同时含乙肝病毒表面抗原和表面活性剂的疫苗的制造技术

专利名称：：同时含乙肝病毒表面抗原和表面活性剂的疫苗的制造技术同时含乙肝病毒表面抗原和表面活性剂的疫苗的制造本文所引用的所有文献都已完整纳入本文作为参考。
技术领域：
本发明属于组合疫苗制造领域，组合疫苗是含有来自一种以上病原体的混合免疫原的疫苗，因此，给予这种疫苗可使对象同时获得对一种以上病原体的免疫力。具体地说，本发明涉及在组合疫苗的制造期间使用表面活性剂。
背景技术：
：单剂量中含有一种以上病原生物的抗原的疫苗被称为"多价"或"组合"疫苗。在欧洲和美国已有许多组合疫苗被批准用于人类，其中包括抵抗白喉、破伤风和百日咳的三价疫苗("DTP"疫苗)和抵抗麻疹、腮腺炎和风疹的三价疫苗("MMR"疫苗)。组合疫苗对患者的益处在于能减少注射次数，从而带来顺应性提高的临床优势(例如参见参考文献1的第29章)，儿科接种时尤其如此。然而同时，由于以下因素其制造较为困难抗原和其他组分之间的物理和生化属性不相容；免疫干扰；以及稳定性。疫苗中必须含有非抗原组分，但这可能造成困难。表面活性剂尤其会给组合疫苗造成问题，这是由于一种抗原可能需要能获得最佳活性的表面活性剂，而这种表面活性剂可能会对其他抗原造成负面影响。此外，儿科疫苗中所含的表面活性剂对一些患者群体可能会造成影响，尽管通常认为这些表面活性剂是安全的。在疫苗领域中特别感兴趣的是聚氧乙烯山梨糖醇酐酯类表面活性剂，尤其是聚山梨醇酯20(也称为"吐温20"，或聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯)和聚山梨醇酯80(也称为"吐温80"，或聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯)。聚山梨醇酯20已用于单价HAVRIXtm甲肝疫苗，聚山梨醇酯80已用于组合疫苗，如5TRIPEDIAtm和INFANRIXtm系列的疫苗。这两种表面活性剂也已被用于稳定液态轮状病毒疫苗[2]。聚山梨醇酯还被用于制造含有乙肝表面抗原('HbsAg，)的组合疫苗，例如参考文献3和4描述了制造四价D-T-P-HBsAg疫苗的方法，其中通过加入非离子型表面活性剂如吐温20、吐温80或TritonX-100以避免干扰HbsAg的磷脂组分。参考文献3和4图2(本文的图l)中的数据显示，表面活性剂是维持HBsAg抗原性所必需的，但对于其他组分则不十分重要。在20|ig/mlHbsAg时检测到的最高表面活性剂浓度为10pg/ml，这时也得到最佳抗原性。在参考文献3和4的方法中，非离子型去污剂在已将HbsAg纯化之后加入。然而在纯化HbsAg之后加入去污剂不是最佳的，因为这在制造过程中需要单独的加工步骤，从而延长了加工时间并增加了在HBsAg中引入污染物的风险。如果在制造组合疫苗时使用污染的组分，则最终的损失将大于制造单价疫苗时丢弃HBsAg，例如，如果将污染的HBsAg组分与干净的D-T-P组分混合则不得不将全部D-T-P-HbsAg混合物丢弃。因此，对于含有非离子型表面活性剂的组合疫苗而言，仍旧需要有在制造过程中不需要将表面活性剂作为单独组分加入的制造方法。发明概述相比将非离子型表面活性剂加入已纯化的抗原[3，4]，本发明在抗原纯化期间使用它们。因此，这种表面活性剂可在最终的组合疫苗中发挥其功能，但污染风险(以及制得之后丢弃所有组合疫苗的风险)被降低。因此，本发明提供了一种制备组合疫苗的方法，其中所述疫苗包含(i)非离子型表面活性剂，(ii)乙肝病毒(HBV)表面抗原，和(iii)至少一种非-HBV病原体的抗原，其中，所述方法包括(i)从重组酵母细胞纯化HBV表面抗原，其中所述纯化包括在存在非离子型表面活性剂时破坏酵母细胞，以得到纯化的HBsAg组分的步骤；和(ii)将纯化的HBsAg组分与至少一种其他非-HBV病原体的抗原组合，以得到所述组合疫苗。为避免上述污染难题，该方法不包括在HBsAg纯化之后将非离子型表面活性剂作为单独组分加入的步骤。表面活性剂(或其他离子型或非离子型表面活性剂)也可能存在于其他抗原组分中，HBsAg将与所述其他抗原组分组合以得到组合疫苗，但应避免在HBsAg中加入作为单独组分的表面活性剂。因此，表面活性剂不作为单独组分加入纯化的HBsAg组分，且不在抗原组合期间加入。本发明还提供了一种制备组合疫苗的方法，其中所述疫苗包含(i)非离子型表面活性剂，(ii)乙肝病毒(HBV)表面抗原，和(iii)至少一种非-HBV病原体的抗原，其中，所述方法包括将纯化的HBV表面抗原与至少一种其他非-HBV病原体的抗原组合，以得到组合疫苗的步骤，其中所述纯化的HBV表面抗原是通过在存在非离子型表面活性剂时破坏表达重组HBsAg的酵母细胞的方法制备的。同样，避免单独加入表面活性剂。本发明还提供了一种免疫原性组合物，其包含(i)非离子型表面活性剂，(ii)乙肝病毒(HBV)表面抗原，和(iii)至少一种非-HBV病原体的抗原，其中所述HBV表面抗原是通过在存在非离子型表面活性剂时破坏表达重组HBsAg的酵母细胞的方法制备的。同样，制备HBsAg时避免单独加入表面活性剂。由于纯化过程中使用的非离子型表面活性剂可保留在HBsAg颗粒中，因此该产品不同于HBsAg是用其他不同方法制得的产品。絲预表臓,本发明可使用各种非离子型表面活性剂[5]，尤其是疫苗制剂中可找到的那些。优选有机表面活性剂。这些通常是环氧垸(例如环氧乙烷)与脂肪醇、脂肪酸、烷基酚、烷基胺或其他具有至少一个活性氢原子的合适化合物的反应产物。对于大多数表面活性剂而言，最常见的醇、胺和酸的碳链长度为C8-C18。最常见的烷基酚是壬基酚和辛基酚。含有聚(氧乙烯)残基的表面活性剂最为优选。例如，本发明可采用的表面活性剂包括，但不限于聚氧乙烯山梨糖醇酐酯表面活性剂(通常称为吐温)，尤其是聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80;环氧乙烷(EO)、环氧丙烷(PO)和/或环氧丁烷(BO)的共聚物，其以商品名DOWFAXtm出售，如线形EO/PO嵌段共聚物；重复乙氧基(氧代-l,2-乙二基)数目可变的辛苯聚醇，特别感兴趣的是辛苯聚醇-9(TritonX-100，或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPALCA-630/NP-40);衍生自月桂基、十六烷基、十八烷基和油烯基醇的聚氧乙烯脂肪醚(称为Brij表面活性剂)，如三乙二醇单月桂基醚(Brij30);和山梨糖醇酐酯(通常称为SPAN)，如山梨糖醇酐三油酸酯(Span85)和山梨糖醇酐单月桂酸酯。聚山梨醇酯20特别适用于本发明。该表面活性剂给予人类，包括用于疫苗的安全性已经得到证实。表面活性剂可根据其'HLB'(亲水性/亲脂性平衡)分类。优选的本发明的表面活性剂的HLB至少为10，优选至少15，更优选至少16。非离子型表面活性剂是本发明组合物的一种组分。为避免给患者施用大剂量的表面活性剂，表面活性剂在组合物中的浓度优选不超过30pg/ml，例如《25吗/ml，《20吗/ml，《15pg/ml，《10吗/ml，《5pg/ml，等等。优选浓度《10吗/ml。作为表示表面活性剂浓度的另一种方法，组合物中表面活性剂的量优选小于50吗(例如《40吗，《30吗，《25pg，《20吗，《15吗，《10吗，等等)/100吗HBsAg。类似地，参考文献3和4建议表面活性剂与HBsAg的质量比小于50%。优选每IOO吗HBsAg含小于25吗表面活性剂。如下文将更加详细描述的，优选的本发明方法采用含白喉和破伤风类毒素的预混组分。这种D-T组分优选基本不含非离子型表面活性剂，且尤其不含聚山梨醇酯20和80。类似的，预混D-T-Pw组分不含非离子型表面活性剂例如聚山梨醇酯20和80。z:條毒表麟嚴乙肝病毒(HBV)是一种已知的造成病毒性肝炎的物质。HBV病毒颗粒由被外部蛋白质外壳或衣壳包裹的内部核心构成。病毒核心含有病毒DNA基因组。衣壳的主要成份是一种称为HBV表面抗原，或者更通常称为'HBsAg'的蛋白质，这是一种分子量约为24kDa的由226个氨基酸构成的蛋白质。所有现有乙肝疫苗均含HBsAg，当这种抗原被给予接种者时它能刺激产生抗-HbsAg抗体从而抵抗HBV感染。为制造疫苗，可用两种方法制备HBsAg。第一种方法涉及从慢性乙肝携带者的血浆中纯化特定形式的抗原，这是因为慢性乙肝携带者的肝脏中会合成大量HBsAg并在HBV感染期间释放到血流中。第二种方法涉及通过重组DNA法表达蛋白质。可用任何一种方法制备用于本发明方法的HBsAg，但优选采用通过重组表达制备的HBsAg。具体地说，优选HBsAg是通过在酵母如酵母属(如酿酒酵母(S.cwvWae))或汉森酵母属(如多形汉森酵母(/^o/;;mow^》中表达制备的。不同于天然HBsAg(即质粒纯化产品中的HBsAg)，酵母表达的HBsAg通常是非糖基化的，且这是可用于本发明的最优选的HBsAg形式。酵母表达的HBsAg是高度免疫原性的，且制造时没有血液产品污染风险。HBsAg通常为基本球形颗粒(平均直径约20nm)的形式，其中含有包含磷脂的脂质基质。酵母表达的HBsAg颗粒可含有在天然HBV病毒颗粒中未发现的磷脂酰肌醇。该颗粒也可含有非毒性量的LPS以刺激免疫系统[6]。HBsAg优选来自HBV亚型adw2。本领域已知许多纯化HBsAg的方法(例如见参考文献7-33)。这些方法被披露用于制造单价HBsAg制品，但不同于参考文献3和4中描述的方法，这些方法无一涉及纯化具体用于组合疫苗的HBsAg。这些以及其他方法都可使用，只要它们适用于在重组酵母细胞中表达之后纯化抗原，其中所述纯化包括在存在非离子型表面活性剂时破坏酵母细胞的步骤。细胞破碎后纯化HBsAg的优选方法包括超滤；排阻层析；阴离子交换层析；超速离心；脱盐；和无菌过滤。