C1抑制剂在预防缺血-再灌注损伤中的应用的制作方法

专利名称：C1抑制剂在预防缺血-再灌注损伤中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及C1抑制剂在预防、降低和治疗缺血-再灌注损伤中的治疗
和预防性应用，特别在由于中风的结果而发生的脑缺血-再灌注损伤中的应 用。
背景技术：
缺血-再灌注损伤是一种熟知的发生中的(occuring)病理状况。其可 以是预见的病理状况或者无法预见的病理状况。中风是一种最常见的无法 预见的缺血-再灌注损伤。中风是工业化国家中导致死亡的第三大因素，导 致长期伤残。中风是一种典型的心血管疾病，影响通向脑部或者脑内的动 脉。当这种动脉被血栓阻塞或者破裂时发生中风，导致由所述阻塞的动脉 供养的脑组织缺血。对脑的直接损害是由于血流中断所致，主要是由于丧 失维持组织存活的氧化作用，如果不能逆转而最后导致梗塞形成所致。然 而，如果所述损害是可逆的(自然或经治疗而逆转)，则缺血组织的再灌注可 自相矛盾地导致进一步的间接损害。当存在长期缺血时，得自单独缺氧的 "直接"损害是主要机制。对于较短时间的缺血，间接或再灌注介导的损 害令人感兴趣地成为对于最终的结果更重要的因素。
据报道补体C1的抑制剂-Cl抑制剂(ClINH)在啮齿动物的脑缺血-再灌 注模型中通过降低缺血-再灌注损伤而展示神经保护作用(De Simoni et al, 2003， J Cereb Blood Flow Metab. 23: 232-9; Akita et al,, 2003， Neurosurgeiy 52: 395-400)。 CIINH对于脑缺血-再灌注损伤的神经保护作用不需要CIq (De Simoni et al.， 2004， Am J Pathol. 164: 1857-63)。最近，Storini等(2005， NeurobiolDis. 19: 10-7)报道了 CIINH通过抑制炎症和细胞从血管系统中募 集至缺血部位而对缺血-再灌注损伤发挥抗炎和抗凋亡作用。然而，给予
C1INH有疗效的中风周时间窗较窄。因此，本发明的一个目的是提供具有 较宽给药时间窗的C1INH。
发明描述
本发明基于令人惊奇的发现，即在小鼠短暂局灶性脑缺血模型中，天 然存在的血浆衍生的Cl抑制剂(C1INH)在缺血之后给予时丧失其大部分降 低缺血-再灌注损伤的能力，而重组的C1INH制备物在缺血和/或再灌注至 少l小时后注射仍能发挥其神经保护作用。令人惊奇地，当在缺血和/或再 灌注后18小时注射时，仍能达到神经保护作用。天然存在的血浆衍生的 C1INH与重组C1INH制备物的差异是前者血浆半衰期为至少24小时并且 是完全唾液酸化的糖蛋白，后者具有降低的血浆半衰期并且具有与血浆产 物不同的糖基化。
天然存在的血浆衍生的C1INH与重组C1INH制备物之间的已知差异 是糖基化的程度和类型。重组的糖蛋白含有大量不同的N-聚糖，包括寡甘 露糖型、杂合型和复合型结构，而血浆衍生的C1INH的N-聚糖主要由完全 唾液酸化的复合型结构组成。由于糖基化的不同，因此血浆衍生的糖蛋白 的血浆半衰期为至少24小时，而重组C1INH具有降低的血浆半衰期。
因此，本发明的一方面涉及预防、降低或治疗至少一种缺血和再灌注 损伤的方法，其中Cl抑制剂在缺血和/或在再灌注之后被给予。所述方法 优选包括给予有效量的血浆半衰期比血楽衍生的C1INH的半衰期短的 C1INH的步骤。或者，所述方法优选包括给予有效量的具有与血浆衍生的 C1INH不同的糖基化的C1INH的步骤。这种方法涉及Cl抑制剂在预防、
降低和/或治疗任何类型的缺血-再灌注损伤中的治疗和/或预防性应用。
Cl抑制剂，也称作Cl酯酶抑制剂，在本文是指补体Cl的抑制剂。 C1INH属于丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族，是补体系统的Cir和CIs的唯一 抑制剂，且是接触系统的因子XIIa和激肽释放酶的主要抑制剂。另外， C1INH还抑制凝血和纤溶系统的其它丝氨酸蛋白酶，如因子XI、组织血纤 维蛋白溶酶原激活物和纤溶酶(Schapira et al. 1985， Complement 2: 111;
Davis， 1988, Ann. Rev. Immunol. 6: 595)。人CIINH是由500个氨基酸组成 的蛋白质，包括一个22个氨基酸组成的信号序列(Carter et al. 1988， Euro. J. Biochem. 173; 163)。血浆CIINH是分子量为大约76 kDa及大量糖基化的 糖蛋白，其分子量中接近26。/。由碳水化合物组成(Perkins et al.， 1990， J. Mol. Biol. 214 , 751)。用于本发明方法中的CIINH优选是具有与SEQ ID NO:l 所示成熟人CIINH的氨基酸序列具有至少65、 67、 68、 69、 70、 75、 80、 85、 90、 95、 98或99%相同性的氨基酸序列的蛋白质。
对于本发明而言，两个氨基酸序列之间的相同性程度是指两个序列之 间相同的氨基酸的百分比。首先，使用如Altschul，etal., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)所述Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)算法检索同 源多肽序列。进行BLAST分析的软件可公开得自美国国家生物技术信息中 'l>(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)0 BLAST算法参数W、 B和E决定了序列 排列对比的灵敏性和速度。BLAST程序使用默认参数字长(W)-3， BLOSUM62评分矩阵(scoring matrix)(见Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA89: 10915 (1989))序列对比(B)=50，期望值(E)-IO， M=5， N=-4。接着，使用ClUSTALW排列对比算法(Higgins D. et al (1994). Nucleic Acids Res. 22:4673-4680)，利用如下参数确定同源序列的相同性程度(如上 述)缺口大小5，缺口开放(Gap open) : 11，缺口延伸(Gap extension): 1，错配:-15，字大小3。
CIINH优选具有可例如由Drouet et al. (1988， Clin Chim Acta. 174:121-30)所述测定的CIINH活性。更优选地，CIINH是人CIINH (hCHNH)，意味着所述CIINH具有在人体内天然存在的氨基酸序列(例如 SEQ ID NO:l或CAA30314所示)，但是不意味着所述CIINH是在例如人 血浆中产生或得自人血浆。
根据本发明的一个方面，本发明方法中使用的CIINH优选具有比血浆 衍生的CIINH的血浆半衰期短的血浆半衰期，更优选本发明的CIINH血 浆半衰期低于得自人血浆的CIINH的血浆半衰期。"降低的血浆半衰期" 是指本发明CIINH的循环半衰期相对于血浆衍生的CIINH的循环半衰期 的负向变化。在本文中，血浆衍生的C1INH是指天然存在的C1INH，其典 型得自血浆且可以从血浆中纯化，但是未经化学或酶修饰。
血浆半衰期是通过在给予C1INH之后不同时间点取血样，并确定每个 样品中C1INH的浓度而测量。血清浓度与时间的相关性也可以用于计算血 浆半衰期。本发明C1INH的血浆半衰期比血浆衍生的C1INH的循环半衰 期优选降低至少2倍、3倍、4倍、6倍，更优选降低至少大约8倍，最优 选降低至少大约10倍。换句话说，本发明C1INH的血浆半衰期优选低于 血浆衍生的C1INH(即其天然存在的对应物)的血浆半衰期的60、 50、 40、 30、 25、 20、 15、 12.5或10%。
