包括病毒构建体或衍生自病毒基因组的改造构建体。某些病毒通过受体介导的胞吞作用进入细胞后，整合到宿主细胞基因组内，并且稳定和有效地表达病毒基因，病毒的这种能力使得它们成为将外源基因转移到哺乳动物细胞的颇有吸引力的备选方法(Ridgeway，载于Fectowj5Wve_yo/A/o/ecw/arC7謹'wgFectora朋d772e/rRodriguez等编著，Stoneham:Butterworth，第467画492页，1988;Nicolas和Rubenstein,载于F"ectora:爿wrve少o/脂/ecw/arvectorsawe/f/zez>wses,Rodriguez和Denhardt纟扁著,Stoneham:Butterworth,第494-513页，1988;Baichwal和Sugden,1986,载于G騰7>a"<er,KucherlapatiR编著，NewYork,PlenumPress,第117-148页；Temin,载于Gewerra似/er，KucherlapatiR编著,NewYork,PlenumPress,笫149-188页，1986)。优选的基因治疗载体一般为病毒载体。虽然一些可以接受外源基因材料的病毒受它们可容纳核苷酸的数量和它们感染的细胞范围的限制，但是已经证实这些病毒成功地进行基因表达。然而，腺病毒不会将其基因材料整合到宿主基因组内，因此基因表达不需要宿主复制，这使它们非常理想地适用于快速、有效的异源基因表达。制备复制感染病毒的技术是本领域众所周知的。在使用病毒递送系统时，所需要的是充分纯化病毒体，使之基本不含不良污染物，例如干扰缺损病毒颗粒或内毒素和其它致热原，因此在接受载体构建体的细胞、动物或个体中，不会引起任何不良反应。优选的载体纯化方法包括使用浮力密度梯度离心，例如氯化铯梯度离心。用作基因载体的DNA病毒包括乳多空病毒(例如猿病毒40、牛乳头瘤病毒和多瘤病毒)(Ridgeway，1988;Baichwal和Sugden,1986)和腺病毒(Ridgeway，1988;Baichwal和Sugden,1986)。体内递送的一个优选方法包括使用腺病毒表达栽体。虽然已经知道腺病毒载体整合到基因组DNA的能力低，但是这一特性被这些载体提供的基因转移的高效率所抵偿。"腺病毒表达载体"是指包括但不限于含有腺病毒序列的构建体，该腺病毒序列足以(a)支持构建体的包装，和(b)表达克隆到其中的反义或有义多核普酸。复制缺陷型腺病毒载体的产生和繁殖依赖于辅助细胞系(称为293)，该细胞系用Ad5DNA片段从人胚肾细胞转化而得，组成型地表达蛋白E1(Graham等，丄G饥Wra/,36:59-72，1977)。因为腺病毒基因组中的E3区可有可无(Jones和Shenk,Ce〃，13:181-188,1978)，现有腺病毒载体，在293细胞帮助下，在E1区、E3区或两区中携带有夕卜源DNA(Graham和Prevec，载于A/o/ecw/arWo/ogy..Gewe7"ra似/erEx/mswz'o"尸rotoco/,E丄Murmy编著，HumanaPress,Clifton,NJ,7:109-128,1991)。辅助细胞系可衍生自人细胞，例如人胚肾细胞、肌细胞、造血细胞或其它人胚胎间充质细胞或上皮细胞。或者，辅助细胞可衍生自可容许人腺病毒的其它哺乳动物物种的细胞。这些细胞包括例如非洲绿猴肾细胞或其它猴胚胎间充质细胞或上皮细胞。如上所述，优选的辅助细胞系是293。Racher等人(5,'c^c/2"o/ogyrec/2m々wes,9:169-174,1995)公开了培养293细胞和繁殖腺病毒的改进方法。在一个方案中，将单个细胞接种到l升硅化转瓶(Techne，Cambridge,UK)中，转瓶内含有100-200ml培养基，使天然细胞聚合物生长。于40rpm搅拌后，用锥虫蓝评价细胞存活力。在另一个方案中，如下使用Fibra-Cel微载体(BibbySterlin，Stone，UK)(5g/1)。将细胞接种体重新悬浮于5ml培养基中，加到250ml锥形瓶的载体(50ml)中，静置l-4小时，偶尔搅拌。然后培养基用50ml新鲜培养基更换，并开始振荡。对于病毒产生，使细胞生长至约80%汇合，此后更换培养基(至25。/。终体积)，加入MOI为0.05的腺病毒。使培养物静置过夜后，使体积增加至100。/。，再次开始振荡72小时。可由反转录病毒构建其它基因转移载体。反转录病毒是一类单链RN病毒，以在感染细胞中经反转录过程将其RNA转化成双链DNA的能力为特征(Coffin，载于Kra/ogy，Fields等编著，RavenPress,NewYork,第1437-1500页，1990)。所得DNA然后稳定地整合到细胞染色体成为原病毒并指导病毒蛋白的合成。整合导致病毒基因序列保留在受体细胞及其子代中。反转录病毒基因组含有3个基因，即分别分别编码衣壳蛋白、聚合酶和包膜组分的gag、pol和env。gag基因上游存在的序列中含有将基因组包装成病毒体的信号。病毒基因组的5'端和3'端存在2个长末端重复序列(LTR)序列。这些序列含有强启动子和增强子序列，也是整合到宿主细胞基因组所需要的(Coffin，1990)。为了构建反转录病毒栽体，将目标蛋白编码核酸插入病毒基因组替换某些病毒序列以产生复制缺陷型的病毒。为了制备病毒体，构建含有gag、pol和env基因，但却没有LTR和包装组分的包装细胞系(Mann等，Ce〃，33:153-159,1983)。如果重组质粒含有cDNA而且与反转录病毒LTR和包装序列一起导入该细胞系中(通过例如磷酸钩沉淀)，则包装序列使重组质粒的RNA转录物包装入病毒颗粒内，然后病毒颗粒被分泌到培养基中(Nicolas和Rubenstein,1988;Temin,1986;Mann等，1983)。然后收集含有重组反转录病毒的培养基，任选浓缩后，用于基因转移。反转录病毒载体能够感染大量的细胞类型。然而，整合和稳定表达需要宿主细胞分裂(Paskind等,Wra/ogy,67:242-248，1975)。其它病毒载体可用作表达构建体。例如可以使用衍生自以下病毒的载体牛痘病毒(Ridgeway，1988;Baichwal和Sugden，1986;Coupar等，Ge"e，68:1-10,1988)、腺伴随病毒(AAV)(Ridgeway，1988;Baichwal详口Sugden，1986;Hermonat牙口Muzycska，iVaf/.^4c"ciSc/.81:6466-6470，1984)和疱渗病毒。它们为各种哺乳动物细胞提供数个有吸引力的特征(Friedmann,ScZence,244:1275-1281，1989;Ridgeway，1988;Baichwal和Sugden，1986;Coupar等，Ge"e,68:1-10，1988;Horwich等，JWra/.,64:642-650,1990)。药物组合物在一些实施方案中，可将PlGF配体和/或一种或多种其它治疗药物给予患者，例如癌症患者。这样的药物可以药物组合物的形式给予。一般来说，需要制备基本上不含可能对人或动物有害的杂质的组合物。—般可用合适的盐和緩冲剂以提供稳定及可被靶细胞摄取的治疗药物。水性组合物可包含有效量的P1GF结合蛋白或肽，溶解或分散于药学上可接受的载体或水性介质中。术语"药学上或药理学上可接受的"是指当给予动物或人时不会产生毒副、致敏或其它不良反应的分子实体和组合物。本文所用"药学上可接受的载体"包括所有的溶剂、分散介质、包衣材料、抗菌药、抗真菌药、等渗剂和吸收延緩剂等。用于药学活性物质的这些介质和成分的应用是本领域众所其在治疗组合物中应用也都包括在本发明内。补充的活性成分也可掺到组合物中。本文要求保护的方法和组合物可包括典型的药物制剂。可通过任何常用途径给予这些组合物，只要通过该途径可到达耙组织。它包括口服、经鼻、口腔、直肠、阴道或局部。或者，可以通过原位，真皮内、皮下、肌内、腹膜内、鞘内、动脉内或静脉内注射给予。这些组合物通常作为药学上可接受的组合物给予。适于使用的药物形式包括无菌水性溶液或者用于制备无菌溶液或分散体的无菌粉剂。在制备和保存条件下必需是稳定的，并且保存时必需防止微生物(例如细菌和真菌)的污染作用。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)的溶剂或分散介质、其合适的混合物和植物油。可以通过例如使用包衣材料(例如卵磷脂)、在分散体的情况下通过维持所需要的粒径及通过使用表面活性剂，来维持适当的流动性。