细胞破碎后可将裂解液沉淀(例如采用聚乙二醇)，将HBsAg留在溶液中以准备超滤。纯化之后可对HBsAg进行透析(例如用半胱氨酸)，透析可用来除去任何含汞防腐剂，如制备HBsAg时可能采用的硫柳汞[30，34]。HBsAg的量通常以微克表示，每剂疫苗中HBsAg的典型含量为10吗。除了序列外，表面抗原可包含全部或部分前-S序列，如全部或部分前-Sl和/或前-S2序列。养朋F拔嚴本发明的免疫原性组合物包含至少一种来自至少一种非-HBV病原体的保护性抗原。所述非-HBV病原体可以是病毒和/或细菌。典型的病毒病原体包括，但不限于脊髓灰质炎病毒；甲肝病毒；流感病毒；麻疹病毒；腮腺炎病毒；风疹病毒；和水痘带状疱疹病毒。典型的细菌病原体包括，但不限于白喉棒状杆菌(Cw7"e6flc^7'ww梭菌(C/oWr，百日咳博德特氏菌(SoWefe〃a流感嗜血杆菌(i/aewo;^7ws/"y/we"zae)，包括b型和无法分型菌株；脑膜炎奈瑟氏球菌(A^wen'awe"/"g加(^)，包括血清群A、B、C、W135和/或Y;肺炎链球菌OS^印tococcws;wewmo"/ae)，包括血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F;以及粘膜炎莫拉氏菌(^0^16//<7catorWafe)。白喉棒状杆菌造成白喉。可对白喉毒素进行处理(例如采用福尔马林或甲醛)以除去毒性同时保留在注射后诱导特异性抗-毒素抗体的能力。这些白喉类毒素被用于白喉疫苗并更加详细地描述于参考文献1的第13章。优选的白喉类毒素是通过甲醛处理的那些。可使白喉棒状杆菌在可添加有牛提取物的生长培养基(例如，Fenton培养基或者Linggoud和Fenton培养基)中生长，然后进行甲醛处理、超滤和沉淀以得到白喉类毒素。然后用包括无菌过滤和/或渗析的方法处理类毒素化的材料。破伤风梭菌造成破伤风。可对破伤风毒素进行处理以得到保护性类毒素。该类毒素可用于破伤风疫苗并更加详细描述于参考文献1的第27章。优选的破伤风类毒素是经过甲醛处理的那些。可使破伤风梭菌在生长培养基(例如，衍生自牛酪蛋白的Latham培养基)中生长，然后进行甲醛处理、超滤和沉淀以得到破伤风类毒素。然后可用包括无菌过滤和/或渗析的方法处理该材料。百日咳博德特氏菌会造成百日咳。疫苗中的百日咳抗原是细胞抗原(全细胞，以灭活的百日咳杆菌细胞的形式；'wP')或无细胞抗原('aP')。有细胞百日咳抗原的制备已充分论述[例如见参考文献1的第21章]，例如可通过热灭活百日咳杆菌I期培养物来获得。当釆用无细胞抗原时，优选采用以下抗原中的一种、两种或(优选)三种(1)解毒的百日咳毒素(百日咳类毒素，或'PT，)；(2)丝状血凝素('FHA，)；(3)黏附素(pertactin)(也称为'69kDa外膜蛋白，)。这三种抗原优选从生长在改良的Stainer-Scholte液体培养基中的百日咳杆菌培养物中分离来制备。PT和FHA可从发酵肉汤中分离(例如通过吸附到羟基磷灰石凝胶上)，而黏附素可通过热处理和絮凝从细胞中提取(例如采用氯化钡)。可在连续层析和/或沉淀步骤中纯化抗原。PT和FHA可通过例如疏水层析、亲和层析和排阻层析来纯化。黏附素可通过例如离子交换层析、疏水层析和排阻层析来纯化。FHA和黏附素在用于本发明之前可用甲醛处理。PT优选用甲醛和/或戊二醛处理来解毒。除了这种化学解毒方法，PT还可以是酶活性已通过突变而降低的PT突变体[35]，但优选通过化学处理来解毒。b型流感嗜血杆菌('Hib')会造成细菌性脑膜炎。Hib疫苗通常基于荚膜糖抗原[例如参考文献l的第14章]，其制备已经充分论述[例如参考文献36-45]。Hib糖类可偶联于载体蛋白以增强其免疫原性，尤其是在儿童中的免疫原性。典型的载体蛋白有破伤风类毒素、白喉类毒素、白喉类毒素的CRM197衍生物、流感嗜血杆菌D蛋白、以及来自血清群B脑膜炎球菌的外膜蛋白复合物。破伤风类毒素是优选的载体，如用于通常称为'PRP-T，的产品。制备PRP-T时可采用溴化氰活化Hib荚膜多糖，将活化的糖类偶联于己二酸接头(如(l-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)，通常为盐酸盐)，然后使接头-糖类部分与破伤风类毒素载体蛋白反应。偶联物的糖类部分可包含从Hib菌制备的全长聚核糖基核糖醇磷酸(PRP)，和/或全长PRP的片段。可采用的偶联物中糖类:蛋白质的比例(w/w)在l:5(即蛋白质过量)和5:1(即糖类过量)之间，例如，比例在1:2和5:1之间以及比例在1:1.25和1:2.5之间。然而，在优选的疫苗中，糖与载体蛋白的重量比在1:2和1:4之间，优选在1:2.5和1:3.5之间。在破伤风类毒素同时作为抗原和载体蛋白的疫苗中，偶联物中糖与载体蛋白的重量比可在1:0.3和1:2之间[46]。给予Hib偶联物优选导致抗-PRP抗体浓度》0.15吗/ml，更优选》lpg/ml，这些是标准的反应阀值。脑膜炎奈瑟氏球菌造成细菌性脑膜炎。根据生物体的荚膜多糖已经鉴定出脑膜炎奈瑟氏球菌的各种血清群，包括A、B、C、H、I、K、L、29E、W135、X、Y和Z。与疾病最为相关的血清群是A、B、C、W135和Y。目前针对血清群A、C、W135和Y的疫苗基于荚膜糖抗原，但这种方法不适用于血清群B，因此采用蛋白抗原和外膜囊泡作为替代。荚膜糖被偶联于载体蛋白以增强免疫原性。典型的载体蛋白是破伤风类毒素、白喉类毒素、白喉类毒素的CRM197衍生物以及流感嗜血杆菌D蛋白。偶联物的糖部分可包含从脑膜炎球菌制备的全长糖类和/或其片段。血清群C糖类可从OAc+或OAc-菌株制备。对于血清群A糖类，在C-3位优选至少50%(例如至少60%、70%、80%、90%、95%或更多)的甘露糖胺残基被O-乙酰化。可采用的脑膜炎球菌偶联物中糖类:蛋白质的比例(w/w)在1:10(即蛋白质过量)和10:1(即糖类过量)之间，例如，比例可在1:5禾口5:1之间、在1:2.5禾卩2.5:1之间、或在1:1.25禾口1.25:1之间。会合予脑膜炎球菌偶联物优选导致相关血清组的血清杀菌测定(SBA)效价提高至少4倍，优选至少8倍。SBA效价可用幼兔补体或人补体测量[47]。肺炎链球菌造成细菌性脑膜炎。对于Hib和脑膜炎球菌而言，现有疫苗基于荚膜糖类。优选包含来自一种以上肺炎链球菌的血清型的糖类，且尤其至少包含血清型6B、14、19F和23F。此外，血清型优先选自1、3、4、5、7F、9V和18C。例如，23种不同血清型多糖的混合物被广泛使用，与5-ll种不同血清型多糖形成的偶联疫苗也被广泛使用[48]。例如，PrevNarTM[49]含有7种血清型(4、6B、9V、14、18C、19F和23F)的偶联抗原。糖类优选偶联于载体蛋白[例如参考文献50-52]。典型的载体蛋白是破伤风类毒素、白喉类毒素、白喉类毒素的CRM197衍生物以及流感嗜血杆菌D蛋白。PrevNarTM产品中的糖类通过还原性胺化单独偶联于CRM197，每0.5ml剂量中含2pg各种糖类(4pg血清型6B)。除了使用肺炎球菌的糖抗原外，组合物中还可包含一种或多种多肽抗原。肺炎球菌若干菌株的基因组序列是可获得的[53,54]并可对其进行逆向疫苗学研究(reversevaccinology)[55-58]以鉴定合适的多肽抗原[59,60]。例如，组合物可包含以下抗原中的一种或多种PhtA、PhtD、PhtB、PhtE、SpsA、LytB、LytC、LytA、Spl25、SplOl、Spl28、Spl30和Sp130，如参考文献61中所定义。组合物可包含一种以上(例如2、3、4、5、6、7、8、910、11、12、13或14)这些抗原。在一些实施方式中，组合物可同时包含肺炎球菌的糖抗原和多肽抗原。可将它们简单混合，或者可将肺炎球菌糖抗原偶联于肺炎球菌蛋白质。用于该实施方式的合适载体蛋白包括上述肺炎球菌蛋白抗原[61]。粘膜炎莫拉氏菌造成中耳炎和窦炎，有时也造成喉炎。其疫苗目前正在研究，如参考文献62所作的综述。像HBV—样，HAV造成肝炎。HAV疫苗描述于参考文献1的第15章。优选的HAV组分基于灭活的病毒，并可通过福尔马林处理来实现灭活。病毒可生长在人胎肺二倍体成纤维细胞如MRC-5细胞上。优选的HAV毒株是HM175，尽管也可采用CR326F。可在允许病毒生长的条件下培养细胞。将细胞裂解，并通过超滤和凝胶渗透层析来纯化所得悬浮液。脊髓灰质炎病毒造成骨髓灰质炎。除了使用口服脊髓灰质炎病毒疫苗，本发明采用了灭活的脊髓灰质炎病毒疫苗(IPV)，如参考文献1第24章的详细描述所披露。脊髓灰质炎病毒可在细胞培养物中生长，优选的培养物采用衍生自猴肾的Vero细胞系。Vero细胞宜作为培养的微载体。生长之后，可采用诸如超滤、渗滤和层析之类的技术纯化病毒粒子。施用于患者之前，脊髓灰质炎病毒必需被灭活，这可通过用甲醛处理来实现。骨髓灰质炎可由三种类型的脊髓灰质炎病毒中的一种造成。这三种类型是类似的并造成相同的症状，但它们的抗原性迥异，被一种类型感染不会产生对其他类型感染的抵抗力。因此本发明优选采用三种脊髓灰质炎病毒抗原1型脊髓灰质炎病毒(例如Mahoney毒株)、2型脊髓灰质炎病毒(例如MEF-1毒株)，和3型脊髓灰质炎病毒(例如Saukett毒株)。优选将病毒单独培养、纯化和灭活，然后合并以得到大量用于本发明的三价混合物。IPV的量通常用<DU，单位("D-抗原单位"[63])表示。抵抗麻疹、腮腺炎和风疹病毒的抗原通常为活病毒，如在已知的单价和三价('MMR')疫苗中所发现的。麻疹病毒疫苗更加详细描述于参考文献1的第19章。腮腺炎病毒疫苗更加详细描述于参考文献1的第20章。风疹病毒疫苗更加详细描述于参考文献1的第26章。典型的麻疹病毒株包括Moraten;Co皿aught;Schwarz;Edmonston隱Zagreb;CAM隱70;AIK-C;TD97;Leningrad-16;Shanghai-191;等等。