例如，本发明的实施例中应用的C1INH(得自转基因兔的乳汁)的血浆 半衰期在人体内为大约3小时，比血浆衍生的C1INH在人体内的平均血浆 半衰期低大约4-8倍。应理解的是本发明C1INH比血浆衍生的C1INH的血 浆半衰期降低的测定优选在相似条件(如果不是相同条件)下进行，即优选 在相应的剂量、样品、相同的生物体(可以是实验室动物如小鼠或人对象) 及相同数量的测试对象的条件下进行。另外，可以通过标准统计学分析方 法对比这两种C1INH制备物的平均血浆半衰期。
可以通过任何常规方法制备具有更短半衰期的C1INH，无论是天然发 生还是重组产生的C1INH。例如可以在重组宿主细胞或生物体中体内制备， 获得具有修饰的碳水化合物结构的C1INH(与血浆衍生的C1INH相比)，或 者天然存在的C1INH的碳水化合物结构可以在体外经化学或酶修饰。优选 地，与血浆衍生的C1INH相比本发明的C1INH通过如下方式进行修饰:(从 糖蛋白的天然存在的变体或重组表达的变体中)除去碳水化合物成分，优选 从N-连接的碳水化合物链中除去唾液酸和/或半乳糖，和/或除去碳水化合 物链从而暴露甘露糖、半乳糖、N-乙酰葡糖胺和/或岩藻糖残基。
根据本发明的另一方面，本发明方法中应用的C1INH优选具有与血浆 衍生的C1INH不同的糖基化。对本发明C1INH的碳水化合物结构进行的 修饰包括导致低糖基化、过糖基化至无唾液酸(asialio)形式C1INH的修饰， 或者导致不同糖基化模式的任何其它修饰。
体外低糖基化可以是缺失C1INH的碳水化合物成分或者全部碳水化合 物链的结果。修饰可包括对N-或O-连接的碳水化合物链或者仅一种类型的 链进行修饰。可包括对所有链或者仅一些链进行修饰。过糖基化可例如是 向C1INH分子中添加额外的碳水化合物成分或者完全的碳水化合物链的结 果。无唾液酸形式的C1INH或者末端唾液酸残基水平降低形式的C1INH 可典型通过除去唾液酸基团而获得。本领域熟知血液中糖蛋白的半衰期高 度依赖于其N-和O-连接的碳水化合物基团的成分和结构。通常地，糖蛋白 的最大半衰期要求其N-和O-连接的碳水化合物基团具有末端唾液酸。如果 这个末端唾液酸不存在，则所述糖蛋白由于半乳糖残基暴露而被迅速从血 液中清除。已经充分确定糖蛋白的碳水化合物成分中末端半乳糖残基的存 在导致肝脏中唾液酸糖蛋白受体对其的血桨清除率增强。因此，在优选的 实施方案中，本发明方法中应用的C1INH优选具有较血浆衍生的人C1抑 制剂降低水平的末端唾液酸残基。唾液酸可以通过一些方式除去。例如， 可以通过化学或酶处理方法除去，例如通过用唾液酸酶处理而除去。适于 这个目的的唾液酸酶由Chou et al, (1996, J Biol Chem. 271.(32): 19219-24; and 1994， J Biol Chem. 269(29): 18821-6)描述，可例如得自V-labs， Inc. (Covington, Louisiana, USA)。在另一个优选的实施方案中，本发明方法中 应用的C1INH优选具有暴露的甘露糖、N-乙酰葡糖胺磷酸甘露糖、半乳糖 和/或N-乙酰半乳糖胺残基。暴露的糖残基通常是位于聚糖分支上的末端糖 残基或者至少是可易于与对所述残基具有亲和性的成分相互作用的糖残基 (如碳水化合物结合结构域)。具有暴露的半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、N-乙 酰葡糖胺、甘露糖、岩藻糖或磷酸甘露糖残基的C1INH可例如通过用如下 一或多种酶进行酶处理而获得(3-D-N-乙酰己糖胺酶、内-P-D-半乳糖苷酶 和/或oc-D-N-乙酰氨基半乳糖苷酶(也可得自例如V-labs， Inc., Covington, Louisiana, USA)。
对C1INH的碳水化合物链的体内修饰可以通过使用重组生产系统进 行。可以使用原核细胞和真核细胞培养物，如酵母细胞、真菌细胞、昆虫 细胞和哺乳动物细胞。例如，COS细胞和CHO细胞是合适的哺乳动物生
产系统。尽管哺乳动物细胞培养系统有能力产生具有唾液酸化的碳水化合 物基团的糖蛋白，但是通常难以实现理想的天然或完全的糖基化，因此重 组产生的糖蛋白通常具有与其天然对应物不同的糖基化模式。通常这种不
同的糖基化模式是不完全的(与天然对应物相比)，具有暴露的半乳糖、N-乙酰葡糖胺和/或甘露糖残基。另外，在真核微生物如酵母或真菌中产生 C1INH将获得具有暴露的甘露糖残基的C1INH。
具有修饰的碳水化合物结构的C1INH也可以在转基因动物中制备，优 选在非人动物中制备，如在转基因兔、牛、小鼠、大鼠、山羊和绵羊中。 优选这种糖蛋白在这些非人转基因动物的乳腺中表达，由此所述糖蛋白可 以得自所述动物的乳汁。本领域技术人员已知这将依赖于产生的特异性糖 蛋白及产生的量、最适用于生产的转基因动物。特别优选用于本发明的 C1INH是得自转基因牛或者兔aagomo^p/z。)目动物的乳汁的C1INH，所 述兔目动物优选Ie; onWfle科，更优选是O^ycto/agw属，最优选是 Oycto/agws c訓'cm/ws禾中o
与其天然的血桨衍生的对应物相比，对C1INH蛋白的碳水化合物链的 结构进行的不同类型的修饰可得自重组生产系统，例如可以同时或连续地 单独或者组合导入不同的糖基化、低糖基化或过糖基化， 一些修饰可以导 入所述分子的一部分中，另一些修饰可以导入所述分子的另一部分中。有 助于所述蛋白质的治疗功效的优选的修饰组合包括本发明C1INH上的表达 的半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰葡糖胺、甘露糖、岩藻糖和/或磷酸甘 露糖残基。本发明的C1INH可以例如具有寡甘露糖型聚糖或者高甘露糖型 聚糖。优选C1INH上的聚糖的至少大约5、 10、 15、 20、 40或60%的末端 残基选自半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰葡糖胺、甘露糖、岩藻糖和磷 酸甘露糖残基。例如，用于本发明中的优选C1INH含有比其天然对应物少 大约2、 4、 5、 6-倍的唾液酸，和/或其至少大约5、 10、 15、 20、 40或60% 的N连接的聚糖是中性的，携带具有平伏的3-和4-OH基团的末端己糖， 如甘露糖和N-乙酰葡糖胺。相反，血浆衍生的C1INH无寡甘露糖型糖基化。 用于本发明中的优选C1INH例如是在兔乳腺中产生的重组人C1INH，其比 天然对应物缺少5-6倍的唾液酸，其大约15。/。的N-连接的聚糖是中性的， 携带末端甘露糖残基。
在一个优选的实施方案中，用于本发明中的C1INH的不同糖基化导致 对甘露糖结合蛋白具有比其血浆衍生的对应物更高的亲和性。甘露糖结合 蛋白(MBP)也被称作甘露聚糖结合蛋白、甘露糖-结合凝集素(MBL)、甘露 聚糖-结合凝集素，或者杀菌Ra-反应因子。MBP是属于一种可溶的C^+依 赖性(C型)凝集素家族的胶原凝集素。MBP通过(与补体激活的经典途径和 旁路途径不同的)凝集素途径作为补体激活物。补体系统是先天免疫防御的 重要成分，由如下三个途径激活经典途径、旁路途径和最近揭示的凝集 素或甘露糖结合凝集素(MBL)途径。
当催化结构域Clr和Cls通过识别蛋白Clq结合免疫复合物时，经典 途径开始激活(见

图11)。
旁路途径以抗体非依赖性方式低速持续进行(turningover),攻击未针 对补体而被特异性保护的颗粒。
凝集素或MBL途径基于MBL与各种病原体或其它细胞结构上存在的 碳水化合物结构的结合而起始或激活。两种丝氨酸蛋白酶-甘露聚糖结合凝 集素相关的丝氨酸蛋白酶(MASP)-I和-2 (见图ll)与MBL相关，显示出与 丝氨酸蛋白酶Cls和Clr的显著相似性。所述复合物基于与甘露聚糖的结 合而具有C4和C3激活能力。所述复合物含有由二硫键连接的两种丝氨酸 蛋白酶MASP-I和MASP-2。在这种形式中，MASP能裂解C4和C3，导 致其失活。与其血浆衍生的对应物相比本发明的C1INH对于人MBP优选
具有更高的亲和性。