可以用各种抗菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯类、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等，来防止微生物的作用。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。通过在组合物使用延緩吸收的成分(例如单硬脂酸铝和明胶)，可^f吏组合物的吸收延緩。本领域技术人员应当了解的是，可以通过包括例如口服或胃肠外(例如静脉内)在内的各种途径给予患者药物组合物。在某些情况下，P1GF配体可以露在脂质体表面或者掺入脂质体中。脂质体由石粦脂或其它脂质组成，一般是无毒、生理上可接受的和可代谢的载体，相对易于制备和给药。在某些实施方案中，必需给予患者有效量的治疗药，例如P1GF配体。"有效量，，是产生所需作用的药物剂量。有效量将取决于例如药物的功效和所需效果。例如，治疗增生性疾病(例如黄斑变性或子宫内膜异位症)可能需要较少量的抗血管生成药，相比之下，癌症治疗则需要更大用量，以减少或消除实体瘤，或者防止或减少其转移。可用本领域众所周知的方法，确定用子特定目的具体药物的有效量。治疗药物化疗药物在某些实施方案中，化疗药物可与一种或多种抗血管生成药(例如P1GF配体)共同给予。化疗药物包括但不限于5-氟尿嘧啶、博来霉素、白消安、喜树碱、卡铂、苯丁酸氮芥、顺柏(CDDP)、环磷酰胺、放线菌素D、柔红霉素、多柔比星、雌激素受体结合剂、依托泊香(VP16)、法尼基(farnesyl)-蛋白转移酶抑制剂、吉西他滨、异环磷酰胺、氮芥、美法仑、丝裂霉素、诺维本、硝基脲、普卡霉素(plicomycin)、丙卡巴耕、雷洛昔芬、他莫昔芬、泰素、temazolomide(DTIC含水形式)、反铂、长春碱和曱氨蝶呤、长春新碱或上述药物的任何类似物或衍生变异体。化疗药及其给药方法、剂量等是本领域技术人员所熟知的(参见例如"PhysiciansDeskReference",Goodman和Gilman的"ThePharmacologicalBasisofTherapeutics"禾口"Remington'sPharmaceuticalSciences",所述文献的相关部分通过引用结合到本文中)。剂量上的某些变动取决于所治疗患者的情况。负责给药的人员在任何情况下都要为每个患者确定合适剂量。激素皮质类固醇激素可提高其它化学治疗药的有效性，因此，它们经常用于联合治疗。泼尼松和地塞米松是皮质类固醇激素药的实例。己酸幾孕酮、醋酸甲羟孕酮和醋酸甲地孕酮等孕酮类药，已经用于子宫内膜癌和乳腺癌。己烯雌酚和炔雌醇等雌激素药，已经用于乳腺癌和前列腺癌等癌症。他莫昔芬等抗雌激素药已经用于乳腺癌等癌症。丙酸睾酮和氟曱睾酮等雄激素药也已用于治疗乳腺癌。血管生成抑制剂在某些实施方案中，本文所公开的PIGF配体可与例如以下的一种或多种抗血管生成药联用血管生长抑素、baculostatin、人血管能抑素(canstatin)、乳腺丝抑蛋白、抗VEGF抗体、抗血管生长因子抗体、抗Flk-l抗体、抗Flt-l抗体、层粘连蛋白肽、纤连蛋白肽、纤溶酶原激活物抑制剂、组织金属蛋白酶抑制剂、干扰素、白介素-12、IP-IO、Gro-p、血小板应答蛋白、2-甲M^雌二醇、增殖蛋白相关蛋白、carboxiamidotriazole、CMIOI、马立马司他、戊聚糖多聚碌iJ臾酯、促血管生成素-2、干扰素-a、除莠霉素A、PNU145156E、16K催乳素片段、利诺胺、沙利度胺、己酮可可碱、染料木碱、TNP-470、内皮生长抑素、紫杉醇、accutin、血管生长抑素(angiostatin)、西多福韦、长春新碱、博来霉素、AGM-1470、血小板因子4或二甲胺四环素。免疫调节剂本文所用的术语"免疫调节剂"包括细胞因子、干细胞生长因子、淋巴毒素和造血因子，例如白介素、集落刺激因子、干扰素(例如干扰素-ot、-P和-力和称为"S1因子"的干细胞生长因子。合适的免疫调节剂部分的实例包括IL-2、IL-6、IL誦IO、IL画12、IL-18、IL-21、干扰素-Y、TNF-a等。术语"细胞因子"是由一个细胞群体释放、并作为细胞间介质而作用于另一细胞的蛋白质或肽的通称。本文更广泛采用的细胞因子的实例包括淋巴因子、单核因子、生长因子和传统的多肽激素。细胞因子包括生长激素，例如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素和牛生长激素；曱状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素，例如滤泡刺激激素(FSH)、甲状腺刺激激素(TSH)和黄体激素(LH);肝生长因子；前列腺素、成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳激素、OB蛋白；肿瘤坏死因子-a和肺瘤坏死因子-p;米勒管抑制物(mullerian-inhibitingsubstance);小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；活化素(activin);血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO);神经生长因子，例如NGF-p;血小板生长因子；转化生长因子(TGF),例如TGF-a和TGF-p;胰岛素样生长因子-I和-II;红细胞生成素(EPO);骨诱导因子(osteoinductivefactor);干扰素，例如干扰素-a、p和y;集落刺激因子(CSF)，例如巨噬细胞-CSF(M-CSF);粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF);和粒细胞-CSF(G-CSF);白介素(IL)，例如IL-1、IL画loc、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-IO、IL-ll、IL-12;IL-13、IL-14、IL-15、IL曙16、IL-17、IL-18、IL曙21、LIF、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、EPO、kit-配体或FLT-3、血管生长抑素、血小板应答蛋白、内皮生长抑素、肺瘤坏死因子和LT。本文所用术语细胞因子包括天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质以及天然序列细胞因子的生物活性等同物。趋化因子通常作为化学引诱物起作用，以将免疫效应细胞募集到趋化因子表达的位点上。有利之处可能是使趋化因子基因与例如细胞因子基因联合表达，以加强其它免疫系统组分募集到治疗位点上。趋化因子包括但不限于RANTES、MCAF、MIP1-a、MIP1-(3和IP-10。技术人员应了解的是，已知某些细胞因子也具有化学引诱效果，并且也可归类在趋化因子术语之内。同样，术语免疫调节剂和细胞因子在其各自成员中是重叠的。放射性同位素疗法和放免疗法在某些实施方案中，本文所公开和要求保护的肽和/或蛋白质可用于放射性核素治疗或放免治疗方法(参见例如Govindan等，2005,『ec/w7o/ogyCawcerjReseorrc/zc&7Vea加eW,4:375-91;Sharkey和Goldenberg,2005,丄M/c/,A/d46:115S-127S;Goldenberg等(提交手稿),"AntibodyPretargetingAdvancesCancerRadioimmunodetectionandRadioimmunotherapy"，所述各文献通过引用结合到本文中)。在具体的实施方案中，P1GF配体可按下述方法直接用放射性同位素标记，然后给予患者。在替代实施方案中，可以按上述预寻靶方法，采用经放射性标记的半抗原肽或P1GF配体给予放射性同位素，并在给予双特异性抗体(其定位于患病组织P1GF表达增加的位点上)之后注射。用于治疗患病组织的放射性同位素包括但不限于mIn、177Lu、212Bi、2、、211At、62Cu、64Cu、67Cu、90Y、125I、131I、32P、33P、47Sc、川Ag、67Ga、142Pr、153Sm、161Tb、166Dy、166Ho、186Re、188Re、189Re、212Pb、223Ra、225Ac、59Fe、75Se、77As、89Sr、"Mo、105Rh、109Pd、143Pr、149Pm、169Er、194Ir、198Au、199Ai^211Pb。