Schwarz和Moraten毒株在美国和欧洲最常使用。典型的腮腺炎病毒株包括JerylLynn;RIT4385;Urabe;Hoshino;Rubim;Leningrad-3;Leningrad-Zagreb;Miyahara;Torii;NKM-46;S-12;等等。JerylLynn、RIT4385、Urabe和Leningrad-Zagreb毒株是全世界最常见的毒株。典型的风疹病毒株包括RA27/3;Matsuba;TCRB19;Takahashi;Matsuura;TP-336;等等。RA27/3是西方国家最常使用的毒株。抵抗禽痘的VZV抗原通常是基于病毒Oka毒株的活病毒。VZV疫苗更详细描述于参考文献l的第28章。流感病毒抗原更详细描述于参考文献1的第17和18章。广而言之，流感病毒疫苗可基于活病毒或灭活病毒，而灭活疫苗可基于全病毒、'裂解'病毒或纯化的表面抗原(包括血凝素和神经氨酸酶)。用来制备疫苗的病毒可生长在鸡蛋或细胞培养物上。流感病毒的疫苗株可随季节而改变。在目前的国际大流行期间，疫苗通常包含两种甲型流感病毒株(H1N1和H3N2)和一种乙型流感病毒株，通常为三价疫苗。本发明还可使用流行性毒株的病毒(即疫苗接受者和普通人群对其无免疫力的毒株)，如H2、H5、H7或H9毒株亚型(尤其是甲型流感病毒)，且针对流行性毒株的流感疫苗可以是单价的或者可基于添加有流行性毒株的常规三价疫苗。流感病毒可以是重配株，并且可通过反向遗传学技术获得。病毒可以是减毒的。病毒可以是温敏的。病毒可以是冷适应的。用于疫苗的这些病原体的抗原性组分通常用以下縮写名称表示'D'表示白喉类毒素；T表示破伤风类毒素；'P'表示百日咳抗原，'Pa'为无细胞的，而'Pw'为细胞的；'Hib'表示b型流感嗜血杆菌荚膜糖；'MenA'、'MenB'、'MenC'、'MenW'和'MenY'表示各种脑膜炎球菌血清群；'IPV'表示灭活的脊髓灰质炎病毒；而'Spn'表示月巿炎球菌。当将抗原性组分与HBsAg组合以制备多价组合物时，抗原可分别加入或在与HBsAg组合之前将它们预混。当使用D和T抗原时，优选使用预混的D-T组分。这种二价组分可用于本发明方法，例如可将它与HBsAg组合以制造三价D-T-HBV组分。替代方法为，可将D-T组分与其它非-HBV抗原(例如与无细胞百日咳抗原)组合，然后可将该组分与HBsAg组合，等等。当使用D、T和Pw抗原时，优选使用预混的D-T-Pw组分，然后将该组分用于本发明方法。当本发明组合物中含有佐剂时，佐剂可在各种阶段加入。通常，先将抗原与佐剂组合然后再用于本发明方法(例如可将二价D-T混合物吸附到铝盐佐剂上，然后再用于本发明方法，可通过单独制备类毒素、将它们各自吸附到氢氧化铝佐剂上、然后混合两种吸附的类毒素(任选加入其他佐剂)，从而得到用于本发明方法的材料)，但也可以先混合抗原然后再加入佐剂，或者将抗原加入佐剂(例如从水性佐剂开始，然后加入单独的或预混的抗原)。如下文所述，优选将HBsAg组分吸附到磷酸铝佐剂上，然后再与非-HBV抗原性组分混合。除HBsAg外，优选的本发明组合物至少包含D、T和P抗原(见参考文献3和4)。特别优选的组合物具有以下组合-HBsAg、D、T-HBsAg、D、T、Pw-HBsAg、D、T、Pw、Hib<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>-HBsAg、Hib-HBsAg、甲肝病毒这些组合物可由所列抗原构成，或者还可含有其他病原体的抗原。因此它们可单独使用或作为其他疫苗的组分。在本发明的一些实施方式中，所述组合物不是5价D-T-Pa-HBV-IPV[30]。因此该组合物可包含Pw组分和/或至少一种偶联物。絲优选的本发明的免疫原性组合物包含佐剂，且该佐剂优选包括一种或多种铝盐，且尤其是磷酸铝佐剂和/或氢氧化铝佐剂。用于本发明方法的抗原性组分优选在使用前含有铝佐剂，即它们被'预混合'或'预吸附'到佐剂上。在含有HBsAg和白喉类毒素的组合物中，所述白喉类毒素可被吸附于氢氧化铝佐剂。在含有HBsAg和破伤风类毒素的组合物中，所述破伤风类毒素可被吸附于氢氧化铝佐剂，但这不是必需的(例如可吸附破伤风类毒素重量的0-10%)。在含有HBsAg和全细胞百日咳抗原的组合物中，所述wP抗原优选与氢氧化铝佐剂和/或磷酸铝佐剂组合。在含有HBsAg和无细胞百日咳抗原的组合物中，所述百日咳抗原可被吸附于一种或多种铝盐佐剂，或者可以未吸附状态加入。当组合物中存在黏附素时则优选在用于本发明方法之前吸附于氢氧化铝佐剂。PT和FHA可被吸附于氢氧化铝佐剂或磷酸铝，然后再用于本发明的方法。在优选的实施方式中，PT、FHA和黏附素可单独预吸附于氢氧化铝，然后再用于本发明的方法。在含有HBsAg和Hib抗原的组合物中，所述Hib偶联物可以是未吸附的，但优选吸附于磷酸铝佐剂[64]。用这种方法吸附对于含有D-T-Pw-Hib-HBsAg抗原的疫苗尤其有效。其他偶联抗原(例如脑膜炎球菌，肺炎球菌)可类似地吸附于铝盐(例如磷酸盐)或者可以是未吸附的[65]。IPV抗原在用于本发明方法之前通常不吸附于任何佐剂，但它们可与其他组分一起吸附于铝佐剂。可采用参考文献66中描述的方法将组合物中的HBsAg吸附于磷酸铝。吸附于磷酸铝不同于熟知的ENGERTX-BTM产品(其中HBsAg被吸附于氢氧化铝)，但与HEPACCINEtm和RECOMBIVAXTM产品相同。如参考文献61中所提到的，对于HBsAg而言磷酸铝是优于氢氧化铝的佐剂。尽管在最终的疫苗中HBsAg可被吸附于氢氧化铝佐剂(如在熟知的ENGERIX-BTM产品中那样)，或者可保持未吸附，但通常将吸附于磷酸铝佐剂。此外，优选先预吸附于磷酸铝再用于本发明方法。当本发明方法采用先将白喉和破伤风类毒素混合再将它们与HBsAg组合而得到的组分时，这种D-T混合物优选含有吸附有D和T抗原的氢氧化铝佐剂。当本发明方法采用先将白喉类毒素、破伤风类毒素和全细胞百日咳抗原混合再将它们与HBsAg组合而得到的组分时，这种D-T-Pw混合物优选同时含有吸附有D和T抗原的氢氧化铝佐剂和磷酸铝佐剂。目前使用的铝佐剂通常被称为"氢氧化铝"或"磷酸铝"佐剂。然而这些只是为方便起见而取的名字，它们都没有准确描述所存在的实际化合物(例如参见16参考文献68的第9章)。本发明可采用通常用作佐剂的任何"氢氧化物"或"磷酸盐,，被称为"氢氧化铝"的佐剂通常为铝的羟基氧化物盐类，其通常至少部分为晶体状的。铝的羟基氧化物可表示为A10(OH)，通过红外(IR)光谱，尤其是通过1070cm'1出现的吸收带和3090-3100cm"出现的强肩峰可将其与其它铝化合物如氢氧化铝A1(0H)3区别开[参考文献68的第9章]。被称为"磷酸铝"的佐剂通常为铝的羟基磷酸盐，经常还含有少量硫酸盐。它们可通过沉淀获得，沉淀期间的反应条件和浓度会影响磷酸根对盐中羟基的取代程度。羟基磷酸盐中P04/A1的摩尔比通常在0.3和0.99之间。羟基磷酸盐因存在羟基而不同于严格的A1P04。例如，3164cm"处的IR光谱条带(例如当加热至20(TC时)证明存在结构性羟基[参考文献68的第9章]。磷酸铝佐剂的P(VA产摩尔比通常为0.3-1.2，优选0.8-1.2，更优选0.95士0.1。磷酸铝通常是无定形的，尤其对于羟基磷酸盐而言。典型的佐剂一般为无定形羟基磷酸铝，其中P04/A1摩尔比为0.84-0,92，包含0.6mgAl3+/ml。磷酸铝通常是颗粒。抗原吸附后其颗粒的直径一般为0.5-20pm(如约5-10pm)。磷酸铝的PZC与用磷酸根取代羟基的程度成反比，这种取代程度可随着用于通过沉淀制备盐的反应条件和反应物浓度而改变。也可通过改变溶液中游离磷酸根离子的浓度(磷酸根越多-PZC的酸性越强)或通过加入缓冲液如组氨酸缓冲液(使PZC的碱性更强)来改变PZC。用于本发明的磷酸铝的PZC通常为4.0-7.0,更优选5.0-6.5，如约5.7。用于制备本发明组合物的磷酸铝溶液可(但不必须)含有缓冲液(如磷酸盐或组氨酸缓冲液或Tris缓冲液)。磷酸铝溶液优选无菌和无热原。磷酸铝溶液可包含游离的水性磷酸根离子，如以浓度为1.0-20mM，优选为5-15mM，更优选约为10mM存在的水性磷酸根离子。磷酸铝溶液也可包含氯化钠。氯化钠浓度优选为0.1-100mg/ml(如0.5-50mg/ml，l-20mg/ml，2-10mg/ml)，更优选约为3±1mg/ml。存在NaCl有助于在吸附抗原之前正确测定pH。在一些实施方式中，本发明可将含有含聚山梨醇酯80、Span85和鲨烯混合物的水包油乳剂的组合物排除在外[69]。在一些实施方式中，本发明可将含有油、a-生育酚和聚山梨醇酯80混合物的组合物排除在外[70]。在一些实施方式中，本发明可将含皂苷佐剂(如QS21)和非离子型表面活性剂(如聚山梨醇酯40、60或80)的组合物排除在外。在一些实施方式中，本发明可将含皂苷佐剂、可代谢的油和非离子型表面活性剂的组合物排除在外[71]。在一些实施方式中，本发明可将含皂苷佐剂、水包油乳剂和固醇的组合物排除在外[72]。在一些实施方式中，本发明可将含3d-MPL、QS21、甘油三酯和水包油乳剂的组合物排除在外[73]。錄歸鹏々絲離維遂会本发明方法包括将纯化的HBsAg与至少一种非-HBV病原体的至少一种抗原组合的步骤。抗原可依次单独组合，或者可将它们预混并一起加入。例如，制造4价DTP-HBsAg疫苗的方法可包括在容器中依次加入HBsAg、D、T和P抗原，或者先预混D、T和P抗原然后将HBsAg与DTP混合物组合。抗原性组分可以任何合适顺序组合。非-HBV病原体的抗原可包含表面活性剂，这种表面活性剂可与纯化HBsAg时使用的非离子型表面活性剂相同或不同。当其他抗原性组分包含表面活性剂时本发明的方法尤其有用，因为这样可避免加入表面活性剂的多个单独步骤。一种或多种非-HBV组分包含聚山梨醇酯80的方法是优选的。