MBP识别具有平伏的3-和4-OH基团的暴露的己糖，如甘露糖和N-乙酰葡糖胺和/或N-乙酰-己糖胺。因此本发明优选的C1INH具有这种末端 己糖。本发明C1INH比其没有暴露的甘露糖和N-乙酰葡糖胺残基的天然血 浆衍生的对应物对于MBP、优选人MBP的更高亲和性使得可以更有效地 耙向、结合和/或抑制MBP。人MBP在本文是指由Kawasakietal. (1983， J. Biochem 94:937-47)鉴定的蛋白质，具有Taylor et al. (1989， Biochem. J. 262
(3), 763-771; NCBI登记号CAA34079)所述的氨基酸序列。与寡糖复合的 大鼠MBP的结构由Weisetal. (1992，Nature. 360:127-34)描述。关于人MBP 的进一步描述见例如US 6,846,649及其中引用的参考文献所述。
所有这些途径(经典途径、旁路途径和凝集素或MBL途径)均产生至关 重要的酶活性，最后导致膜攻击复合物(MAC或C5b-C9)的装配(见图11)。 在生理学条件下，补体系统的激活由可溶的和膜结合的调节蛋白的协同作 用而有效控制。这些蛋白质之一是Cl抑制剂(C1INH)，这是结合Cls和Clr 的一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，是目前唯一已知的经典途径的生理学抑制剂。 另外，C1INH通过结合并抑制MASP-1和MASP-2而失活MBL-介导的补 体活化。
不同补体途径的激活优选在人血清中通过Wielisa试剂盒(产品no. COMPL300,Wieslab，Sweeden)测量。这是一种可商购的酶免疫测定，利用 C5b-C9的沉积作为常规读数(common read-out)而特异性检测三种补体途 径的每一途径。简而言之，将微滴定条的孔用三种补体途径的每一途径的 特异性激活物包被。人血清在含有特异性封闭剂的稀释剂中稀释，以保证 仅激活各自的途径。进一步加入浓度在0-75}imol范围内的本发明的C1INH 或其血浆衍生的对应物，在室温保温30分钟，加入所述孔中。在随后所述 稀释的人血清在所述孔中于37-C保温60分钟期间，补体通过特异性包被而 被激活。然后洗涤所述孔，形成的C5b- C9用特异性碱性磷酸酶标记的抗 C5b-C9抗体检测。在进一步洗涤后，通过与碱性磷酸酶底物溶液保温对特 异性抗体进行检测。使补体激活量与色强度相关，并作为吸光度测量(光密 度OD)。使用这种试剂盒，发现本发明的重组人C1INH (rhCHNH)及血浆 衍生的C1INH (pdCHNH)对于经典途径具有相似的抑制能力。然而，发现 本发明的CIINH比血浆衍生的C1INH对于MBL途径的抑制能力高大约 20% (见实施例3)。
因此，在这个优选的实施方案中，用于本发明中C1INH的不同糖基化 导致对于MBP具有比其血浆衍生的对应物更高的亲和性，这导致对MBP 更有效的抑制，使得可以更有效抑制凝集素途径。对凝集素途径的更有效
抑制优选是指至少高5%的抑制、还更优选至少高10%的抑制、还更优选至 少高15%的抑制、还更优选至少高20%的抑制、还更优选至少高25°/。的抑 制、还更优选至少高30%的抑制、还更优选至少高35%的抑制、还更优选 至少高40%的抑制、还更优选至少高45%的抑制、还更优选至少高50%的 抑制、还更优选至少高55%的抑制、还更优选至少高60%的抑制、还更优 选至少高65%的抑制、还更优选至少高70%的抑制、还更优选至少高75% 的抑制、还更优选至少高80%的抑制、还更优选至少高85%的抑制、还更 优选至少高90%的抑制、还更优选至少高95%的抑制及最优选至少高98% 的抑制。凝集素途径的活化优选通过上述Widisa试剂盒测量。
本发明的方法可用于预防、降低或治疗任何类型的缺血和再灌注损伤。 优选地，本发明的方法应用于其中缺血和再灌注损伤已知至少部分通过、 更优选主要通过凝集素途径而产生的情况中。对于心肌缺血和再灌注损伤 (JImmunology 2005, 175:541-546)、肾缺血-再灌注损伤(Am J Pathol. 2004 165(5): 1677-88)、 胃肠道缺血-再灌注损伤(J Immunol. 2005 15:174(10):6373-80)及中风(deShnoni et al, 2004 Am J. Pathol. 164:1857-63)， 已经示出再灌注损伤主要是通过凝集素途径产生，很少通过经典途径产生。 因此，本发明的C1INH优选是比其天然血浆衍生的对应物更强的凝集素途 径抑制剂。优选本发明的C1INH在人体内是比其天然血浆衍生的对应物更 强的凝集素途径的抑制剂。
与本发明实施例中使用的实验模型不同，现实生活中缺血的发生通常 是无法预见的事件。因此在缺血和/或随后的再灌注发生之前给予ClINH通 常是不现实的，在现实中ClINH将不得不在缺血和/或随后的再灌注之后几 个小时给予。然而，这严重限制了常规血浆衍生的C1INH的治疗功效，因 为当在缺血-再灌注之后给予时其大部分失效，并且仅具有极小的治疗功效 时间窗(见图2及deSimoni et al, 2004 Am J. Pathol. 164:1857-63所述)。相反， 当也在缺血或者在缺血发作之后至少1小时和/或在开始再灌注之后30分 钟注射本发明的C1INH，其仍能发挥其神经保护作用。因此，在本发明的 用于预防、降低或治疗至少一种无法预见的或预见的缺血和再灌注损伤发
生的方法的一个优选实施方案中，本发明的C1INH至少在缺血结束或之后 (即当缺血的组织被再灌注时)给予。更优选地，本发明的C1INH在缺血之 后或者在开始再灌注之后至少10、 15、 20、 30、 45、 60、 90或120分钟给 予。优选地，本发明ClINH在缺血之后或者在缺血和/或再灌注发生之后不 超过24、 12、 6、 4或3小时时间内给予。在另一个优选的实施方案中，Cl 抑制剂在缺血之后或者在缺血和/或再灌注发生之后至少3小时、优选至少 6小时、更优选至少9小时、更优选至少18小时给予。
在一个优选的实施方案中，所述方法用于预防、降低或治疗无法预见 的、突然的或者急性发生的缺血-再灌注。与无法预见的、突然的或者急性 发生的缺血-再灌注损伤相关的病变或疾病包括但非限于在急性心肌梗塞 (AMI)、中风包括围产期中风、失血性休克、肠缺血、经皮冠状动脉腔内成 形术(PCTA)失败后的急诊冠状动脉手术、具有血管夹紧(blood vessel cross clamping)的任何血管手术(例如大动脉夹紧，引起骨骼肌缺血)或者在处理胰 管或胆管之后的胰腺炎处理(ERCP)之后的缺血-再灌注损伤。在这种情况 中，本发明的C1INH优选在急性心肌梗塞(AMI)、中风包括围产期中风、 失血性休克、肠缺血、经皮冠状动脉腔内成形术(PCTA)失败后的急诊冠状 动脉手术、具有血管夹紧的任何血管手术(例如大动脉夹紧，引起骨骼肌缺 血)或者在处理胰管或胆管之后的胰腺炎处理(ERCP)之后至少1、5、 10、 15、 20、 30、 45、 60、卯或120分钟给予。或者，给予本发明C1INH的时间优 选在开始再灌注后至少l、 5、 10、 15、 20、 30、 45、 60、 90或120分钟。
另外，无法预见的缺血-再灌注损伤优选是指其中是治疗或手术诱导再
灌注而不是缺血的情况。这种治疗或手术包括但非限于
-药物溶栓，包括对中风、急性冠状动脉综合症、外周动脉闭塞、肺
栓塞、肾动脉闭塞进行的静脉内和血管内治疗方法；
-机械溶栓，例如经皮冠状动脉介入治疗、外周动脉血管成形术、内 脏动脉血管成形术；
-冠状动脉搭桥术；
-颈动脉内膜剥除术；
-肠系膜缺血；
休克，包括失血性休克、心源性休克、神经性休克、过敏性休克；
-皮瓣坏死(flap-failure)，例如整形手术； -手指或足趾及肢体的再植； -绞窄性肠梗阻。
或者，在另一个优选的实施方案中，所述方法用于预防、降低或治疗 预见的缺血-再灌注发生。预见的缺血-再灌注的发生优选包括其中治疗或手 术诱导缺血及随后的再灌注的情况。下文列出了其中治疗或手术诱导暂时 无血流或血流减少，即缺血或缺氧，然后出现再灌注的情况
-心肺转流术；
-动脉瘤修复，包括大动脉瘤、脑动脉瘤的修复； -颈动脉内膜剥除术，其中在手术期间使用夹子； -深低温停循环术；