治疗性放射性核素的优选衰变能范围为20-6,000keV，对于俄歇发射体(Augeremitter)的优选范围为60-200keV,对于p发射体为100-2,500keV,而对于a发射体为4,000-6,000keV。有用的P粒子发射放射性核素的最大衰变能优选为20-5,000keV,更优选100-4,000keV,最优选500-2,500keV。还优选基本衰变俄歇发射粒子的放射性核素。例如，Co-58、Ga-67、Br-80m、Tc-99m、Rh-103m、Pt-109、In-lll、Sb-119、1-125、Ho國161、Os-189m和lr-192。有用的(3粒子发射放射性核素的衰变能优选<1，000keV，更优选〈100keV，最优选〈70keV。还优选伴有a粒子产生的基本衰变的放射性核素。这样的放射性核素包括但不限于Dy-152、At-211、Bi-212、Ra-223、Rn-219、Po-215、Bi-211、Ac-225、Fr-221、At-217、Bi-213和Fm-255。有用的a粒子发射放射性核素的衰变能优选为2,000-10,000keV，更优选3,000-8,000keV，最优选4,000-7,000keV。例如，"Cu因其半衰期为61.5小时并且充足供应(3粒子和Y射线，被认为是用于放免治疗的更有希望的放射性同位素，可采用螯合剂对溴乙酰氨基-卡基-四乙胺四乙酸(TETA),将"Cu与PlGF配体(例如抗P1GF抗体)缀合在一起。或者，可使用二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)，将发射高能P粒子的WY与肽、抗体、融合蛋白或其片段缀合在一起。额外的潜在放射性同位素包括"C、13N、150、75Br、98Au、224Ac、126I、133I、77Br、113mIn、95Ru、97Ru、103Ru、105Ru、107Hg、203Hg、mmTe、mmTe、125mTe、、%、、、、，丄、、、、143Pr、161Tb、166Ho、199Au、57Co、58Co、51Cr、59Fe、75Se、20T1、225Ac、76Br、〗69yb等。在另一个实施方案中，辐射敏化剂可与棵的或缀合的PIGF配体、抗体或抗体片段联用。例如，辐射敏化剂可与放射性标记的配体、抗体或抗体片段联用。当与仅用放射性标记的配体、抗体或抗体片段治疗相比时，添加辐射敏化剂可导致功效增强。辐射敏化剂参见D.M.Goldenberg(主编)，CANCERTHERAPYWITHRADIOLABELEDANTIBODIES,CRCPress(1995),所述文献通过引用全部结合到本文中。通常以类似方式产生肽、抗体、体片段或融合蛋白，所述肽、抗体、体片段或融合蛋白具有加载硼附加物的载体用于热中子活化治疗。然而，有利的是可以等待直到未靶定的免疫缀合物清除后再进行中子辐射。使用与P1GF配体结合的抗体可加速清除。参见美国专利第4,624,846号对该基本原理的描述。例如，硼附加物例如碳硼烷，可以与P1GF配体抗体连接。可以用垂悬侧链上的羧基官能团，制备碳硼烷，正如本领域众所周知的一样。可通过^友硼烷的氛基活化并与载体上的胺缩合，使碳硼烷与栽体(例如氨基葡聚糖)连接起来。然后将中间缀合物与P1GF抗体缀合。给予P1GF抗体缀合物之后，通过热中子辐射活化硼附加物并转化成放射性原子，其通过a-发射衰变，产生高毒性、短射程效果。药盒各种实施方案可涉及含有适于治疗或诊断患者患病组织的组分的药盒。示例性的药盒可含有至少一种P1GF配体。任选其它药盒成分可包括一种或多种其它抗血管生成药、化疗药物、双特异性抗体或如上所述的其它成分。如果含有给药组分的组合物并非配制成经消化道(例如口服)给予的剂型，则可包括能够通过某些其它途径递送药盒组分的装置。一类装置(例如用于胃肠外给药)是注射器，用于将组合物注射到患者体内。也可使用吸入装置。可将药盒组分包装在一起，或分开包装在两个以上单独的容器中。在一些实施方案中，容器可以是含有适于重配的无菌冻干组合物制剂的小瓶(管)。药盒也可含有适于重配和/或稀释其它试剂的一种或多种緩沖剂。可使用的其它容器包括但不限于袋、盘、盒、管等。可将药盒组分经无菌包装并保存在容器内。可包括的另一部分是给药盒使用人员的使用说明书实施例本文包括以下实施例，用于说明本发明优选的实施方案。本领域技术人员应当理解的是，在随后实施例中公开的技术代表着已被证实是在实施本发明中效果良好的技术，因此可视为在实施中构成优选才莫式。然而，本领域技术人员按照本说明书应当理解的是，可以在不偏离本发明精神和范围的情况下，对已公开的具体实施方案做出改动，却仍然保持相似或类似的结果。实施例1.P1GF对肿瘤细胞生长、移动、血管生成和转移的作用方法与材料免疫组织化学、组织病理学和流式细胞术通过标准方法，用1-5吗/1111第一抗体和1:500稀释的？110标记的第二抗体(BiosourceInternational,Camarillo,CA)进行流式纟田胞术。使用细胞Quest软件(CellQuestsoftware),从BDFACSCalibur流式细胞仪(BDBiosciences)中收集数据。对于P1GF和VEGF表达，用标准免疫组织化学方法(Taylor等，2002a)，使得自USBiomaxInc.(Rockville，MD)的石蜡包埋的原发性乳腺癌组织阵列与TARP，NCI(Bethesda，MD)染色。组织阵列还可探测Flt-l或NRP-l(ABXIS，Seoul,Korea)。使载玻片脱蜡，用适当的正常血清封闭，与购自SantaCruzBiotechnology,Inc.(SantaCruz,CA)的抗体一起温育。与第一抗体温育后，在3%^02中猝灭内源过氧化物酶，随后使用生物素化的第二抗体。将抗生物素蛋白-生物素-辣根过氧化物酶(HRP)缀合物涂在经洗涤的载玻片上。将载玻片与HRP底物3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB，得自Sigma,St.Louis，MO)温育10分钟，用苏木精(Sigma)复染。在100倍下观察经染色的载玻片，通过指定反映染色强度的相对数值给染色强度评级弱(0.25-0.5),中等(0.5-1.0)，高(l.0-2.0)，强(〉2.0);得分按0.25个点递增。所有载玻片都由一名研究人员读数(盲测)，由另一名抽查。仅评价看似有活力的肿瘤区域，将表示总强度和被染色细胞％的数值赋予各载玻片。分值不包括细胞外、结締组织和白细胞的染色。还评价了本底染色(由对照Ag8抗体表示)，然后减去本底染色。如果染色强度为o.5以上，则肿瘤样本^^见作阳性。人肺瘤异种移植物样品用苏木精和伊红染色。细胞系为了进一步表征所使用的细胞系，对于P1GF或VEGF表达，用流式细胞术测定MCF-7、MDA-MB-231和-468(美国典型培养物保藏中心，Mannassas,VA)。对于雌二醇受体a的表达(SantaCruzBiotechnology),还通过细胞单层培养物的IHC，进行MDA-MB-231和-468和MCF-7的测定。MCF-7为阳性，MDA-MB-231和-468对于雌激素受体为阴性。对于Flt-l,还通过IHC，对MDA-MB-231和-468异种移植物肿瘤进行探测，结果为阳性。未得到MCF-7肿瘤的Flt-l测试。噬菌体的分离和筛选按照供应商的方法，噬菌体文库(Ph.D,12噬菌体展示肽文库试剂盒，NewEnglandBiolabs，Inc.，Ipswich,MA)4皮用来淘选重组人PlGF-2(P1GF)或重组人VEGF165(VEGF)(R&DSystems,Flanders,NJ)。随后用P1GF或者用对应于P1GF分子上推定受体结合部位的肽进行淘选。噬菌体进行三轮淘选后，接种到琼脂上，经一系列10倍稀释后用于滴定。从滴定板中挑选充分分离的噬斑，扩增用于进一步研究。测序由扩增噬斑分离出DNA，用Ph.D.试剂盒所推荐的引物(噬菌体特异性的M13)测序，Ph.D.试剂盒即热测序酶放射性标记终止子《盾环观J序i式剂盒(ThermoSequenaseRadiolabeledTerminatorCycleSequencingKit)(USB,Swampscott,MA)。结合肽l(BP1)含有20个氨基酸。对照肽CPA得自从BP1中用A置换H、R和D残基。BPl和CPA是商用合成的(UniversityofGeorgia),#支用于体外和体内研究。检测肽序列与Flt-l或PlGF上的推定配体结合部位的同源性。一种肽，即结合肽l(BP1)，与结构域2的Flt-l结合部位的位置同源性最小，对应Y199和L204(Davis-Smyth等，1998，《/说o/C/em273:3216-3222;Iyer等，2001,J说o/C&m276:12153-12161),且其序列不比其它的长。