当本发明组合物中含有白喉和破伤风类毒素时，优选将它们预混后再与HBsAg组合。因此，本发明方法包括将含有HBsAg的第一组分与含有D和T抗原的第二组分组合。类似地，当组合物中含有白喉类毒素、破伤风类毒素和全细胞百日咳抗原时，优选将它们预混，因此本发明的方法包括将含有HBsAg的第一组分与含有D、T和Pw抗原的第二组分组合。当使用D-T混合物时，本发明疫苗中白喉类毒素与破伤风类毒素的比例通常在2:l和3:l之间(以Lf为单位测量)，优选在2.4:1和2.6:1之间，更优选为2.5:1。当本发明组合物含有佐剂时，佐剂也可以在不同阶段加入。通常，先混合抗原与佐剂再用于本发明方法(例如先将二价D-T混合物吸附于铝盐佐剂再用于本发明方法)，当也可以在将抗原混合之后再加入佐剂或先将抗原加入佐剂(例如从水性佐剂开始，然后加入单独的或预混的抗原)。如上文所述，优选将HBsAg组分吸附到磷酸铝佐剂，然后再与非-HBV抗原性组分组合。资練劳本发明组合物可包含(a)抗原性组分；和(b)非抗原性组分。所述抗原性组分可包含上述抗原或由上述抗原构成。所述非抗原性组分可包括载体、佐剂、赋形剂、缓冲剂，等等，下文将更加详细描述。这些非抗原性组分可具有各种来源。例如，它们可存在于制造期间使用的一种抗原或佐剂材料中或者可独立于那些组分而加入。优选的本发明组合物包含一种或多种药物载体和/或赋形剂。为控制张力，优选包含生理盐，如钠盐。优选氯化钠(NaCl)，其含量可以为l-20mg/ml。组合物的重量克分子渗透浓度将在200mOsm/kg和400mOsm/kg之间，优选240-360mOsm/kg，且更优选为2卯-320mOsm/kg。之前已报道称重量克分子渗透浓度对于接种造成的疼痛没有影响[74]，尽管如此将重量克分子渗透浓度保持在该范围内是优选的。本发明的组合物可含有一种或多种缓冲液。典型的缓冲液包括磷酸缓冲液；Tris缓冲液；硼酸缓冲液；琥珀酸缓冲液；组氨酸缓冲液；或柠檬酸缓冲液。缓冲液的含量通常为5-20mM。本发明组合物的pH通常在5.0和7.5之间，为得到最佳的稳定性更通常在5.0和6.0之间，或当存在白喉类毒素和/或破伤风类毒素时在6.0和7.0之间。因此，本发明的方法在包装之前可包括调节半成品疫苗的pH的步骤。本发明的组合物优选是无菌的。本发明的组合物优选是无热原的，例如含有<1EU(内毒素单位，标准测量)/剂，优选0.1EU/剂。本发明的组合物优选不含谷蛋白。由于HBsAg的吸附特性，最终的疫苗产品可以是具有絮状外观的悬浮液。这种外观意味着不容易看见微生物污染，因此疫苗中优选含有防腐剂。当将疫苗包装在多剂量容器中时这特别重要。优选包含的防腐剂是2-苯氧乙醇和硫柳汞。然而如果可能本发明方法不使用汞防腐剂(例如硫柳汞)。因此，用于所述方法的一种到所有组分可基本不含汞防腐剂(尤其是二价D-T组分；IPV组分；偶联组分)。然而，如果先用这种防腐剂处理组分(尤其是HBsAg)再用于本发明则不可避免会含有痕量防腐剂。然而为安全起见，优选最终组合物中含有少于约25ng/ml汞。更优选地，最终疫苗产品含有不可检测的硫柳汞。这通常可通过先除去抗原制品中的汞防腐剂再将其用于本发明方法或者在制备用于制造组合物的组分时避免使用硫柳汞而实现。当本发明方法采用二价D-T混合物时，它应不含硫柳汞。在一些实施方式中，D-T混合物可含有2-苯氧乙醇，但在其他实施方式中它不含硫柳汞和2-苯氧乙醇。当本发明方法采用三价D-T-Pw混合物时，它可不含2-苯氧乙醇，但可含有硫柳汞。制造期间，通常用WPI(注射用水)稀释组分以得到所需的最终浓度。以A产表示，本发明组合物中磷酸铝的浓度优选小于5mg/ml，例如《4mg/ml，《3mg/ml，《2mg/ml，《1mg/ml，等等。本发明组合物中HBsAg的浓度优选小于60pg/ml，例如《55吗/ml，《50^g/ml，《45pg/ml，《40吗/ml，等等。典型浓度约20)ig/ml。本发明组合物中白喉类毒素的浓度通常至少为50IU/ml。本发明组合物中破伤风类毒素的浓度通常至少为100IU/ml。本发明组合物中白喉类毒素与破伤风类毒素的比例通常在2:1和3:1之间(以Lf为单位测量)，优选在2.4:1和2.6:1之间，更优选为2.5:1。本发明组合物中wP抗原的量通常至少为8IU/ml。以糖计，本发明组合物中Hib偶联物的量通常在10和30pg/ml之间。以EU(Elisa单位)计，HAV抗原的量通常至少为600EU/ml。IPV抗原的量取决于毒株的血清型。对于1型病毒，组合物通常含有约80DU/ml。对于2型病毒，组合物通常含有约16DU/ml。对于3型病毒，组合物通常含有约65DU/ml。以糖计，本发明组合物中脑膜炎球菌偶联物的量通常在每毫升各血清群5-25吗之间。以糖计，本发明组合物中肺炎球菌偶联物的量通常在每毫升各血清型2-20吗之间。本发明的组合物优选以0.5ml的剂量给予患者。当提及0.5ml的剂量时应理解为包括正常的偏差，如0.5ml士0.05ml。本发明可提供适合包装成单次剂量的半成品，然后可将该单次剂量分配给患者。上面提到的浓度通常是最终包装剂中的浓度，因此半成品疫苗的浓度可能较高(例如通过稀释降至最终浓度)。本发明组合物将通常为水性形式。在用本发明所述方法制造的最终疫苗中可能还保留有痕量的各种抗原性组分的残余物质。例如，如果采用甲醛来制备白喉、破伤风和百日咳的类毒素，则最终的疫苗产品可能保留有痕量的甲醛(例如少于1(Hig/ml，优选〈5pg/ml)。在制备脊髓灰质炎病毒时可能采用培养基或稳定剂(例如培养基199)，这些物质可能被携带入最终的疫苗。类似地，游离氨基酸(例如丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸和/或甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、脯氨酸和/或羟脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和/或缬氨酸)、维生素(例如胆碱、抗坏血酸等)、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、钙、葡萄糖、腺嘌呤硫酸、酚红、乙酸钠、氯化钾等可保留在最终的疫苗中，其各自的浓度《100ng/ml，优选〈10iig/ml。抗原制备中的其他组分，如新霉素(例如硫酸新霉素，尤其来自IPV组分)、多粘菌素B(例如硫酸多粘菌素B、尤其来自IPV组分)等也可以，例如，每剂亚纳克级的量存在。源自抗原制剂的最终疫苗的其他可能组分来源于未对抗原进行充分纯化。因此可能存在小量百日咳博德特氏菌、白喉棒状杆菌、破伤风梭菌和/或酿酒酵母的蛋白质和/或基因组DNA。为使这些残余组分的量最小化，优选先处理抗原制剂以去除所述残余组分再将抗原用于本发明方法。当采用IPV组分时，通常使其在Vero细胞上生长。最终的疫苗优选含有小于10ng/ml，优选《lng/ml，例如《500pg/ml或《50pg/mlVero细胞DNA，例如少于1Ong/mlVero细胞DNA，所述DNA的长度》50个碱基对。錄微会離包麥将HBsAg与佐剂组合之后，本发明方法可包括取出0.5ml混合物样品并将其包装入容器的步骤。对于多剂量情况，可取出多个剂量并将它们一起包装在单个容器内。本发明方法还可包括将疫苗包装入容器以供使用的进一步的步骤。合适的容器包括药瓶和一次性针筒(优选无菌针筒)。当将本发明的组合物包装入药瓶时，优选这些药瓶是用玻璃或塑料材料制成的。药瓶在加入组合物之前优选被灭菌。为避免对乳胶过敏患者造成问题，可用不含乳胶的塞子密封药瓶。药瓶中可装有单剂量疫苗或者可装有一剂以上疫苗('多剂量'药瓶)，例如，10剂。当采用多剂量药瓶时，各剂量应在严格无菌条件下用无菌针头和针筒取出，同时要小心避免污染药瓶的内容物。优选的药瓶由无色玻璃制成。药瓶可具有适配的盖子(例如，Luer锁紧套口)，从而可将预装针筒插入该盖，将针筒的内容物排入药瓶内(例如以重建其中的冻干材料)，并可将药瓶的内容物重新吸回针筒。从药瓶上取下针筒之后，可加上针头并可将组合物施用于患者。所述盖优选位于封口或覆盖物内侧，从而在接触盖子之前封口或覆盖物己被除去。当组合物被包装入针筒时，针筒上通常未附加针头，但可与针筒一起提供单独的针头以供装配和使用。优选安全针头。通常为1英寸23号、1英寸25号和5/8英寸25号针头。可在针筒上提供可剥离的印有内容物批号和有效期的标签以方便保存。针筒内的活塞优选有限位件以防止活塞在抽吸过程中意外被拉出。针筒可具有乳胶橡皮帽和/或柱塞。一次性针筒装有单剂量疫苗。针筒通常会具有针帽以在附加针头之前密封针尖，且该针帽优选由丁基橡胶制成。如果针筒和针头是独立包装的，则优选为针头配备丁基橡胶护罩。优选灰色丁基橡胶。优选的针筒是以商品名"Tip-Lok"TM销售的针筒。当采用玻璃容器(例如，针筒或药瓶)时，优选采用由硼硅玻璃而非钠钙玻璃制成的容器。将组合物装入容器后将该容器装箱以供销售，例如装入纸板箱，箱上还将标示疫苗的细节，例如其商品名、疫苗中抗原的组成(例如，'乙肝重组体，等)、容器规格(例如，'一次性预装Tip-Lok针筒，或'10x0.5ml单剂量药瓶，)、其剂量(例如，'各含一个0.5ml剂量')、警告(例如，'仅供儿科使用')、有效期、适应症(例如'有效免疫抵抗所有已知亚型造成的乙肝病毒(HBV)感染，可用于肾功能不全(包括血透析前(pre-haemodialysis)和血透析)的患者，患者年龄15岁以上，，等等)、专利号，等等。每箱可含有一个以上包装的疫苗，例如5个或10个包装的疫苗(尤其对于药瓶而言)。如果疫苗是含在针筒内的，则包装上应显示针筒的图片。疫苗可包装在一起(例如装入同一箱子)并夹入包含疫苗细节的单页，如给药说明、疫苗内抗原的细节等。说明还可包括警告，例如将肾上腺素溶液放在方便获得的地方以应对接种后发生的过敏反应等。