-止血带的应用，即在外伤处置中使用止血带
-实体器官移植；
-任何其它医源性血流中断。
另外，与预见的缺血-再灌注损伤的发生相关的病变或疾病包括但非限 于在器官移植(肺、肝、肾、心脏)之后、具有血管夹紧的任何血管手术(例 如大动脉夹紧，引起骨骼肌缺血)之后、或者在对胰管或胆管进行处理(ERCP)
之后的胰腺炎之后、体外循环(ECC)期间或之后发生的缺血-再灌注损伤。
在预防、降低或治疗至少一种预见的缺血和再灌注损伤发生的方法的 —个优选实施方案中，本发明的C1INH至少在缺血期末或之后给予，即当 缺血组织再灌注时给予。更优选地，本发明的C1INH在缺血期之后或者在 开始再灌注之后至少IO、 15、 20、 30、 45、 60、 90或120分钟给予。优选 地，本发明的C1INH在缺血之后或者在缺血和/或再灌注发生之后不超过 24、 12、 6、 4或3小时给予。在另一个优选的实施方案中，Cl抑制剂在 缺血之后或者在缺血和/或再灌注发生之后至少1小时、3小时、优选至少 6小时、9小时、更优选至少18小时给予。或者，本发明另一方面提供了一种预防、降低或治疗至少一种预见的
缺血和再灌注损伤发生的方法，其中本发明的C1INH在缺血和再灌注之前 或在此期间给予。本领域技术人员已知根据本发明C1INH的血浆半衰期， 可以调整给予本发明C1INH的最早的可能时间点以获得最佳结果。
根据一个优选的实施方案，本发明的C1INH持续给予需要其的对象和 /或在器官移植情况中持续给予待移植的器官。待移植的器官优选在具有合 适培养基及适量C1INH的组合物中保存。
或者，或与前述优选的实施方案组合，在预见的缺血和再灌注损伤发 生之前优选是指在至少一种预见的缺血和再灌注损伤发生之前至多3小时、 优选2小时、l小时、更优选至多30分钟给予本发明C1INH。
需要本发明C1INH的对象是指可发生预见的缺血和再灌注损伤的对 象。预见的缺血和再灌注损伤的发生已经在本文描述。
优选在预见的缺血和再灌注损伤发生之前给予C1INH，因为其可与在 缺血和再灌注损伤发生之后给予C1INH相同或更好的方式预防与缺血和再 灌注损伤相关的大多数(如果不是全部)损害的发生。
在一个更优选的实施方案中，所述方法用于无法预见的缺血-再灌注的 发生。更优选地，缺血-再灌注损伤发生在中风或围产期中风之后。在这些 类型的无法预见的缺血-再灌注发生中，我们证实了本发明的C1抑制剂在 缺血半影区(pneumbra)中的神经保护作用。缺血半影区优选是指海马和/或 皮质。神经保护作用优选是指在海马中发生缺血之后至多3小时及在皮质 中发生缺血之后至多9小时用本发明的Cl抑制剂处理后减少海马和/或皮 质中的神经变性。更优选地，在海马缺血至多4、 5、 6或更多小时及在皮 质缺血至多IO、 11、 12或更多小时减少神经变性。神经变性优选如实施例 2所述评价将脑组织切片用特异于神经元变性的标记物优选Jade (SchnmedLC等，参考文献4)染色，通过荧光显微镜分析。使用这种方法， 减少神经变性是指在处理的样品中较未处理的样品中观测到染色的细胞减 少至少2%。优选地，神经变性的减少是指染色的细胞减少至少5%、 7%、 10%、 15%、 20%、 25%、 30%、 35%、 40%或更多。
或者，或与前述实施方案组合，应用Cl抑制剂可降低缺血和域再灌
注导致的损伤。更优选地，当缺血-再灌注损伤在中风或围产期中风之后发
生时，应用本发明的C1抑制剂可减小梗塞面积。更优选地，梗塞面积如实 施例2所述量化。更优选地，使用这种量化方法，在缺血发生至少3小时 后，梗塞面积减小至少10%、优选至少20%、 40%、 60%、 70%、 80%，及 最优选梗塞面积减少90%。
用于本发明方法中的C1INH可以作为本领域药物组合物的一部分或者 与本领域药物组合组合应用。这些药物组合物典型包含所述C1INH及药物 学可接受的载体或赋形剂。根据希望的局部或系统治疗方案、治疗区域及 活性化合物的稳定性，可以通过多种方式给予这些药物学组合物。根据给 予方法确定合适的配方。所述药物组合物优选通过肠道外方法给予，例如 通过静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌内注射或输注方式给予；或者通 过鞘内注射或颅内给予方法给予。在一个优选的实施方案中，通过静脉内 输注方法给予。通过肠道外给予的合适配方为本领域所已知，典型是液体 配方。肠道外给予的C1INH制备物必须是无菌的。灭菌可在冻干和重建之 前或之后通过无菌过滤膜过滤而易于实现。C1INH制备物可通过输注或推 注方法持续给予。液体C1INH配方可例如通过输液泵给予。典型的静脉内 输注的组合物可以含有100-500 ml无菌的0.9% NaCl或5%葡萄糖溶液， 任选补加20%白蛋白溶液及100-500 mg的C1INH。用于静脉内注射的药物 组合物含有例如1 - 10 ml无菌缓冲的水和1-250 mg本发明的ClINH。制备 可经肠道外给予的组合物的方法为本领域所熟知，在多个资料中详细描述， 例如在以其全部内容并入作参考的Remington's Pharmaceutical Science (15th ed.， Mack Publishing, Easton, PA, 1980)中描述。
本发明方法中使用的CIINH的有效剂量即有效浓度和频率依赖于使用 的特定药物组合物、病变的严重性及患者的一般状况。通常地，可以通过 常规优选法确定基于本发明方法中使用的CIINH的药物组合物的有效剂 量。合适的起始点是基于血浆衍生的CIINH的等价药物组合物的使用剂量。 本发明的药物组合物的优势是在治疗时可以应用高初始剂量，提高成功治
疗的可能性。这个高初始剂量是可能的，因为本发明药物组合物中的C1INH 较其天然对应物示出较快的清除率。特别是对于急性病例的治疗，本发明 的高初始剂量的C1INH可以是有利的。这个高初始剂量可以是天然存在的 对应物剂量的至少1.5、 2、 3或4倍。
在一个优选的实施方案中，本发明的C1INH经静脉内给予，剂量为大 于50、 100、 200、 400、 600、 800或1000 U/kg个体体重，优选为50-2000、 100 - 1000、 200 - 800、 400-700或500-700 U/kg个体体重。1单位(U)的 C1INH是在lml人血液中存在的C1INH的量。 一个这样的单位相应于大约 275jig血浆衍生的ClINH。假定分子量为110,000道尔顿，人血浆中C1INH 的浓度为2.5|iimol/L(Nuijens et al. (1989), J. Clin. Invest. 84:443)。
在本发明方法的另一个优选实施方案中，所述药物组合物进一步含有 溶血栓药或者与溶血栓药组合应用或者在用这种溶血栓药随后治疗之后使 用。本文所述溶血栓药是指能溶解血凝块(血栓)及重新开放动脉或静脉的药 剂(药物)。溶血栓药通常是丝氨酸蛋白酶，将血纤维蛋白溶酶原转变为纤溶 酶，使得纤维蛋白原和纤维蛋白分解及血栓溶解。优选的溶血栓药包括 reteplase (r-PA或Retavase)、alteplase (t-PA或Activase)、尿》敫酶(Abbokinase)、 尿激酶原、茴香酰化的纯化的链激酶激活物复合物(APSAC)，及链激酶。
另一方面，特别是除了美国之外的权限，本发明涉及本发明的C1INH 根据上述任何方法在生产预防、降低或治疗再灌注损伤的药物中的应用。
在本文及其权利要求书中，动词"包含"以其非限制性含义应用，是 指包括该单词后面的项目，不排除未特别指出的项目。另外，文中"一个"、 "一种"等不排除存在一个以上的因素，除非文中需要其是一个且只有一 个因素。因此，"一个"通常是指"至少一个"。
附图描述
图h在缺血之前、之后及1小时后，用盐水或每只小鼠15UrhClINH (重组人C1INH，见实施例1.2)处理后的小鼠在缺血后48小时梗塞面积的 评价。
在缺血之前、之后及l小时后，用盐水或每只小鼠15U血浆衍 生的hClINH处理后的小鼠在缺血后24小时梗塞面积的评价.