其它肽长度为9-12个氨基酸，根据淘选间序列的一致性进行选择。得自分离噬菌体的两个噬斑序列是相同的(结合肽3，BP3)。肽序列肽名称序列BP1SHRYRLAIQLHASDSSSSCV(SEQIDNO:1)BP2QDDHLTTGR(SEQIDNO:2)BP3QEAFNRLTSRMH(SEQEDNO:3)BP4RMPYSEHSAPLG(犯QIDNO:4)用于与P1GF、VEGF或Flt-l结合的噬菌体或游离肽的测定对于各包被孔，使用噬菌体展示系统供应商推荐的淘选方案，另外的孔在緩冲液(作为緩冲液对照)中温育。去除包被溶液后，板在室温下用2%BSA的PBS溶液封闭1.5小时。还封闭另一个未包神支板，用于稀释噬菌体。封闭后，经扩增的噬菌体(~108噬菌体/1111)用封闭緩沖液按l:20稀释，将各稀释液50inl加入PlGF包被/封闭孔中和仅封闭孔中。噬菌体在室温下进行结合l-2小时。倒空各板，通过浸泡洗涤并倒空三次(洗涤液0.05%吐温-20(Tween-20)的PBS溶液)。与HRP缀合的抗M13-嗟菌体抗体(AmershamBiosciences,Buckinghamshire,England)用封闭緩冲液按l:1000稀释后，加到所有孔中，并在室温下温育1小时。各板如所述经浸泡洗涤。加入底物，30-60分钟后，在410nm下读取吸光度。96孔板用10)ug/mlP1GF、10pg/ml重组人Flt-l融合蛋白(R&DSystems)或10pg/mlVEGF包被，通过包被96孔板来测定游离肽结合。用2.5或25U/ml肝素(Sigma,St.Louis,MO)进行竟争测定。在C端依次用接头和FLAG表位(DYKDDDDKSEQIDN0:5)合成BP1、BP3、BP4和BP3合成型(scrBP3)。加入第一试剂30分钟后，加入第二试剂，再孵育30分钟。通过探测FLAG表位评价肽结合(Prickett等，Biotechniques7:580-9,1989;Castrucci等，J.Virol.66:4647-53,1992)。在490nm下读取吸光度。在基于ELISA的结合测定中，CPA与P1GF和VEGF结合，但是对Flt-1的亲和性削弱(50%)。CPA肽在体外和体内始终是无活性的。肿瘤细胞存活力在低血清(iy。)条件下进行MTT(3-(4,5-二甲基噻唑基-2)-2,5-二苯基溴化四唑，Sigma)测定，确定P1GF对细胞存活力的作用，肽的毒性及其对P1GF介导的乳腺肺瘤细胞生长的作用(Mosmann，1983,J7mmwwo/A/ef/265:55-63;Modrak等,2000,5Zoc/2emB/o//2>^尺es268:603-606)。肽浓度为1-2^M，外源PlGF的浓度为2nM。所测人乳腺肿瘤系为MDA-MB-231、MDA-MB-468和MCF-7(ATCC,Mannasses,VA)。筒单地说，将培养基中的5-10X1(^个细胞/ml接种到96孔板中，培养基含有1。/。胎牛血清(FBS)。24小时后，细胞用各种肽以l-2pM的浓度处理(4种结合肽)，一式四份和/或用rhuPlGF按2nM的浓度处理。在规定时间后，将0.5mg/mlMTT(5mg/ml母液用无血清RPMI培养基按l:10稀释)力口到各孔(Mosmann,1983)中。当细胞中紫色结晶清楚可见时，各板似乎已充分发育，用酸/醇(0.04MHCl/异丙醇)终止反应。在570nm下读取结晶溶解后的吸光度。选择24小时的时间点，因为该时间可测到P1GF对肿瘤细胞迁移的体外作用(参见下述伤口愈合测定)。另用含有10。/。FBS的培养基进行这些测定，得到类似的结果。伤口愈合测定为了测定P1GF、VEGF和BP肽对乳腺胂瘤和正常人内皮细胞(HEC)的功能作用，进行伤口愈合测定(Verma等，2001,Ce〃M'cra編3:169-180;Sung等，2003,￡"xpCe//■287:209-218;Itokawa等，Afo/.C朋cw77je厂.1:295-302,2002)。将MCF-7、MDA-謹-231和MDA-MB-468乳腺肿瘤细胞系或HEC接种到培养皿的无菌玻璃封盖玻片上或6孔板中。当细胞70-80%汇合时，用无菌塑料移液管尖刮擦单层培养物。封盖玻片用无菌PBS洗涤，然后用PlGF或VEGF(2nM)、肽(2jaM)、或者用抗体(0.67-lixg/ml)单独或联合处理。抑制剂浓度为50jnMPD98059(PD98)(促分裂原活化蛋白激酶激酶l[MEK1]抑制剂)、5nM渥曼青霉素(-舞脂酰肌醇3激酶[PI3K]抑制剂)或人重组可溶性Flt-l(sFlt-l)(R&D系统)。将肽或sFlt-l与含有P1GF、VEGF的培养基温育10分钟后加入细胞。将细胞与PD98和渥曼青霉素预温育15-30分钟后加入P1GF。用显微镜检查经染色(Wright-Giemsa)和封好的封盖玻片。通过统计分离自伤口边缘并且似乎正向伤口中央迁移的细胞数，求出5-10个100倍视野的值。结果用100倍视野中迁移到伤口的平均细胞数表示。在某些情况下，结合得自独立实验的数据以调整表中不同处理的内容。细胞侵袭测定向生长因子还原的基质胶侵袭室(growthfactor-reducedMatrigelinvasionchamber)(BDBiosciencesDiscoveryLabware,Bedford,MA)加入5x104细胞，测定细胞侵袭(Taylor等，2003b;Passaniti等，1992，丄"6/"ve"67，519-528)。Matrigel⑧塞中的各添加物与100]li1PBS(总体积)在室温下一起预温育10分钟后，将各添加物加到基质胶中。将生长因子(2.0或0.2nM)、肽(2jig/ml)或抗体(liLig/ml)加到低血清(0.1。/。胎牛血清[FBS])培养基中的细胞内。包括了基线和基于化学引诱物的侵袭(10%FBS)。在24小时(MDA-MB-231)或48小时(MCF-7、MDA-MB-468)染色后，在100倍放大倍率下，通过统计侵袭室膜底部的细胞数，来确定侵袭细胞数目。提供3-5个独立实验的结果。肽治疗对体内胖瘤生长的作用将组织培养基中生长的人乳腺肿瘤细胞系MDA-MB-231经皮下(s.c.)植入到棵小鼠两胁。当肿瘤可见时，给小鼠称重，并测量肺瘤。当胂瘤体积平均约0.06-0.12cn^时，开始用肽治疗。小鼠用200吗肽的PBS溶液通过腹膜内注射治疗两周，间隔3-4天。在每次治疗时，给动物称重并测量肿瘤。在第二个实验中，包括了对照肽CPA。最终治疗后第三天，收获肿瘤和肺。在各小鼠总数为4片载玻片或切片的所有肺组织中，统计存在的集落(colony)(<20个细胞)、簇(cluster)(〉20-100个细胞)和结节(nodule)(>100个细胞)，以确定肺(得自实验l)的肿瘤负荷。数据用每个治疗组(3-4只小鼠/组)各大小转移的平均数表示。统计每个治疗组的各总数的合计数，除以该组小鼠的总数。通过下列公式确定转移的抑制百分比％抑制=(#模拟品治疗-#治疗/#模拟品治疗)x100。将生长在组织培养基中的MDA-MB-231植入SLID小鼠的乳腺脂肪垫(mfp)中(3xl()S个细胞，4-5只小鼠/组)。在该模型中，较不可能发生大量的肺转移(Richert等，^"ea^Ca"cer化&7:R819-27,2005)。植入后第5天，当所有小鼠中可触到小肿瘤时，开始肽治疗(8次治疗)。最终肽治疗后三天，取出肿瘤并称重。如上所述收获肺，并用显微镜检查转移。统计分析用ANOVA评价结合、存活力、移动、血管生成、肿瘤生长和转移肿瘤负荷。尸<0.05^^见为有显著性。结果P1GF在原发性人乳腺癌和乳腺肿瘤细胞系中进行组成型表达如上所述，通过组织阵列的免疫组织化学染色，研究原发性乳腺癌和乳腺肿瘤细胞系的组成型P1GF和P1GF受体表达的频率。结果(见表1)表明P1GF阳性样品的比例比VEGF的高(PlGF为43。/。-60。/。；VEGF为13。/。-14。/。)。P1GF受体NRP-1的表达不限于乳腺癌实质(27。/。)，但肺瘤内皮除外。另一方面，对于Flt-l，肿瘤实质和内皮都为阳性(分别为65%和56%)。表l:原发性乳腺癌的P1GF、VEGF、NRP-l和Flt-l表达。<table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table>用来源。ND,未进行。肺癌和脑肿瘤(成胶质细胞瘤)也属于具有相对高频率表达的癌(分别为32%和20%，数据未显示)。