包装好的疫苗优选储存于2-8'C。不应冷冻。制造过程中疫苗可以全液体形式提供(即所有抗原性组分都在水性溶液或悬浮液中)，或者可制备其中一些组分为液体形式而其他组分为冻干形式的疫苗。因此，可在使用时将以下两种组分混合在一起而临时制备最终的疫苗(a)包含水性抗原的第一组分；和(b)包含冻干抗原的第二组分。这两种组分优选存在于独立容器内(例如药瓶和/或针筒)，同时，本发明提供了含有组分(a)和(b)的试剂盒。这种形式对于含有偶联物组分，尤其是Hib和/或脑膜炎球菌和/或肺炎球菌偶联物的疫苗尤其有用，因为这些组分在冻干形式下可能更加稳定。因此，可将偶联物冻干再用于本发明。冻干之前也可加入其他组分，例如稳定剂。优选的稳定剂包括乳糖、蔗糖和甘露醇，以及它们的混合物，如乳糖/蔗糖混合物、蔗糖/甘露醇混合物，等等。因此，最终的疫苗可含有乳糖和/或蔗糖。采用蔗糖/甘露醇混合物能加速干燥过程。因此，本发明提供了制备两容器组合疫苗的方法，该方法包括以下步骤-如上所述制备水性组合疫苗，但其中所述一种或多种抗原不包括偶联的荚膜糖抗原；-将所述组合疫苗包装在第一容器内(例如针筒)；-制备冻干形式的偶联的荚膜糖抗原；-将所述冻干的抗原包装在第二容器内(例如药瓶)；和-将所述第一容器和第二容器一起包装在试剂盒内。然后可将所述试剂盒分发给医师。D、T、P和HBsAg组分优选为液体形式。賴^微微赫膽本发明组合物适合给予人类患者，且本发明提供了提升患者免疫应答的方法，该方法包括将本发明组合物给予患者的步骤。本发明还提供了本发明组合物在药物中的用途。本发明还提供了(i)从重组酵母细胞纯化的HBsAg，其中所述纯化过程包括在存在非离子型表面活性剂时破坏酵母细胞，和(ii)一种或多种非-HBV抗原，在制造给予患者的药物中的应用。本发明的免疫原性组合物优选是疫苗，该疫苗至少用于预防和/或治疗乙肝病毒感染。已经接受本发明组合物的患者的血清抗-HBsAgGM效价优选^500mIU/ml，所述值在第一次免疫接种6周后测得。更优选，当12个月后测量时，所述效价》500mlU/ml。为发挥充分功效，典型的儿童初次免疫方案可包括给予一次以上的剂量。例如，可在以下时间给予剂量第0和6个月(0时刻为第一次给药的时间)；第0、1、2和6个月；第O天、第21天，然后在6-12个月之间给予第三次剂量；第2、4和6个月；第3、4和5个月；第6、10和14周；或第O、1、2、6和12个月。组合物还可用作加强剂量，例如对儿童而言在其两岁时使用。本发明组合物可通过肌内注射给予，例如注射到手臂或腿中。按照本发明制造的疫苗可与单独的肺炎球菌偶联疫苗，如PrevnarTM同时给予患者。由于本发明组合物包含铝基佐剂，储藏过程中组分可能会沉淀。因此在给予患者之前需要振荡组合物。经过振荡的组合物将是混浊的白色悬浮液。汰遂舰艰具体的本发明的多价免疫原性组合物包括含有HBsAg、D、T、Pa和IPV的五价组合物。该疫苗为水性形式。同时含有氢氧化铝和磷酸铝佐剂。HBsAg被吸附于磷酸铝。D、T和Pa被吸附于氢氧化铝。每毫升中含约50Lf白喉类毒素；约20Lf破伤风类毒素；约50吗PT;约50吗FHA;约16吗黏附素；约20吗HBsAg;约80DU1型脊髓灰质炎病毒；约16DU2型脊髓灰质炎病毒；约64DU3型脊髓灰质炎病毒。剂量约0.5ml。可装在预装针筒中。含HBsAg、D、T、Pa和IPV的五价组合物。该疫苗为水性形式。同时含有氢氧化铝和磷酸铝佐剂。HBsAg被吸附于磷酸铝。D、T和Pa被吸附于24氢氧化铝。每毫升中含至少60IU白喉类毒素；至少80IU破伤风类毒素；约50吗PT;约50吗FHA;约16吗黏附素；约20吗HBsAg;约80DU1型脊髓灰质炎病毒；约16DU2型脊髓灰质炎病毒；约64DU3型脊髓灰质炎病毒。剂量约0.5ml。可装在预装针筒中。含HBsAg、D、T和Pw的四价组合物。该组分为水性形式。同时含有氢氧化铝和磷酸铝佐剂。HBsAg被吸附于磷酸铝。D和T被吸附于氢氧化铝。该组合物包含硫柳汞，但优选不含2-苯氧乙醇。每毫升中含至少60IU白喉类毒素；至少120IU破伤风类毒素；至少8IUPw;约20吗HBsAg。剂量约0.5ml。含HBsAg、D、T、Pw和Hib-T偶联物的五价组合物。HBsAg、D、T和Pw组分为水性形式；Hib-T被冻干。同时含有氢氧化铝和磷酸铝佐剂。D和T被吸附于氢氧化铝。HBsAg和Hib-T被吸附于磷酸铝。冻干的Hib-T包含乳糖。水性组分中可含有硫柳汞。每毫升中含至少60IU白喉类毒素；至少120IU破伤风类毒素(加上作为Hib-T载体的5-25吗破伤风类毒素);至少8IUPw;约20吗HBsAg;约5吗Hib-T(以糖类计)。剂量约0.5ml。含HBsAg、D、T、Pw以及Hib-T偶联物、MenA偶联物和MenC偶联物这三种偶联物的七价组合物。HBsAg、D、T和Pw组分为水性形式；三种偶联物被冻干。同时含有氢氧化铝和磷酸铝佐剂。D和T被吸附于氢氧化铝。HBsAg被吸附于磷酸铝。冻干组分中可包含乳糖和/或蔗糖。水性组分可包含硫柳汞。每毫升中可能含至少60IU白喉类毒素；至少120IU破伤风类毒素(加上作为Hib-T载体的5-25吗破伤风类毒素)；至少8IUPw;约20吗HBsAg;约5吗各种偶联物(以糖类计)。剂量约0.5ml。这些组合物本身可用作疫苗或作为进一步疫苗的组分。例如，本发明提供了一种六价组合物，其包含上述五价HBsAg-D-T-Pa-IPV组合物加上冻干的Hib-T偶联物。所述冻干的Hib-T优选不吸附于铝盐。本发明还提供了一种七价组合物，其包含上述五价HBsAg-D-T-Pa-IPV组合物加上冻干的Hib-T和MenC偶联物。本发明还提供了一种八价组合物，其包含上述五价HBsAg-D-T-Pa-IPV组合物加上冻干的Hib-T、MenC和MenY偶联物。本发明还提供了一种五价组合物，其包含上述四价HBsAg-D-T-Pw组合物加上冻干的Hib-T偶联物。本发明还提供了一种七价组合物，其包含上述四价HBsAg-D-T-Pw组合物加上冻干的Hib-T偶联物、MenA偶联物和MenC偶联物的混合物。使用时可用含有HBsAg的水性材料重建冻干材料以得到最终的疫苗，且冻干组分和水性组分优选一起包装在试剂盒中，如上所述。具体的本发明方法包括那些包括以下步骤的方法按照本发明纯化HBsAg;将HBsAg吸附于磷酸铝佐剂；获得不含硫柳汞、带有氢氧化铝佐剂的二价D-T混合物；获得PT、FHA和黏附素作为Pa组分；获得EPV抗原，将l、2和3型合并在一起，优选不含铝盐佐剂；以任何顺序组合D-T、Pa、IPV和HBsAg，以得到最终的七价组合物；任选包装在针筒内。按照本发明纯化HBsAg;将HBsAg吸附于磷酸铝佐剂；获得不含2-苯氧乙醇、含硫柳汞、带有氢氧化铝和磷酸铝佐剂的三价D-T-Pw混合物；将D-T-Pw与HBsAg组合以得到最终的四价组合物；任选包装在针筒内；任选与冻干的偶联物组分如Hib-T、MenA、MenC组合包装。按照本发明纯化HBsAg;将HBsAg吸附于磷酸铝佐剂；获得不含2-苯氧乙醇、含硫柳汞、带有氢氧化铝和磷酸铝佐剂的三价D-T-Pw混合物；获得冻干的Hib-T偶联物；将D-T-Pw和HBsAg组合以得到水性四价组分；将水性四价组分包装在玻璃瓶内；将冻干的Hib-T和/或MenC和/或MenY包装在玻璃瓶内；将两个瓶子一起装在单个试剂盒内以供重建得到五价组合疫苗。所述玻璃瓶可以是I型玻璃并配有丁基橡胶塞。按照本发明纯化HBsAg;将HBsAg吸附于磷酸铝佐剂；获得不含2-苯氧乙醇、含硫柳汞、带有氢氧化铝和磷酸铝佐剂的三价D-T-Pw混合物；获得IPV抗原，将l、2和3型合并在一起，优选不含铝盐佐剂；以任何顺序合并D-T-Pw、IPV和HBsAg以得到最终的五价组合物；任选包装在针筒内；任选与冻干的偶联物组分如Hib-T、MenA、MenC组合包装。其他组分可在任何阶段加入，例如氯化钠、佐剂、防腐剂，等等。例如，这些方法可用于制备上述疫苗。可在几乎相同时间进行不同的方法步骤，或者可单独进行。可在相同位置或不同位置，甚至在不同国家进行方法步骤，例如可在与冻干Hib-T不同的位置进行HBsAg的纯化。微激纖條A偶联的糖抗原包含载体蛋白，其中的糖是直接或通过接头共价连接的。偶联技术的一般信息可在参考文献45中找到。已知可将各种蛋白质用作载体，优选的载体蛋白是细菌毒素或类毒素，如白喉类毒素或破伤风类毒素。其他合适的载体蛋白包括，但不限于，白喉毒素的CRM197突变体[75-77]、脑膜炎奈瑟球菌外膜蛋白[78]、合成肽[79、80]、热激蛋白[81,82]、百日咳蛋白[83，84]、细胞因子[85]、淋巴因子[85]、激素[85]、生长因子[85]、含有各种病原体衍生抗原的多种人CD4+T细胞表位的人造蛋白[86]如N19[87]、流感嗜血杆菌的D蛋白[88,89]、肺炎球菌表面蛋白PspA[90]、肺炎球菌溶血素[91]、铁摄取蛋白[92]、艰难梭菌(Cj骄c/fe)的毒素A或B[94]等等。糖类优选通过-NH2基连接于载体，例如载体蛋白赖氨酸残基或精氨酸残基侧链中的-NH2基。也可以连接于-SH基(例如在半胱氨酸侧链中)。偶联物中糖:蛋白质的比例(w/w)在l:5(即蛋白质过量)和5:1(即糖类过量)之间是优选的。组合物可包含小量游离载体。不考虑任何作为单独抗原的载体，未偶联载体优选不超过组合物中所有载体蛋白总量的5%，其含量更优选小于2重量％。组合物中也可包含一种以上类型的载体蛋白，例如以降低载体抑制风险。用于脑膜炎奈瑟氏球菌偶联物的载体蛋白可以是流感嗜血杆菌的D蛋白。这种蛋白质详细描述于参考文献参考文献95和96，将其用作偶联物中的载体蛋白描述于参考文献97。术语"D蛋白"包括天然的全长蛋白质的片段，如参考文献97所述，还包括含有全长D蛋白或这些片段的融合蛋白(例如，流感病毒NS1蛋白的片段和D蛋白的片段的融合物)。