从缺血开始后在不同时间点接受盐水或每只小鼠15U兔 rhCl-INH的小鼠在缺血48小时后梗死灶体积评价。数据以平均值土 SEM 表示(每组6只小鼠)。*P<0.05， **P<0.01，相对于盐水，单向ANOVA和 Dunnett作为post-hoc检验。
图4: Fluoro-Jade染色的半定量评估。-=无阳性，+=低阳性，= 中等阳性，+++=高阳性。
图5:在缺血发生后不同时间点接受盐水或每只小鼠15U兔rhCl-INH 的缺血小鼠的纹状体中通过Fluoro-Jade染色显示的神经变性代表性图像。 条杆100pm。
图6:在缺血发生后不同时间点接受盐水或每只小鼠15U兔rhCl-INH 的缺血小鼠的海马齿状回中通过Fluoro-Jade染色示出的神经变性代表性图 像。条杆10(Him。
图7:在缺血发生后不同时间点接受盐水或每只小鼠15U兔rhCl-INH 的缺血小鼠的皮质中通过Fluoro-Jade染色示出的神经变性代表性图像。条 杆lOO(im。
图8:在缺血发生后3小时接受盐水或每只小鼠5、 10、 15U兔rhCl-INH 的小鼠在缺血48小时后的梗死灶体积评价。数据以平均值士SEM表示(每 组6只小鼠)。**P<0.01 ，相对于盐水，单向ANOVA和Dunnett作为 post-hoc检验。
1_2:在缺血发生后3小时接受盐水或每只小鼠15UpdCl-INH或者牛 或兔rhCl-INH的小鼠在缺血48小时后的梗死灶体积评价。数据以平均值 士SEM表示(每组6只小鼠)。*PO.05, **P<0.01，相对于盐水，单向 ANOVA禾口 Dunnett作为post-hoc检验。
图10:在缺血发生后3小时接受盐水或每只小鼠15UpdCl-INH或者 牛或兔rhCl-INH的小鼠在缺血48小时后评价的总体神经功能缺损(上方 10a)和局灶性神经功能缺损(下方10b)(每组6只小鼠)。**P<0.01，相对于
盐水，单向ANOVA和Kruskal-Wallis作为post-hoc检验。
图11:补体激活的不同途径概述。
图12、 13: rhClINH和pdClINH对经典补体途径激活的作用。向正常 人血清的两个不同样品(上方是样品1，下方是样品2)中加入增加剂量的 rhClINH或pdClINH(x-轴)。作为对照，利用其中溶解有与rhClINH同样 稀释的rhClINH的缓冲液(20 mM柠檬酸盐，0.19 M蔗糖pH 6.8;经0.22|im 滤膜过滤)。读数为C5b-9的沉积，测定中正常血清对照规定为100。/。(y-轴)。 数据以平均值和SD表示(n = 3)。
图14、 15: rhClINH和pdClINH对MBL补体途径激活的作用。向正 常人血清的两个不同样品(上方是样品1，下方是样品2)中加入增加剂量的 rhClINH或pdClINH(x-轴)。作为对照，利用其中溶解有与rhClINH同样 稀释的rhClINH的缓冲液(20 mM柠檬酸盐，0.19 M蔗糖pH 6.8;经0.22|im 滤膜过滤)。读数为C5b-9的沉积，该测定中正常血清对照规定为100%(y-轴)。数据以平均值和SD表示(n-3)。
图16: rhClINH和pdClINH对经典补体途径和MBL补体途径激活的 作用。向正常人血清的两个不同样品(上方是样品1，下方是样品2)中加入 增加剂量的rhClINH或pdClINH (x-轴)。作为对照，利用其中溶解有与 rhClINH同样稀释的rhClINH的缓冲液(20 mM柠檬酸盐，0.19 M蔗糖pH 6.8;经0.22pm滤膜过滤)，读数为C5b-9的沉积，每次测定的补体激活百 分比以下式计算(样品-NC)/(PC-NC)X100。 PC设为100%。结果以在每 个测试浓度的3个独立vei'dunning的平均值SD表示。
实施例
实施例1
先前的实验示出在脑局灶性缺血小鼠模型中在缺血后48小时评价发 现，在缺血开始时给予单剂量rhClINH (15U/小鼠)以与血浆衍生的C1INH 非常相似的方式显著降低缺血体积。在这个实施例中，我们研究了 rhClINH 神经保护活性对于缺血体积和功能缺损的功效时间窗。我们还通过评价神
经变性和神经胶质应答研究了 rhCl腿对于七天结果(seven-days outcome) 的作用。
1.方法
1.1 一过性局灶脑缺血
如先前所述通过大脑中动脉栓塞(MCAO)实现缺血(De Simoni et al, 2003和2004，见上文)。通过在N20/02 (70/30%)混合物中的5°/。异氟醚诱导 麻醉，用在相同混合物中的1.5-2%异氟醚维持。为了证实每只动物中血管 闭塞的合适度，使用激光多普勒血流仪(Transonic BLF-21)利用位于脑表面 上并用印模材料固定在颅骨上的柔软的0.5 mm光纤探头(Transonic， Type M， 0.5 mm直径)测量血流，坐标为AP--lmm， L=-3，5mm。简而言之，暴露 右颈总动脉，通过在颈总动脉上做的切口将硅丝(7-0)导入颈内动脉中并行 进至大脑前动脉，以阻断其分支进入大脑前动脉和MCA。使所述硅丝行进 直至观测到与缺血前基线相比血流减少>70%。在缺血30分钟后，小心除 去所述尼龙丝恢复血流。
1.2药物治疗
在缺血后不同时间经静脉内单次注射给予小鼠的15U/小鼠 rhClINH或者相同体积的盐水
一在缺血期开始时(rhClINH-前)， —在缺血期结束时(rhClINH-后)， 一在缺血期开始后1小时(rhClINH lh-后)。
这项研究中使用的rhClINH是在乳腺中表达人ClINH的转基因兔中产 生，并从得自这些动物的乳汁中纯化，如WO01/57079所述。 1.3神经功能缺损的评估
在缺血48小时后，由有经验的未知实验条件的研究人员针对小鼠独特 的两项神经功能评分而对每只小鼠进行评估。总体神经功能缺损小鼠的如 下类别的每一项得分为0-28:毛发、耳、目艮、姿势、自发活动、癫痫行为。 局灶性神经功能缺损小鼠的如下类别的每一项得分为0-28:身体对称性、 步态、攀爬、旋转行为、前肢对称性、强制性旋转、感觉应答。数据以中
位值和第25至第75百分位值表示。 1.4梗塞面积的量化
在缺血48小时后，将小鼠用Equitensin(120W/小鼠，腹膜内注射)深度 麻醉，经心灌注30ml的PBS0.1mo1/1、 pH7.4，随后灌注在PBS中的60ml 冰冷多聚甲醛(4n/。)。在从颅腔中小心取出脑之后，将其移至在PBS中的30% 蔗糖溶液中，在4'C低温保护过夜。然后将脑沉浸在异戊烷中于-45。C速冻 3分钟，之后密封于小瓶中，在-7(TC贮存直至使用。为了确定损伤面积， 以240|am间隔依次制作20|im脑冠状切片，用中性红(Neutral Red Gurr Certistain,BDH，England)染色。在每个切片上，梗塞面积经盲式(blindly) 评价并通过组织学染色的相对苍白度(relative paleness)而描绘。梗塞面积 通过从每个切片上的对侧半球的面积中减去同侧半球中的正常组织面积而 确定。通过使用计算机辅助图像分析仪并通过图像分析系统(Analytical Image System)计算进行量化，综合每个脑组织切片上的梗塞面积而计算梗
死体积。
1.5旷场试验(open field test)
在缺血7天之后，通过旷场试验评估小鼠行为。这个试验可用于检测 长期缺血小鼠中的焦虑状态和探究行为及活动。旷场由一个包括4个不同 物体的塑料箱组成(41 x41 x41cm)。旷场区域分成28 x28cm的中心带及周 围的边缘带。将小鼠单独置于旷场的中心，由未知实验条件的研究人员对 小鼠的行为观测5分钟。记录inside crossings(主要与焦虑行为相关)、outside crossings (主要与运动活性相关)、后腿站立(rears)(主要与探究行为相关) 及与物体接触(主要与感觉/运动活性相关)的次数。
1.6神经元计数