结肠癌属于最低的组成型表达体(8%),与结肠胂瘤细胞系相同(1/4)(未显示)。用流式细胞术分析人乳腺癌细胞系、MCF-7、MDA-MB-231和MDA-MB-468的P1GF和VEGF表达。对于MCF-7、MDA-MB-231和MDA-MB-468，P1GF阳性细胞的百分比分别为29%、49%和38%。对于MCF-7、MDA-MB-23l和MDA-MB-468，VEGF阳性细胞的百分比分别为8%、18%和13%。因此，这些细胞系是相对高的P1GF表达体和相对低的VEGF表达体。MDA-MB-23l和-468异种移植物肿瘤都表达PlGF受体Flt-l。MDA-MB-468的NRP-1染色微弱(未显示)，文献中已记载了由MDA-MB-23l表达NRP-l(Soker等，J.说o/C/zew.271:5761-7,1996)。这些细胞系净皮用于随后的研究。P1GF结合肽的衍生乳腺癌细胞相对高频率的P1GF、NRP-l和Flt-l表达表示P1GF可对这些细胞产生直接作用。为了研究P1GF的乳腺癌细胞的作用，通过噬菌体肽文库淘选获得PlGF结合肽和Flt-l结合肽(BP)。在至少3轮淘选后获得结合肽。结合肽1和结合肽2(BP1、BP2)得自对rhuPlGF的淘选，而结合肽3和结合肽4(BP3、BP4)得自首先对对应于PlGF的推定受体-结合部位序列肽淘选2轮，然后对rhuPlGF淘选第三轮的噬菌体。BP3是两个不同噬菌体斑所共有的序列。分离后，在P1GF包被板中对噬菌体进行基于ELISA的结合测定。噬菌体BPl的吸光度读数(410nm)为0.024(噬菌体文库本底0.003)。结果表明P1GF淘选的噬菌体与P1GF包被孔的结合比本底增加10-20倍。合成肽BP1(SHRYRLAIQLHASDSSSSCVSEQIDNO:l),其具有C端FLAG表位，用于测定与PlGF和Flt-l及与VEGF的结合。BP1与P1GF结合(A4900.100±0.058)，与VEGF165结合(A4900.299±0.174)，不过与Flt-l的结合最强(A490，0.886士0.096)。当Flt-l-故固定化后，通过向结合试验中加入未结合的Flt-l,来进一步测定Flt-l结合。加入游离Flt-l(2nM)引起BPl与固定化Flt-l的结合降低380/0(A490对于仅5fiMBPl为0.527土0.025;加入游离Flt-l和BPl，为0.327±0.127)。进行额外的测定以确定P1GF的存在是否会干扰BP1-Flt-1相互作用。浓度为lnM和100nM之间的PlGF对BPl与Flt-l结合没有显著作用。这些发现表示BPl与Flt-l上不是与结构域2的部位相互作用，而PlGF与Flt-l的主要相互作用则定位在结构域2上。随后，研究了BP1与存在于Flt-l和PlGF-2的肝素结合部位的締合。如图l所示，向Flt-l包一皮的各^1中加入肝素后，再加入BP1导致BP1结合降4氐64。/。(尸<0.0002)。然而，如果BP1在加入肝素前加入，BP1的结合仅^皮抑制130/。(尸〉0.Q5)。因此，BP1最可能在肝素结合部位或在肝素结合部位附近与Flt-l结合。BP1本身可含有肝素结合基序，因为首6个残基与玻连蛋白中存在的肝素结合区的首6个残基有相同的模式(XBBXBX)。该结构域可用作选择性结合肽序列的核心，在抑制血管生成、肿瘤转移和/或肿瘤细胞移动方面可显示出功效提高。技术人员应当了解的是，例如在标作"X"的位置上氨基酸的随机化，可能导致有用的BP1类似物的产生。虽然电荷分布可能很重要，但是其它碱性残基(例如组氨酸、精氨酸、赖氨酸)在标作"B"位置上的置换也可导致有用的BP1类似物的产生。未发现BP1与VEGF的可测量结合。料想不到的是，BP1与Flt-l的结合还是本底的10倍。Flt-l结合的特异性通过将未结合Flt-l(2nM)加到基于ELISA的结合试验中进行测定，这引起5pMBP1与固定化Flt-l的结合降低38。/。。还测定了肽BP3、肽BP4及BP3合成型(ascrambledversion)(BP3scr)作为游离肽与PlGF和Flt-l的结合，在高达50pM的浓度下，与P1GF无可检测结合。未发现这些肽与Flt-l的可检测结合。乳腺肿瘤细胞当暴露于P1GF或肽时的存活力对P1GF和所有4种肽对乳腺肿瘤细胞存活力的作用进行了测定。选择细胞系MCF-7、MDA-MB-231和MDA-MB-468,因为它们代表了许多原发性和转移性乳腺癌。MCF-7为雌激素受体阳性，具有适当良好分化的组织结构。MDA-MB-231最初获自转移性胸膜渗出物(Cailleau等，1974，JAto/Ca"ce〃w对53:661-674)，为雌激素受体阴性，形成不良分化的III级腺癌异种移植物。MDA-MB-468是为雌激素受体阴性，分化不良，在棵小鼠是致瘤的。所有这三种肿瘤组成型产生的PlGF^PlGF阴性结肠肺瘤细胞系HT-29的3-4倍(通过流式细胞术)，且表达低水平的PlGF受体Flt-l(数据未显示)。MDA-MB-231产生的P1GF最多，MDA-MB-468最低。将P1GF(2nM)加到肿瘤细胞培养物中导致24小时培养后细胞数目增力口(对于MDA-MB-231和MDA-MB-468i3<0,04)(图4)。为了测定肽对P1GF刺激的存活力和增殖的作用，使肽(1-2^VI)与P1GF(2nM)混合。将肽加到^4nGF的MTT测定中的结果见图4。将BP4加到含PlGF的MCF-7培养物中(图4A)导致细胞存活力显著降低，与将BP3加到MDA-MB-231中一样(尸<0.03)。所有这三种肽都降低含P1GF的MDA-MB-468培养物的存活力(未显示)(尸<0.03)。肿瘤细胞仅与肽(2)iM)孵育24小时对细胞存活力无显著性作用，MCF-7与BP1孵育除外，其中存活力降低21。/。(P〈0.005)。与未处理对照相比，与BP3、MCF-7孵育48小时后同样丧失存活力(P〉0.05)。P1GF刺激肿瘤细胞迁移并参与转移P1GF、VEGF和Flt-l，2nM;肽，2pM。抗体浓度为l|ig/ml。MEK1抑制剂、PD98059(PD98)，50pM。PI3K抑制剂、渥曼青霉素，5nM。结果用迁移到"伤口，，的平均细胞数士SD表示，细胞数得自5-10个100倍显微视野/治疗/18-24小时实验，11=2-4次实验。抗体和抑制剂治疗的数值来自包括所有相关对照的单独实验。在两个实验中，所有数值约为大多数前一实验数值的一半，因此通过因子2使之归一化，然后再与其它实验平均。UT表示未处理对照。承与UT相比i3<0.01(ANOVA);十与仅P1GF相对P<0.02(ANOVA)。丰与仅PlGF相比i3<0.001(ANOVA)。将处理的平均数值除以仅P1GF或仅VEGF的数值，来确定相^f活性。PI3K和MEK1活化通常与酪氨酸激酶受体(RTK)胞内信号转导有关。另外，活化的PI3K和MEKl涉及肺瘤细胞迁移(Zeng等，J说o/.C72e肌276:26969-79;Hollande等，爿肌J.尸/z;^/0/.Ga对raz."fe对.丄/ver尸/2，z'o/.280:G910-21,2001)。为了研究P1GF刺激的移动是否是由这些激酶之一的活化所致，MDA-MB-231用P1GF和PI3K抑制剂(渥曼青霉素，5nM)或MEKl抑制剂(PD98059,50jiM[PD98〗)处理。PD98和渥曼青霉素分别显著抑制PlGF刺激的迁移达68。/。和72。/。(尸<0.001)(表2)。这些结果表示P1GF通过PI3K和MEK1途径的活化，可能是通过经Flt-l的PI3K活化，来刺激细胞移动。因为侵袭基底膜的能力对转移是必不可少的，所以进行了添力口P1GF或VEGF的侵袭测定。按2.0nM和0.2nM加入PlGF导致24小时后MDA-MB-231的侵袭增加几乎3倍(11土8.1未处理对30±13.7(2.0nM)或28士12(0.2nM)PlGF处理，尸<0.05)(图2)。VEGF(2.0nM或0.2nM)不改变MDA-MB-231的侵袭能力(10±8.0个细胞)。肽BP1的加入导致P1GF刺激的侵袭降低500/。(15±4.2个细胞)(对于仅P1GF，尸<0.02)。对照肽CPA，不抑制P1GF的活性(35±17.3个细胞)。将抗P1GF抗体(0.6fig/ml)加到0.2nMP1GF测定中导致侵袭细胞减少460/。(15±2.3个细胞，一次实验)。总之，这些结果表示P1GF在侵袭性肿瘤细胞系MDA-MB-231中刺激侵袭，抑制肽BP1类似于P1GF抗体，可抑制这种活性。