当这些片段与T-非依赖性糖类抗原偶联时保留了将其转变成T-依赖性抗原的能力。典型的片段至少将包括D蛋白N-端的1/3。该蛋白质可在大肠杆菌中方便地表达[96]，且这种重组材料优选用于本发明[97]。凝遂术语"含有"包括"包含"以及"由...组成"，例如"含有"X的组合物可仅由X组成或可包含其它的物质，例如X+Y。术语"基本上，，不排除"完全"，例如"基本上不含"Y的组合物可完全不含Y。"基本上"可视需要从本发明定义中省去。与数值x相关的术语"约"表示，例如x±10%。除非另有说明，包括混合两种或多种组分的步骤的方法对于特定混合顺序没有任何要求。因此可以任何顺序混合组分。当有三种组分时则可将两种组分相互组合，然后将该组合物与第三种组分合并，等等。当将抗原描述为被"吸附"到佐剂时，优选至少50%(以重量计)的抗原被吸附，例如50%、60%、70%、80%、卯％、95%、98%或更多被吸附。优选白喉类毒素和破伤风类毒素都被全部吸附，即在上清液中检测不到。也优选将HBsAg全部吸附。白喉类毒素的量可表达为国际单位(IU)。例如，NIBSC提供的'吸附的白喉类毒素的第三国际标准1999'(DiphtheriaToxoidAdsorbedThirdInternationalStandard1999)[98，99]含有160IU/安瓿。除了IU系统，'Lf，单位("絮凝化单位"或"临界絮凝化剂量")被定义为与1国际单位抗毒素混合产生最佳絮凝化混合物的类毒素的量[100]。例如，NIBSC提供的'简易白喉类毒素'(DiphtheriaToxoid,Plain)[101]，其含有300LF/安瓿，并还提供了'用于絮凝试验的白喉类毒素的第一国际参考试剂，(The1stInternationalReferenceReagentForDiphtheriaToxoidForFlocculationTest)[102]，其含有卯0LF/安瓿。破伤风类毒素的量可表达为国际单位(IU)。例如，NIBSC提供的'吸附的破伤风类毒素的第三国际标准2000，(TetanusToxoidAdsorbedThirdInternationalStandard2000)[103，104]含有469IU/安瓿。除了IU系统，'Lf'单位("絮凝化单位"或"临界絮凝化剂量")被定义为与1国际单位抗毒素混合产生最佳絮凝化混合物的类毒素的量[100]。例如，NIBSC提供了'用于絮凝试验的破伤风类毒素的第一国际参考试齐廿，(The1stInternationalReferenceReagentforTetanuxToxoidForFlocculationTest)[105]，其含有1000LF/安瓿。wP抗原的量可表达为国际单位(IU)。例如，NIBSC提供的'百日咳疫苗的第三国际标准，(ThirdInternationalStandardForPertussisVaccine)[106]含有46IU/安瓿。其含有46IU/安瓿。各安瓿含有2.0ml等分水溶液的冻干残余物，该水溶液含有10升用8升M/15Sorensen缓冲液pH7.0稀释的细菌悬浮液(根据美国不透明度标准等于180不透明单位)。除了IU系统，还可使用'OU，单位("不透明单位")(例如，4OU约为1IU)。偶联物的量通常用糖的质量表示(即偶联物(载体+糖)的剂量作为整体将高于标识剂量)以避免由于载体选择造成的偏差。当采用动物(尤其是牛)材料来培养细胞时，它们应获自未患遗传性海绵状脑病(TSE)且尤其未患牛海绵状脑病(BSE)的来源。附图简述图1是参考文献3和4中图2的拷贝，所述文献声称，该图显示了"基于吸附方法的抗原性和免疫力，其中，样品1是将疫苗各组分组合之后加入过量氢氧化铝凝胶得到的样品，样品2是在组合之前加入相同浓度凝胶的样品"。图1A和1B分别显示了样品1和2的相对抗原性。图1C和1D分别显示了针对样品1和2各抗原的相对抗体形成水平。图2显示了组合物中HBsAg稳定性的western印迹结果。在图2A中，各泳道为(1)Laemmli样品缓冲液(LSB);(2)MW标记；(3-5)l吗三种单独的对照HBsAg制品；(6-8)三种单独的五价产品的上清液；(9-10)LSB。在图2B和2C中，各泳道为(l)MW标记；(2-4)lng三种单独的对照HBsAg制品；(5-7)三种单独的五价产品的上清液，在2-8"储存2周；(8-10)三种单独的五价产品的上清液，在36-38t:储存2周。在图2D中，各泳道为(l)MW标记；(2)对照HBsAg;(3-5)三种单独的五价产品的上清液。图3显示了五价组合物的pH随时间的变化情况。图4显示了八价组合物中HBsAg稳定性的western印迹结果。在图4A和4B中泳道1含有MW标记；泳道2含有lpg/mlHBsAg对照；泳道3含有八价组合物上清液。在图4B中泳道4含有LSB;泳道5含有与泳道2相同的对照；泳道6含有DOC/TCA提取物。实施本发明的方式朋"g游表这赠众制备了编码HBsAg[107,108]的多形汉逊酵母(//,/0/;;/^77^)宿主。在300升发酵罐内准备100升培养基并与酵母一起培育。发酵可持续到细胞浓度达到100克/升。此时，由于宿主是甲基缺陷型的(methyl叩tr叩hic)故加入甲醇，并停止发酵。最终培养物的体积为160-170升。通过离心从培养基中收获细胞。不同于参考文献3和4中所述的在纯化之后在HBsAg中加入非离子型表面活性剂，表面活性剂是在蛋白质纯化期间使用的。具体地说，收获的酵母细胞是悬浮于含0.1-0.2%聚山梨醇酯20和10mMEDTA的磷酸盐缓冲液的。将悬浮液冷却并采用高压液体匀浆器破坏细胞。然后通过离心澄清匀浆的细胞悬浮液。在悬浮液中加入NaCl，然后缓慢加入聚乙二醇至浓度为3-5%以进行沉淀。将溶液搅拌5分钟，之后静置30分钟并离心10分钟。再在悬浮液中缓慢加入PEG至8-10%，搅拌并静置2小时。将该溶液离心IO分钟。在此悬浮液中加入热解法二氧化硅至浓度为1-2%。将该溶液搅拌12小时，离心，并将沉淀完全溶于含脱氧胆酸钠的硼砂缓冲液。在水浴中振荡100-120分钟后将溶液离心并收集上清液。将上清液加载到已经用Tris/Cl缓冲液以200毫升/分的流速平衡过的DEAE柱上，并用含NaCl溶液的Tris/Cl缓冲液洗脱。在DEAE洗出液中加入氯化锶至浓度最高达1.2g/mL并以40,000rpm离心该溶液。用PBS稀释脱盐的CsCl收集液至蛋白质浓度400吗/ml，加入福尔马林至浓度为0.025%，并使混合物静置72小时。最终用PBS除去残余的福尔马林。由此HBsAg被纯化并掺入了聚山梨醇酯20，但表面活性剂是在破裂重组细胞之前而并非是在纯化抗原之后加入的。纽伴多份资艰在铝盐佐剂悬浮液中加入酵母表达的HBsAg、白喉类毒素、破伤风类毒素和全细胞百日咳抗原。调节混合物的pH，然后加入Hib-CRM197偶联物，从而它不会被吸附到铝佐剂上。该方法得到含有以下组合物的五价疫苗30<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>在进一步的工作中，在加入CRM-Hib组分之后加入来自血清组C、W135和Y中每一种的单独的脑膜炎球菌-CRM197偶联物以得到八价疫苗<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>表示疫苗稳定性和功效的一个重要参数是Hib偶联物的水解百分比，临床上限为25%游离糖类(参考文献109称，20%不会影响临床免疫原性)。通过HPAEC-PAD测量了五价疫苗的这一参数，HPAEC-PAD能够以最小量的分离和纯化(withminimalseparationandclean-up)直接量化皮摩尔水平的未偶联糖类。分析针对于游离糖类的量。测定了游离糖的量并表示为占总量的百分比。结果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>最多25%的游离糖是临床上可接受的。所有的值都低于该范围，在2-8"C储存最多达4周时低于6.5%。在热应激条件下(36-38'C储存4周)观察到较高水平，但仍旧低于25%的值，其中对第l批观察到最大值，为11.6%。对多价Hib疫苗进行的早期工作显示，相比在2-8'C储存2年，在36-38'C储存1个月使更多的CRM-Hib水解。因此可以预计，在正常储存条件下储存至少两年仍有可接受的水解。还在于2-8。C储存6个月之后对游离糖类进行了HPAEC-PAD分析。数据如下<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>因此，与储存4周相比，储存6个月后游离糖的百分比仅少量增加，其值仍旧远低于25%的值。因此CRM197-Hib在这三种剂型中非常稳定。图3A显示了三批五价疫苗在2-8X:储存6个月期间pH的变化。图3B显示了三批产品在36-38。C储存4周期间pH的变化。在2-8°。储存6个月后pH是稳定的，而在热应激条件下，直到2周后pH才略微下降0.1个单位，而直到4周后才进一步略微下降。即便如此，所有的pH值都保持在6.0-7.0的可接受范围内。三批五价疫苗的重量克分子渗透浓度为312-315mOsm/Kg，位于可注射疫苗重量克分子渗透浓度240-360mOsm/Kg的可接受范围中央。为获得组合疫苗的功效，评价抗原的功效和免疫原性是重要的。评价了五价疫苗中白喉、破伤风和百日咳抗原的功效并检测了CRM-Hib和HBsAg的免疫原性。进行ELISA分析以评价免疫接种后特定抗体的水平。用小鼠模型和不同于测定HBV功效的免疫接种方案测量HBsAg的免疫原性。DTP功效值如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>对这三批抗原中的每一批，功效检测结果都明显高于可接受的下限，这些结果显示这三批抗原有良好的功效。