在缺血7天之后，如前所述对小鼠进行经心灌注。为了确定神经元计 数，以640pm间隔依次切割成20pm脑组织冠状切片，用甲酚紫(Cresyl Violet acetate, Sigma, St. Louis, MO)染色。选择同侧和对侧半球的三个20|im 切片进行神经元计数测定。第一个切片是位于距离前囟+0.86的前后方向立 体定向坐标。神经元数量的减少通过集合两个半球的三个切片中的存活神
经元数而计算，以占对侧半球的百分比表示。使用连接有Soft Imaging System Colorview摄像机和AnalySIS软件的Olympus BX61显微镜。由未 知处理情况的研究人员在40X放大率进行定量分析。
1.7对星形胶质细朐和小胶质细胞进行免疫组织化学分析 在缺血7天之后，制备厚度为20jam的经心灌注的缺血小鼠脑组织的 冠状截面切片，用于评价星形胶质细胞和小胶质细胞/巨噬细胞免疫染色。 简而言之，将切片在含0.4% Triton X-100的0.1 mol/L PBS溶液中漂洗30 分钟，随后在含0.1°/。 Triton X-100和3。/。正常山羊血清(NGS)的PBS溶液 中漂洗15分钟。然后将切片与星形胶质细胞和小胶质细胞的抗体(抗-GFAP 1:1500， Chemicon;抗-CDllb 1:250，由Dr. A. Doni， Mario Negri Institute惠 赠)保温过夜。第二天，将切片在PBS中洗涤，与生物素酰化的二抗保温l 小时，洗涤并与抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶保温。在与3'-3-二氨基 联苯胺四盐酸盐反应之后，洗涤切片，干燥，通过梯度乙醇脱水，在二甲 苯中固定，用DPX封固剂封盖，之后经光学显微镜分析。 2.结果
2.1功效的时间窗
2丄1神经功能缺损的评估
在缺血48小时后接受rhClINH或盐水的缺血小鼠中评估神经功能缺 损情况。观测到与盐水处理的缺血小鼠相比，经rhCHNH-处理的每组小鼠 均有轻微(尽管不显著)的降低(rhCl腿-前9和12; rhCl腿-后7和11; rhClINH lh-后9和13;盐水10和12.5，分别为总体和局灶性功能缺损 的中位值)(数据未示出)。
2丄2梗死面积的评价
在缺血48小时后，与盐水处理的小鼠(41.51士7.01mm"相比，剂量为 15U/小鼠-前、-后及lh-后的rhClINH-处理的小鼠示出缺血体积明显降低(缺 血体积分别为13.67 + 2.59mm3、 9.06 + 0.77mm3和8.24 + 1.00 mm3)(图1 ， 数据以平均值土SEM表示)。
2.2七天结果
2.2.1旷场实验
缺血诱导抬头次数较未试验过的动物显著减少，在rhClINH-处理组中 这个参数与未缺血的小鼠无差异。评估的其它参数在这三组中未示出任何 差异。
2.2.2神经元计数
为了评估rhClINH的保护作用是否长期存在，我们评价了在诱导缺血 和用药物治疗之后7天神经元的丧失情况。结果示出rhClINH保护作用在 此时仍然存在神经元丧失14%±2.18%均值(盐水处理的小鼠)相对于4% ± 1.24%均值(rhC 1INH处理的小鼠)(数据未示出)。
2.2.3对小胶质细胞/巨噬细胞和星形胶质细胞进行免疫组织化学分析
在缺血7天之后，在接受盐水的缺血小鼠的损伤的海马和纹状体中观 测到大量激活的小胶质细胞和浸润的巨噬细胞(数据未示出)。15单位的 rhClINH-pre在这两个区域中均能削弱这种激活和浸润作用(数据未示出)。 经盐水处理的缺血小鼠的同侧海马示出轻微的星形胶质细胞增生，这与在 rhCHNH-处理的缺血小鼠中观测到的结果无差异(数据未示出)。在任一组中 的其它脑部区域未示出任何相关星形胶质细胞的激活。
3.结论
本发明数据示出剂量为15U/小鼠的rhClINH当在缺血开始(-pre)或结 束(-后，即在再灌注时)给予对象时，在降低缺血体积方面作用相似。更重 要的是当在缺血发生后1小时(lh-后)注射该抑制剂时其也能发挥神经保护 作用。另外，rhClINH的保护作用在缺血后7天仍存在。这些结果与血浆 衍生的hClINH形成鲜明对比，当在缺血后1小时注射后者时，其几乎完 全丧失发挥神经保护作用的能力(见图2)。
这项研究的主要结果如下
1. 小鼠血浆中rhClINH的半衰期为大约3小时(在15U/小鼠的剂量)。 抗原与功能活性之间的良好相关性表明所述重组蛋白质在血浆中仅以其活 性形式循环；可能是组织分布有助于血浆水平的降低。
2. 15U/小鼠-pre剂量的rhClINH非常有效地降低缺血体积(降低
69%) o
3. 通过染色评价，15U/小鼠的剂量的rhClINH能明显降低海马中的变 性神经元数，因此表明缺血体积的降低归因于神经元免于损伤。
4. 当在缺血开始(-前)、结束(-后)或缺血发生1小时后(lh后后，即再 灌注开始30分钟)给予时，rhClINH在降低缺血体积方面作用相似。因此， rhClINH较pdClINH (当在缺血1小时后给予pdClINH时其不再起作用) 的作用功效时间窗宽大。
5. rhClINH-前剂量的神经保护作用时长期的，通过在缺血开始后7天 进行的神经元计数而示出。
6. 在缺血之后48小时评价发现，rhCHNH使得总体和局灶性功能缺损 略为改善。这个发现与用pdClINH观测到的结果相似。为了评估rhClINH 对于长期行为功能表现的影响，我们通过旷场实验分析了小鼠的行为。结 果示出缺血之后7天rearing行为在缺血小鼠中比未经试验的小鼠中的得分 显著降低。这种降低在rhClINH处理的小鼠中不存在，其得分与对照小鼠 无差异。
7. 在早期(48小时)和晚期(7天)时间点进行评价，示出rhClINH能削 弱缺血小鼠脑组织中小胶质细胞/巨噬细胞的激活/募集。这些细胞是脑组织 炎症应答的标志。
8. 在48小时由缺血激发的星形胶质细胞的强应答由rhClINH削弱。 在两个实验组中星形胶质细胞激活均明显降低，在盐水和rhClINH-处理的 小鼠中可观测到无差异。
实施例2:对rhCl-INH在局灶性脑缺血的小鼠模型中的神经保护作用的研 究
我们先前已经证实了 15U的rhCl-INH在小鼠脑缺血/再灌注模型中具 有明显的神经保护作用，当在缺血/再灌注发生之后1小时给予时也如此， 而pdCl-ENH在治疗后这个时间点不再有效。这种神经保护作用是长期的， 事实上在缺血及治疗之后7天，用rhCl-INH治疗的小鼠缺血的脑组织仍示
出梗死面积降低。在如下实验中，我们确定了rhCl-INH的神经保护作用对 缺血体积的功效时间窗(超过1小时后)和剂量应答。另外，我们使用相同方 案直接对比了 pdCl-INH、兔和牛rhCl-INH的作用(对于兔rhCl-INH是在 最有效剂量和时间点)
方法
动物
涉及动物及其照顾的程序根据符合国家(D丄.n.116, G.U. suppl. 40， 18 February 1992)和国际法和政策(EEC Council Directive 86/609， OJ L 358,1; Dec. 12,1987; NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, U.S. National Research Council 1996)的研究机构指导进行。将雄性C57B1/6小鼠 (26-28 g， Charles River, Calco,Italy)圈养，5只/笼，保持在恒定的温度(21士 1°C)和相对湿度(60%)，规律光照/黑暗(7am-7pm)。随意取食(小鼠食用 Altromin颗粒)和水。
一过性局灶性脑缺血
如前所述通过大脑中动脉闭塞(MCAO)实现缺血u。利用含5%异氟 醚的NaO/Oa (70/30%)混合物诱导麻醉，并用在相同混合物中的1.5-2%异 氟醚保持麻醉状态。为了证实每只动物中血管闭塞的合适性，通过激光多 普勒血流仪(Transonic BLF-21)使用位于脑表面并用压模材料固定在颅骨上 的柔软的0.5mm光纤探头(Transonic, Type M, 0.5 mm直径)测量血流，使 用如下坐标AP--lmm， L=-3，5mm。简而言之，暴露右颈总动脉，通过 在颈总动脉上做的切口将硅丝(7-0)导入颈内动脉中并行进至大脑前动脉， 以阻断其分支进入大脑前动脉和MCA。使所述硅丝行进直至观测到与缺血 前基线相比血流减少>70%。在缺血30分钟后，小心除去所述尼龙丝恢复 血流。