MDA-MB-468和MCF-7获得类似的结果，但没有统计显著性沐3)。表3.P1GF增加乳腺癌细胞系的侵袭潜力。BP1抑制P1GF介导的侵袭潜力。<table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table>在使用MDA-MB-231的同位乳腺脂肪垫(mfp)模型中，用BP1治疗的肿瘤重量减小23。/。(模拟品治疗，0.423±0.089g;CPA，0.416±0.083g;BP1，0.345士0.095)，其都未达到统计显著性。植入MDA-MB-231的mfp未产生大的肺结节，可能是由实验期限短所致(4.5周)。然而，接近肺静脉的微转移(micrometastases)(20至>100个细胞)是显而易见的(未显示)。对于模拟品治疗、CPA和BPl,每只小鼠的微转移计数分别为3.4土1.9，2.8士1.3和0.6±0.5(对于模拟品治疗或CPA治疗尸<0.02)，转移减少82%。带有MDA-MB-468异种移植物(平均肿瘤体积0.19cm3)的小鼠经腹膜内注射各个肽(200iag/剂)进行治疗(图5)。一周两次治疗4周后，用BP1(图5A)或BP3(图5B)治疗的小鼠中，肿瘤生长受抑制分别达49%和58%。两周治疗后BPS对胂瘤生长作用是明显的(图5B),而BP1的抑制作用一周后就很明显(图5A)。在用BP1治疗期间，在第IO天、第14天、第17天和第24天(图5A)各肿瘤体积的平均变化具有显著性(尸<0.05)。用BP2的治疗无效果；肿瘤以几乎与才莫拟品治疗对照相同的速率继续生长(结果未显示)。BP4治疗造成20%的肿瘤生长抑制(结果未显示)。抑制血管生成为了进一步研究P1GF结合肽对内皮细胞迁移和血管生成的作用，将含有P1GF、BP1、BP2或PBS的基质胶基底膜塞经皮下植入棵小鼠两胁。在PBS对照中，内部微血管的数目为16.2±11.4/mm2。仅P1GF的植入物含有28.9±17.2/mm2(是模拟品治疗植入物的1.8倍)，具有P1GF和BP1的植入物仅含有12.3±13.0个微血管/mm2(尸〈0.02)。讨论数项研究表明由癌(包括乳腺癌)引起的P1GF表达，与复发、转移和死亡率有关(Wei等，Gut54:666-72,2005;Chen等,CancerLett.213:73-82,2004;Parr等，Eur.J.Cancer41:2819-27，2005;Weidner等，Am.J.Pathol.143:401-9，1993;Zhang等，WorldJ.Surg.Oncol.3:68,2005)。P1GF还与许多病理状态(Carmeliet等，Nat.Med.7:575-83，2001)和胂瘤新血管形成(Li等，FASEBJ.20:1495-97，2006;Taylor等，Int.J.Cancer1-5:158-69，2003)有关。人类癌症中VEGF和P1GF的临床研究结论不一致。例如，在一份报告中，P1GF，而不是VEGF,刺激离体费城染色体阳性的急性髓细胞性白血病的生长(Ikai等，Eur.J.Haematol.75:273-9,2005)。另一方面，VEGF与肾细胞癌阶段、组织学等级及其血管供应和静脉侵袭有关(Matsumoto等，AnticancerRes.23:4953-8，2003)。这些作者净良道称，PIGF还是该癌症独立的预后因子。已经开发出大量抗VEGF药物，包括封闭性抗体在内的阻止VEGF-受体结合的一些小分子和反义寡核苷酸已经在临床试验中进4亍观'J"i式(Whatmore等，2002,jwg/ogewew's5:45-51;Mulligan-Kehoe等,2002,J说o/C/zem277:49077-49089;Shi和Siemann,2002,6rJCa"cw87:119-126;Yang等，2003，A^/A/349，427-434)。这些研究的结果提出肿瘤血管生成是复杂和充足的；也就是说，当通过治疗降低VEGF时，或者在VEGF表达较低的肺瘤类型中，可能有建立将血液供应给恶性肿瘤的"后备"机制。P1GF有可能参与这种功能冗余。P1GF还是动脉生成的，引起从先存在的吻合中形成动脉(Pipp等，2003)。以上提供的数据显示P1GF提高乳腺癌细胞的转移潜力，因为它刺激移动和侵袭，这与在肿瘤中以转移为特征的上皮-间充质细胞间的转化有关。相比之下，在这些测定中外源性添加VEGF对肿瘤细胞移动或侵袭不起作用。这些结果不同于Bachelder等人的结果(CancerRes.62:7203-6,2002)，其中发现VEGF是侵袭刺激物(MDA-MB-231)。然而，这项研究没有包括P1GF;因此，未进行生长因子的比较。我们的结果根据的是肿瘤细胞环境存在P1GF或VEGF，而Bachelder等人(2002)使用RNAi抑制细胞产生VEGF，其结果可能不同于VEGF的旁分泌作用。另一份报告显示，当通常是低P1GF和高VEGF表达体的肿瘤系过度表达PlGF时的PlGF抑制作用(Xu等，CancerRes.6:3971-7,2006)。这种表达模式不同于本研究所用乳腺细胞系的模式，所述细胞系是高P1GF、低VEGF表达体，是一种模拟原发性人乳腺癌的模式。至少一项其它的研究显示，VEGF和P1GF协同剌激病理病症中的血管生成(Carmeliet等，2001)。P1GF或VEGF对胂瘤病理的作用极有可能是复杂的，可能部分是由它们在肿瘤微环境中相对充足，以及在肿瘤细胞和内皮中存在它们的活性受体所致。正如本文所公开的一样，用抗P1GF抗体，以及BP1、所研发的PlGF-2/Flt-l拮抗肽，抑制P1GF刺激癌细胞移动和侵袭的能力。曾推测如果P1GF是抑制性的，则它的除去可能使VEGF介导的活性继续，然而情况并非如此。对外源P1GF刺激作用潜在的胞内机制进行了研究，结果显示PI3K和MEK1途径可能参与P1GF刺激的迁移。之前已发现这些途径与细胞迁移有关(Hollande等，2001),但是这些激酶也参与促进癌症进程的其它过程，包括蛋白质翻译、基因调节、增殖、侵袭和抗凋亡(Zeng等，J.Biol.Chem.276:26969-79，2001;Hollande等，2001;Belka等，Int.J.Radiat.Oncol.Biol.Phys.58:542-54，2004;Pommery等，Ann.Pharm.Fr.63:69-75，2005;Bancroft等，Clin.CancerRes.7:435-42，2001;Mekhail等，CellCycle3:1027-9，2004;Pollheimer等，Angiogenesis3:159-66，1999)。表达P1GF的胂瘤细胞可通过自分泌/旁分泌途径获得存活益处，所述途径赋予它们更多的抗死亡信号，并在需要时使它们迁移至血供给处的。为了阐明P1GF在胂瘤和内皮细il包生物学中的作用，我们研发了拮抗肽BPl,它抑制P1GF对肺瘤和内皮细胞的活性，影响体内自主转移。本文的结果表明BPl对PlGF-2/Flt-l-肝素締合产生拮抗作用。肝素结合是某些受体酪氨酸激酶完全活化必不可少的(Park等，Bioechem.Biophys.Res.Comm.264:730-4,1999;Schlessinger等,Molec.Cell.6:743-50，2000;Ito等，Angiogenesis3:159-66,1999)，我们的发现支持这一结论，即PI3K和MEK1途径的抑制常常与受体酪氨酸激酶(例如Fit-1)抑制由P1GF刺激的细胞迁移有关。通过防止肝素与PlGF-2和Flt-l紧密締合，BPl可防止活化信号传递到细胞内部。FGF-FGFR-肝素复合物结晶研究证明，肝素使配体和受体多重接触。这种締合促进受体的二聚化，这是活化所必需的(Park和Lee，1999;Schlessinger等，2000;Ito和Claesson-Welsh，1999，Angiogenesis3:159-166)。通过干预这种复合物，BPl可防止肝素与PlGF和Flt-l紧密締合。我们发现包括在血管生成测定中的外源肝素，即使在所加生长因子(例如VEGF或PIGF)不存在时也增加血管的形成(未公布数据)。在这种情况下，所增加的血管生成非常可能是由肝素介导的对基质胶是内源的生长因子与迁移到植入物细胞上的受体之间的相互作用加强所致。除抑制P1GF介导的迁移以外，BPI能够抑制加入PIGF的基底膜植入物中微血管的生长。这种内皮细胞迁移的抑制和胂瘤中血管的形成，与迁移测定数据一起，表示P1GF在乳腺癌病理中的功能是刺激内皮细胞迁移，以及可能刺激管形成(数据未显示)，并且还引起肿瘤细胞自身向血供给处移动。