为评价HBsAg免疫原性，在第0天和第14天通过皮下注射给一组10只CD1小鼠接种五价疫苗(0.5ml，用盐水1:4稀释)。在第21天采集小鼠血液并用(a)"Enzygnost抗-HBII"检验(DB公司(DadeBehring))或(b)"AusabEIA"检验(雅培公司(Abbott))通过ELISA评价HBsAg特异性抗体。这些ELISA检验具有不同模式和不同的HBsAg灵敏度。因此无法比较两种检测之间效价的几何平均值。然而，在各检测中，血清的GMT值是最佳的。结果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>进行这种类型的小鼠免疫原性试验获得的所有GMT值都高于文献中报道的值。两种抗原的应答者的百分比始终较高，处于约100%的最佳水平。为评价Hib免疫原性，在第0天、第10天和第20天通过皮下注射给一组8只CD1小鼠接种五价疫苗(0.5ml，用盐水1:4稀释)。在第34天采集小鼠血液并通过ELISA评价Hib特异性抗体。结果如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>HBsAg与铝佐剂的吸附是疫苗免疫原性的重要因素，该参数是通过免疫印迹测量的。免疫印迹过程基本如下用D0C/TCA沉淀1ml疫苗悬浮液，用LSB使其变性，然后加载到12%丙烯酰胺SDS-PAGE上；加入1pg各批次HBsAg作为对照；山羊抗-HBsAg抗体制剂被用作第一抗体(1:1000稀释)并4每抗-羊POD偶联物(1:2500稀释)用作第二抗体。五价疫苗的结果示于图2。图2A的泳道6-8显示，在O时间点组合物中没有可检测的可溶性HBsAg，图2B和2C的泳道5-10证实，在2-8。C或36-38°C储存2周和4周后亦是如此。在三个不同批次中，在这些不同条件下约99%的HBsAg保持吸附在佐剂上。在2-8。C储存6个月后再进行一次稳定性试验(图2D)。三批疫苗中每一批的吸附仍约为99%。图2所用的阳性对照含有1MgHBsAg。观察到与S肽(24kDa)对应的单个条带以及聚集体的特征性条带(约45kDa)。未见Pre-S2。还用类似的方法检测了八价疫苗的HBsAg吸附。将1ml样品3500rpm离心10分钟。将上清液转移到新的试管中并用DOC/TCA沉淀。将沉淀重悬于200|il提取缓冲液，煮沸5分钟并1300rpm离心10分钟。将20pl该提取物和经DOC/TCA沉淀的上清液加载到12%SDS-PAGE上进行Western印迹。图4A显示了0时点的八价疫苗，图4B显示了在2-8。C储存8个月后的该疫苗。图4B的泳道3和6不存在任何明显染色(明显少于在对照泳道2和5中用lpgHBsAg观察到的染色)说明，在该储存期之后HBsAg吸附仍旧是稳定的。發歸f多舰欲收集如下3种抗原性组分-三价D-T-PW组分制备的D-T-Pw组分包括吸附到氢氧化铝佐剂上的白喉类毒素、同样吸附到氢氧化铝佐剂上的破伤风类毒素和以磷酸铝作为佐剂的全细胞百日咳抗原。该组分含有硫柳汞但不含2-苯氧乙醇。-HBsAg组分从重组酿酒酵母表达并纯化HBsAg。将纯化的蛋白质吸附到磷酸铝抗原上[110]。-Hib偶联物组分从Hib毒株20752制备Hib多糖，用溴化氰活化并用己二酸酰肼间隔物衍生化后通过碳二亚胺縮合共价偶联于破伤风类毒素，糖:载体的重量比约为1:3。该偶联物被吸附于磷酸铝佐剂[64]然后与乳糖一起冻干。将D-T-Pw组分与HBsAg组分混合。HBsAg水平为20吗/ml。D水平》60IU。T水平^120IU。Pw水平》8IU。将这种白色混浊悬浮液形式的四价混合物以水性形式包装入有丁基橡胶塞的玻璃瓶，瓶中含有1剂(0.5ml)、2剂(lml)或10剂(5ml)。也将冻干的Hib组分装入药瓶。每个药瓶中的粉末量为在用每瓶1剂、2剂或10剂重建之后可达到5pg/ml(以糖类计)的量。将两个药瓶包装在一个盒子中。盒子中含有1瓶各组分(单剂量或多剂量药瓶)或IOO瓶各组分。为对患者给药，将水性D-T-Pw-HBsAg材料吸入针筒，并注入装有冻干偶联物的药瓶。在冻干材料重活化之后用新的针头将其吸回针筒，从而得到可施用于患者的五价疫苗。可采用各种3-剂初免方案第2、4和6个月；第3、4和5个月；或第6、10和14周。也可在两岁时将该疫苗用作加强剂。10剂量药瓶中所含的材料在用一个药瓶重建后足以免疫10名患者。先用第一针筒重建，然后用新的针筒吸出单个剂量，每个针筒一剂。在另一种(不太优选的)安排中，将10个剂量吸入一个针筒，然后在患者之间更换针头。应当理解的是，本发明只是用实施例的方式进行描述，只要不偏离本发明范围和精神，可以对本发明作出修改。参考文献(其内容通过引用纳入本文)I](f座度j)(Tocc/"esXPlotkin和Orenstein编)。第四版，2004，ISBN:0-7216-9688-0。2]美国专利6616931。3JWO02/055105。4]US2004/0048336。5]if7A庸f表^"存丝,i/,^"教众学》f7Vcw'ow'cSw//acto"te,Ogam'cC/2e附"/0^.NicoM.vanOs编，ISBN:0824799976。6]Vanlandschoot等，(2005)■/Ge"Wra/86:323-31。7]Hilleman(1993)(TZ;^^ii欲游^f^"教》(He/7油'fe5/""/"/^/;^"/￡^第17-40页，SBN0-8247-8780-3。8]Gerin等，(1969)4:763。9]Gerin等，(1969)J肠/7:569。10]Siebke等，(1972)Jcto尸aAo/Mr'croWo/5ta"B部分80:935。II]Pillot等，(1976)JC"wM'cra編4:205。12]Duimel和Krijnen(1972)版5b"g23:249。13]Neurath等，(1974)尸A^腦71:2663。14]Charm和Wong(1975)万Zo&c/oto/16:593。15]美国专利4，857，317。16]美国专利4,683,294。17]Houwen等，(1975)J^/wm/Mo/Me,/zocfe8:185。18]Sitrin等，(1993)ifZI皮欲游^^錄J1第83-101页，ISBN0-8247-8780-3。19]Wampler等，(1985)iW」SLS482:6830-4。20]Chi^，(1994)」"wA^A;ac5W721:365-73。21]Agraz等，(1994)/Owww"/ogrJ672:25-33。22]Mason等，(1992)/WASL489:11745-9。23]Demi等，(1999)JWra/Mertorfs79:205-17。:24]Ibarra等，(1999)■/CAra附atogr5<SWJ/;p/735:271陽7。25]WO麵0058。26]日本专利申请JP63239234。27]美国专利4,694,074。28]EP-0341733。29]美国专利5,242,812。30]WO02/12287。31]俄国专利申请RU-2128707。32〗Hardy等，(2000)/5/o,ecA"o/77:157-67。33]Dogan等，(2000)5/o&c/oto/Prag16:435-41。34]WO03/066094。35]Rappuoli等，(1991)77S7EC//9:232-238。36]Ramsay等,(2001)丄朋c"357(9251):195-196。37]Lmdberg(1999)Facc/"e17,增刊2:S28-36。38]Buttery禾QMoxon(2000)/7Co〃P/jw'c/a"sZowd34:163-168。39]Ahmad和Chapnick(1999)/ra/ec,C7Z"M)W/力附13:113-133，vii。40]Goldblatt(1998)乂Mo/.M/cra^o/.47:563-567。:41]欧洲专利0477508。:42]美国专利5,306,492。43]W098/42721。44](f錄^feff^"JVCwy'"go/e松cc/"e^(Cruse等编)ISBN3805549326，尤其是第10巻48-114。36[45]Hermanson(1996)(f主欽錄教^"术》(B/oco">We7k^m々we^ISBN:0123423368或012342335X。[46[47[48[49[50[51[52[53[54:[55[56[57:[58[59[60[61[62[63Zwww"/z加'ow附一的第6辑(Robertson)[64[65[66[67[68[69[70[71[72[73[74[75[76[77[78:[79[80[81[82[83[84[85[86[87[88[89WO96/40242。腿<9.歸/印5W:594:51，1976。Zielen等，(2000)/ra/e"./附/w"68:1435-1440。Darkes和Plosker(2002)Paed/a^4:609-630。Watson(2000)/Wz'afr/"/ertZfe■/19:331-332。Rubin(2000)尸eda^C//"WoW/zJ附47:269-285，v。Jedrzejas(2001)M/cra編她/層iev65:187-207。Tettelin等，(2001)5Wewce293:498-506。Hoskins等，(2001)J5a"e"'o/183:5709-5717。Rappuoli(2000)CwrM'cra編3:445-450Rappuoli(2001)Facc/"e19:2688-2691。Masignani等，(2002)<9//"别o/7Tzer2:895-905。Mora等，(2003)DragD&cov7bofe[y8:459-464。