药物治疗
在缺血后不同时间以不同剂量给予小鼠单剂量静脉内注射C1-INH (兔 rhCl-INH、牛rhCl-INH或者pdCl-INH)。对照小鼠接受相同体积的盐水。 神经功能缺损评估
在缺血48小时后，由有经验的未知实验条件的研究人员针对小鼠独特 的两项神经功能评分对每只小鼠进行评估。总体神经功能缺损小鼠的每一 项如下类别的得分为0-28:毛发、耳、眼、姿势、自发活动、癫痫行为。 局灶性神经功能缺损小鼠的每一项如下类别的得分为0-28:身体对称性、 步态、攀爬、旋转行为、前肢对称性、强制性旋转、感觉应答。数据以中 位值和百分位值表示。
梗死面积的量化
在缺血48小时后，将小鼠用Equitensin(120ial/小鼠，腹膜内注射)深度 麻醉，经心灌注30ml的PBS 0.1mol/l、 pH7.4，随后灌注在PBS中的60ml 冰冷多聚甲醛(4%)。在从颅腔中小心取出脑之后，将其移至30%蔗糖的 PBS溶液中，在4"C低温保护过夜。然后将脑沉浸在异戊垸中在-45t:速冻 3分钟，之后密封于小瓶中，在-7(TC贮存直至使用。为了确定损伤面积， 以240|im间隔依次制作厚度为20pm的脑冠状切片，用中性红(Neutral Red Gurr Certistain， BDH, England)染色。在每个切片上，梗塞面积经盲式评价 并通过组织学染色的相对苍白度(relativepaleness)而描绘。梗塞面积通过
从每个切片上的对侧半球的面积中减去同侧半球中的正常组织面积而确 定。通过使用计算机辅助图像分析仪并通过图像分析系统(Analytical Image
System)计算进行量化，综合每个脑组织切片上的梗塞面积而计算梗死体积。
神经变性的评价
通过用Fluoro-Jade"染色(这是神经元变性的标志物)在厚度为20|am的 切片上评估神经变性的存在。简而言之，将切片干燥，在乙醇(100%-75%) 和蒸馏水中再水化。然后将其在0.06%高锰酸钾中保温15分钟，在蒸馏 水中洗涤，移至0.001% Fluoro-Jade染色溶液中染色30分钟。在染色后， 将切片在蒸馏水中漂洗，干燥，浸入二甲苯中，用DPX封固剂(BDH，Poole， UK)封盖，之后进行荧光显微镜分析。
结果
短暂缺血中的功效时间窗 为了评估功效时间窗，从缺血开始后3、 6、 9、 18和24小时给予15U 的兔rhCl-INH或盐水。48小时后，在缺血发生后3和6小时用兔rhCl-INH 3处理的缺血小鼠比用盐水处理的缺血小鼠(44.43土5.94mm"示出缺血体积 明显降低(分别为11.71 土0.63mm3和20.38士2.37mm3)。当在缺血后9和18 小时给予兔rhCl-INH时，其仍有效，但是功效较小(分别为23.63士4.11mm3 和27.13土2.58mm3)。在缺血后24小时给予时，该抑制剂丧失其有益作用 (41,92±2.76,3)(图3)。在盐水处理的小鼠中，FIuoro-Jade染色示出在纹 状体皮质和海马中存在神经变性。当在早期时间点给予时，rhCl-INH能减 少海马(直至3小时)和皮质(直至9小时)中的神经变性。当在缺血后6和9 小时用这种抑制剂处理小鼠时，在海马中观测到一些变性神经元。在稍后 的处理时间点(18和24小时)，当缺血体积较大时，Fluoro-Jade染色示出在 皮质中存在神经变性的神经元。在所有测试时间点，在盐水和rhCl-INH处 理的动物中纹状体均示出广泛的神经变性(图5、 6、 7)。由未知实验条件的 ff究人员对每只动物进行Fluoro-Jade染色半定量评估(图4)。
短暂缺血中的剂量应答
由于在人遗传性血管性水肿中使用的C1-INH剂量低于本发明在小鼠 中风治疗中的用量，因此在本发明的缺血模型中使用较低的剂量。基于先 前的实验结果，选择处理后3小时进行剂量应答实验。在缺血和再灌注发 生后3小时给予不同剂量的兔rhCl-INH (5和IO单位)。10U/小鼠的剂量 在降低缺血体积方面仍有效(22.10士3.65mm3)，而5U的兔rhCl-INH不再 改变脑损伤的程度(47.39±4.081111113)。这些数据示出兔rhCl-INH能以剂量 依赖性方式改变缺血损伤(图8)。
在用10U rhCl-INH处理的小鼠中，通过Fluoro-Jade染色在纹状体观 测到一些神经变性的神经元，但在海马和皮质中未观测到；而用5U处理的 缺血小鼠在纹状体皮质中出现大量神经变性(数据未示出)。
在功效时间窗或剂量应答实验中均未示出总体和局灶性神经功能缺损 的任何明显变化(数据未示出)。
pdC 1-INH与rhC 1-INH (来自兔和牛)作用的对比
先前关于pdCl-INH的数据得自一种不同的短暂脑缺血模型。为了直 接对比pdCl-INH、牛rhCl-INH和兔rhCl-INH，将这些化合物给予使用相 同实验方案(硅涂覆的丝)诱导的缺血小鼠。在缺血发生后3小时给予剂量为 15U/小鼠的所述抑制剂。
正如所预期的，pdCl-INH在此时间点不能发挥神经保护作用(47.39± 4.08mm3)。然而，牛rhCl-INH-处理的缺血小鼠较盐水处理的小鼠示出明显 降低的缺血体积，但是程度较兔rhCl-INH-处理的小鼠低(图9)。令人惊奇 的是总体和局灶性神经功能缺损均通过牛rhCl-INH得以改善(图10)。
Fluoro-Jade染色示出在用pdCl-INH处理的缺血小鼠脑组织的所有考 虑的区域(皮质、纹状体和海马)中均存在大量神经变性。牛rhCl-INH处理 的小鼠脑组织染色示出皮质和海马中不同程度的神经变性，因为在6只小 鼠中有3只小鼠在这两个区域均观测到明显的神经变性，而其它3只小鼠 的神经变性量很少。在6只小鼠中均示出纹状体广泛的Fluoro-Jade染色。
评论
这项工作的最相关数据是兔rhCl-INH的功效时间窗。剂量为15U/小 鼠的兔rhCl-INH在缺血发生之后直至18小时仍能显著降低缺血体积，而 pdCl-INH在缺血3小时之后已经丧失其神经保护作用。这个令人惊奇的特 征使得rhCl-INH成为人类中风治疗的一种可能的候选物。pd和rhCl-INH 的不同功效可归因于这两种分子的不同糖基化，导致与血浆衍生的C1-INH 相比rhCl-INH对于甘露糖结合蛋白(MBP)的亲和性较高。通过与MBP的 结合，rhCl-MH导致参与心、肾和胃肠道缺血/再灌注损伤发病机制的补体 凝集素途径受抑制7'9。这个未经充分鉴定的途径在脑缺血中的作用还未知， 需要进一步的实验以阐明rhCl-INH神经保护作用的机制。
rhClINH较pdClINH在缺血发生后时间窗中的良好神经保护作用可如 下进一步解释，即所述重组分子通过结合细胞表面抗原而更有效地靶向组 织损伤部位和/或更有效的组织穿透。需要进行更多的研究以充分阐明本发 明所述观测结果的精确分子学机制。
Fluoro-Jade染色提供了损伤随着时间进展的间接证据。用rhCl-INH早
期处理可以完全挽救缺血半影区(海马和皮质)。处理给予得越晚，在缺血半
影区就有越多的神经元变性。这些发现证实rfiCl-INH对于缺血半影区发挥 神经保护作用。兔riiCl-INH能以剂量依赖性方式降低缺血体积。功效时间 窗实验中使用的rhCl-INH最有效的剂量(15U/小鼠，相应于大约600U/kg) 高于在人遗传性血管性水肿中的使用剂量(大约25-100U/kg)。为了证实较低 的剂量在降低神经变性和缺血性梗死中是否仍有效，进行剂量应答实验。 结果示出400U/kg(10U/小鼠)的rhCl-INH仍能显著减少缺血性损伤，但是 程度降低。高于HAE所用剂量(5U/小鼠，200U/kg)8倍的剂量无效。这些 发现与所表明的在各种炎症的治疗中需要大剂量C1-INH的结果5—致。特 别是这种剂量是达到对内皮粘附分子的重要抑制作用所必需的6，这是参与 脑缺血/再灌注损伤病理学的一种机制。最后，在缺血之后3小时给予剂量 为15U/小鼠的牛rhCl-INH提供神经保护作用，但是显著低于兔rhCl-INH 的神经保护作用。与盐水处理的小鼠相比，所述牛来源的抑制剂也能改善 神经损伤。这些发现表明这种分子能改善缺血小鼠的一般状况。