Bae等(Clin.CancerRes.11:2651-61，2005)最近报道了Flt-l拮抗肽的抗癌潜力，该肽抑制VEGF与Flt-l结合，并且抑制分泌VEGF的结肠肿瘤异种移植物的生长和转移。用VEGF作为迁移和增殖的刺激物，通过该肽与内皮细胞而不是与肿瘤细胞的相互作用，来测定该肽的活性。引人注意的是，这些作者所使用肽也抑制PlGF与Flt-l的结合，其部分功效归因于这种相互作用。然而，这些作者的肽似乎不同于BP1，因为它干扰Flt-l结构域2生长因子结合部位(Bae等，2005)，没有与肝素结合区相互作用的证据。因此，Bae等人提供的肽非常可能按不同于BP1的方式起作用。通过用BP1治疗自发转移的人乳腺癌异种移植物，对癌症中P1GF的体内作用进行了研究。用BP1肽治疗抑制皮下MDA-MB-231胂瘤的生长，肺部转移的发生降低94%,在同位(mfp^莫型中，降低82%。这些结果证实抗Flt-l肽(例如BP1)的生长和转移抑制性能，表明该受体可在某些癌症进程中起关键作用，并代表了抗癌疗法的一个靶标。总之，我们证实了在某些原发性人类癌和细胞系，尤其是乳腺癌中P1GF的表达增加。P1GF增加了乳腺癌细胞系MDA-MB-231和-468的增殖和MCF-7和MDA-MB-231的移动。据我们所知，这是证明由P1GF直接活化恶性细胞最早的报道。此外，我们分离的肽BPl,它与PlGF和Flt-1结合，并且最终破坏体外？16-2/^1配体受体对的活性。被BP1阻断的活性包括P1GF刺激的肿瘤细胞存活力和移动，以及基底膜植入物中微血管的形成。另外，用肽BP1治疗带有胂瘤的小鼠抑制乳腺肿瘤异种移植物MDA-MB-468的皮下生长，明显降低由MDA-MB-231造成的肺转移。实施例2:小鼠角膜测定中抑制P1GF介导的血管生成在体内角膜组织中，对P1GF配体阻断P1GF介导的血管生成能力进行了研究。用改良的vonGraefe白内障刀在5-6周龄雄性C57B16/J小鼠双眼形成角膜微嚢袋。将由聚葡萄糖醛酸(polyglucuronicacid)/聚乳酸緩释剂型组成的微丸(Micropellet)植入各个角膜嚢袋内，该微丸含有100ngPlGF或PlGF与lpMBP-l、BP-2、BP-3或BP-4。在小丸植入后第5天，用裂隙灯活组织镜检查眼睛。测量血管长度和新血管形成。P1GF诱导强烈的血管生成反应并伴有高密度的微血管形成。加入BP-1、BP-3或BP-4抑制角膜组织中P1GF介导的血管生成。治疗糖尿病性视网膜病或黄斑变性患者抑制血管形成，改善病症。实施例3:BP1融合蛋白和缀合物对于口服给药或者在其它实施方案中，BP1及其类似物可与载体蛋白重组连接或化学连接。对于天然蛋白质中存在的20种常见L-氨基酸组成的肽连接，优选重组DNA方法。对于连接含有D-氨基酸、修饰氨基酸或非天然氨基酸的肽才莫拟物或肽，仅化学缀合方法是目前可行的。正如本文所公开的一样，提供制备与人IgGl的Fc(hFc)糖类连接的BP1缀合物的通用方法。三种示例性的包含BP1和hFc的融合蛋白的构建方法见下。用标准重组DNA技术，制备用于在骨髓瘤细胞中表达hFc的载体。表达载体shCD20-Fc-pdHL2(图6)用作DNA模板以通过PCR扩增Fc的编码序列(铰链区、CH2区和CH3区)。进行两次PCR。用下述成对引物，第一次PCR扩增完整的前导肽序列(A片段)。5'XbaI:TCTAGAGCACACAGGACCTC(SEQIDNO:6)3'Hind3:GAAGCTTGGAGTGGACACCT(SEQIDNO:7)用以下成对引物，笫二次PCR扩增铰链和CH2(B片段)5'Hind3:AAGCTTCCGACAAAACTCAC(SEQIDNO:8)3'Sac2:CCGCGGCTTTGTCTTGGCAT(SEQIDNO:9)用Xbal和Sac2消化shCD20-Fc-pdHL2后，将车交大的DNA片段与A片段和B片段连接，得到Fc的表达载体(hFc-pdHL2)。实施例4.BPl与hFc缀合骨髓瘤细胞用hFc-pdHL2转染，筛选阳性克隆。使最高的生产克隆在滚瓶中生长，培养物上清液用A蛋白纯化，得到hFc。用下述两种方法之一，进行BPl与hFc的缀合。在第一种方法中，hFc用高碘酸钠氧化，在糖类中产生醛基团。脱盐步骤之后，氧化hFc用杂-交联剂(hetero-crosslinker)例如BMPH(Pierce,产品号22297)衍生化以通过酰胼与醛反应引入马来酰亚胺基。除去过量试剂后，马来酰亚胺偶联的hFc通过BPl的半胱氨酸残基反应与BPl缀合。另一方法是将BMPH与BP1偶联，用反相HPLC分离所得产物后，使BMPH-BP1与氧化的hFc反应。实施例5:BPl-hFc的表达载体在替代实施方案中，BPl-hFc被构建成为由两个相同多肽组成的融合蛋白，每个多肽由通过柔性接头(例如(GGGGS)3)与人IgGl的铰链区、CH2和CH3连接的BP1组成。两个多肽通过由4i链上的半胱氨酸残基所形成的二硫键共价结合。预期BP1-Fc将提供以下优势(1)BP1对VEGFR1肝素结合区的亲和性可能由于二价BP1而升高；(2)分子大小的增加(-60kDa)可以更好地排除肝素与VEGFRl结合，导致更有效抑制地P1GF和VEGFR1间的相互作用；和(3)Fc的存在可能延长血清半寿期，并且可通过与在上皮细胞中表达的新生Fc受体(FcRn)结合，实施口服或肺递药。在骨髓瘤细胞中表达BP1-Fc的载体如下构建。简单地i兌，用保护编码BP1的114bp序列的10-15bp重叠序列和(GGGGS)3接头合成3个长的寡核苷酸，将HindIII位点加到末端。将寡核苷酸退火，用DNA聚合酶延长。使含有BP1和接头的所得DNA片段纯化并克隆到中间载体，然后通过测序证实。然后，用HindIII消化中间载体分离出该片段，克隆到HindlII切割的Fc-pdHL2上(参见实施例3)。因为有两个可能的方向，通过双重酶消化鉴定正确的一个并分离(BPl-hFc-pdHL2)。用BPl-hFc-pdHL2转染骨髓瘤细胞，篩选高产量克隆。使最高生产基因在滚瓶中生长，培养物上清液用A蛋白纯化以获得BPl-hFc。实施例6:二聚体BPl-hFc(BPl-hFc-ddd2)通过在BPl-hFc的C端上附加被称为ddd2(SEQIDNO:IO)的特定肽序列，来获得由二聚体BPl-hFc组成的融合蛋白。二硫4建使二聚体BPl-hFc稳定，二聚体BPl-hFc含有4个BPl。ddd2ARA(SEQIDNO:IO)实施例7:BPl-hFcx抗VEGFR2Fab(~160kDa)用产生能够既靶向VEGFR1又靶向VEGFR2的~160kDa缀合物的A2B技术，使BPl-Fc通过二硫键与抗VEGFR2Fab连接。首先通过将被称为ad2(SEQIDNO:ll)的特定肽序列附加在CH1的C端，产生B型的抗VEGFR2。为了产生BPl-hFcx抗VEGFR1Fab，将BPl-hFc-ddd2(实施例6)与B型的抗VEGFR2相混合，用TCEP还原1小时。除去TCEP后，加入DMSO至终浓度为10。/。，以诱导2个亲本蛋白中各存在的ddd2和ad2之间形成二硫4建。ad2GGCGQ正YLAKQIVDNAIQQAGC(SEQEDNO:11)承承氺根据本说明书，无需过度实验，便可制备和实施本文所公开和要求保护的组合物和方法。虽然在优选的实施方案方面描述了组合物和方法，但是对本领域技术人员显而易见的是，在不偏离本发明的构思、精神和范围的情况下，可以对本文所述組合物和方法及方法步骤或步骤的顺序进行改动。更准确地讲，化学和生理上相关的某些药物可以替换本文所述药物，而又可获得相同或类似的结果。对本领域技术人员显而易见的是，对所有这些类似的替换和修饰4皮视为落入本发明所附权利要求书的精神、范围和构思内。权利要求1.一种包含胎盘生长因子(P1GF)配体的组合物，其中所述配体抑制血管生成、肿瘤生长或肿瘤转移。2.权利要求1的组合物，其中所述配体是肽。3.权利要求2的组合物，其中所述肽通过针对P1GF的噬菌体展示进行鉴定得到。4.权利要求2的组合物，其中所述肽包^i^自以下序列的至少12个连续的氨基酸残基BP-1(SEQIDNO:l)、BP-2(SEQIDNO:2)、BP-3(SEQIDNO:3)或BP-4(SEQIDNO:4)。5.权利要求4的组合物，其中所述肽包含BP-1的序列(SEQIDNO:l)。6.权利要求l的组合物，其中所述配体包含抗体、抗体片段、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、人抗体片段或抗体类似物。7.权利要求2的组合物，其中所述肽为线状或环状构象。