Wizemann等，(2001)/w/ec〃/wm/"69:1593-1598。Rigden等，(2003)CWfiev5/oc/ze附Mo/編38:143-168。WO02/22167。McMichael和Green(2003)CwrC(p/"/wveWz'gDrags4:953-8。世界卫生组织(WHO)的(f扇i^^^资^^^l^/yi^齐J1(Tte/附附w"o/ogz'ca/6必&/orW097細697。WO02細249。美国专利6013264。美国专利4,624,918。俊欺没仏f卓舒膽,爐展i1(Tflcc!."e"es/gn,T7je5W)w""cr"c竭謂""//謂cW(Powell和Newman编)普莱美出版社(PlenumPress)1995(ISBN0-306-44867陽X)。WO術14837。美国专利6146632。W099/11241。W099/12565。W098/56414。Nony等，(2001)^tcc/we27:3645-51Anonymous(2002-1)iese"rc/Z)&c/(WM,e，453077'Anderson(1983)7w/ec〃附ww"39(1):233-238。Anderson等，(1985)JC7z'w/"veW76(1):52-59。EP-A-0372501。BP-A-0378881。EP-A-0427347。W093/17712。WO94/03208。W098/58668。EP-A-0471177。WO91/01146Falugi等，(2001)五wrJ7w附M"o/31:3816-24Baraldo等，(2004)/w/e"/wwww72:4884-87。EP-A-0594610。WO00/56360。[90]WO02麵998。[91]Kuo等，(1995)ih/ec,/m/m/"63-2706-13。[92]WO01/72337。[93]WO00/6176L[94]WO2004純157。[95W091/18926和美国专利5858677、5888517、5989828、6025484和6139846[96]Janson等，(1991)//ec,7mww"59:119-25。[97]WO00/56360。[98]Sesardic等，(2001)5zo/og/a^29:107-22.'[99]NIBSC编码98/560。[100]世界卫生组织的《免疫的免疫学基础系列丛书》的第1辑(Galazka)。[IOI]NIBSC编码69/017。[102]NIBSC编码DIFT。[103]Sesardic等，(2002)5z'o/og/ca/s30:49-68。[104]NIBSC编码98/552。[105]NIBSC编码TEFT。[106]NTBSC编码66/303。[107]Diminsky等，(1997)松cd"e15:637-47。[108]Heijtink等，(2002)20:2191-6。[109]Sturgess等，(1999)Kcc/we17:1169-1178。[110]W093/24148。权利要求1.一种制备组合疫苗的方法，其中所述疫苗包含(i)非离子型表面活性剂，(ii)乙肝病毒(HBV)表面抗原，和(iii)至少一种非-HBV病原体的抗原，其中，所述方法包括(i)从重组酵母细胞纯化HBV表面抗原，其中所述纯化包括在存在非离子型表面活性剂时破坏酵母细胞，以得到纯化的HBsAg组分的步骤；和(ii)将纯化的HBsAg组分与至少一种其他非-HBV病原体的抗原组合，以得到所述组合疫苗。2.—种制备组合疫苗的方法，其中所述疫苗包含(i)非离子型表面活性剂，(ii)乙肝病毒(HBV)表面抗原(HBsAg)，和(iii)至少一种非-HBV病原体的抗原，其中，所述方法包括将纯化的HBsAg与至少一种其他非-HBV病原体的抗原组合，以得到组合疫苗的步骤，其中所述HBsAg是通过在存在非离子型表面活性剂时破坏表达重组HBsAg的酵母细胞的方法制备的。3.—种免疫原性组合物，其包含(i)非离子型表面活性剂，(ii)乙肝病毒(HBV)表面抗原，和(iii)至少一种非-HBV病原体的抗原，其中所述HBV表面抗原是通过在存在非离子型表面活性剂时破坏表达重组HBsAg的酵母细胞的方法制备的。4.如上述任一权利要求所述的方法或组合物，其特征在于，所述非离子型表面活性剂包含聚(氧乙烯)残基。5.如权利要求4所述的方法或组合物，其特征在于，所述非离子型表面活性剂是聚氧乙烯山梨糖醇酐酯。6.如权利要求5所述的方法或组合物，其特征在于，所述非离子型表面活性剂是聚山梨醇酯20。7.如上述任一权利要求所述的方法或组合物，其特征在于，所述非离子型表面活性剂在最终产品中的含量为《30^ig/ml。8.如上述任一权利要求所述的方法或组合物，其特征在于，所述非离子型表面活性剂在最终产品中的含量为每100吗HBsAg《50吗。9.如上述任一权利要求所述的方法，其特征在于(i)所述至少一种非-HBV病原体包括白喉棒状杆菌和破伤风梭菌；(ii)这两种病原体的抗原为白喉类毒素和破伤风类毒素；和(m)所述白喉和破伤风类毒素最初以基本上不含聚山梨醇酯20的混合物形式存在。10.如上述任一权利要求所述的方法或组合物，其特征在于，所述HBV表面抗原是非糖基化的。11.如上述任一权利要求所述的方法或组合物，其特征在于，所述HBV表面抗原的形式为包含含磷脂脂质基质的颗粒。12.如上述任一权利要求所述的方法或组合物，其特征在于，所述HBV表面抗原来自HBV亚型adw2。13.如上述任一权利要求所述的方法或组合物，其特征在于，所述HBV表面抗原在最终组合物中的含量为约10pg/剂。14.如上述任一权利要求所述的方法或组合物，其特征在于，所述疫苗包含Hib偶联物、脑膜炎球菌偶联物和/或肺炎球菌偶联物。15.如上述任一权利要求所述的方法或组合物，其特征在于，所述最终组合物选自3价HBsAg、D、T组合物；4价HBsAg、D、T、Pw组合物；5价HBsAg、D、T、Pw、Hib组合物；7价HBsAg、D、T、Pw、Hib、MenA、MenC组合物；8价HBsAg、D、T、Pw、Hib、MenA、MenC、MenW135组合物；8价HBsAg、D、T、Pw、Hib、MenA、MenC、MenY组合物；9价HBsAg、D、T、Pw、Hib、MenA、MenC、MenW135、MenY组合物；4价HBsAg、D、T、Pa组合物；5价HBsAg、D、T、Pa、Hib组合物；5价HBsAg、D、T、Pa、脊髓灰质炎病毒组合物；6价HBsAg、D、T、Pa、脊髓灰质炎病毒、Hib组合物；7价HBsAg、D、T、Pa、脊髓灰质炎病毒、Hib、MenC组合物；8价HBsAg、D、T、Pa、脊髓灰质炎病毒、Hib、MenC、MenA组合物；8价HBsAg、D、T、Pa、脊髓灰质炎病毒、Hib、MenC、MenY组合物；8价HBsAg、D、T、Pa、脊髓灰质炎病毒、Hib、MenC、MenW135组合物；10价HBsAg、D、T、Pa、脊髓灰质炎病毒、Hib、MenC、MenA、MenW135、MenY组合物；2价HBsAg、Hib组合物；和2价HBsAg、甲肝病毒组合物。16.如上述任一权利要求所述的方法或组合物，其特征在于，所述最终组合物包含磷酸铝佐剂和/或氢氧化铝佐剂。17.如上述任一权利要求所述的方法或组合物，其特征在于，所述最终组合物包含磷酸铝和氢氧化铝佐剂两者。18.如权利要求16或17所述的方法或组合物，其特征在于，所述最终组合物中A产的浓度为《5mg/ml。19.如上述任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述方法包括加入预混D-T组分。20.如上述任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述方法包括加入预混D-T-Pw组分。21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述预混D-T-Pw组分包含磷酸铝和氢氧化铝佐剂两者。22.(i)从重组酵母细胞纯化的HBsAg，其中所述纯化过程包括在存在非离子型表面活性剂时破坏酵母细胞，和(ii)一种或多种非-HBV抗原，在制造给予患者的药物中的应用。23.—种制备五价组合物的试剂盒，其中所述五价组合物包含HBsAg、D、T、Pw和Hib-T偶联物抗原；所述D和T抗原被吸附于氢氧化铝佐剂；所述HBsAg和Hib-T被吸附于磷酸铝佐剂；所述HBsAg、D、T和Pw组分以水性形式存在于第一容器中；所述Hib-T以冻干形式与乳糖组合存在于第二容器中；且所述HBsAg是通过在存在非离子型表面活性剂时破坏表达重组HBsAg的酵母细胞的方法制备的。24.—种制备七价组合物的试剂盒，其中所述七价组合物包含HBsAg、D、T、Pw、Hib-T偶联物、MenA偶联物和MenC偶联物；所述HBsAg、D、T和Pw组分以水性形式存在于第一容器中；所述三种偶联物以冻干形式存在于第二容器中；所述第一容器还包含氢氧化铝和磷酸铝佐剂两者，其中所述D和T抗原被吸附于氢氧化铝，而HBsAg被吸附于磷酸铝，且所述HBsAg是通过在存在非离子型表面活性剂时破坏表达重组HBsAg的酵母细胞的方法制备的。25.如权利要求24所述的试剂盒，其特征在于，所述第一容器还包含硫柳汞。全文摘要当制备用于组合疫苗的HbsAg时，已知在纯化HbsAg之后加入非离子型去污剂。然而，在纯化HbsAg之后加入去污剂并不是最佳的，因为这在制造时需要有分离加工步骤。因此，本发明将它们用于HbsAg纯化过程中。文档编号A61K39/00GK101330927SQ200680047253公开日2008年12月24日申请日期2006年11月7日优先权日2005年11月8日发明者M·肯托尼申请人:诺华疫苗和诊断有限公司