实施例3: rhCl!NH与血浆衍生的C1INH抑制经典途径和MBL途径的激 活的能力对比 材料与方法
rhClINH和pdClINH (Cetor， Sanquin, Amsterdam, The Netherlands)对于 经典和凝集素途径功能的作用在Wieslab TM complement system Screen (Euro-Diagnostica, Malmo, Sweeden)中使用两种不同来源的血清来检测。一 种血清是试剂盒中包含的血清，用作阳性对照(后文称作血清样品1)。另一 血清样品得自可商购人血清库(25个不同供体的血清库；Kordia, Leiden，荷 兰)，后文称作血清样品2。将这两个血清样品一式三份单独与0、 15、 30 和75 iumol rhClINH或pdClINH在室温保温30分钟。为此，将pdClINH 和rhClINH原液在水中稀释为适当浓度。取相应于15、 30和75pmol rhClINH或pdClINH的体积，用水调节为15^1。取与rhClINH相同稀释 度的溶解有rhClINH的缓冲液(20 mM柠檬酸盐，0.19 M蔗糖pH 6.8;经
0.22(im滤膜过滤)作为对照以干扰Wieslab补体系统。根据厂商指导，将经 典途径和MBL途径的阳性对照(PC)和阴性对照(NC)(试剂盒中提供)及两种 血清样品在稀释剂CP(经典途径)和稀释剂MP(MBL途径)中稀释为1/101。 为127.5jil这些稀释的血清补加22.5|il水、pdClINH、rhClINH或者缓冲液， 在室温保温30分钟。接着，将100nl/孔的PC、 NC、稀释剂CP或MP (空 白)及样品移液至合适的平板上，在37t:保温l小时。在保温后，用300)il/ 洗涤溶液将孔洗涤3次，随后在室温与10(Hil/孔的结合物保温30分钟。再 次洗涤后，将孔与100^d/孔的底物再次在室温保温30分钟。通过加入100^1/ 孔的5mMEDTA终止反应，在405nm读取吸光度。
为了计算结果，从PC、 NC和样品组中减去空白组(稀释剂CP或MP) 的吸光度。补体激活的百分比利用如下公式计算(样品-NC)/(PC-NC)X 100。这意味着PC总是设定为100%。对于每种条件，计算平均值、标准 偏差及CV%。
结果
通过Wielisa检査rhClINH和pdClINH对经典途径的作用 在两个不同血清样品中分析rhClINH和pdClINH对经典途径激活的抑 制作用。如图12、 13和16所示，rhClINH和pdClINH在这两个血清样品 中均剂量依赖性降低经典途径介导的C5b-9沉积。而75nm浓度的rhClINH 与pdClINH相比似乎在血清样品1中略强地抑制经典途径激活，这种作用 在血清样品2中未观测到。在所有其它测试浓度，在rhClINH与pdClINH 之间未观测到抑制作用的差异。因此，推断rhClINH和pdClINH在人血清 中抑制经典途径激活方面效果相同。
通过Wielisa检查rhClINH和pdClINH对MBL途径的作用 在相同的实验设置中，分析rhClINH和pdClINH对MBL途径激活的 抑制作用。如图14、 15和16所示，rhClINH和pdClINH也均剂量依赖性 降低MBL途径的激活。然而，与其中未观测到差异的经典途径相反， rhClINH与pdClINH相比呈现出是MBL途径的更强的抑制剂。在所有三 个测试浓度及在这两个血清样品中，rhClINH-介导的MBL途径的抑制比
pdClINH高 20。/。。因此，推断rhClINH与pdClINH相比是MBL途径的
更有效的抑制剂。 结论
结果示出rhClINH和pdClINH在抑制经典途径中效果相等，但是 rhClINH是MBL途径的更强的抑制剂。在所有测试浓度，rhClINH比 pdClINH介导的MBL途径抑制强~20%。 参考文献
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权利要求
1.血浆半衰期小于6小时的C1抑制剂在制备用于预防、降低或治疗至少一种缺血和再灌注损伤的药物组合物中的应用，其中所述C1抑制剂在缺血和再灌注后给予。
2. 权利要求1的应用，其中所述Cl抑制剂与得自血浆的人Cl 抑制剂相比具有降低的末端唾液酸残基水平。
3. 权利要求1或2的应用，其中所述C1抑制剂包含一种聚糖， 所述聚糖具有选自半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰葡糖胺、甘露 糖和岩藻糖的末端残基。
4. 前述任一项权利要求的应用，其中所述Cl抑制剂具有与SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列至少65%相同性的氨基酸序列。
5. 前述任一项权利要求的应用，其中所述C1抑制剂得自遗传工 程化细胞或生物体。
6. 权利要求5的应用，其中所述C1抑制剂得自转基因非人动物。
7. 权利要求6的应用，其中所述Cl抑制剂得自转基因非人动 物的乳汁。
8. 权利要求6或7的应用，其中所述转基因非人动物是牛或者 Z^go附or; /za目的动物，优选兔。
9. 前述任一项权利要求的应用，其中所述Cl抑制剂以50-2000 单位/kg体重范围的量被应用。
10. 前述任一项权利要求的应用，其中所述C1抑制剂在缺血和/ 或再灌注后至少1小时、优选至少3小时、更优选至少6小时、更 优选至少9小时、更优选至少18小时给予。
11. 前述任一项权利要求的应用，其中所述药物组合物还含有溶 血栓药或者与溶血栓药组合应用或者在用这种溶血栓药治疗后应 用。
12. 前述任一项权利要求的应用，其中所述药物组合物用于预防、降低或治疗至少一种无法预见的缺血和再灌注损伤的突然或急性发 生。
13. 权利要求12的应用，其中所述药物组合物用于预防、降低或 治疗在中风或围产期中风之后的至少一种缺血和再灌注损伤。
14. 权利要求1-11任一项的应用，其中所述药物组合物用于预 防、降低或治疗至少一种预见的缺血和再灌注损伤的发生，优选在 器官移植后的发生。
15. 如权利要求1-9的C1抑制剂在制备用于预防、降低或治疗 至少一种缺血和再灌注损伤的药物组合物中的应用，其中所述Cl 抑制剂是在至少一种预见的缺血和再灌注损伤发生之前或发生期间 给予。
16. 权利要求15的应用，其中所述C1抑制剂在至少一种预见的 缺血和再灌注损伤发生之前至多3小时、优选至多2小时、更优选 至多1小时、最优选至多30分钟给予，和/或其中本发明的Cl抑制 剂被持续给予需要其的对象和/或在器官移植情况中被持续给予待 移植的器官。
17. 权利要求15或16的应用，其中预见的缺血和再灌注损伤的 发生是在器官移植情况中。
18. 权利要求1-17任一项的应用，其中所述药物组合物用于预 防、降低或治疗已知通过凝集素途径产生的至少一种缺血和再灌注 损伤，优选心肌、肾、胃肠道缺血和再灌注损伤或中风。
19. 权利要求13的应用，其中C1抑制剂发挥神经保护作用，优 选在海马和/或皮质中发挥神经保护作用。
20. 前述任一项权利要求的应用，其中所述Cl抑制剂发挥降低 由缺血和/或再灌注诱导的损伤的作用。
全文摘要
本发明涉及C1抑制剂在预防、降低和治疗缺血和再灌注损伤中的治疗和预防性应用。本发明的C1抑制剂在缺血和再灌注后给予仍具有治疗作用，并因此特别可用于无法预见的缺血-再灌注的发生如中风。
文档编号A61P41/00GK101365478SQ200680048287
公开日2009年2月11日 申请日期2006年12月19日 优先权日2005年12月21日
发明者F·皮珀, G·J·齐瑞, J·H·努延斯, M·G·德西莫尼, M·曼奈斯 申请人:法明知识产权股份有限公司