8.权利要求7的组合物，其中所述肽在肽的两端包含半胱氨酸残基，且半胱氨酸残基彼此键合形成环肽。9.权利要求l的组合物，其中所述肿瘤是淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤、神经胶质瘤、黑素瘤或癌。10.权利要求9的组合物，其中所述肿瘤是乳腺癌。11.权利要求2的组合物，其中所述肽与PlGF和Fms样酪氨酸激酶受体Flt-l结合。12.权利要求11的组合物，其中所述肽与P1GF-2和Flt-l上的肝素结合部位结合。13.权利要求12的组合物，其中所述肽抑制肝素与P1GF和/或Flt-l结合。14.权利要求12的组合物，其中所述肝素抑制肽与P1GF和/或Flt-l结合。15.权利要求2的组合物，其中所述配体与另一种分子或化合物连接。16.权利要求15的组合物，其中所述配体与以下成分连接抗体、双特异性抗体、抗体片段、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、人抗体片段、抗体类似物、Fc片段、Fc-结合蛋白、抗体-结合融合蛋白、药物、前药、毒素、酶、寡核苷酸、放射性同位素、免疫调节剂、细胞因子、激素、结合分子、脂质、多聚物、胶束、脂质体、纳米粒子或其组合。17.权利要求16的组合物，其中所述配体与结合到肿瘤抗原上的分子连接。18.权利要求15的组合物，其中所述配体与结合到疾病靶标上的分子连接。19.权利要求17的组合物，其中所述分子是双特异性抗体或其片段，所述抗体或片段具有一个结合肿瘤相关抗原的部位和笫二个结合P1GF配体的部位。20.权利要求15的组合物，其中所述配体与单克隆抗体或其片段共价连接，所述单克隆抗体或片段具有结合疾病靶标的部位。21.权利要求19的组合物，其中双特异性抗体具有针对肿瘤相关抗原的结合部位，所述抗原选自A3、A33抗体特异性抗原、BrE3-抗原、CD1、CDla、CD3、CD5、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD45、CD74、CD79a、CD80、HLA-DR、NCA95、NCA90、HCG及其亚基、CEA(CEACAM5)、CEACAM6、CSAp、EGFR、EGP-1、EGP-2、Ep-CAM、Ba733、HER2/neu、低氧诱导因子(HIF-1)、KC4抗原、KS-1抗原、KSl-4、Le-Y、巨噬细胞抑制因子(MIF)、MAGE、而C1、MUC2、而C3、而C4、PAM-4、PSA、PSMA、RS5、SIOO、TAG-72、p53、生腱蛋白、IL-6、IL-8、胰岛素生长因子-1(IGF-1)、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、肿瘤坏死抗原、VEGF、ED-B纤连蛋白、17-lA-抗原、血管生成标记、癌基因标记和癌基因产物。22.权利要求l的组合物，其中所述肿瘤选自急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞性白血病、胆管癌、乳腺癌、宫颈癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、结肠直肠癌、子宫内膜癌、食管癌、胃癌、头颈部癌、霍金奇淋巴瘤、肺癌、甲状腺髓质癌、非霍金奇淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、神经胶质瘤、黑素瘤、肝癌、前列腺癌和膀胱癌。23.权利要求15的组合物，其中所述P1GF配体是结合肽，所述结合肽与抗体Fc片段、Fc-结合蛋白或抗体-结合融合蛋白共价连接。24.权利要求23的组合物，其中所述P1GF配体与抗体Fc片段连接，所述抗体是IgGl。25.—种用于抑制肿瘤血管生成、转移、肿瘤生长、肿瘤细胞存活和/或癌细力包移动的方法，该方法包^^舌a)获得与胎盘生长因子(P1GF)结合的配体；和b)给予受治疗者所述配体其中所述配体抑制肿瘤血管生成、转移、肿瘤生长、肿瘤细胞存活和/或癌细力包移动。26.权利要求25的方法，其中所述配体是肽。27.权利要求26的方法，该方法进一步包括通过噬菌体展示对肽进行鉴定。28.权利要求26的方法，其中所述肽包含选自以下序列的至少12个连续的氨基酸残基BP-1(SEQIDNO:l)、BP-2(SEQIDNO:2)、BP國3(SEQIDNO:3)或BP-4(SEQIDNO:4)。29.权利要求28的方法，其中所述肽包含BP-1的序列(SEQIDNO:l)。30.权利要求25的方法，其中所述配体选自抗体、抗体片段、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、人抗体片l殳和抗体类似物。31.权利要求25的方法，其中所述受治疗者患有乳腺癌。32.权利要求26的方法，该方法进一步包括将一种或多种抗癌症药物与所述肽联合给药。33.权利要求25的方法，该方法进一步包括给予受治疗者磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)或促分裂原活化蛋白激酶激酶1(MEK1)的抑制剂。34.权利要求33的方法，其中所述PI3K抑制剂是渥曼青霉素，或者MEK1抑制剂是PD98059。35.权利要求32的方法，其中所述药物选自化疗药物、放射疗法、免疫疗法、放免疗法、局部高温、激光辐射和手术切除。36.权利要求25的方法，该方法进一步包括给予受治疗者一种或多种抗血管生成化合物。37.权利要求36的方法，其中所述化合物抑制VEGF介导的血管生成。38.权利要求25的方法，其中所述配体抑制P1GF激活的癌细胞移动。39.—种治疗涉及血管生成的疾病的方法，该方法包括a)获得与胎盘生长因子(P1GF)结合的配体；和b)给予受治疗者配体其中所述配体抑制血管生成。40.权利要求39的方法，其中所述疾病选自癌症、增生、糖尿病性视网膜病、黄斑变性、炎性肠病、节段性回肠炎、溃疡性结肠炎、类风湿性关节炎、结节病、哮喘、水肺、肺动脉高压、牛皮癣、角膜移植排斥、新生血管性青光眼、遗传性出血性毛细血管扩张、心肌血管生成、斑块新血管形成、再狭窄、血管创伤后新内膜形成、毛细管扩张、血友病性关节、血管纤维瘤、慢性炎症相关的纤维化、肺纤维化、深部静脉血才全形成和伤口肉芽形成。41.一种使药物靶向肿瘤或血管内皮细月包的方法，该方法包括a)获得与胎盘生长因子(P1GF)结合的配体；和b)将配体与药物连接；其中P1GF配体与肿瘤和/或血管内皮细胞结合。42.权利要求41的方法，其中所述配体选自BP-1(SEQIDNO:l)、BP國2(SEQIDNO:2)、BP-3(SEQIDNO:3)和BP-4(SEQIDNO:4)。43.权利要求41的方法，该方法进一步包括给予双特异性抗体，所述双特异性抗体具有一个针对P1GF配体的结合部位和第二个针对肿瘤抗原的结合部位。44.权利要求43的方法，其中所述配体-抗体复合物经口;^或吸入给药，配体-抗体复合物通过与新生Fc受体转运系统相互作用而#皮吸引。45.—种药盒，所述药盒包括P1GF配体和包装容器。46.权利要求45的药盒，该药盒还包括化疗药物、双特异性抗体、抗血管生成药或其组合。47.—种融合蛋白，该融合蛋白包含P1GF配体序列和第二种序列。48.权利要求47的融合蛋白，其中所述P1GF配体序列包*自以下序列的至少12个连续的氨基酸BP-1(SEQIDNO:l)、BP-2(SEQIDNO:2)、BP-3(SEQIDNO:3)或BP-4(SEQIDNO:4)。全文摘要本发明涉及用于抑制血管生成和/或肿瘤生长、存活和/或转移的方法和组合物。在具体实施方案中，该方法和组合物可涉及针对胎盘生长因子(PlGF)，例如BP-1、BP-2、BP-3或BP-4的配体。一些方法可包括单独给予患者一种或多种PlGF配体，或者与一种或多种其它药物联合给予，其它药物例如化疗药物、其它抗血管生成药、免疫治疗药物或放射免疫治疗药物。PlGF配体有效地抑制血管生成、肿瘤细胞移动、肿瘤转移、肿瘤生长和/或肿瘤存活。在某些实施方案中，可以给予患者PlGF配体以改善其它血管生成相关疾病，例如黄斑变性。在一些实施方案中，可以通过任何已知方法来测定PlGF表达水平，从而选择最有可能对PlGF靶向疗法作出反应的患者。文档编号A61K38/17GK101534849SQ200680039268公开日2009年9月16日申请日期2006年10月16日优先权日2005年10月19日发明者A·P·泰勒,D·M·戈登伯格,张健行申请人:分子医学和免疫学中心;免疫医疗公司